蛋白棕榈酰化验证攻略，速看！

蛋白质是生命活动的执行者，而蛋白质的功能往往依赖于翻译后修饰（PTM）的精细调控。在众多修饰方式中，棕榈酰化（Palmitoylation）是一种重要的脂质修饰，通过动态调控蛋白质的定位、稳定性和相互作用，广泛参与细胞信号传导、膜运输和疾病发生等过程。

图1蛋白发生棕榈酰化修饰（Villanueva et al., 2023）。

01 蛋白棕榈酰化的原理

蛋白棕榈酰化是指棕榈酸（16碳饱和脂肪酸，C16:0）通过硫酯键（-S-）或氧酯键（-O-）共价连接到蛋白质的半胱氨酸（Cys）残基上的过程。与其他脂质修饰（如豆蔻酰化、法尼基化）不同，棕榈酰化具有可逆性，使其成为动态调控蛋白质功能的关键机制。

棕榈酰化由棕榈酰转移酶（PATs，如DHHC家族蛋白）催化，而去棕榈酰化酶（如APT1/2、PPT1）可移除棕榈酸基团，形成动态平衡。棕榈酰化酶（PATs）：如DHHC3、DHHC17等，负责将棕榈酸连接到靶蛋白。去棕榈酰化酶：如APT1（酰基蛋白硫酯酶1）、PPT1（棕榈酰蛋白硫酯酶1）等，负责移除修饰。

棕榈酰化主要影响蛋白质的以下特性：

（1）膜定位：促进蛋白质锚定在细胞膜（如Ras、G蛋白偶联受体）；

（2）稳定性：防止蛋白质降解（如Hedgehog信号通路中的蛋白）；

（3）信号转导：调控激酶活性（如Src家族激酶）；

（4）蛋白质相互作用：影响复合物形成（如突触后支架蛋白PSD-95）。

图2 棕榈酰化酶（PATs）介导的蛋白棕榈酰化（Abdulrahman et al., 2025）。

02 检测蛋白棕榈酰化的方法

目前常用检测棕榈酰化的方法有：代谢标记法和酰基-生物素交换法（Acyl-Biotin Exchange，ABE）。两种方法检测蛋白棕榈化修饰的侧重点不一样。代谢标记法检测的是棕榈酰化修饰的能力，反映实时棕榈酰化活性；而ABE法反映的是累积棕榈酰化水平。

（1）代谢标记法

用含炔基的棕榈酸类似物（如17-ODYA）代谢标记，通过点击化学反应（Click Chemistry）连接生物素或荧光标签，实现无放射性检测。

17-ODYA是一种棕榈酸（C16:0）的类似物，其结构特点是在脂肪酸链的第17位碳原子上引入炔基（-C≡CH），而保留了棕榈酸的羧基端（-COOH）。内源性棕榈酰转移酶（DHHC家族）无法区分天然棕榈酸和17-ODYA，仍会将其共价连接到靶蛋白的半胱氨酸（Cys）上。

17-ODYA加入到细胞培养基进行标记，炔烃标记棕榈酰化蛋白后，再通过铜催化的叠氮-炔环加成反应将炔烃标记的蛋白与检测标签（如生物素）连接。最后利用生物素-链霉亲和素的高亲和力，用磁珠下拉棕榈酰化蛋白，Western Blot验证棕榈酰化修饰的目标蛋白。注意：17-ODYA竞争性整合到新发生的棕榈酰化反应中，而非修饰已存在的棕榈酰化蛋白，因此体现的是目标蛋白棕榈酰化的活性。

图3 代谢标记法（17-ODYA）检测蛋白棕榈酰化流程图（Tay et al., 2016）。

（2）酰基-生物素交换法（ABE）

ABE法通过三步化学交换将棕榈酰化修饰转化为可检测的生物素标签，是研究内源性蛋白棕榈酰化的金标准方法。

1）封闭游离巯基：棕榈酰化蛋白的未修饰Cys会被NEM共价封闭，形成稳定的Cys-NEM加合物，防止后续步骤的非特异性标记。

2）羟胺（HA）特异性切割棕榈酰化Cys的硫酯键：暴露出新的巯基（-SH）会被羟胺特异性切割，而其他脂修饰（如豆蔻酰化、法尼基化）或二硫键（-S-S-）不被切割，以不加羟胺的样本作为阴性对照（应无生物素标记）。

3）生物素标记暴露的巯基：巯基反应性生物素（如HPDP-Biotin）与羟胺切割后暴露的Cys巯基（-SH）结合，形成生物素标记蛋白。最后通过用磁珠下拉棕榈酰化蛋白，Western Blot验证棕榈酰化修饰的目标蛋白。

ABE法是检测已存在的棕榈酰化蛋白，反映累积棕榈酰化水平。

图4 ABE法检测蛋白棕榈酰化的流程图（Brigidi et al., 2013）。

03 案例解读

验证目标蛋白的棕榈酰化通常需要这两种方法共同检测，例如Yu等人在验证VPAC1蛋白的棕榈酰化时同时采用了这两种方法。

图5-A通过酰基生物素交换实验检测VPAC1蛋白（带EYFP标签）中Cys37的棕榈酰化，在VPAC1-CHO细胞中，经过HA处理后，VPAC1-EYFP显示出较强的生物素标记信号，表明Cys37发生了棕榈酰化，在VPAC1-C37/A-CHO细胞中，生物素标记信号显著减弱，几乎检测不到，表明Cys37的突变（C37/A）抑制了棕榈酰化。

图5-B通过代谢物标记法/点击化学方法检测VPAC1蛋白中Cys37的棕榈酰化,在VPAC1-CHO细胞中，经过点击化学反应处理的样本显示出较强的生物素标记信号，表明Cys37发生了棕榈酰化;在VPAC1-C37/A-CHO细胞中，生物素标记信号显著减弱，几乎检测不到，表明Cys37的突变（C37/A）抑制了棕榈酰化。

图5-C通过时间依赖性实验验证17-ODYA代谢标记的效率，将VPAC1-CHO细胞在含有17-ODYA的培养基中孵育不同时间（30分钟、60分钟、120分钟、240分钟），按照上述点击化学方法处理样本，通过Western Blot检测EYFP标记的VPAC1蛋白，随着代谢标记时间的延长，生物素标记信号逐渐增强，表明17-ODYA代谢标记的效率随时间增加。

图5-D比较VPAC1-CHO和VPAC1-C37/A-CHO细胞中VPAC1蛋白的生物素标记信号,将VPAC1-CHO和VPAC1-C37/A-CHO细胞分别用17-ODYA代谢标记，并进行点击化学反应,使用链霉亲和素-琼脂糖珠子捕获生物素标记的蛋白质，通过Western Blot检测VPAC1蛋白。

图5 VPAC1蛋白中Cys37的棕榈酰化的检测结果（Yu et al., 2017）。

参考文献

Yu R, Liu H, Peng X, et al. The palmitoylation of the N- terminal extracellular Cys37 mediates the nuclear translocation of VPAC1contributing to its anti-apoptotic activity[J]. Oncotarget, 2017, 8(26): 42728.

Abdulrahman, Farah A., et al. "zDHHC-Mediated S-Palmitoylation in Skin Health and Its Targeting as a Treatment Perspective." International Journal of Molecular Sciences 26.4 (2025): 1673.

Villanueva C E, Hagenbuch B. Palmitoylation of solute carriers[J]. Biochemical pharmacology, 2023, 215: 115695.

Brigidi G S, Bamji S X. Detection of protein palmitoylation in cultured hippocampal neurons by immunoprecipitation and acyl-biotin exchange (ABE)[J]. Journal of visualized experiments: JoVE, 2013 (72): 50031.

Tay C L, Jones M L, Hodson N, et al. Study of Plasmodium falciparum DHHC palmitoyl transferases identifies a role for PfDHHC9 in gametocytogenesis[J]. Cellular microbiology, 2016, 18(11): 1596-1610.