纳米奇兵攻克黄斑变性的新曙光【AbMole】

年龄相关性黄斑变性（AMD），这位 “视力的无形杀手”，悄然侵蚀着无数人的视觉世界，尤其是湿性 AMD，其引发的脉络膜新生血管（CNV），如同肆意生长的 “血管杂草”，疯狂破坏视网膜结构，让无数患者陷入视力衰退的绝望深渊。传统的玻璃体内注射抗血管内皮生长因子（anti-VEGF）疗法，虽为众多患者带来过一丝希望的曙光，却因疗效局限、频繁注射带来的并发症以及患者依从性差等问题，难以从根本上扭转战局。而在这场与黑暗的较量中，科研工作者们如同执着的 “光明使者”，不断探索新的 “武器”，试图打破这一困境。最近，一项极具创新性的研究成果，为攻克湿性 AMD 带来了全新的思路与希望，其中，AbMole 的科研产品也在研究中发挥了重要作用，助力科研人员深入探索疾病机制，揭开治疗的新篇章。

年龄相关性黄斑变性（AMD）作为一种典型的神经退行性视网膜疾病，是导致不可逆视力丧失的主要原因之一，严重影响患者的生活质量。AMD 主要分为干性和湿性两种类型，其中湿性 AMD 尤为棘手。在湿性 AMD 患者的眼睛里，视网膜下方脉络膜层会过早地生长出异常的血管和毛细血管，形成脉络膜新生血管（CNV）。这些新生血管不仅结构脆弱，容易破裂出血，还会导致视网膜水肿、渗出，进一步损害视力，最终可能导致失明。

目前，玻璃体内注射抗血管内皮生长因子（anti-VEGF）药物，如雷珠单抗（Lucentis）、贝伐单抗（Avastin）和阿柏西普（Eylea），是治疗湿性 AMD 的主要手段。这些药物旨在阻断 VEGF 的活性，抑制病理性血管生成。然而，临床实践表明，这种疗法的效果并不理想，约 50% 的湿性 AMD 患者即使经过一年的持续治疗，也没有明显的改善。这背后的原因，与湿性 AMD 复杂的发病机制密切相关。

越来越多的研究证据显示，视网膜作为人体耗氧量最高的组织之一，极易受到遗传、年龄、光照、缺氧等多种因素的影响。这些因素会促使视网膜产生过量的活性氧（ROS），打破视网膜内的氧化还原平衡。过量的 ROS 会对视网膜色素上皮（RPE）细胞造成损伤，导致其功能失调，进而引发玻璃膜疣的形成、炎症反应以及新生血管的生成，推动湿性 AMD 的病情发展。此外，患者需要频繁接受侵入性的玻璃体内注射，这不仅给患者带来了身体上的痛苦和心理上的负担，还容易引发一系列并发症，如眼内出血、感染、视网膜脱离和眼压升高等，严重影响患者的治疗体验和预后效果 。因此，开发一种更安全、有效、微创的治疗策略，成为了眼科领域亟待解决的重大难题。

面对湿性 AMD 治疗的困境，科研团队将目光聚焦于多功能纳米颗粒的研发。他们希望通过创新的设计，打造出一种能够同时调节氧化还原平衡、减轻炎症反应、抑制血管生成的新型纳米治疗剂，并采用微创的给药方式，提高治疗效果和患者的依从性。

在这项研究中，科研人员精心挑选了两种具有独特功能的小分子物质：虾青素（AST）和阿西替尼（AXI），并将它们巧妙地封装进美国食品药品监督管理局（FDA）批准的聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物（PLGA）中，成功制备出了多功能纳米治疗剂 PLGA@AST/AXI。虾青素（AST）是一种红色的类胡萝卜素，因其独特的结构，两端的紫罗兰环极性区域与共轭碳骨架相结合，赋予了它卓越的抗氧化、抗炎、抗增殖和抗凋亡特性。在以往的研究中，AST 已被证实能够有效逆转线粒体氧化应激，修复受损的线粒体能量代谢功能，保护线粒体完整性，在神经退行性疾病的防治中展现出巨大的潜力。而阿西替尼（AXI）则是一种小分子酪氨酸激酶抑制剂，能够选择性地靶向血管内皮生长因子受体，发挥强大的抗血管生成作用 。

在研究过程中，AbMole 提供的科研产品为实验的顺利开展和机制的深入探究提供了有力支持。AbMole 作为专业的科研试剂供应商，其产品的高质量和高稳定性确保了实验数据的可靠性和准确性。在对纳米颗粒的各项性能进行研究时，AbMole 的相关产品用于精确检测和分析，帮助科研人员深入了解纳米颗粒的特性和作用机制，为后续的实验设计和结果分析奠定了坚实的基础。

为了制备 PLGA@AST/AXI 纳米颗粒，科研人员采用了乳液溶剂蒸发法。首先，将 0.5mg 虾青素（AST）和 1mg 阿西替尼（AXI）分别溶解在 0.2mL 二甲基亚砜（DMSO）中。随后，将这两种溶液加入到已充分溶解在 2mL 二氯甲烷（DCM）中的 10mg PLGA 中，并在磁力搅拌下混合均匀。接着，加入 4mL 5%（w/v）的聚乙烯醇（PVA）溶液，将混合物在 4°C 下超声处理 30 分钟，使其均匀分散在水溶液中。最后，加入 8mL 超纯水，搅拌过夜以蒸发有机溶剂，得到的纳米颗粒经过三次超纯水洗涤后，通过离心浓缩备用。同时，科研人员还采用相同的方法制备了仅负载 AST 或 AXI 的 PLGA 纳米颗粒，作为对照实验材料。

在制备出纳米颗粒后，科研人员对其进行了全面的表征分析。通过透射电子显微镜（TEM）观察发现，PLGA、PLGA@AST、PLGA@AXI 和 PLGA@AST/AXI 这四种纳米颗粒均呈现出均匀的分散状态。动态光散射（DLS）测量结果显示，它们的平均流体动力学直径分别为 70±0.45nm、60±0.42nm、100±0.50nm 和 114±0.48nm，与 TEM 观察到的粒径结果相符 。此外，这些纳米颗粒表面均带有负电荷，这主要归因于 PLGA 分子以及少量存在于颗粒表面的 PVA。通过紫外 - 可见吸收光谱（UV-vis）分析，科研人员确定了 AST 和 AXI 成功封装进纳米颗粒中，其最大吸收波长分别对应 AST 和 AXI 的特征吸收峰。

为了评估纳米颗粒中药物的负载情况和包封效率，科研人员将新鲜制备的 PLGA@AST、PLGA@AXI 和 PLGA@AST/AXI 纳米颗粒进行离心纯化和冻干处理，然后溶解在 DMSO 中，通过测量溶液在特定波长下的吸光度，计算出药物负载率（DL%）和包封效率（EE%）。结果显示，PLGA@AST/AXI 中 AST 的药物负载率为 4.23±0.15%，AXI 的药物负载率为 8.57±0.32%；AST 的包封效率为 87.21±0.29%，AXI 的包封效率为 79.63±0.25% 。

稳定性和药物释放性能是评估纳米治疗剂的关键指标。科研人员将 PLGA@AST/AXI 纳米颗粒置于 37°C 的水和磷酸盐缓冲液（PBS）中，发现其能够保持良好的稳定性。在药物释放实验中，将 Free AST/AXI 和 PLGA@AST/AXI 分别装入透析袋，置于含有 1% 聚山梨酯 20 的 PBS 溶液（pH 7.4）中，在 37°C 振荡条件下，定期取样测定药物浓度。结果表明，与 Free AST/AXI 的快速释放不同，PLGA@AST/AXI 表现出缓慢的药物释放特性，在两个月内，超过 80% 的 AST 和几乎全部的 AXI 从纳米颗粒中释放出来 。

在体内药代动力学研究中，科研人员将雌性 C57BL/6 小鼠随机分为两组，分别通过单次结膜下注射给予 Free AST/AXI 和 PLGA@AST/AXI（每只眼睛含 5μg AST 和 10μg AXI）。在注射后的第 1、3、7、30 和 60 天，分别处死小鼠，收集结膜和眼球组织，通过高效液相色谱（HPLC）测定 AST 和 AXI 的浓度。结果显示，PLGA@AST/AXI 能够在结膜中持续释放药物长达两个月，注射后 7 天，眼球内药物浓度达到峰值（AST 为 1.44μg / 眼，AXI 为 2.94μg / 眼），随后逐渐下降；而 Free AST/AXI 组的药物则迅速代谢，眼球内药物浓度远低于 PLGA@AST/AXI 组 。在兔子实验中，单次结膜下注射 PLGA@AST/AXI（每只眼睛含 125μg AST 和 250μg AXI）后，在第 3 天和第 7 天处死兔子，收集眼部组织进行检测，发现 AST 和 AXI 在视网膜 - 脉络膜组织中均能持续检测到，而 Free AST/AXI 组的药物则快速消失。这表明 PLGA@AST/AXI 能够将药物持续递送至视网膜 - 脉络膜区域，为治疗眼部后段疾病提供了可能。

为了验证 PLGA@AST/AXI 的生物相容性和细胞毒性，科研人员采用标准的甲基噻唑基四唑（MTT）法，评估了该纳米颗粒对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）、成人视网膜色素上皮细胞系 - 19（ARPE19）和人结膜上皮细胞（HConEpic）的相对细胞活力。结果显示，PLGA@AST/AXI 在浓度为 10μg/mL 时，能够显著抑制 HUVECs 的生长，而对 ARPE19 和 HConEpic 细胞在 72 小时的共培养后几乎没有毒性，证实了其良好的生物相容性，确定 10μg/mL 为后续细胞实验的合适剂量。

鉴于湿性 AMD 的发病与氧化应激、炎症和血管生成密切相关，科研人员分别从这三个方面对 PLGA@AST/AXI 的治疗效果进行了深入研究。

在抗氧化能力评估方面，科研人员采用 DPPH 法测定 PLGA@AST 的自由基清除能力。将不同浓度的 PLGA@AST 与新鲜配制的 DPPH 溶液混合，在黑暗条件下振荡 30 分钟后，测定 516nm 处的吸光度。结果显示，与未处理组相比，浓度为 160μg/mL 的 PLGA@AST 对自由基的清除率高达 89±4.6%，且在 0 - 160μg/mL 的浓度范围内，清除活性呈现出明显的浓度依赖性，充分证明了 PLGA@AST 强大的抗氧化能力 。为了进一步验证 PLGA@AST/AXI 的抗氧化效果，科研人员建立了体外湿性 AMD 模型，用 200μM H₂O₂处理 ARPE19 细胞模拟氧化应激环境，然后采用 DCFH-DA 法检测细胞内 ROS 水平。结果表明，H₂O₂处理后 ARPE19 细胞内 DCF 荧光强度显著增加，而 PLGA@AST/AXI 能够明显抑制 H₂O₂诱导的 ROS 产生，且抗氧化效果呈剂量依赖性。在无 H₂O₂处理的情况下，PLGA@AST/AXI 与 DCFH-DA 几乎无相互作用，荧光水平与未处理组和仅 DCFH-DA 处理组相当 。此外，通过伤口愈合实验和 Transwell 迁移实验，科研人员发现 PLGA@AST 和 PLGA@AST/AXI 能够促进 H₂O₂处理后的 ARPE19 细胞迁移，进一步证实了其抗氧化能力。

在炎症反应方面，科研人员用脂多糖（LPS）刺激原代巨噬细胞分化为促炎型 M1 巨噬细胞，然后将 PLGA@AST/AXI 及相关对照组（PBS、PLGA、PLGA@AST 和 PLGA@AXI）加入 M1 巨噬细胞中，培养 24 小时后收集上清液，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测关键促炎细胞因子（TNF-α、IL-6 和 IL-1β）的水平。结果显示，只有 PLGA@AST 和 PLGA@AST/AXI 处理组能够显著降低这些细胞因子的分泌，表明 PLGA@AST/AXI 具有强大的抗炎作用 。有趣的是，科研人员观察到含有 AST 的纳米药物处理细胞仅 2 小时后，细胞就变红，这说明 AST 能够轻易穿过细胞膜发挥作用。

在血管生成抑制方面，科研人员通过评估 PLGA@AST/AXI 对 VEGF 诱导的 HUVECs 迁移、侵袭和管形成的影响，研究其抗血管生成能力。实验结果表明，与对照组相比，PLGA@AXI 和 PLGA@AST/AXI 处理组的 HUVECs 迁移面积明显减小，穿过 Transwell 的细胞数量显著减少，管形成能力也被有效抑制 。统计分析显示，PLGA@AXI 和 PLGA@AST/AXI 处理组在管形成实验中的网格数、节点数和分支长度比例与其他组相比表现出优异的抗血管生成能力。

在体外实验取得良好结果的基础上，科研人员进一步在体内评估了 PLGA@AST/AXI 对湿性 AMD 的治疗效果。他们首先通过激光光凝法在雌性 C57BL/6 小鼠的眼睛中诱导脉络膜新生血管（CNV），建立湿性 AMD 小鼠模型。激光照射后一周，通过眼底荧光血管造影（FFA）、光学相干断层扫描（OCT）和组织学染色等方法，确认模型建立成功 。

随后，将 CNV 模型小鼠随机分为六组，分别接受不同的处理：（i）PBS 对照组；（ii）Free AST/AXI 组（每只眼睛含 5μg AST 和 10μg AXI）；（iii）PLGA@AST 组（每只眼睛含 5μg AST）；（iv）PLGA@AXI 组（每只眼睛含 10μg AXI）；（v）PLGA@AST/AXI 组（每只眼睛含 5μg AST 和 10μg AXI）；（vi）雷珠单抗（Lucentis）组（每只眼睛含 10μg，作为临床对照药物） 。通过单次结膜下注射给予不同制剂后，在不同时间点对小鼠进行 FFA、OCT 等检测。

FFA 结果显示，PLGA@AST/AXI 处理组在注射后第 1 周，CNV 渗漏的荧光强度显著降低，随着时间推移，病变面积几乎不可见。统计分析表明，PLGA@AST/AXI 处理组的 CNV 病变荧光强度与治疗前相比下降至仅 6.71%，而其他对照组（Free AST/AXI、PLGA@AST、PLGA@AXI 和 Lucentis 组）的平均荧光强度分别为 75.10%、64.58%、51.96% 和 19.59% 。OCT 观察结果显示，PLGA@AST/AXI 组的脉络膜和视网膜中 Bruch 膜的水肿面积与对照组相比显著减少，CNV 病变的纵向测量值也明显下降 。

为了直观观察眼底新生血管的协同治疗效果，科研人员对不同处理组小鼠的视网膜进行铺片，并使用血管标记物 IB4 进行染色。结果显示，PLGA@AST/AXI 处理组的新生血管显著消退，CNV 面积仅为健康组的 2.33 倍，远低于其他对照组 。H&E 染色结果也证实，PLGA@AST/AXI 处理组的 Bruch 膜明显增厚，水肿面积减少，进一步表明该纳米治疗剂在实验性湿性 AMD 小鼠模型中取得了良好的治疗效果 。

湿性 AMD 会导致光感受器细胞、RPE 细胞和脉络膜毛细血管逐渐死亡，引起中心视力进行性丧失。为了评估 PLGA@AST/AXI 对光感受器细胞功能的影响，科研人员通过视网膜电图（ERG）分析了不同处理组小鼠眼底光感受器细胞（视锥细胞和视杆细胞）的功能。在暗适应条件下，对小鼠进行 ERG 测量，结果显示，PLGA@AST/AXI 处理组在暗视阶段的 a 波和 b 波振幅与其他组相比显著增加，表明该纳米治疗剂能够有效恢复 CNV 小鼠的光感受器细胞功能，对湿性 AMD 具有良好的治疗效果 。

通过免疫荧光染色，科研人员进一步探究了 PLGA@AST/AXI 协同治疗湿性 AMD 的潜在机制。他们检测了炎症相关细胞因子（IL-1β 和 NF-κB）、RPE 细胞标志物（RPE65）和血管生成相关因子（VEGF）的表达水平。结果显示，PLGA@AST 和 PLGA@AST/AXI 能够显著降低 IL-1β 和 NF-κB 的表达，有效减轻激光诱导的 CNV 小鼠的炎症反应；PLGA@AST/AXI 处理组的 RPE65 平均荧光强度明显高于其他组，表明其在促进 RPE 细胞恢复方面具有良好效果；同时，PLGA@AST/AXI 处理组的 VEGF 检测水平最低，说明该纳米治疗剂能够更有效地抑制新生血管生成 。综合以上结果，PLGA@AST/AXI 通过中和过量 ROS、减轻炎症反应和抑制血管生成等多种作用机制，协同提高了对激光诱导的 CNV 小鼠的治疗效果。

在验证了 PLGA@AST/AXI 的治疗效果后，科研人员对其体内生物相容性进行了评估。将 2μL PBS 或 PLGA@AST/AXI（每只眼睛含 5μg AST 和 10μg AXI）单次结膜下注射到健康小鼠眼中，一个月后通过多种检测手段评估其对眼部组织的影响。

对小鼠眼睛进行 H&E 染色，结果显示，PBS 对照组和 PLGA@AST/AXI 处理组的角膜、虹膜、睫状体、晶状体、视网膜等眼部结构均保持正常形态，未观察到明显的炎症细胞浸润、组织损伤或异常增生现象，表明 PLGA@AST/AXI 不会引起眼部组织的急性病理改变 。进一步检测眼部相关的血液学指标，包括白细胞、红细胞、血红蛋白等，发现 PLGA@AST/AXI 处理组与对照组之间无显著差异，说明该纳米治疗剂对全身血液系统没有明显影响 。此外，通过检测肝肾功能相关指标，如谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、血尿素氮（BUN）和肌酐（CRE）等，结果显示 PLGA@AST/AXI 处理组与对照组相比均处于正常范围，表明其对肝肾功能无明显损害 。这些结果充分证实了 PLGA@AST/AXI 在体内具有良好的生物相容性，为其进一步的临床应用提供了重要的安全性依据。

这项研究的成功，不仅为湿性 AMD 的干预带来了新的策略，更展现了纳米技术在眼科疾病治疗领域的巨大潜力。PLGA@AST/AXI 纳米治疗剂凭借其独特的设计，实现了抗氧化、抗炎和抗血管生成的多重功能，为攻克湿性 AMD 这一难题提供了新的 “武器”。与传统的玻璃体内注射疗法相比，结膜下注射 PLGA@AST/AXI 具有微创、便捷、减少感染风险等优势，有望提高患者的治疗依从性和生活质量。