TurboID技术：邻近标记技术的高效工具

在生物医学研究领域，理解蛋白质之间的相互作用对于揭示细胞的生理和病理机制至关重要。BioID技术作为一种基于生物素标记的邻近依赖性标记方法，已被广泛应用于活细胞中蛋白质相互作用的识别。然而，传统的BioID方法需要长达15 - 18小时的标记时间，这限制了其在某些需要快速标记或低温条件下应用的场景。为了解决这一问题，TurboID应运而生，这是一种经过定向进化的BioID变体，能够在更短的时间内完成生物素标记，并且在较低温度下也能有效工作。

一、TurboID技术的原理

TurboID是一种经过定向进化的生物素连接酶，其基于大肠杆菌的BirA蛋白突变体。在活细胞内，TurboID能利用ATP将生物素转化为高反应活性的生物素-5'-AMP中间体，该中间体可与目标蛋白邻近的蛋白质上的赖氨酸残基发生共价结合，实现对邻近蛋白的生物素化标记，进而在短时间内高效捕获蛋白质相互作用网络。

TurboID原理图

二、TurboID技术的步骤

1. 构建融合蛋白表达载体：构建TurboID与目标蛋白的融合表达载体，若目的蛋白有特殊定位还可增加靶向引导序列，之后对构建的载体进行验证。
2. 细胞转染与培养：将构建好的表达载体转染到选定的细胞系中。使用无生物素培养基培养细胞，消除内源性生物素干扰，一般将细胞在低生物素培养基中培养5 - 7天。同时，需要设置未转染细胞组（±Biotin）、转染TurboID组（±Biotin），用PEI或者lipo进行转染。
3. 生物素标记及反应终止：对需添加Biotin的未转染组和TurboID组，用50μM生物素处理细胞30分钟（可按需设置不同时间梯度），后用含PMSF的冰PBS洗涤3 - 5次终止生物素化反应，收集细胞至EP管。
4. 细胞裂解与磁珠富集：用RIPA缓冲液裂解细胞颗粒，冰上孵育30分钟后离心，吸取上清液作为input，其余部分与链霉抗生物素蛋白磁珠进行IP，洗涤磁珠后收集上清，再依次用RIPA裂解缓冲液等洗涤磁珠，最后将珠子重悬在RIPA裂解缓冲液中并转移至新EP管。
5. 质谱分析与数据处理：对洗脱下来的蛋白质进行胰蛋白酶消化，产生的肽段通过质谱分析鉴定。利用生物信息学工具对质谱数据进行处理和分析，包括蛋白质鉴定、定量分析以及与数据库的比对等，以筛选出与目标蛋白相互作用的候选蛋白质。

   

TurboID步骤图

三、TurboID技术的应用

1. 研究蛋白质与其他分子的相互作用：可用于鉴定蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸、蛋白质与脂质等的相互作用。
2. 探索细胞内的分子网络和信号通路：通过揭示蛋白质之间的相互作用，帮助理解细胞内的信号传导机制和分子网络的构建，为研究细胞生理功能和病理机制提供依据。
3. 分析亚细胞结构的组成和功能：可用于研究特定细胞器或亚细胞结构中的蛋白质组成，深入了解其结构和功能。
4. 研究生物大分子相分离：在相分离研究中具有独特优势，可用于多种相分离凝聚体的研究。

四、TurboID技术的优势

1. 快速标记：TurboID能够在10分钟内完成生物素标记，相较于传统BioID所需的15 - 18小时，大大缩短了标记时间。这一特性使得TurboID特别适合研究短暂或瞬时的蛋白质相互作用，以及在需要快速标记的实验条件下应用。
2. 低温兼容性：TurboID在较低温度下也能有效工作，这拓宽了其应用范围，使其能够在更多的实验条件下发挥作用，例如在模拟某些特殊生理或病理环境的实验中。
3. 内质网腔中的高效标记：TurboID在内质网腔中的标记能力优于BioID。在内质网腔这一特殊环境下，BioID的标记效率较低，而TurboID能够克服这一障碍，实现对内质网腔内蛋白质的高效标记。说明TurboID可能在其他具有特殊环境条件的细胞器或细胞外环境中也具有优势。

五、TurboID技术的局限性

1. 标记的不可控性：TurboID在未添加外源生物素时也会发生一定程度的生物素标记，这可能导致背景信号较高，影响实验结果的准确性和特异性。因此，在使用TurboID进行实验时，需要对生物素标记的可控性进行优化，以减少背景信号的干扰。
2. 蛋白质稳定性和细胞毒性：TurboID及其衍生的miniTurbo蛋白在某些情况下可能会表现出蛋白质不稳定或细胞毒性的问题。例如，miniTurbo的表达水平通常较低，这可能是由于细胞对其的选择性清除或蛋白质的快速降解。此外，TurboID的持续表达可能会对细胞的正常生理功能产生影响，这需要在实验设计中加以考虑。

六、总结

TurboID作为一种新型的邻近标记工具，在蛋白质相互作用研究领域展现出了巨大的潜力。其快速标记、低温兼容性和在特殊细胞环境中的高效标记能力为其广泛应用提供了基础。然而，TurboID也面临着标记不可控性和蛋白质稳定性等挑战。未来的研究可以通过优化实验条件、改进TurboID的突变体设计等方式来克服这些局限性。同时，随着对TurboID技术的深入研究和应用，我们期待它能够在更多的细胞器和细胞外环境中发挥作用，为揭示细胞内的蛋白质相互作用网络和生命活动的奥秘提供更加强大的技术支持。