Molecular Biology and Genetic Engineering (2017)
Conjugacin Bacteriana
Lpez Karen1 Hernndez Yhara1 Hernndez Maria1 Villadiego Heifren1 Alvarez Manuel1
Correspondencia: [email protected]
1 Universidad de Sucre, Facultad de Educacin y Ciencias, Programa de Biologa, Lnea de
profundizacin en Biotecnologa, Ingeniera Gentica, Sincelejo Colombia.
RESUMEN
El proceso de conjugacin bacteriana se presenta naturalmente en pocas especies, entre las que se encuentra
Escherichia coli, y consiste en la trasferencia de informacin gentica de una clula donadora a otra receptora por
contacto directo, mediante una estructura denominada Pili sexual. En este experimento, se emplearon dos cepas de
E. coli resistentes a antibiticos; una con resistencia a estreptomicina y la segunda con resistencia a ampicilina. Esto
con el fin de inducir la conjugacin entre ellas, confirmando la transferencia del ADN recombinante en el sistema
mediante la observacin de los medios de cultivo inoculados. En algunos de estos se observ crecimiento de una
sola cepa, as como el crecimiento de ambas de acuerdo a la presencia o ausencia de ampicilina, estreptomicina o
ambas en el medio.
Palabras clave: conjugacin bacteriana, Escherichia coli, ADN recombinante, resistencia a antibiticos.
Introduccin. Pero adems contienen la informacin para
realizar una actividad muy especial: la
Las bacterias (los primeros organismos vivos)
conjugacin bacteriana que permite el
tienen en su interior unos elementos genticos
intercambio de plsmidos entre especies, e
accesorios que son estudiados y conocidos
incluso gneros diferentes de bacterias. Estos
fundamentalmente como portadores de
intercambios implican la transferencia de
resistencia a antibiticos y como vectores
informacin gentica (por medio de una
(sistema de transferencia de informacin) en
estructura llamada pilus) de una especie a otra
ingeniera gentica. Estos elementos, conocidos
que, en muchos casos, hace posible a la receptora
como plsmidos son molculas circulares de
la propia supervivencia. [1]
ADN en doble cadena (ADN extracromosmico)
que se multiplican independientemente dentro de Los elementos extracromosmicos mueven
las clulas y que se transmiten cuando stas se informacin horizontalmente, dando lugar a la
dividen. [1] transferencia de trozos de material gentico, por
lo general de pequeo tamao. Los plsmidos
La informacin de los plsmidos, que slo
transfieren genes del hospedador junto con su
constituye de un 1% a un 3% del genoma de la
propio replicn [2]. Una de las pocas especies
clula, participa en la actividad bacteriana en
bacterianas que presentan sistemas naturales de
funciones no codificadas por el cromosoma:
conjugacin es Escherichia coli puesto que
hacen posible la asimilacin de sustancias
tienen la capacidad de transferir porciones de
complejas, les coneren resistencia a txicos,
cromosoma y por ello es comn su uso en
entre ellos los antibiticos, y son causantes de
experimentos de conjugacin.
varias enfermedades en animales y vegetales;
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Materiales y mtodos.
1. Incubar los subcultivo R strep y Ramp
y las placas de conjugacin a 37c por
una hora antes de iniciar el
procedimiento.
2. Usando una pipeta esteril mezclar
1ml de subcultivo E. Col Rstrep con
un 1ml de E.col Ramp en la placa
previamente calentada. Agitar
vigorosamente el medio regresarlo
junto con los subcultivo a la Anotar resultados en tablas.
incubadora. Realizar pasos como lo
muestra en la figura. Resultados y anlisis
Imagen 1. Ilustra cmo se realiza el estriado
3. Dividir en dos secciones la placa
marcando una seccin como I y la
otra como II. Ilustracin 1. Frotis en recombinacin.
4. Sembrar en estras con ayuda de un asa
el subcultivo cepa I en su respectiva seccin Como instrumento porta inculos ms frecuente
y luego II con el mismo procedimiento. se utiliza el asa de siembra, con el que se puede
tomar inculo a partir de colonias o de medio
lquido, debido a que mantiene un pequeo
volumen de agua por tensin superficial. Para
depositar el inculo en lquido basta con
introducir el extremo en el medio y agitar
ligeramente.
5. Sembrar la placa que se haba incubado
previamente (plato recombinante o mezcla
de conjugacin).
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Ilustracin 5. Guardado en incubadora.
Una vez colocados los discos de ambos
experimentos, las placas se incuban toda la noche
a la temperatura ptima de crecimiento de la
Ilustracin 2. Flameado en recombinacin.
bacteria que se est utilizando. A la maana
La presencia de microorganismos en todos los siguiente hay que medir el dimetro de los halos
medios ambientales hace imprescindible que para de inhibicin y anotarlos en el cuaderno.
estudiar una bacteria determinada sea necesario
destruir todas aquellas que pudieran encontrarse
contaminando los medios o los instrumentos de
trabajo. Esto se consigue mediante la
ESTERILIZACION, consistente en la
destruccin de todo microorganismo.
Ilustracin 3. Obtencin de muestra.
Ilustracin 4 medios de confirmacin. A). lb agar B). lb agar +
str C). lb Agar + amp D). lb agar + str + amp
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Ilustracin 7. Resultado en medio para confirmacin A). lb agar
D Ilustracin 8. Resultado en medio para confirmacin B). lb agar
+ str
Ilustracin 6. Resultados en medio para confirmacin A). lb agar
B). lb agar + str C). lb Agar + amp D). lb agar + str + amp.
20 horas.
Ilustracin 9. Resultado en medio para confirmacin C). lb Agar
+ amp
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Ilustracin 10. Resultado en medio para confirmacin D). lb agar Ilustracin 12. Anlisis de Ilustracin 13. Resultado en medio
+ str + amp para confirmacin C). lb Agar + amp despus de 72 horas.
Tabla 1. Confirmacin 20 horas
Contenid R. Amp I R. Str II
o caja
Petri Espera Observa Espera Observad
do do do o
LB Agar + + + + + +
LB Agar
-- -- -- + -- --
+ Str
LB Agar
+ + + -- -- --
+Amp
LB Agar
+ Str + -- -- -- -- -- --
Amp
G1 G G1 GH
H
Ilustracin 11 resultado para la recombinacin. A). Amp B). Str
C). Amp + str
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Recombinacin 20 horas inhibiendo la ltima tapa de la sntesis de
Contenido la pared celular bacteriana unindose a
de caja Esperado Observado unas protenas especficas llamadas PBPs
Petri
(Penicillin-Binding Proteins) localizadas
LB Agar + +
Str + - en la pared celular. Al impedir que la
Poco?
pared celular se construya correctamente,
LB Agar
+Amp + + + la ampicilina ocasiona, en ltimo trmino,
la lisis de la bacteria y su muerte. La
LB Agar +
Str + Amp + - ? -
ampicilina no resiste la accin hidroltica
de las beta-lactamasas de muchos
G1 GH estafilococos, por lo que no se usa en el
tratamiento de estafilococias. Aunque la
ampicilina es activa frente a los
estreptocos, muchas cepas se estn
Los principales mecanismos implicados
en la resistencia se pueden agrupar de la volviendo resistentes mediante
siguiente manera: mecanismos diferentes de la induccin
de b-lactamasas, por lo que la adicin de
1. Disminucin de la permeabilidad cido clavulnico no aumenta la actividad
hacia el antibitico. de la ampicilina frente a estas cepas
2. Inactivacin enzimtica del resistentes.
antibitico
3. Modificacin qumica de la diana Por qu no crece en LB+Strep?
sobre la que acta el antibitico La estreptomicina est incluida dentro de
4. Sntesis de una enzima resistente los aminoglucsidos, un tipo de
Por qu no crece en LB+AMP? antibitico que acta a nivel ribosomal
inhibiendo la sntesis proteica en la
La ampicilina es un antibitico subunidad pequea del ribosoma
penicilnico semisinttico, de amplio (subunidad 30S) de forma que impide que
espectrro y activo por va oral. Aunque es se forme el complejo de iniciacin de la
ms activo que las penicilinas naturales no sntesis proteica.
estable frente a las beta-lactamasa
producidas por bacterias gram-postitivas Existen diferentes mecanismos de
o gram-negativas. (Nicholls PJ. resistencia frente a la estreptomicina:
Neurotoxicity of penicillins. J Inactivacin enzimtica en el cual se
Antimicrob Chemother 1980). sintetizan enzimas que catalizan la
inactivacin; alteracin del ingreso, por
Los antibiticos beta-lactmicos como la diversos mecanismos como las bombas de
ampicilina son bactericidas. Actan
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extrusin o el cambio en la conformacin ribosoma. El efecto de la mutacin es
de la molcula (por ejemplo, aadir una alterar una protena de modo que el
adenina a la estreptomicina impidiendo ribosoma que contenga esa protena
as e paso de sta al interior de la bacteria); mutante evita la unin de la
alteracin del sitio de unin al ribosoma, estreptomicina con el ARNr (de algn
se produce la mutacin de una protena. modo, el mutante da la va de acceso del
antibitico a su diana molecular).
La estreptomicina tiene adems otros usos
habituales, como plaguicida para Las posibles causas por las cuales no
controlar plagas bacterias en los cultivos recombino posiblemente se deben a
agrcolas, como puede ser el caso del errores en el procedimiento, manipulacin
fuego bacteriano, enfermedad producida en, tambin pudo haber fallas en la
por Erwinia amylovora. En la actualidad manipulacin del kit, descartamos que el
existen unos 16 productos plaguicidas con medio LB pudiera estar contaminado ya
estreptomicina registrados. que es un medio slido nutritivo utilizado
para crecimiento de microorganismos
En la tabla 1 de confirmacin se puede
modificado genticamente o fallas en el
identificar como como los valores
aislamiento de la bacteria.
esperados estaban en acuerdo con los
obtenidos a exencin del medio Strep, Conclusin
esto puede estar relacionado con algunos
Las posibles causas por las cuales no se
efectos de la estreptomicina.
activ el plsmido posiblemente se deben
Efectos de la estreptomicina: a errores en el procedimiento,
manipulacin en la hidratacin del
Diana de la estreptomicina:
plsmido liofilizado, o en el choque
La estreptomicina ejerce su efecto trmico de las partculas, tambin pudo
antibitico unindose a una zona concreta haber fallas en la manipulacin del kit,
del ARNr del ribosoma eubacteriano. descartamos que el medio LB pudiera
Mutacin de resistencia a la estar contaminado ya que es un medio
estreptomicina: slido nutritivo utilizado para crecimiento
de microorganismos modificado
Con relativa frecuencia (clula y divisin) genticamente o fallas en el aislamiento
surge en la poblacin bacteriana una dela bacteria, solamente hubo crecimiento
mutacin espontnea que convierte a la de E. coli en una caja control con LB lo
bacteria afectada en resistente a la que significa que la bacteria no insert el
estreptomicina (fenotipo StrR); esta plsmido.
mutacin afecta al gen str, que codifica a
una protena de la subunidad pequea del
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Los mtodos de transformacin para las ampicilina y estreptomicina, las cepas
construcciones genticas son receptoras se caracterizan por su
relativamente ms simples e incluyen los sensibilidad a estos antibiticos (Blanc,
genes de inters y de seleccin con sus 2007) Como las dos cepas son donadoras
secuencias regulatorias respectivas. El y receptoras ya que la primera presenta
ADN para ser clonado es incluido en resistencia a la estreptomicina y la
segunda es sensible a este antibitico, en
plsmidos que son transferidos completos
cambio la segunda cepa presenta
durante el bombardeo a las clulas, o bien
resistencia a la ampicilina pero es
de forma de molcula lineal (el plsmido susceptible a la estreptomicina. Por lo
cortado en un punto). Tambin es muy tanto, las dos cepas contendrn el mismo
comn que una vez obtenida la genotipo.
construccin gentica dentro de un En el procedimiento experimental sobre
plsmido (en el cual se clona y se obtienen conjugacin bacteriana, La cepa donadora
muchas copias para trabajar), luego se son las dos, esto debido a que, la cepa dos
extrae el fragmento del mismo para slo es sensible a la ampicilina y la cepa uno
tener la secuencia con los genes de inters presenta resistencia ante este mismo tipo
y de seleccin (incluidas las secuencias de antibitico. Cabe resaltar que la cepa 2
regulatorias) y as reducir el fragmento de presenta un tipo de resistencia a la
ADN a transferir. estreptomicina pero esta misma es
susceptible a la ampicilina. Por lo tanto, se
Las cajas que se deben comparar son las puede afirmar que las dos cepas son
de los dos crecimientos en la LB con donadoras y receptoras. Lo cual se afirma,
ampicilina. Las clulas que no fueron debido a que, las cepas receptoras se
trasformadas no deben crecer en medio caracterizan por su sensibilidad a los
LB con ampicilina, mientras que las antibiticos mencionados.
clulas en las que se realiz la
conjugacin deberan crecer en el medio 2. Qu marcadores gentico fueron
con ampicilina ya que ste les confiere empleados para verificar la
resistencia al antibitico. conjugacin?
CUESTIONARIO
Los marcadores genticos empleados en
1. Cul es el genotipo de la cepa esta prctica, sobre conjugacin
donadora y la cepa receptora bacteriana fueron; la ampicilina y la
empleada en este procedimiento? estreptomicina. Cabe mencionar que se
Las cepas donadoras se caracterizan por conoce como marcadores genticos a
presentar un genotipo de resistencia todas aquellas molculas (protenas o
(genes que codifican protenas, que ADN) que se pueden identificar y
confieren resistencia a las bacterias) a la caracterizar para llegar a definir un
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genotipo determinado; Muchos de ellos ( y 5gramos de NaCl, despus se adiciono
marcadores genticos) permiten la todo eso en un Erlenmeyer de 2litros y se
asociacin de genotipos con fenotipos llen con agua destilada hasta el afore,
especficos. para as ajustarlo a un pH de 7.5.
3. Mencione otros marcadores de Composicin del medio LB
seleccin que podran utilizarse como
criterio para identificar bacterias COMPOSICIN
conjugadas. DEL MEDIO LB
Triptona (digerido
Los marcadores genticos son todas pancretico de la 10
aquellas molculas (protenas o ADN) que casena)
se pueden identificar y caracterizar para Extracto de levadura 5
definir un genotipo determinado. Muchos cloruro de Sodio 5
de ellos permiten la asociacin de pH 7
genotipos con fenotipos especficos. Para
Gramos / litro 20
identificar las bacterias transformadas, se
utilizan marcadores de seleccin Anexo
proporcionados por plsmidos
(Cercenado et al. 2010). Los marcadores 1. En la prueba de confirmacin, por qu
de seleccin ms utilizados son los genes no hubo crecimiento de cepas 1 en lb +
de resistencia a antibiticos como: placa amp? Primero hay que aclarar que la
cepa 1 era resistente a ampicilina por lo
Ampicilina tanto ella tena que crecer, pero en la tabla
1, se present una excepcin es decir, la
Tetraciclina.
cepa a pesar de ser resistente e inoculada
Cloranfenicol. en un medio con ampicilina no creci.
Dicho fenmeno tal vez fue resultado de
Kanamicina errores en la manipulacin, entre ellos el
hecho de no tomar suficiente muestra con
Quinolonas el asa o que tal vez esta estaba a una
temperatura intolerable por la cepa y
Trimetoprim Sulfametoxazol. muri, en consecuencia no se observ
crecimiento.
4. Explique la composicin y
preparacin del medio LB. 2. En la prueba de confirmacin, por qu
no hubo crecimiento de las cepas 2en lb +
Para la preparacin del medio LB, se placa estreptomicina?
pesaron 5gramos de triptona, luego se Aplica la misma respuesta de la pregunta
pes 2.5 gramos de extracto de levadura 1. Con la diferencia de componentes
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empleados, es decir, Solo que la cepa era cepa I, de igual manera para la otra placa,
resistente a estreptomicina y no a la pero si adems se observa crecimiento en
ampicilina. la placa con los dos antibiticos, la cepa
en ese caso es recombinante.
3. por qu las cepas no crecen en la placa
de confirmacin que contiene Referencias
estreptomicina y ampicilina?
Pginas web:
Porque en la tabla de confirmacin an no
hay conjugacin y las cepas I y II solo [1]
presentan resistencia a un solo antibitico https://books.google.com.co/books
y el medio contiene los dos antibiticos. ?id=XASBb5SvwgEC&pg=PA126
Dichas cepas an no han adquirido los &dq=conjugacion+bacteriana&hl=
mecanismos de Resistencia de cada es&sa=X&ved=0ahUKEwjbycfV
antibitico, es decir, la cepa I es w5TWAhVMQSYKHYkNABkQ6
susceptible a la estreptomicina y la cepa II AEILDAB#v=onepage&q&f=false
es sensible a la ampicilina. No obstante se [2]
observ crecimiento en esta placa, lo cual https://books.google.com.co/books
se debe a errores de manipulacin, por
?id=1Csa9wR2sCkC&pg=PA883
ejemplo, al momento de poner el asa al
mechero no se eliminaron las cepas &dq=conjugacion+bacteriana&hl=
resistentes y hubo contaminacin entre es&sa=X&ved=0ahUKEwjbycfV
ellas o que no se extendi la muestra w5TWAhVMQSYKHYkNABkQ6
teniendo en cuenta el lmite mximo en la AEISzAH#v=onepage&q=conjuga
placa. cion%20bacteriana&f=false
4. Se puede saber si el crecimiento de la
placa de acoplamiento est formado solo http://microbiologiaumh.blogspot.
por clulas recombinante o simplemente com.co/2011/05/estreptomicina.
el crecimiento de las cepas 1 y 2. ARTICULOS DE
DIVULGACION
Si es posible saber si las clulas de una
placa son resultados de una GARCIA LOBO, J.M., F. DE LA CRUZ
recombinacin o si solo tienen Resistencia (1990): Mecanismos de formacin de
uno de los dos antibiticos. En este caso transposones bacterianos con resistencia
se pueden emplear medios que tengan un a mltiples antibiticos.
solo antibitico y otra que contenga los En: "Microbiologa 1990" (coordinado
dos, entonces si se observa crecimiento en por J. Casadess y F. Ruiz-Berraquero).
la placa con un solo antibitico, se puede pp. 45-51. Secretariado de Publicaciones
determinar que cepa es, por ejemplo si de la Universidad de Sevilla.
crece en el medio con ampicilina y no en
estreptomicina, se determina que es la
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FRANKLIN, T.J., G.A. SNOW
(1989): Biochemistry of
antimicrobial action (4th edition).
Chapman and Hall, Londres. Se
recomienda leer el captulo 8.
Nicholls PJ. Neurotoxicity of
penicillins. J Antimicrob
Chemother 1980;6:161-72.
Anonymous-Ampicillin. IARC
Monogr Eval Carcinog Risks Hum
1990 50: 153-67
Bear DM, Turck M, Petersdorf RG.
Ampicillin. Med Clin North Am
1970 Sep 54:5 1145-59
Rolinson GN, Macdonald AC,
Wilson DA Bactericidal action of
beta-lactam antibiotics on
Escherichia coli with particular
reference to ampicillin and
amoxycillin. J Antimicrob
Chemother 1977 Nov 3:6 541-53
