Fijacin biolgica de Nitrgeno.

(ltima Act. 08-02-2008)

Jos Olivares Pascual ([email protected])

Estacin Experimental del Zaidn, CSIC, Granada

Supuestas las necesidades de agua cubiertas, el nitrgeno es el factor

limitante ms importante para el desarrollo de las plantas que lo necesitan
para formar protenas, cidos nuclicos, etc. Dentro de los ciclos
biogeoqumicos de los elementos minerales, el del nitrgeno (Fig. 1) es
especialmente complicado por encontrarse, en condiciones naturales, en

distintos estados de valencia (de +5 a -3) formando compuestos estables.

Uno de estos compuestos, el nitrato, la forma ms usual tomada por la
planta, es clave en su nutricin y puede hallarse en el suelo derivado del
contenido mineral del mismo, de aquel que se pueda incorporar de la
atmsfera o de la biotransformacin de las moleculas orgnicas que lo
contienen formando parte de los restos vegetales y animales que all llegan o
de los propios microorganismos que lo habitan. La desnitrificacin, o
reduccin del nitrato hasta nitrgeno molecular o dinitrgeno, N2, es una
actividad microbiana importante, cuantitativamente considerada y por su
efecto contaminante del ambiente. Las prdidas de nitrgeno asimilable que
esta actividad conlleva son compensadas por la llamada fijacin de
nitrgeno, que se entiende como la oxidacin o reduccin de este elemento
para dar xidos o amonio. Todos los procesos del ciclo actan de forma que
en condiciones normales las diferentes actividades microbianas estan
equilibradas y las prdidas son compensadas por las ganancias. La masiva
utilizacin de fertilizantes nitrogenados est actuando sobre el ciclo con
claros resultados negativos, entre ellos contribuyendo al cambio climtico
(Nitrgeno y cambio climtico).

La fijacin de nitrgeno puede ser puramente abitica o biolgica. Por la

primera se forman xidos como consecuencia de la combustin de
compuestos orgnicos, descargas elctricas, etc., que son arrastrados al
suelo por la lluvia, o amonio por el proceso industrial Haber Bosch. Por la
segunda, la fijacin biolgica de nitrgeno (FBN), proceso llevado a cabo
por organismos procariticos, el N2 es reducido a amonio e incorporado a la
biosfera.
A pesar de la abundancia de N2 en la atmsfera (ms del 70 por ciento), no
es aprovechable por las plantas que se ven obligadas a utilizar las formas
combinadas que se encuentran en el suelo en cantidad insuficiente para
soportar los cultivos intensivos. Por lo que supone en el aporte de nitrgeno
a las plantas, la FBN presenta un gran inters que ha determinado que sea
considerada objeto de intensa investigacin desde que en 1888 fue
descubierta, aunque empricamente era aprovechada ya por los romanos
cuando observaron el efecto beneficioso de la rotacin de los cultivos
(Bosquejo histrico). No en vano la fijacin biolgica contribuye
globalmente de forma importante al suministro del nitrgeno requerido por
las plantas. El resto necesario procede casi en su totalidad del amonio
sintertizado va Haber Bosch con un gasto, para conseguir el H2 y la alta
temperatura y presin requeridas, del 1 % de la energa consumida a nivel
mundial. Hoy da la FBN cobra ms valor, si cabe, dentro del contexto de
la agricultura sostenible, ya que puede evitar el uso abusivo de fertilizantes
nitrogenados con el consiguiente ahorro en el consumo de energa y la
disminucin de la degradacin del medio. Desde este punto de vista
ecolgico, tambin es interesante sealar la importancia de la FBN en el
mar por la necesidad de nitrgeno asimilable disponible que requieren los
ocanos para actuar como sumideros del CO2 de la atmsfera.
Este proceso microbiano es llevado a cabo por organismos procariticos en
vida libre o en simbiosis, esto ltimo si ocurre en asociacin mutualista con
las plantas. Hay una gran representacin de especies microbianas
portadoras de esta caracterstica pertenecientes a muy diferentes grupos de
bacterias como se puede ver en la Tabla 1.
Se trata de un proceso altamente consumidor de energa. El triple enlace
que une los dos tomos de nitrgeno es duro de romper. El trabajo es
llevado a cabo por la enzimanitrogenasa con el consumo de 16 molculas de
ATP por N2 reducido, segn la ecuacin:
N2 + 16ATP + 8e- + 8H+ = 2NH3 + 8H2 + 16ADP + 16Pi
Algunos fijadores libres, como Azotobacter, requieren hasta 100 unidades de
equivalentes de glucosa por unidad de nitrgeno fijado. Por ello su
significacin agrcola es baja, que se incrementa considerablemente en el
caso de la fijacin simbitica, como la establecida entre Rhizobium y las
leguminosa, donde la relacin disminuye de 6 a 12 unidades de glucosa
consumidas por unidad de nitrgeno reduido. En este caso, adems, la
fuente de energa son los compuestos carbonados suministrados
directamente por la planta derivados de lafotosntesis, mientras que los

fijadores libres han de tomarlos del suelo donde no existen en la cantidad y

forma necesarias. As de hecho, Azotobacter proporciona al suelo unos
cientos de gramos de nitrgeno por hectrea/ao y, en cambio, este valor
sube en la asociacin de Rhizobium con alfalfa, trbol, guisante o soja, a
unos cientos de kilos. A pesar de estas diferencias, la fijacin libre por s sola
representa a nivel global algo menos de la mitad del total de N2 fijado por
ao (Fig. 2), ya que la simbitica, aunque sea ms alta, est limitada a unas
pocas especies vegetales, entre ellas, las leguminosas de gran importancia
econmica y social.
Fig.2

Tal limitacin es un handicap a la hora del aprovechamiento

integral de este proceso biolgico, del que quedan fuera cultivos tan
importantes como arroz, maz o trigo. Esta es tambin la causa de
que se busque la forma de que estas especies vegetales,
fundamentales en alimentacin humana, puedan llegar a utilizar el
N2 y hacerse
independientes
de su
aplicacin
como
fertilizante.
Junto al
inters que
esta
posibilidad
tiene y que ha
determinado la
dedicacin de
numerosos
grupos a su
estudio, dos
hechos han
determinado el avance de los conocimientos sobre la FBN desde los
aos 70. Por un lado, la introduccin para su deteccin y medida de
la tcnica de la reduccin de acetileno a etileno (ARA), basada en la
capacidad de la nitrogenasa de reducir compuestos de triple enlace
(algo sobre evolucin) y, por otro, la aplicacin a las investigaciones
en curso de las herramientas propias de la biologa molecular.
La determinacin de ARA permiti hacer medidas de la actividad
enzimtica fidedignas con un simple cromatgrafo de gases,
eliminando la nunca precisa observacin del crecimiento
bacteriano en medios de cultivo libres de nitrgeno o la poco

asequible espectrometra de masas para determinar la

incorporacin de 15N2. Esta ltima tcnica es muy usada en los
experimentos que se realizan para conocer el nitrgeno de la planta
que procede de la atmsfera o del suelo y/o fertilizante aplicado,
especialmente en ensayos de campo.
Los estudios genticos, por otra parte, demostraron la implicacin
directa en la fijacin de unos veinte genes, nif, en el caso de los
fijadores libres (Figura 3 y regulacin) y de bastantes ms en los
simbiticos, como Rhizobium, ya que el establecimiento de la
simbiosis mutualista con la planta conlleva una complicacin
adicional. En la Fig. 3 se
Fig.3
muestran los
genes nif de Klebsiella pneu
moniae, enterobacteria
capaz de fijar N2 en
anaerobiosis. Las
asequibilidad de esta
bacteria y la especial
distribucin de esos genes
en su genoma ha facilitado
considerablemente el
estudio molecular del
proceso y la transferencia
de los conocimientos a
otros sistemas fijadores.
Aunque todos los organismos y
sistemas fijadores son
susceptibles de ser aprovechados
en agricultura, y de hecho se
puede encontrar en la
bibliografa referencias al
respecto, hay algunos ms tiles que otros, no slo por la eficiencia del
proceso y por los niveles de nitrgeno que incorporan, sino tambin, por
el inters de los cultivos susceptibles de ser tratados. Los sistemas
potencialmente ms tiles, como se ha dicho arriba, implican, de una
forma ms o menos ntima, un hospedador con el que la bacteria
establece la asociacin beneficiosa.
Entre ellos, un primer sistema recoge lo que se llaman rizocenosis
asociativas, por no formarse en la asociacin microbio-planta estructuras
especializadas en las races. Entre estas asociaciones se encuentra la
formada por plantas C4 del tipo maz o caa de azucar
y Gluconacetobacter, Azoarcus, Herbaspirillum o Azospirillum. Aqu la

bacteria fija nitrgeno a expensas del exudado radical que

aprovecha muy bien al colonizar los espacios intercelulares del
cortex de la raz. Aunque estas asociaciones han dado mucho que
hablar, pues se ha asociado siempre la mayor produccin vegetal a
la fijacin de N2, por lo menos, en el caso de Azospirillum, est
demostrado que el efecto beneficioso de la asociacin es debido
mayoritariamente a la capacidad que posee la bacteria de producir
fitohormonas que determinan un mayor desarrollo del sistema
radical y, por tanto, la posibilidad de explorar un volumen ms
amplio de suelo. As como Rhizobium est evolutivamente
especializado en proporcionar nitrgeno a la planta cuando se
encuentra asociado a ella (las formas bacterianas que fijan
nitrgeno en los ndulos, los llamados bacteroides, no se
multiplican por lo que todo el nitrgeno fijado es traspasado al
hospedador), el N2 que fijan estas otras bacterias no es exportado y
solamente puede ser aprovechado despus de su muerte y lisis y
una vez que haya sido mineralizado. Pero, aunque estas bacterias
no se puedan usar en la prctica como fijadoras, hay estudios que
demuestran su utilidad en inoculaciones conjuntas, conRhizobium o
solas como PGPRs (rizobacterias que promueven el crecimiento
vegetal).

En un segundo sistema intervienen cianobacterias y algunas plantas entre las que ciertos hele
importante en la fertilizacin de los cultivos de arroz. Aunque las cianobacterias estan provist
especiales dirigidas a la convivencia de la fijacin, proceso anaerobio, con la fotosntesis. En u
de nitrgeno combinado en los llamados heteroquistes donde no hay fotosntesis y s fijacin d
a estos cultivos pueden hacer al arroz bastante independiente de la fertilizacin nitrogenada.
especialmente en el Sudeste asitico. En otros casos, como en Gleothece o Synechococcus, la fi
realizandose la fotosntesis de da y la fijacin en la noche.
Fig. 4a
Fig.4b

Dentro de un tercer sistema, que encuadra las endorrizobiosis

mutualistas, se encuentran la conocida como actinorriza, que se

establece entre Frankia, un actinomiceto, y algunas plantas leosas,
como el aliso o la casuarina, y la asociacin Rhizobium-leguminosa
que, como se ha indicado ms arriba, es la que tiene ms
importancia desde el punto de vista agronmico. Ha sido y es la
ms estudiada y se toma como modelo para una posible extensin
de la capacidad fijadora a otros cultivos. Adicionalmente, el papel
del uso de leguminosas arbustivas en la recuperacin o
regeneracin de suelos degradados es de resear y donde
las micorrizas tienen tambin una gran importancia.
Si bien estas bacterias, de la subclase a de las proteobacterias, se
engloban colectivamente bajo el trmino genrico de Rhizobium,
pertenecen a los gneros Rhizobium,Sinorhizobium, Allorhizobium,
Bradyrhizobium, Mesorhizobium y Azorhizobium (Tabla 2).

La mayora de las especies

de la
familia Leguminosae forma
n esta asociacin, y es
Fig.5
especialmente frecuente en
las
subfamilias Papilionoideae
y Mimosoideae y escasa
en Cesalpinoideae. En las
races de estas plantas
aparecen cuando son
infectadas
por Rhizobium unas
tumoraciones de distinta
forma y tamao, ndulos
(Figura 5), donde se lleva a
cabo la fijacin de N2.

En unos pocos ejemplos (en las leguminosas Sesbania y

Aechynomene) tambin se forman ndulos en los tallos. Algunas de
las bacterias son bastantes especficas con posibilidad de infectar y
nodular un reducido nmero de especies vegetales. Otras son ms
promiscuas. En cualquier caso, la capacidad de infectar las clulas
del cortex de la raz se deriva de un intercambio de seales entre el
microsimbionte y el hospedador. Flavonoides exudados por las
plantas inducen la expresin en Rhizobium de los genes nod (Figura
6) implicados en la sntesis de los conocidos como factores de
nodulacin o, simplemente, factores nod.

En lineas generales, cada leguminosa libera al medio unos

determinados inductores (p. e. la alfalfa, luteolina y la soja
genisteina) que la bacteria reconoce y la lleva a sintetizar el factor
nod correspondiente, que est constituido por un esqueleto de 4 a 5
N-acetil glucosaminas con bastantes sustituciones que determinan
la especificidad. Estos factores, que se conocen tambin por su
composicin como lipoquitooligosacridos (LCOs), determinan
modificaciones en los pelos radicales, la formacin del canal de
infeccin y la divisin de clulas del cortex, que conducen a la
formacin del ndulo en cuyo interior, perfectamente estructurado,
se va a llevar a cabo la fijacin (Fig. 7).

Al ndulo llega el fotosintetizado, en forma de sacarosa, para

soportar el proceso. Servir de fuente de energa, poder reductor y
esqueleto carbonado para la incorporacin del amonio resultante
de la fijacin, que ser transportado por el xilema al resto de la
planta en forma de amidas o ureidos, segn el hospedador sea de
origen templado o tropical (Fig. 8). Aunque por mucho tiempo se
ha creido que el amonio producido era transferido a la clula
hospedadora por simple difusin pasiva, y as muestra esta figura,
se ha descrito que tan pronto como el amonio aparece se convierte
en alanina y de esta forma es transportado fuera de la bacteria.
Por qu alanina? Se especula que esto impide la utilizacin del
amonio por la propia bacteria. Una vez fuera este aminocido es
convertido rpidamente en glutamato para su transporte como
amidas y/o ureidos al resto de la planta. Sin embargo, la
implicacin de la alanina, aunque llamativa, es una hiptesis
actualmente muy controvertida (metabolismo del carbono y
nitrgeno en el ndulo).

Esta
fijacin

Fig. 8. Esquema de funcionamiento de un ndulo

simbtica puede considerarse bastante eficiente, sin embargo, parte de la

energa consumida en el proceso se gasta en reducir protones a hidrgeno,
(como se puede ver en la ecuacin mostrada al comienzo), reduccin
concomitante con el paso de N2 a amonio, que hace que la fijacin sea un
terico 25 por ciento menos eficiente. Hay cepas microbianas provistas
de hidrogenasa capaces de reciclar el hidrgeno y recuperar la energa
perdida, y a otras se les podra transferir los genes responsables de este
caracter.
Entre los numerosos genes de la planta que de una u otra manera estn
relacionados con la simbiosis, y descritos especialmente en Lotus
japonicus y Medicago truncatula, leguminosas que se han tomado como
modelo dado su simplicidad genmica, hay algunos de funcin conocida,
como LjSYMRK/MtNORK/DMI2, que codifican una quinasa que
inicialmente se pens podra ser el receptor de la seal bacteriana, o
PsSYM8/DMI1 implicados en los pulsos de calcio. Algunos de estos genes
tienen que ver en la formacin de las micorrizas. Tambin se han descrito
otros genes, como HAR1 (en L. japonicus), Sym29 (Pisum sativum) o
NARK (soja) que codifican protenas homlogas a CLAVATA1
deArabidopsis. Estos genes estan implicados en la regulacin de la
nodulacin, en lo que se conoce como autorregulacin, que limita el
nmero de ndulos que se pueden formar en las races. Es curioso que
mientras la expresin de CLV1 tiene un efecto a corta distancia, sobre el
crecimiento apical del tallo, la expresin de los otros, si bien ocurre en
tallo y hojas, se manifiesta a larga distancia sobre la formacin de
primordios de races laterales y ndulos. Mutantes en estos genes son
hipernodulantes, lo que no es til para la planta teniendo en cuenta la
limitacin energtica a que est sometida la fijacin. Un paso importante
supuso la obtencin del primer mutante de M. truncatula que no responde
al factor nod con la deformacin de los pelos radicales ni flujo de calcio.
Este mutante (npf) es capaz, sin embargo, de establecer simbiosis con
hongos de la micorriza, por lo que el locus NPF (Nod Factor Perception)
est implicado de forma especfica en la percepcin del Factor nod, al

contrario que otros descritos previamente comunes a ambas

simbiosis (DMI1, DMI2, DMI3) responsables de la transduccin de
la seal. Estos genes necesarios para la percepcin de los factores
nod se conocen como NFR1, NFR5, en L. japonicus y LYK3 y LYK4
en M. truncatula, y codifican quinasas transmembranas del tipo
LysM serina/treonina cuyos dominios extracelulares podan ligar
dichos factores. La Fig. 9 representa esquemticamente algunos de
los genes implicados en el proceso de nodulacin descritos hasta
ahora. Esta representacin (para ms detalles ver Fig. 14 de Futuro
de la FBN) no es una foto fija pues de vez en cuando se incorporan
nuevos genes a la cadena.
La secuenciacin a punto de concluir de los genomas de L.
japonicus y M. truncatula facilitar considerablemente las cosas, de
tal forma que se podr tener idea de los genes que estn ausentes o
no se regulan adecuadamente en plantas no leguminosas de inters
agronmico, para que sean capaces de establecer una simbiosis
efectiva con Rhizobium y as hacerse independientes de la
fertilizacin nitrogenada.
Hay otras luces en el tnel: la observacin de que los factores nod
pueden activar el gen MtENOD12, que codifica una nodulina
temprana de M. truncatula, en plantas transgnicas de arroz (Oryza
sativa) sugiere tambin que al menos parte de los mecanismos de
percepcin/transduccin pueden operar en plantas no leguminosas.
De hecho, Rhizobium es capaz de nodular la no
leguminosa Parasponia andersonii, perteneciente a las ulmaceas.
Hay tambin muchas similitudes entre el proceso de floracin y
nodulacin, incluso en el desarrollo del canal de infeccin en su
marcha hacia el primordio nodular y el tubo polnico en su avance
hacia el vulo. Se puede afirmar que la nodulacin ha utilizado
mecanismos preexistentes en las plantas que han derivado a la
simbiosis Rhizobium-leguminosa a lo largo de la evolucin.
Recientemente se ha descrito, incluso, que no todas las bacterias
que fijan nitrgeno en simbiosis con las leguminosas requieren la
produccin de factores nod. La activacin de genes de la planta
implicados en el reconocimiento de las citoquininas lleva
igualmente a la formacin de ndulos.

Fig. 9
Esta simbiosis mutualista, que se puede tomar como paradigma de
la aplicabilidad de la fijacin de nitrgeno, es la que presenta
mayor inters a la hora de hablar de biofertilizacin, t rmino que
se define como la utilizacin de microorganismos vivos para
mejorar el crecimiento de las plantas, bien incidiendo sobre su
nutricin a travs de la puesta a su disposicin de los nutrientes
requeridos, bien actuando sobre su desarrollo por la produccin de
fitohormonas. En paralelo se utiliza biocontrol y biorremediacin
cuando con la inoculacin de microorganismos se quiere eliminar
los patgenos del medio o incrementar la respuesta defensiva de la
planta hacia ellos o eliminar compuestos xenobiticos del ambiente,
respectivamente. La utilizacin de inoculantes para las leguminosas
es fundamental si la especie vegetal no ha sido cultivada en ese
suelo y, por tanto, no hay presencia de la especie
de Rhizobium correspondiente. Este es el caso de la soja en Europa
que ha de ser inoculada con B. japonicum o S. fredii. Sin embargo,
an cuando existen en nuestro suelos las bacterias apropiadas para
vicias, alfalfa, trboles, guisante, lenteja, garbanzo, etc., no siempre
son lo suficientemente efectivas, esto es fijadoras de nitrgeno, y

hay casos en los que se hace necesaria la inoculacin si se quieren

obtener rendimientos satisfactorios. Lo mismo ocurre cuando las
caractersticas del suelo, como la acidez, sequa, etc. influyen en la
persistencia de Rhizobium. En las Fig. 9 y 10 se exponen ejemplos
de inoculacin a distintas escalas.

Fig.1
0

Fig.
11
Las leguminosas que nodulan nunca se encuentra en condiciones
naturales sin formar la simbiosis con sus bacterias presentes en el
medio. En un suelo donde no sea posible la infeccin de la planta
por ser una especie vegetal nueva implantada en el lugar, el
rendimiento del cultivo no es superior al 40 por ciento potencial.
Con la inoculacin se puede llegar hasta el 80 por ciento, el 20 por
ciento restante slo se conseguir con manipulacin gentica y el
manejo adecuado de la simbiosis. Los intentos de utilizar
fertilizante nitrogenado para incrementar el rendimiento, aparte
del costo econmico que supone, inhibe el establecimiento de una
simbiosis efectiva y, por tanto, el aprovechamiento del N2. No hay
que desconocer que la FBN est sometida, por diferentes
mecanismos, a una estricta regulacin por nitrgeno combinado en
el medio. La nutricin nitrogenada de las leguminosas es, por otra
parte, ms complicada que en otras plantas. La aplicacin de
nitrgeno en forma de nitrato o amonio no mejora el rendimiento
frente a la fijacin. Determina un alargamiento del ciclo vegetativo

que puede redundar en una drstica disminucin de la cosecha. Las

leguminosas no han sido mejoradas en este sentido, al contrario
que los cereales. La capacidad del trigo silvestre para usar
nitrgeno es muy reducida, slo los cultivares modernos dan una
respuesta proporcional, entre ciertos lmites, al nitrgeno aplicado.
El suministro continuado de nitrgeno derivado de la fijacin va
cubriendo las necesidades del hospedador, por lo menos hasta la
fructificacin, cuando el fotosintetizado en lugar de ir hacia la raz
deriva al llenado del fruto. Una prctica til con buenos resultados
es aplicar en floracin nitrgeno combinado de rpida absorcin.
En este momento el nitrogeno aplicado no tiene efecto negativo
sobre la fijacin porque sta ya se ha detenido por falta de fuente
energtica y los ndulos han entrado en senescencia.
En el caso concreto de Rhizobium, los inoculantes deben de estar
constituidos por cepas seleccionadas por su infectividad,
competitividad (posibilidad para nodular en presencia de las cepas
nativas normalmente menos funcionales), y capacidad para fijar
nitrgeno en simbiosis con la especie vegetal correspondiente. En
todos los inculos, sean del tipo que sean, sera adems deseable,
que las cepas que los constituyen estuvieran provistas de alguna
estrategia por la que desaparecieran del ambiente una vez
cumplida su mision o se impidiera la transferencia gentica
horizontal para salvaguardar la biodiversidad de la microbiota del
medio. La eliminacin del inculo o el control de la transferencia
gentica deben ser tenidas en cuenta fundamentalmente cuando se
trate de inoculantes preparados con organismos modificados
genticamente (OMG), obtenidos con vistas a incrementar algunas
de sus propiedades. En el caso de Rhizobium, por ejemplo, la
capacidad de fijar nitrgeno de una manera ms eficiente (por la
presencia de hidrogenasa) o la resistencia a condiciones adversas:
salinidad, sequa, pH bajo, presencia de pesticidas, etc. (ver Futuro
de la FBN)
En esta simbiosis mutualista tampoco hay que olvidar la planta.
Aunque ms difcil de estudiar que la bacteria, ya se conocen genes
del hospedador directamente implicados en el establecimiento de
una simbiosis efectiva con Rhizobium, as como algunas de las
protenas, llamadas nodulinas, codificadas por ellos. Mutaciones en
muchos de estos genes, conocidos como Sym, bloquean la
nodulacin en diferentes etapas de su desarrollo, y unos cuantos
parecen ser comunes con la micorrizacin. Todos estos
conocimientos se aplican a conseguir la extensin de la capacidad
fijadora a otras plantas no leguminosas de inters. Junto a la
alternativa de lograr que el maz, el trigo o el arroz sean infectados

de forma eficiente por Rhizobium, se presenta la posibilidad de

transferir la capacidad fijadora a estas plantas de tal forma que
sean capaces de aprovechar el N2 por s mismas. Todava hay que
salvar muchos obstculos, tanto en una como en otra variante, pero
no es aventurado afirmar que es cuestin de tiempo. Hay que decir,
sin embargo, que no todo es ptimo en la obtencin de plantas
autosuficientes para el nitrgeno, pues aunque los cultivos no
tendran que ser fertilizados seran menos productivos. El costo
energtico que supone la fijacin llega a ser hasta tres veces ms
alto que la utilizacin del nitrato por lo que las plantas creceran
menos, el rendimiento sera ms bajo y puede que incluso se
redujera el rea de cultivo, pero esa independencia de la
fertilizacin nitrogenada hara el cultivo posiblemente ms
rentable, adecuado para zonas economicamente dbiles y
ambientalmente ms limpio (Perspectivas).
Mientras tanto y como resumen prctico, la seleccin de cepas y su
adecuada manipulacin gentica para preparar los inoculantes ms
idoneos y la mejora de la planta para que no sea factor limitante en
el establecimiento de la correspondiente simbiosis, son objetivos a
corto plazo.
Recientemente se ha descrito que especies de Methylobacterium,
Burkholderia y Ralstonia (hoy da Wautersia) entre
otras proteobacterias, pueden nodular leguminosas tropicales y
establecer con ellas simbiosis efectivas. Este hallazgo, todava por
explotar, parece interesante por lo que puede suponer para la
ampliacin natural de las simbiosis fijadoras a otros
microorgansmos distintos de Rhizobium, y quin sabe, si con eso
facilitar la extensin de esta caracterstica a otras especies vegetales
fuera de la leguminosas.
Bibliografa para consultar:
- Gonzlez-Lpez, J. Lluch, C. Interaccin plantamicroorganismo: metabolismo del nitrgeno. Ed. Rueda SL.
Madrid. 1992.
- Leigh, G.J. Nitrogen fixation at the millennium. Elsevier Science.
London, RU (2002)
- Morot-Gaudry, J.F. Nitrogen assimilation by plants.
Physiological,biochemical and molecular aspects.
Science Publisher Inc. Plymouth, RU, 2001.
- Postgate, J. Nitrogen Fixation, Cambridge University Press,
Cambridge, RU, 1998.

- Spaink, H.P., Kondorosi, A., Hooykaas, P.J.J. The Rhizobiaceae,

Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Holanda. 1998.
- Sprent, J.I. Nodulation in legumes. Royal Botanic Gardens, Kew,
RU. 2002.
- Triplett, E.W. Prokaryotic Nitrogen Fixation, Horizon Scientific
Press, Wymondham, Norfolk, RU, 2000.
- Leigh, G.J. The world's greatest fix: a history of nitrogen in
agriculture. Oxford University Press. 2004 .
- Palacios, R. , Newton, W.E. Genomes and genomic of nitrogen
fixing organisms. Springer, Dordrecht, Holanda. 2005.
- Bedmar, E.J., Gonzlez, J., Lluch, C., Rodelas, B. Fijacin de
nitrgeno: Fundamentos y aplicaciones. Sociedad Espaola de
FijacindeNitrgeno (SEFIN), Granada 2006.
- Jones. K.M., Kobayashi, H., Davies, B.W., Taga, E., Walker, G.C.
How rhizobial symbionts invade plants: the SinorhizobiumMedicago model. Nature Rev. 5, 619-633 (2007)
- Sprent, J.I. Evolving ideas of legume evolution and diversity: a
taxonomic perspective on the occurrence of nodulation. New.
Phytol. 174, 11-25 (2007)
En Espaa este proceso biolgico es estudiado bajo diferentes puntos
de vista por varios grupos: en el Consejo Superior de Investigaciones
Cientficas (Centro de Ciencias Medioambientales, Estacin
Experimental Aula Dei, Estacin Experimental del Zaidn, Instituto de
Bioqumica Vegetal y Fotosntesis, Instituto de Recursos Naturales y
Agrobiologa de Salamanca), en las Universidades: Autnoma de
Madrid (Dpto. de Biologa), Crdoba (Dpto de Bioqumica y Biologa
Molecular), Granada (Dptos. de Biologa Vegetal y Microbiologa), La
Laguna (Dpto. Microbiologa y Biologa Celular), Navarra (Dpto. de
Fisiologa Vegetal), Politcnica de Madrid (Dpto. de Biotecnologa),
Pblica de Navarra (Dpto. de Ciencias del Medio Natural), Salamanca
(Dpto. de Microbiologa), San Pablo (CEU), Sevilla (Dptos. de
Microbiologa y Parasitologa y de Microbiologa), CIFA (Las Torres y
Tomejil).

Enlaces de inters:
www.toulouse.inra.fr/6enfc
www.ugr.es/~eianez/
www.chasque.net/microlab/
www.cifn.unam.mx

www.fund-culturadepaz.org
www.ugr.es/local/sefin
Agradecimientos: se agradece la colaboracin de los miembros del
Grupo de Investigacin, de Francisco Gutirrez, de la asistencia de
Francisca Gonzlez y, especialmente la de Javier de la Fuente,
webmaster de esta pgina.

Azospirillum es un gnero de bacterias de la subclase alfa proteobacteria dentro de la

familia Rhodospirillaceae que son diazotrofs asociados con las plantas. Se considera que es
uno de los rizobacteris que promueven el crecimiento de las plantas (Plant growth-promoting
rhizobacteria, PGPR). Tiene aplicaciones en la agricultura y adems es unorganismo
modelo en la gentica de las bacterias asociados con las plantas en general.Se utilizan
como abono biolgico ( biofertilizante ).
La primera especie del gnero Azospirillum fue aislada por parte de Martinus Beijerinck(1925)
de suelos pobres en nitrgeno de los Pases Bajos y originariamente recibi el nombre
de Spirillum lipoferum. Ms tarde esta bacteria fue aislado por Schroder (1932) del suelo y de
algas marinas secas en Indonesia . Luego se descubri que se encontraba ampliamente
distribuido en la rizosfera de varias de las hierbas tropicales. Desde entoncesAzospirillum se
aislado de numerosas gramneas silvestres y cultivadas, cereales yleguminosas de climas
tropicales, subtropicales y templados de todo el mundo.

Ver imagen grande

El gnero Azospirillum

Jess Caballero-Mellado

Programa de Ecologa Molecular y Microbiana, Centro de Investigacin sobre Fijacin

de Nitrgeno, UNAM, Ap. P. 565-A, Cuernavaca, Mor., Mxico.

Historia
An cuando Spirillum lipoferum fue descrito en 1925 por Beijerinck, esta bacteria
estuvo olvidada por varias dcadas. Son las observaciones de Pea-Cabriales y
Dbereiner en 1973 (50) las que iniciaran la poca moderna de esta bacteria. Estudios
taxonmicos de S. lipoferum (88, 89) conducen a su reclasificacin en un gnero
nuevo, Azospirillum (166).
Actualmente son reconocidas seis especies en el gnero Azospirillum. Las dos primeras
en ser descritas fueron A. lipoferum y A. brasilense (166), siendo stas las mas
ampliamente estudiadas. Posteriormente fueron descritas las especies A.
amazonense (105), A. halopraeferans (141), A. irakense (85) y A. largomobile (26)
siendo el nombre de esta especie corregido a A. largimobile (158). Pocos aos antes sta
especie fue considerada como un sinnimo de la especie A. lipoferum (57).
Recientemente, en honor de quien impulsara los estudios con este gnero bacteriano y
descubriera otros diaztrofos, se ha propuesto la especie candidata A.
doebereinerae (70).
Pocos aos despus del redescubrimiento de Azospirillum y hasta alrededor de 1993,
este gnero fue el ms estudiado entre las bacterias asociadas a plantas. La capacidad
de Azospirillum para estimular el crecimiento de las plantas y de aumentar el
rendimiento de los cereales promovi numerosos estudios sobre la ecologa, fisiologa y
gentica de esta bacteria. En la actualidad su uso comercial comienza a extenderse en
diferentes pases, includo Mxico.
Aislamiento
El aislamiento de las bacterias del gnero Azospirillum resulta en lo general muy simple,
ya sea a partir de suelo rizosfrico o de la superficie de las races (rizoplano) de
numerosas plantas hospederas. Tambin se le aisla del interior de las races o tallos de
algunas plantas. El medio de cultivo usado por excelencia para el enriquecimiento de las
especies de Azospirillum ha sido el NFb semigelificado "libre" de nitrgeno y con
malato como fuente de carbono (52). No obstante, en este medio de cultivo son aisladas
predominantemente cepas de las especies A. lipoferum y A. brasilense. El medio NFb
con algunas modificaciones en su composicin y pH permiten el aislamiento
predominante de otras especies de Azospirillum (51). Estos medios son usados
frecuentemente para evaluar la actividad reductora de acetileno, como indicativo de la
fijacin de nitrgeno. Tubos en los cuales se observa el crecimiento bacteriano en forma
de sombrilla, la cual se transforma en una pelcula blanca y densa abajo de la superficie
del medio de cultivo, y vire del indicador azl de bromotimol son considerados
tentativamente como positivos para el aislamiento en cultivo puro de la bacteria.
El cultivo puro se logra en diferentes medios de laboratorio (126), siendo muy
comunmente usado un medio adicionado del colorante rojo Congo (146), en el cualA.
lipoferum y A. brasilense toman un color rojo escarlata que permite la diferenciacin de

otros gneros bacterianos. Aun cuando el medio BLCR fue diseado para mejorar el
aislamiento de cepas de Azospirillum brasilense (20), su uso no fue aceptado por
haberse demostrado que no era apropiado para el estudio de poblaciones naturales de
esta bacteria (73). Posteriormente se observ que la concentracin de estreptomicina
usada (200 mg/litro) en el medio BLRC era inhibitoria del crecimiento de un gran
nmero de cepas (103).
Adems de los medios y mtodos descritos, tambien existen reportados algunos medios
de cultivo y mtodos para el crecimiento de Azospirillum en cultivo puro y en
asociacin con plantas, as como para su conservacin (2, 126).
Identificacin
El gnero Azospirillum pertenece a la subclase alfa de las proteobacterias (181),
siendo A. lipoferum la especie tipo (166). Caractersticas tiles en la identificacin
rutinaria son la forma vibroide, el pleomorfismo y su movilidad en espiral (51). Las
clulas contienen cantidades elevadas de poli--hidroxibutirato (PHB), hasta 50% del
peso seco celular (124), observndose al microscopio las clulas jvenes con
abundantes granulos refringentes. En cultivos semigelificados y gelificados con mas de
24 h de incubacin se presentan frecuentemente clulas refringentes con forma ovoide y
de paredes gruesas similares a quistes (96). Una de las caractersticas fenotpicas ms
ampliamente usada como criterio para el reconocimiento tentativo del
gnero Azospirillum es el color rojo escarlata que toman las colonias (Fig. 1) al crecer
en un medio adicionado del colorante rojo Congo (146). No obstante, en este medio
pueden hallarse colonias mutantes de Azospirillum de color blanco debido a la
incapacidad de producir polisacridos no identificados (25).
Diversas pruebas bioqumicas y fisiolgicas son utilizadas rutinariamente para el
reconocimiento de las especies de Azospirillum. En la Tabla 1 se presentan algunas
caractersticas fenotpicas que contribuyen a diferenciar las especies de Azospirillum.
Adicionalmente, la diferenciacin de especies del gnero Azospirillumse logra
evaluando la capacidad de usar diversos aminocidos y su efecto sobre la fijacin de
nitrgeno (68), recomendndose el uso de la histidina para la caracterizacin y
aislamiento selectivo de la especie A. lipoferum.
Los patrones de protenas de membrana (8, 48), as como los patrones de protenas
celulares (141), determinados mediante electroforesis en geles de poliacrilamidadodecilsulfato (SDS-PAGE), permiten una clara diferenciacin de las especies A.
lipoferum, A. brasilense, A. amazonense y A. halopraeferens.
En forma complementaria para la identificacin fenotpica de las especies
de Azospirillum pueden ser usadas diversas tcnicas inmunolgicas. La aglutinacin en
tubo, tcnicas de precipitacin en capilar, inmunoelectroforesis (44, 46),
inmunofluoresencia e inmunodifusin (44, 93) fueron mtodos usados exitosamente en
la identificacin y numeracin de Azospirillum spp. El uso de la tcnica de ELISA

(Enzyme-Linked Immnunosorbent Assay) permite la identificacin y numeracin

especfica de cepas de Azospirillum, como fue demostrado con la cepa Cd de A.
brasilense (99) permitiendo evaluar la capacidad de colonizacin de esta cepa en plantas
inoculadas.
La identificacin genotpica especfica al nivel de gnero y especies de Azospirillum se
logra en forma reproducible mediante el uso de sondas basadas en secuencias de los
genes 23S rRNA (86). Con los oligonuclotidos reportados se logra tanto la
identificacin especfica del gnero Azospirillum como de las especies A. lipoferum, A.
brasilense, A. amazonense, A. halopraeferens y A. irakense, mediante experimentos tipo
"dot blot". Estas sondas tambin pueden ser usadas para la deteccin in situ de las
especies de Azospirillum.
Alternativamente, la identificacin genotpica rutinaria de las especies de Azospirillum,
as como su deteccin, se logra fcilmente y en forma reproducible amplificando
mediante el uso de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) los genes 16S rDNA
[p. ej. usando las secuencias de los oligonuclotidos 27f (5'GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG) y 1495r (5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA)] y
cortando los productos amplificados con la enzima de restriccin AluI (63,66). Con esta
estrategia se obtienen fragmentos de tamaos especficos para cada especie
de Azospirillum, distinguibles fcilmente en geles de agarosa
Caractersticas genmicas
El genoma de cinco de las 6 especies de Azospirillum, excepto el de A. largimobile el
cual no fue analizado, es constitudo por varios megareplicones algunos de los cuales
son aparentemente lineares (107). El tamao global del genoma en las especies
de Azospirillum vara de un mnimo de 4800-kb en A. irakense a practicamente el doble,
9600-kb en A. lipoferum. En A. brasilense y A. amazonenze el tamao es alrededor de
7000-kb. El nmero de replicones vara entre cepas de A. brasilense, encontrndose
comunmente 7-8 replicones (33, 107) (Fig. 2) e incluso hasta 10 en A. lipoferum (107).
Sera de esperarse que uno de los replicones de gran tamao correspondiera al
cromosoma, pero interesantemente, en A. brasilense se mostr por primera vez que el
genoma de esta especie est constituda por mltiples cromosomas (33),
correspondiendo stos a replicones de alrededor de 600-kb, 1000-kb y 1700-kb. La
existencia de cromosomas mltiples en A. brasilense ha sido corroborada, pero se
reporta la existencia de un cromosoma extra de alrededor de 2500-kb (107). En las otras
especies de Azospirillum tambin se encontr que el genoma est constitudo por varios
cromosomas (107), confirmndose la hipotesis sugerida previamente (33) sobre la
multiplicidad de cromosomas en el gnero Azospirillum. Asi, el gnero Azospirillum se
suma al reducido grupo de bacterias [Agrobacterium tumefaciens (4), Brucella spp.
(79),Burkholderia cepacia (36), Rhodobacter spheroides (163), Vibrio
parahaemolyticus (180)] que presentan varios cromosomas en lugar de un solo
cromosoma circular.

Aspectos de la gentica de Azospirillum y de los genes que participan en la interaccin

con las races de las plantas, as como los involucrados en la fijacin, asimilacin y
regulacin de nitrgeno han sido revisados recientemente por Steenhoudt y
Vanderleyden (161).
La presencia de plsmidos es comn en A. lipoferum y A. brasilense, siendo sta una de
las primeras caractersticas genmicas reportadas para el gneroAzospirillum (Fig. 2).
En general cada cepa muestra un perfil plasmdico nico conformado por 1 a 6
plsmidos, con tamaos en el rango de 6- a 550-kb (59, 62,136). Aun cuando se
reportaron algunas discrepancias en el perfil de plsmidos, analizando incluso la misma
cepa (p. ej. Sp 7), la presencia de un plsmido de 90-Mda (llamado p90; aprox. 135-kb)
es comn entre las cepas de A. brasilense. Debido a que el p90 no ha podido ser curado
en A. brasilense, se considera que ste plsmido codifica funciones celulares esenciales
(41, 131). Adems de la presencia de plsmidos en cepas de Azospirillum, tambin fue
reportada la presencia de minicromosomas (179), y aunque su designacin fue hecha
solamente sobre la base de su gran tamao, 2775-kb aproximadamente, su presencia fue
confirmada solo recientemente (33, 107).
Con excepcin del p90, involucrado en la biosntesis de cido indol actico (84) y en la
adherencia a las races (41, 111) no se conoce la funcin de los otros plsmidos en las
especies de Azospirillum. No obstante, algunes genes como
los nodPQ o exoB y exoC han sido identificados en el p90 mediante ensayos de
hibridacin o complementacin gentica (113, 175). Recientemente ha sido identificado
el gen repA (origen de replicacin del plsmido) en el p90 de A. brasilense(173). El
mapa fsico del p90 fue constuido a partir del plsmido obtenido de la cepa tipo
de Azospirillum brasilense Sp7 (131).
Distribucin
Los azospirilla muestran una muy amplia distribucin geogrfica alrededor del mundo.
An cuando son mas abundantes en las regiones tropicales, tambin se les encuentra en
las regiones templadas, fras y desrticas (45, 52, 65, 169). En las regiones templadas
del sur de Brasil, los Estados Unidos y Kenia la presencia deAzospirillum es menor al
10% en las muestras analizadas (52). El pH del suelo juega un papel importante en la
presencia de las especies del gnero Azospirillum. Las especies de A. brasilense y A.
lipoferum se encuentran en mayor abundancia en suelos con valores de pH cercanos a la
neutralidad, an cuando a pH abajo de 5 se les encuentra en forma esporadica y no
logrndose su aislamiento de suelos con pH menor a 4.5 (52, 49, 120). Un estudio en el
que se evaluaron 23 tipos de suelos con caractersticas diferentes mostr que algunos
factores abiticos tales como porcentaje de arcilla, contenido de materia orgnica,
capacidad de retencin de agua y contenido de nitrgeno afectan positivamente la
sobrevivencia de A. brasilense (24), en tanto que el tamao de las partculas de arena y
especialmente la alta concentracin de carbonato de calcio afectan negativamente la

sobrevivencia de esta especie en ausencia de plantas. No obstante, la sobrevivencia

de A. brasilense en la rizosfera es independiente de la aridez del suelo.
Las bacterias del gnero Azospirillum han sido aisladas de la superficie de la raz de una
muy amplia variedad de plantas y de su rizosfera, incluyendo cereales como maz, trigo,
arroz, sorgo, avena (85, 91, 135, 94, 151, 156, 178), pastos forrajeros como Cynodon
dactylon (34, 121), Poa pratensis, Festuca arundinacea(162), de diferentes especies
de Pennisetum (87, 169) y Panicum (34, 103, 104, 169). Especies
de Azospirillum fueron aisladas incluso del henequn [Agave fourcroydes (103)], y
plantas cactceas que incluyen diferentes especies de Opuntia y Stenocereus (109, 138).
En algunos casos se logr confirmar el aislamiento deA. brasilense y A. amazonense de
semillas de pastos esterilizadas superficialmente (162). Aun cuando no fueron
identificados al nivel de especie, algunas cepas deAzospirillum fueron aisladas de
esporocarpos de los hongos ectomicorrzicos Hebeloma crustuliniforme, Laccaria
laccata and Rhizopogon vinicolor (100).
Ambiente rizosfrico
Aparentemente, una bacteria del suelo deber sobrevivir a las mltiples interacciones
que se presentan con la compleja comunidad microbiana que habita el mismo
microambiente, antes de que ocurra cualquier interaccin con las races de la planta. En
el inicio de una interaccin con las races de la planta hospedera, el microorganismo
especfico deber llegar a la superficie de las races, adherirse y multiplicarse para
colonizarla. Si la bacteria tiene la capacidad de invadir los tejidos internos, se
diseminar en el interior de la raz e incluso en otros rganos de la planta.
La adaptacin de Azospirillum al futuro ambiente rizosfrico probablemente se inicia
con la germinacin de la semilla, la cual exuda infinidad de compuestos orgnicos que
forman parte fundamental de la espermosfera. Posteriormente, la exudacin de
compuestos ser a travs de las races durante el desarrollo de la planta (43). Aun
cuando las especies de Azospirillum difieren en su capacidad para utilizar diferentes
compuestos como fuentes de carbono y nitrgeno, estas bacterias usan para su
crecimiento unos pocos mono y disacridos asi como alcoholes polihidroxilados, y
principalmente diversos cidos orgnicos tales como mlico y succnico y algunos
aminocidos (68, 166). Para el uso de diferentes fuentes de carbono, tanto A.
lipoferum como A. brasilense tienen todas las enzimas de la via de Embden-MeyerhofParnas y de la va de Entner-Doudoroff (108, 177), as como todas las enzimas del ciclo
de los cidos tricarboxlicos (108). Tanto A. lipoferum como A. brasilense tienen la
capacidad de crecer autotrficamente con H2 y CO2, proceso en el que participa la
ribulosa-1,5-difosfato carboxilasa (106,168). A pesar de que el uso de cido
poligalacturnico y pectina fue reportado en A. brasilense Sp7 (170, 171) y que se
detect actividad pectato liasa (167), existen evidencias contradictorias en cuanto al uso
de polisacridos por esta especie. A. brasilense puede metabolizar varios mono y
disacridos constituyentes de la pared celular de las races de Pennisetum

americanum (118). Sin embargo, estos autores no pudieron confirmar que la cepa Sp7
fuera capaz de usar cidos poligalacturnicos, o pectina, ni otros polisacridos tales
como xilanos, polipectatos y celulosa.
La riqueza en compuestos orgnicos en la espermosfera/rizosfera conduce a intensas
actividades e interacciones microbianas. Algunos estudios indican que la quimiotaxis a
los exudados de raz es uno de los factores que influyen en la llegada de los
microorganismos a la rizosfera (154). Tanto en A. lipoferum como en A. brasilense se
demostr una fuerte actividad quimiotctica hacia diversos azcares, cidos orgnicos y
aminocidos (13, 15, 71, 140), as como hacia compuestos aromticos (102) y exudados
radicales (5, 61, 71). La respuesta quimiotctica a diferentes fuentes de carbono es
variable dependiendo de la especie de Azospirillume incluso es cepa-especfica (140).
Tambin una respuesta hacia el oxgeno (aerotaxia) fue observada en A.
brasilense (14, 15). Zonas de baja concentracin en oxgeno fueron las preferidas por
las clulas bacterianas para su crecimiento y multiplicacin, siendo repelidas por altas
concentraciones de oxgeno y condiciones anaerbicas (14, 139). La aerotaxia parece
ser especialmente importante bajo condiciones de fijacin de nitrgeno, permitindole a
las clulas de Azospirillumalcanzar concentraciones de oxgeno lo suficientemente bajas
para que se exprese la actividad nitrogenasa. Se sugiere que tanto la respuesta quimio y
aerotctica son caractersticas que contribuyen en el proceso de colonizacin de las
races de las plantas, ya que el consumo de oxgeno durante el crecimiento activo de las
races enriquece el ambiente con sustratos orgnicos y genera gradientes de oxgeno al
consumirse ste durante la respiracin (112). No obstante, la colonizacin de la
rizosfera y la superficie o el interior de las races ser el resultado del enriquecimiento
selectivo de los microorganismos mejor adaptados a estos ambientes. Por ejemplo, la
capacidad para producir bacteriocinas por algunas cepas de A. brasilense y A.
lipoferum (129, 130, 157, 165) podra representar ventajas competitivas sobre las cepas
de estas especies o ntimamente relacionadas que sean sensibles a estas biomolculas.
Adems, la capacidad de producir siderforos (agentes quelantes del hierro) por algunas
cepas de A. brasilense (9, 155, 165) (Fig. 3) pudiera ser de gran importancia durante la
colonizacin del ambiente rizosfrico y de la superficie de las races al ejercer efectos
antagnicos contra otros miembros de la comunidad microbiana, incluyendo a
microorganismos deletreos o patgenos de las plantas (Fig. 4). Es concebible que en el
ambiente rizosfrico las especies de Azospirillum puedan ser antagonizadas. Alrededor
de la tercera parte de ms de 400 actinomicetos aislados de la rizosfera del centeno
fueron reportadas como antagonistas de Azospirillum spp. y A. lipoferum (92). Esta
actividad antagonista correlaciona con la alta sensibilidad de A. brasilense a los
antibiticos estreptomicina, tetraciclina y cloranfenicol (103) producidos por
actinomicetos del suelo, en comparacin a la elevada resistencia a los antibiticos del
tipo -lactmicos producidos por hongos. La expresin constitutiva de la actividad lactamasa fue observada entre numerosas cepas de A. brasilense (103). Estos resultados
sugieren que el antagonismo causado por hongos contra Azospirillum es limitado.
Tambin es concebible que se presenten efectos sinrgicos entre Azospirillum y otros
miembros de la comunidad rizosfrica. Por ejemplo, el filtrado de un cultivo

de Phialophora radicicola, hongo usado como agente de biocontrol, promueve el

crecimiento de A. lipoferum y A. brasilense (58). De manera similar, la interaccin
entre A. brasilense y Azotobacter chrococcum o Streptomyces mutabilis conduce a
incrementos de sus respectivas poblaciones en la rizosfera de trigo (53).
Diversas condiciones tales como el envejecimiento celular y la presencia de metales
pesados provocan que las clulas vibroides de Azospirillum cambien su morfologa y
tomen la forma de "quistes" (conocidos como formas C), conduciendo a la agregacin
celular y formando grumos visibles de gran tamao (19). Aparentemente, residuos de
arabinosa presentes en el exopolisacrido y en el polisacrido capsular estan
involucrados en la agregacin de A. brasilense (31). La agregacin y la formacin de
quistes mejora la sobreviviencia de Azospirillum, situacin en la que la acumulacin de
poli--hidroxibutirato (PHB) parece desempear una funcin importante al servir como
almacen de carbono y energa (125). Adems, diversas funciones fisiolgicas son
atribuidas al PHB, destacndose la mayor resistencia a la desecacin (96, 147, 148), a la
luz ultravioleta y al choque osmtico (164). Se ha sugerido que la formacin de quistes
pudiera desempear una funcin importante en la sobreviviencia de Azospirillum en el
ambiente rizosfrico, e.g., cuando los nutrientes son limitados, previo a la asociacin
con las races de la planta (164, 127). Recientemente, ha sido publicada una amplia
revisin sobre las caractersticas de A. brasilense en relacin con la agregacin celular
(29).
Interaccin con la planta
Probablemente, una vez que las clulas de Azospirillum se han adaptado a las
condiciones del ambiente rizosfrico y han logrado llegar a la superficie de las races,
debido a sus caractersticas quimio y aerotcticas, se iniciar el establecimiento de la
asociacin. Diferentes estudios han mostrado que A. brasilense tiene la capacidad para
adherirse a las races de plantas gramneas como el mijo (Pennsisetum purpureum)
y Digitaria decumbens (171), trigo (77), maz (61), as como a las races de plantas de
otras familias que incluyen al algodn y tomate (98), e incluso a superficies inhertes
como poliestireno y arena (22, 23, 98). La capacidad deAzospirillum para adherirse a las
races, al menos a las de mijo, es significativamente mayor que la mostrada por otras
bacterias de la comunidad rizosfrica
comoRhizobium, Azotobacter, Klebsiella o Pseudomonas, e incluso que E. coli (171).
La asociacin de Azospirillum con las races de las plantas se desarrolla en dos etapas
completamente independientes (111). La primera consiste en una adsorcin rpida, dbil
y reversible, la cual es dependiente de protenas de la superficie bacteriana del tipo de
las adhesinas en conjunto con la participacin del flagelo polar (40, 111). La segunda
fase consiste de un anclaje lento pero firme e irreversible que alcanza su mximo nivel
16 h despus de la inoculacin, el cual parece ser dependiente de un polisacrido
extracelular de Azospirillum (111). Los resultados de un estudio reciente sugieren la
posibilidad de que una protena de la membrana externa de Azospirillum participe en el
proceso de adherencia a las races de las plantas (31). El proceso de adherencia

de Azospirillum a las races de las plantas ha sido revisado recientemente (29). En

diversos casos se ha reportado la aparicin de material fibrilar que contribuye al anclaje
de Azospirillum a las races de diversas plantas (98, 171), describindose como esencial
para el anclaje a las partculas de arena (23). An en la actualidad, la naturaleza del
material fibrilar no ha sido elucidada (47, 161), aunque parece ser de origne bacteriano.
Recientemente se ha publicado una revisin sobre la capacidad de Azospirillum para
adherirse a superficies abiticas del suelo (18).
La inoculacin de diversas plantas con Azospirillum ha mostrado que los principales
sitios de colonizacin son las areas de elongacin celular y las bases de los pelos
radicales (98, 82). Slo algunas clulas de Azospirillum llegan a adherirse a la cofia o a
los pelos radicales (82). Sin embargo, fue observada la presencia deAzospirillum dentro
del mucigel que se acumula en la cofia (171). La inoculacin de races de trigo con una
cepa de Azospirillum que expresa constitutivamente el gen reportero gusA mostr que
en los primeros das de la asociacin las clulas bacterianas colonizan especficamente
los sitios de emergencia de las races laterales y las regiones de los pelos radicales, tanto
de la raz primaria como de las races secundarias y posteriormente la superficie de la
raz (172). En plantas de trigo fue observado que la inoculacin de Azospirillum induce
cambios en la morfologa de los pelos radicales, siendo stos cambios
significativamente mayores que los causados por Rhizobium
leguminosarum o Azotobacter chrococcum, los cuales son mnimos (77, 80). Adems,
fue observado que la inoculacin con 105 a 106 clulas de Azospirillum causa tanto la
elongacin como el aumento de la superficie total de la raz (Fig. 5), en tanto que la
inoculacin de 108 a 109 clulas causan la inhibicin del desarrollo de sta (82).
Aparentemente, el incremento del tamao del sistema radical se debe, al menos
parcialmente, al aumento de la divisin celular y al intenso crecimiento de la zona de
elongacin de las races (97). Es de inters sealar que los sitios que
coloniza Azospirillum lipoferum son diferentes, dependiendo de la variedad de la planta,
al menos en el caso del arroz (116). La capacidad de Azospirillum para colonizar las
races de las plantas es variable dependiendo de la cepa. Con el uso de microscopia
confocal de rayos lasser y sondas de oligonucletidos fluorescentes (6) y con el uso de
anticuerpos monoclonales cepa-especficos (153) ha sido mostrado que algunas cepas
de A. brasilense, incluyendo a la cepa tipo Sp7, se encuentran restringidas al ambiente
rizosfrico y son capaces de formar colonias solamente en la superficie de la raz de
plntulas de trigo, en tanto que otras cepas son encontradas frecuentemente en altas
densidades en los espacios intercelulares de la raz, as como en el interior de los pelos
radicales. Resultados similares, usando otras metodologias, habian sido reportados con
algunas de las mismas cepas de Azospirillum inoculadas en trigo creciendas en
condiciones de campo (11).
Experimentos de inoculacin
Considerando la capacidad de Azospirillum para asociarse con plantas de inters
agrcola, as como su capacidad para fijar N2 en medios de cultivo, se disearon

numerosos experimentos para evaluar el efecto de la inoculacin sobre el crecimiento de

las plantas. No existen reportes que indiquen efectos patognicos en las plantas
causadas por la inoculacin de Azospirillum. El nico reporte existente en esta direccin
indica que ninguna de las especies de Azospirillum causa sintomas visibles de
enfermedad sobre la raz o las hojas de plantas de trigo, algodn o tomate (17). Con la
inoculacin de Azospirillum se observ frecuentemente un mayor desarrollo del sistema
radical (Fig. 6) (123, 133, 135, 174) el cual se traduce en mayor superficie de absorcin
de nutrientes, as como en mayor desarrollo de la parte area de las plantas (Figs. 7 y 8)
(7, 117, 123, 133, 135, 150). Tambin fueron observados incrementos en el contenido de
nitrgeno, fsforo, potasio y otros minerales en las plantas inoculadas
(32, 101, 117, 133, 149, 160). Principalmente con A. brasilense y A. lipoferum se
llevaron a cabo gran cantidad de experimentos en muchos pases para evaluar su efecto
sobre el rendimiento de los cultivos
(3, 10, 11, 27, 32, 37, 56, 60, 80, 83, 110, 114, 119, 123, 134, 145, 149, 159, 176). Una
amplia revisin sobre los resultados de los experimentos desarrollados entre los aos
1974-1994 fue realizada por Okon y Labandera (128). Esta evaluacin revel que el
xito de la inoculacin fue en el rango del 60 al 70% de los experimentos realizados en
suelos y regiones climticas diferentes (Fig. 9), con incrementos significativos,
generalmente en el rango de 5 a 30%, en el rendimiento de los cultivos (Fig. 10). Sin
embargo, cuando se evalu el efecto de la inoculacin en conjunto con la aplicacin de
niveles intermedios de fertilizacin con nitrgeno, fsforo y potasio, el xito de los
experimentos se incrementa hasta 90% (128). Frecuentemente se observ que la
inoculacin de los cultivos con Azospirillum permite reducir en 40-50% el nivel de los
fertilizantes sin que exista disminucin en el rendimiento de la cosecha. Recientemente
fueron observados incrementos en la biomasa de pastizales naturales inoculados con A.
brasilense aun bajo condiciones de crecimiento subptimas (75).
Mecanismos de estimulacin del crecimiento de las plantas
La capacidad de Azospirillum para estimular el crecimiento de las plantas ha sido
demostrado en decenas de experimentos, tanto de campo como de invernadero. Varios
son los mecanismos que se han sugerido como responsables del efecto estimulatorio
observado en las plantas inoculadas.
En numerosos estudios de inoculacin con Azospirillum, adems del mejor crecimiento
de las plantas, fueron observados incrementos en el contenido de nitrgeno total de las
plantas inoculadas respecto a las testigo (10, 37, 81, 80, 117, 122, 133, 152, 160) y en la
incorporacin de 15N (90, 142, 143). No obstante, en la mayora de estos estudios no
fueron observadas diferencias significativas en el porciento de nitrgeno o en el
contenido de protena entre plantas inoculadas y no inoculadas, razn que contribuy a
desechar la idea de que la fijacin biolgica de nitrgeno fuera el mecanismo
responsable de los efectos benficos observados. Debido a que los efectos de la
inoculacin con Azospirillum sobre el crecimiento de la raz y la parte area de las
plantas son similares a los que se presentan cuando las plantas son tratadas con

fitohormonas (144, 167) fue sugerido que estas sustancias podran ser responsables del
mejor crecimiento de las plantas, as como de los incrementos observados en el
contenido de minerales y en el rendimiento de los cultivos
(10, 27, 32, 80, 114, 119, 122, 135, 160)
Recientemente ha sido revisada la funcin de las fitohormonas en las asociaciones
planta-microorganismo (72). Azospirillum tiene la capacidad de producir auxinas,
citocininas y giberelinas en medios de cultivo (28, 55, 74, 109, 132, 144, 167). No
obstante, el mecanismo analizado con mayor amplitud ha sido la produccin de auxinas,
especialmente la del cido indol actico (AIA) (16, 67, 69, 78, 115, 182). El AIA
producido por las bacterias puede modificar el contenido de fitohormonas de las plantas
conduciendo a la estimulacin del crecimiento de las mismas (12).
En cultivos de Azospirillum, adems de AIA se han encontrado otros compuestos
indlicos y metabolitos relacionados tales como el cido indol pirvico (38), indol
lctico (39, 42), indol acetamida (12, 39, 69), indol acetaldehdo (38), indol etanol e
indol metanol (42), triptamina, antranilato y otros compuestos indlicos no identificados
(69). En diferentes estudios se ha tratado de obtener mutantes incapaces de sintetizar
AIA, sin embargo, en el mejor de los casos solamente se logr obtener mutantes
hipoproductoras de este compuesto. Esto sugiri la existencia de ms de una va
biosinttica del AIA en Azospirillum (1, 69). Actualmente se conoce
que Azospirillum puede sintetizar AIA a travs de tres vas. En tanto que las vas del
cido indol pirvico (38) y la del indol acetamida (12) son dependientes del triptofano,
la tercera es una va independiente de este aminocido (137), desconocindose el
precursor del AIA. Resultados recientes permiten sugerir que la indol piruvato
descarboxilasa es una enzima comn tanto a la va del indol pirvico como a la va no
dependiente de triptofano (95).
A pesar de que existe la tendencia de atribuir a las fitohormonas, especialmente al AIA,
los efectos benficos de la inoculacin con Azospirillum, tambin existe la propuesta de
que tales beneficios son el resultado de diversos mecanismos (21, 101, 133, 135, 174).
Se han sugerido otros mecanismos como responsables de los efectos estimulatorios
causados por la inoculacin de Azospirillum (183) y algunos de stos han sido revisados
por Bashan y Holguin (19).
Aplicacin
Algunas compaias en diferentes pases han registrado inoculantes de Azospirillum para
maz y otros cultivos (75, 128). Burdman y col. (30) refieren que en Sudafrica se lleva a
cabo la produccin de inoculantes a base de Azospirillum para 150,000 hectreas de
maz y 12,000 de trigo. Algunas caractersticas de la produccin de inoculantes a base
de Azospirillum han sido discutidas (54, 76, 128).
Aun cuando el uso de Azospirillum como bioestimulante del crecimiento de las plantas
no se ha generalizado mundialmente, en Mxico la aplicacin de sta bacteria en

diferentes cultivos ha revasado con mucho lo hecho en otros pases. En el ciclo agrcola
primavera-verano (PV) del ao 1999 la Secretara de Agricultura, a travs de su Instituto
Nacional de Investigaciones Forestales Agrcolas y Pecuarias (INIFAP) y de la
Fundacin Mexicana para la Investigacin Agropecuaria y Forestal, A.C., en
colaboracin con el Centro de Investigacin sobre Fijacin de Nitrgeno-UNAM, llev
a cabo la inoculacin de alrededor de 450,000 hectreas de maz y 150,000 hectreas de
sorgo, cebada y trigo, empleando cepas de Azospirillum seleccionadas por su capacidad
para promover el crecimiento de las plantas e incrementar el rendimiento de los
cultivos.
La evaluacin del rendimiento de grano en alrededor de 675 hectreas de los diversos
cultivos, que comprendieron cerca de 170 sitios de Mxico con caractersticas edficas
en regiones climticas diferentes mostr el xito de la inoculacin en el rango de 62 a
95% de los casos analizados, con incrementos que fluctuaron en el rango de 6 a 98%.
En la Tabla 2 se presenta un resumen de los resultados obtenidos en el ciclo agrcola
PV-1999. El incremento promedio en la produccin de los cultivos de maz, trigo,
cebada y sorgo bajo las diferentes condiciones evaluadas fue del 26%. Los resultados
fueron dependientes de la variedad y cultivo, tipo de suelo, uso y nivel de fertilizantes
(35). La mejor respuesta a la inoculacin se present en suelos de tipo ligero (arenosos),
con niveles intermedios de fertilizacin en el rango de 45-90 Kg N/ha, y con las
variedades "criollas" de maz. Considerando la cantidad de variedades, cultivos, suelos
y condiciones climticas evaluadas, los resultados de la inoculacin
con Azospirillum reflejan claramente la capacidad de la bacteria para promover el
desarrollo de las plantas y el impacto positivo sobre el rendimiento de los cultivos de
grano. El programa de "Biofertilizacin" se continu durante el ciclo PV-2000,
inoculndose alrededor de un milln y medio de hectreas.
El temor o las precauciones expresadas en algunas revisiones sobre el tema, por cierto
muy escasas, para extender el uso de Azospirillum a niveles comerciales debido a la
"inconsistencia de la inoculacin" tienen poco valor ante los resultados de produccin
obtenidos en decenas de experimentos, as como los obtenidos en miles de hectreas con
diferentes cultivos, variedades y condiciones edficas y climticas.
An en la actualidad hacen falta muchos estudios de investigacin bsica, tanto sobre la
bacteria como en su interaccin con la planta, para un mejor entendimiento de la
asociacin Azospirillum-planta. No obstante, en mi opinin, la aplicacin
de Azospirillum como bioestimulante que incrementa la produccin de los cultivos
deberia extenderse a todos aqullos lugares donde la aplicacin de fertilizantes es nula o
escasa, como lamentablemente ocurre en no pocos pases que tienen una agricultura
subdesarrollada. En las regiones donde se practica una agricultura moderna, la
inoculacin con Azospirillum permitira reducir las elevadas cantidades de fertilizantes
que generalmente se aplican y con ello disminuir tanto el costo de produccin como los
problemas derivados de su uso, principalmente la contaminacin, sin detrimento de la
produccin.