UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLN

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS

SECCIN DE BIOQUMICA Y FARMACOLOGA HUMANA

BIOQUMICA DIAGNSTICA
LABORATORIO DE GENTICA MOLECULAR
GRUPO: 1602 SEMESTRE: 2017-I

EQUIPO 3: LUNA BENTEZ MAX; ROSALES BOLAOS FRANCISCO ENRIQUE

PROFESORAS: BQD LARISSA ANDREA GONZLEZ SALCEDO; BQD NGELES LPEZ CABRERA
ENTREGA 7-OCTUBRE-2016

INFORME DE LA PRCTICA
EXTRACCIN, CUANTIFICACIN Y ELECTROFORESIS DE DNA

RESUMEN
Uno de los ms importantes aportes a la biologa ha sido el reconocimiento del DNA como la molcula de la vida. Para
su estudio y la aplicacin de tcnicas moleculares es necesario la extraccin de DNA ntegro y puro. La extraccin consiste
en el aislamiento y purificacin de molculas de DNA y se basa en las caractersticas fisicoqumicas de la molcula. Una
vez obtenido el material gentico, es importante determinar el rendimiento mediante espectrofotometra, ya que una
caracterstica del DNA es que absorbe la luz ultravioleta (UV) a 260 nm, lo que permite estimar su concentracin. Adems
de conocer la cantidad y calidad del DNA por espectrofotometra, es importante conocer si el DNA obtenido est integro,
lo cual se puede observar mediante electroforesis en gel de agarosa, debido a las bandas que se forman. Los objetivos de
la prctica son cuantificar DNA extrado por 2 diferentes mtodos (por perclorato de sodio y por fenol-cloroformo) mediante
espectrofotometra, as como evaluar la pureza e integridad del DNA por electroforesis, para comparar los resultados
obtenidos por ambos mtodos. Los resultados obtenidos por el mtodo de perclorato de sodio fueron: relacin 260/280 =
1.577, concentracin = 22.371 ng/L, bandas difusas; mientras que por el mtodo de fenol-cloroformo fueron: relacin
260/280 = 1.92, concentracin = 1342.28 ng/L, bandas muy difusas. Como conclusiones, se logr extraer DNA humano
por los mtodos de perclorato de sodio y de fenol-cloroformo, siendo que por el mtodo de perclorato de sodio se obtuvo
menor cantidad de DNA y contaminado, en contraste al mtodo de fenol-cloroformo, con el cual se obtuvo mayor cantidad
de DNA y alta pureza; y al no evaluarse la integridad de ambas muestras por fallas en la electroforesis, se concluye que el
mtodo ms eficaz es el de fenol-cloroformo.
Palabras clave: Nucletidos, espectrofotometra, absorbancia, densidad ptica, electroforesis.

SUMMARY
One of the most important contributions to biology has been the recognition of DNA as "the molecule of life". For their study
and application of molecular techniques is necessary the extraction of DNA full and pure. The extraction involves the
isolation and purification of DNA molecules and is based on the physicochemical characteristics of the molecule. After
obtaining the genetic material, it is important to determine the performance by spectrophotometry, as a feature of DNA is
that it absorbs ultraviolet (UV) at 260 nm, which allows estimation of their concentration. Besides knowing the quantity and
quality of DNA by spectrophotometry, it is important to know if the DNA obtained is integral, which can be observed by
agarose gel electrophoresis, because the bands are formed. The objectives of the practice are quantified DNA extracted by
2 different methods (sodium perchlorate and phenol-chloroform) by spectrophotometry, and to assess the purity and the
integrity of the DNA by electrophoresis, to compare the results obtained by both methods. The results obtained by the
method of perchlorate were: ratio 260/280 = 1.577, concentration = 22.371 ng/L, diffuse bands; while by the phenol-
chloroform method they were: 260/280 ratio = 1.92, concentration = 1342.28 ng/L, very diffuse bands. In conclusion, it
was possible to extract human DNA by the methods of sodium perchlorate and phenol-chloroform, being that by the method
of sodium perchlorate less DNA and contaminated was obtained, in contrast to the method of phenol-chloroform, the which
greater amount of DNA and high purity was obtained; because the integrity of both samples evaluated by electrophoresis
failures, it is concluded that the most effective method is phenol-chloroform.
Keywords: Nucleotides, spectrophotometry, absorbance, optical density, electrophoresis.

1
INTRODUCCIN precipita con isopropanol y se lava con etanol para
finalmente ser resuspendido en un tampn estabilizante
Uno de los ms importantes aportes a la biologa ha sido para DNA. El segundo mtodo permite la purificacin de
el reconocimiento del DNA como la molcula de la vida. DNA mediante la adicin de fenol y cloroformo lo que da
Para el estudio de DNA existen diferentes muestras que lugar a la aparicin de 2 fases: una fase acuosa superior
pueden ser obtenidas y analizadas de un paciente; que contiene los cidos nucleicos y una fase orgnica que
sangre, semen, saliva, cabello, hueso, diente o tejido, la contiene las protenas disueltas en el fenol y los lpidos
forma ms rpida y fcil de obtener es la sangre. La disueltos en el cloroformo, posteriormente se precipita el
sangre est compuesta por clulas y restos celulares en DNA de la fase acuosa con isopropanol o etanol absoluto
una solucin acuosa: el plasma. Dentro de las clulas, y se lava con etanol al 70% para eliminar sales y
estn los eritrocitos, leucocitos y plaquetas, de las cuales, pequeas molculas orgnicas que podran an estar
los leucocitos son las nicas clulas nucleadas que se presentes en la muestra, se emplea alcohol isoamlico
presentan como granulocitos, monocitos y linfocitos, y, para cambiar la constante dielctrica del medio , por
por lo tanto, las nicas de las que se puede obtener DNA ltimo el DNA se resuspende en un tampn apropiado ().
por la presencia de este ncleo. (Koolman y Rhm, 2005)
Una vez obtenido el material gentico, es importante
Debido a que en el DNA se encuentran cifradas las determinar el rendimiento mediante espectrofotometra.
instrucciones que definen las caractersticas propias de La ley de Beer-Lambert indica que la concentracin de
cada organismo, diversas tecnologas y sistemas de una molcula en solucin depende de la cantidad de luz
anlisis se han desarrollado para la caracterizacin de absorbida de las molculas disueltas. Una caracterstica
esta molcula. La aplicacin de tcnicas moleculares del DNA es que absorbe la luz ultravioleta (UV) a 260 nm,
inicia con la extraccin de DNA y la obtencin exitosa de con lo cual se puede estimar su concentracin. Cuando
datos confiables y reproducibles depende, en gran la longitud de la celda en que se disuelve el DNA, es de
medida, de la extraccin de DNA ntegro y puro (Rocha, 1 cm, la absorbancia es igual a la densidad ptica (DO).
2009). En el caso de DNA genmico o de doble cadena, una
densidad ptica equivale a 50 g/ml (Alejos, 2014).
El DNA est constituido por dos cadenas de nucletidos
unidas entre s formando una doble hlice. Los Adems de conocer la cantidad y calidad del DNA por
nucletidos estn integrados por un azcar espectrofotometra, es importante conocer si el DNA
(desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada obtenido est integro. La integridad del DNA se puede
(adenina, guanina, timina o citosina). La unin de los observar mediante electroforesis en gel de agarosa. Si el
nucletidos ocurre entre el grupo fosfato y el azcar, DNA est integro, se debe observar una banda estrecha
mediante enlaces fosfodister, dando lugar al esqueleto cercana al pozo en que se coloc la mezcla de DNA. Si
de la molcula. Las bases de cadenas opuestas se unen est fragmentado, se observar una banda de ms de 1
mediante puentes de hidrgeno y mantienen estable la cm de ancho o un sendero luminoso en el carril de la
estructura helicoidal. Los grupos fosfato estn cargados muestra. El DNA fragmentado dificulta y afecta la
negativamente y son polares, lo que le confiere al DNA reproducibilidad de las tcnicas moleculares (Alejos,
una carga neta negativa y lo hace altamente polar 2014).
(Rocha, 2009).

La extraccin consiste en el aislamiento y purificacin de METODOLOGA

molculas de DNA y se basa en las caractersticas
fisicoqumicas de la molcula. Los mtodos tradicionales Se siguieron las metodologas para las prcticas 2, 3, 4 y
de extraccin utilizan solventes orgnicos para separar a 5 del manual de prcticas de gentica molecular de la
las protenas del DNA y, una vez suspendido en la fase FES Cuautitln, pginas 23-24, 29-30, 35, 41-42.
acuosa, aislarlo por precipitacin con etanol. En general,
la extraccin consiste de cinco etapas principales:
homogeneizacin del tejido, lisis celular, separacin de RESULTADOS
protenas y lpidos, precipitacin y redisolucin del DNA
(Alejos, 2014). Tabla 1. Resultados de las determinaciones
espectrofotomtricas.
Los mtodos de extraccin del DNA ms utilizados son
por perclorato (Salting Out) y por fenol-cloroformo. El Mtodo de Lectura Lectura Relacin Concentracin
mtodo por perclorato de amonio o sodio a altas extraccin 260 nm 280 nm 260/280 DNA (ng/L)
concentraciones se fundamenta en el cambio de
solubilidad que experimentan las protenas cuando son Perclorato 0.022 0.014 1.577 22.371 ng/L
sometidas a modificaciones en la concentracin salina,
inicia con una lisis celular con un detergente aninico que Fenol- 1.342 0.699 1.92 1342.28 ng/L
solubiliza los componentes celulares e inhibe la accin de Cloroformo
las nucleasas intracelulares, a continuacin se
desnaturalizan y se eliminan las protenas por
precipitacin salina, por ltimo el DNA en solucin se
2
 DNA como de protenas), lo que reduce las interacciones
polares del DNA con el disolvente y favorece las
interacciones hidrofbicas entre las protenas y el DNA,
causando finalmente su precipitacin, permite cuantificar
mayor cantidad de DNA, y favorece que el DNA obtenido
no se encuentre contaminado por la utilizacin de otros
solventes orgnicos, pero si por protenas que le restara
pureza, como en este caso. Mientras que por el mtodo
de fenol-cloroformo es mejor en base a la calidad que se
obtiene, pero no as en la concentracin, ya que como el
fenol elimina las protenas asociadas al DNA, y la mayor
parte del DNA genmico se encuentra unido a histonas
(protenas) se puede arrastrar algo de este al momento
Grfica 1. Se muestra una grfica de barras comparativa de las de realizar la extraccin con este mtodo, aunque en este
concentraciones de DNA obtenidas por espectrofotometra Epoch de los caso no existi ni contaminacin por fenol o por
mtodos de extraccin por Perclorato de sodio y por Fenol-Cloroformo.
Se puede observar que por el mtodo de Fenol-Cloroformo se obtuvo
cloroformo, y la cantidad extrada de DNA fue bastante
una mayor cantidad de DNA con respecto al mtodo de Perclorato de (Sepp, 2004).
sodio.
Con la finalidad de verificar la integridad del DNA
Imagen 1. Electroforesis de DNA extrado por perclorato extrado, as como el tamao de distintos fragmentos de
de sodio y por fenol-cloroformo. DNA, se realiz electroforesis en gel de agarosa. La
electroforesis consiste en la separacin de molculas
(protenas, isoenzimas, cidos nucleicos) a travs de una
matriz tamponada, agarosa en este caso, la cual funciona
como un filtro separando las molculas en un campo
elctrico, de acuerdo al tamao y la carga neta que
poseen. Las bandas se logran observar gracias a la
tincin con GelRed, colorante fluorescente no txico, que
acta mediante insercin entre las pares de bases que
conforman el cido nucleico, permitiendo la fluorescencia
bajo luz UV (Fierro, 2014).

La resolucin y velocidad de separacin de fragmentos

DISCUSIN DE RESULTADOS de DNA por electroforesis son reguladas a travs de la
concentracin de agarosa en el gel y el voltaje aplicado
La pureza de la muestra est relacionada con el valor de durante la electroforesis (Fierro, 2014). En esta prctica
mxima absorbancia de los cidos nucleicos detectada a se utiliz agarosa al 0.8% y la electroforesis fue a 100
una longitud de onda de 260 nm, la relacin de volts durante 30 minutos. Se puede observar que para el
absorbancia a 260 nm y 280 nm se utiliza para evaluar la caso del mtodo. Sin embargo, debido a la
pureza de ADN, una proporcin de 1.7-1.9 es contaminacin y a la perforacin del gel de agarosa
generalmente aceptada como DNA puro (Alejos, 2014). (respectivamente), las bandas resultantes no tenan
resolucin, por lo cual la electroforesis fall y no se puede
En el caso de la extraccin por perclorato se obtuvo una evaluar la integridad del DNA obtenido.
proporcin de 1.577 mientras que en la extraccin por
fenol-cloroformo se obtuvo 1.92. Estas relaciones indican Hay que considerar que al aumentar la concentracin de
que por el mtodo de perclorato se obtuvo un DNA impuro agarosa se dificulta el movimiento de los fragmentos a lo
lo cual se puede deber a la presencia de protena, fenol u largo del gel, permitiendo una mayor resolucin en los
otros contaminantes que absorben fuertemente en o fragmentos de menor longitud. Por otro lado, el
cerca de 280 nm. Mientras que por el mtodo de fenol- incremento del voltaje aumenta proporcionalmente la
cloroformo el DNA obtenido fue casi puro, con alguna leve velocidad de migracin de los fragmentos en el gel
presencia de contaminantes, pero en muy poca cantidad. (Fierro, 2014).
Tambin es necesario considerar que ambas muestras
de sangre se encontraban lipmicas, por lo cual los La tcnica para la cuantificacin de ADN en la
lpidos pudieron participar en la contaminacin por el electroforesis consiste simplemente en la utilizacin de
mtodo de perclorato, mientras que esto no ocurre en el una secuencia de concentraciones de solucin patrn de
mtodo de fenol-cloroformo ya que el cloroformo se ADN (marcador de peso molecular) con la que se
encarga de disolver a los lpidos (Riera, 2010). comparan muestras de ADN de concentracin
desconocida (Fierro, 2014). Sin embargo, como las
Por lo que la extraccin de DNA por el mtodo de bandas por ambos mtodos no estaban bien definidas, o
perclorato de sodio al basarse en la reduccin de nada definidas, no se pudo realizar la comparacin con el
solubilidad del DNA por efecto de las sales y aumento de marcador de peso molecular.
las interacciones hidrofbicas (cargas negativas tanto de
3
CONCLUSIONES

Se logr extraer DNA de dos muestras de sangre humana

por los mtodos de perclorato y de fenol-cloroformo. En
cuanto a la cuantificacin del DNA por
espectrofotometra, el mtodo de fenol-cloroformo obtuvo
una mayor concentracin de DNA, as como tambin una
mejor calidad del mismo en base a la relacin 260/280,
esto en comparacin con el mtodo de perclorato de
sodio.

Por lo que, comparando los resultados obtenidos se

observ que por el mtodo por perclorato es sencillo
trabajar y extraer el DNA, slo que en ocasiones se puede
extraer una menor cantidad de DNA o estar contaminado
por protenas si no se agregan las sales como es debido.
Mientras que por el mtodo de cloroformo es posible
extraer mayor cantidad de DNA, pero el riesgo de
contaminacin por fenol o por cloroformo aumenta si no
se realiza correctamente la extraccin. Una mejor tcnica
en la electroforesis hubiera ayudado a corroborar la
integridad del DNA por ambos mtodos, pero al no
tomarse en cuenta, se concluye que el mtodo ms eficaz
es el de fenol-cloroformo.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Alejos, L. (2014). Extraccin y purificacin de DNA.

Herramientas moleculares aplicadas en ecologa:
aspectos tericos y prcticos (Compilado). Mxico:
SEMARNAT. Pgs. 1-3.

Fierro, F. (2014). Electroforesis de DNA. Herramientas

moleculares aplicadas en ecologa: aspectos tericos y
prcticos (Compilado). Mxico: SEMARNAT. Pgs. 27-
29.

Koolman, J. & Rhm, K. (2005). Bioqumica: texto y atlas.

(3 ed.). Espaa: Mdica Panamericana. Pg. 274.

Riera, M. (2010). Protocolo de extraccin de DNA por

salting-out para pequeos volmenes de sangre. Revista
de Ciencia y Tecnologa; 12(14): 4-7 pp.

Rocha, P. (2009). Teora y prctica para la extraccin y

purificacin del ADN de palma de aceite. Palmas; 23(3):
9-17 pp.

Sepp, R. (2004). Rapid techniques for DNA extraction

from routinely processed archival tissue for use in PCR. J
Clin Pathol; 47(4): 318-323 pp.