Universidad Nacional de Colombia

Sede Bogotá
Facultad de Ingeniería
Departamento de Ingeniería Química y Ambiental
Laboratorio de orgánica

Informe – Práctica 5 y 6 - 18 Oct 2019

Cromatografía en capa fina y cromatografía en columna

Grupo 11 – Julian A. Pineda Ríos, Sheila A. Pradilla Díaz
RESUMEN:
PALABRAS CLAVE:
1. OBJETIVOS

1.1. GENERAL

Identificar la composición de una sustancia compuesta por diferentes colorantes mediante el

uso de la cromatografía en capa fina y la cromatografía en columna.

1.2. ESPECÍFICOS

1.2.1. Usar la cromatografía en capa fina con el fin de identificar el solvente o la mezcla
de solventes más apropiada para separar los colorantes presentes en la muestra
problema.

1.2.2. Aplicar la cromatografía en columna para separar cada uno de los colorantes
presentes en la muestra problema usando los solventes identificados en la
cromatografía de capa fina.

1.2.3. Corroborar los resultados obtenidos en la cromatografía de columna, repitiendo la

cromatografía en capa fina con los colorantes separados.
2. INTRODUCCIÓN

Cromatografía en capa fina

La cromatografía es un método físico de separación en el cual los componentes a separar se

distribuyen entre dos fases: una fase estacionaria inmóvil (sólida o líquida) y una fase móvil (líquida
o gaseosa). Se usa para separar mezclas esencialmente moleculares y se basa en las diferencias de
las velocidades en la que los componentes que hacen parte de la mezcla viajan por la fase
estacionaria bajo la influencia de una fase móvil es un proceso de adsorción-desorción.

Como fase estacionaria es muy común utilizar sílica gel, como fue el caso de este laboratorio. La
sílica gel, también conocida como ácido silícico, se prepara precipitando silicato de sodio con ácido
clorhídrico, donde por policondensación se agrupan en partículas coloidales que forman una red
tridimensional como la mostrada en la figura 1 que, después de ser lavado y calentado forma un
gel poroso y duro.

Figura 1. Estructura de la sílica gel

En cromatografía se llama Rf al coeficiente de partición. Este es la medida de la velocidad de un

compuesto y es propio para cada sustancia.

𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑙𝑎 𝑚𝑒𝑧𝑐𝑙𝑎 𝑑𝑒𝑠𝑑𝑒 𝑒𝑙 𝑝𝑢𝑛𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑎𝑝𝑙𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛

𝑅𝑓 =
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑒𝑙𝑢𝑦𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒𝑠𝑑𝑒 𝑒𝑙 𝑝𝑢𝑛𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑎𝑝𝑙𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛

Cuando no se tiene sustancia patrón, se hace migrar junto con la sustancia a analizar una sustancia
de referencia. Se obtiene entonce la siguiente relación:

𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑙𝑎 𝑚𝑒𝑧𝑐𝑙𝑎 𝑑𝑒𝑠𝑑𝑒 𝑒𝑙 𝑝𝑢𝑛𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑎𝑝𝑙𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛

𝑅𝑠𝑡 =
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑙𝑎 𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑠𝑑𝑒 𝑒𝑙 𝑝𝑢𝑛𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑎𝑝𝑙𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛

A pesar de que el coeficiente de partición es constante y característico para cada sustancia, se

pueden encontrar fluctuaciones hasta del 10% a causa de distintos factores como la temperatura,
la concentración, el pH, impurezas presentes, entre otros. En la Figura 1 se muestra el montaje que
se deber realizar para una cromatografía en capa fina.
 Figura 2. Montaje para cromatografía en capa fina.

Cromatografía en columna

En la cromatografía de columna las moléculas de una mezcla se separan con base en la afinidad de
éstas por la fase estacionaria o por la fase móvil. Si una molécula tiene más afinidad por la fase
estacionaria que otra; ésta última bajará más rápido que la primera. Si la fase estacionaria es un
sólido y la fase móvil un líquido que fluye por gravedad, se tiene una cromatografía clásica (CC),
cuyo principio de separación ocurre por adsorción. Se realiza dentro de un tubo de vidrio que se
empaca con el sorbente que es un sólido activo como se muestra en la figura 1. La mezcla se aplica
en lo alto de la columna, donde es absorbido inicialmente; luego se eluye un solvente que
transporta los componentes de la mezcla de acuerdo con el poder selectivo de adsorción de la fase
estacionaria.

Figura 3. Montaje para cromatografía en capa fina.

En la práctica se usaron como solventes: metanol, Diclorometano y MEK (Butanona) y como

colorantes de referencia: O- Nitrofenol, Rojo de Metilo, Sudán (III) Y M- Nitroanilina.
3. DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCEDIMIENTO

Cromatografía en capa fina

Preparación de la placa

Procedimiento cromatografía
Cromatografía en columna

4. DATOS EXPERIMENTALES Y RESULTADOS

Figura 4. Solventes usados en la cromatografía de capa fina, organizados de mayor a menor

polaridad. Metanol (izquierda), Diclorometano (centro), MEK (derecha).
 Figura 2. Resultados cromatografía en capa fina. Láminas lado derecho (rojo de metilo y O-
nitrofenol vs Sustancia problema). Laminas lado izquierdo (Sudan III y m-nitroanilina vs sustancia
problema).

Tabla 1. Resultados de la cromatografía de capa fina inicial.

Placa I Placa II
Compuesto Distancia(cm)±0.05 Compuesto Distancia(cm)±0.05
M.P 5.0 M.P 4.6
Metanol O.N 5.4 M.N 4.9
R.M 4.9 S (III) 4.6
M.P 5.7 M.P 5.8
Diclorometano O.N 6.2 M.N 4.6
R.M - S (III) 5.7
M.P 5.4 M.P 5.8
MEK O.N 6.4 M.N 6.5
R.M 5.7 S (III) 6.5
M.P: muestra problema, R.M: Rojo de Metilo, O.N: O-nitrofenol, M.N: M-nitroanilina, S (III): Sudán
(III)

Tabla 2. Resultados de Rf de la cromatografía de capa fina inicial.

Placa I Placa II
Compuesto Rf Compuesto Rf
M.P 0,926 M.P 0,939
Metanol O.N 1,000 M.N 1,000
R.M 0,907 S (III) 0,939
Diclorometano M.P 0,919 M.P 1,000
 O.N 1,000 M.N 0,793
R.M - S (III) 0,983
M.P 0,844 M.P 0,892
MEK O.N 1,000 M.N 1,000
R.M 0,891 S (III) 1,000

Tabla 3. Resultados cromatografía en capa fina final.

Compuesto Distancia (cm)

Solvente 5,6
Diclorometano S (III) 5,5
Rf: 0,982
Solvente 4,9
MEK R.M 4,7
Rf: 0,959

Figura 3. Cromatografía en columna, separación del Sudán (III) usando Diclorometano.

 Figura 4. Cromatografía en columna, separación del Rojo de Metilo usando MEK.

5. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Distancia medida desde la línea sobre la cual se colocaron las muestras.

El metanol fue el solvente más polar de los que se escogieron para hacer la cromatografía en capa
fina. Fue capaz de arrastrar tanto la sustancia problema como los colorantes de referencia que se
usaron, pero no de separarlos con una distancia significativa. Este solvente parece arrastrar del rojo
de metilo otro componente adicional, pues como se observa en la Figura 2. La placa muestra una
mancha a la altura de 4.8 cm y otra un poco más pequeña a la altura de 5.4 cm, sin embargo, en la
línea base se sigue viendo parte del colorante en cuestión, razón por la cual se intuye que el metanol
no es el mejor eluyente para aislar el Rojo de Metilo. Si se analizan las distancias recorridas usando
metanol como eluyente se llega a la hipótesis de que la sustancia problema contiene rojo de metilo
y Sudán III.

Tabla 4. Comparación de la polaridad de la molécula de los solventes utilizados

Solvente Momento Dipolar (Debye)

Diclorometano 1,55
Metanol 1,70
MEK 2,76
El Diclorometano fue el solvente de mediana polaridad que se escogió para hacer la cromatografía
en capa fina, en la gráfica x se puede observar que este solvente no arrastra al rojo de metilo y que
de la muestra problema sólo alcanza a arrastrar una de las sustancias que la componen, que según
las distancias registradas equivaldría al Sudán III.

Después de analizar los resultados obtenidos en la cromatografía en capa fina se determinó que la
sustancia problema era una mezcla de Rojo de metilo y Sudán (III) y que la mejor forma de
separarlos era usando dos solventes: Diclorometano y MEK. En un principio se intentó separar los
colorantes usando únicamente MEK, pero tal como muestra la figura 2 este eluyente arrastra
demasiado al Sudán (III) y no es capaz de aislarlo, por tal razón, se decidió realizar una primera
separación con Diclorometano, de la cual se obtuvo la muestra roja que se observa en la figura 3
(parte inferior de la columna), y luego realizar una segunda separación usando MEK para separar el
rojo de metilo tal como se muestra en la figura 4 (parte superior de la columna).

Finalizada la separación cromatográfica por columna se obtuvieron por purificación los

compuestos puros de la muestra problema, realizando nuevamente la cromatografía de capa fina
para verificar los resultados de la primera cromatografía. En ambos casos la separación nos mostro
que los compuestos que se supusieron estaban en la muestra problema eran acertados.

6. CONCLUSIONES
 La cromatografía de capa fina utiliza el principio de la separación liquido-liquido, en una
muestra problema realizando un barrido con diferentes solventes podemos apreciar con cuál
de ellos, los compuestos aislados tienen mayor afinidad en función de su polaridad.

 La cromatografía de capa fina como método de identificación de compuestos es muy eficiente,

teniendo en cuenta los costos, la rapidez y sencillez del procedimiento, además tiene una gran
ventaja que permite la utilización de otros compuestos, o luz UV, para poder observar de mejor
manera las placas cuando los compuestos son de difícil identificación por el arrastre de las
placas

 La cromatografía de columna tiene una mayor ventaja porque se pueden corroborar las
muestras obtenidas, hacer una separación que nos permita identificar la muestra problema con
mayor detalle.

 Los resultados de la cromatografía en capa fina y en columna arrojaron que los compuestos
presentes en nuestra muestra problema era: Sudan III y Rojo de Nitrilo

7. CUESTIONARIO

Cuestionario practica 5:

1. Si al momento de introducir la placa, el eluyente toca el sitio de aplicación de la mancha, se da

una mala lectura del dato final de la cromatografía porque el dato de Rf se calcula comparando
 la distancia recorrida por el centro de la mancha de la sustancia desde el punto de aplicación
con la distancia recorrida por el eluyente también desde el punto de aplicación.

2. El efecto de la polaridad e la cromatografía es de vital importancia en el procedimiento debido

a que se debe tener en cuenta tanto en la fase móvil como en la inmóvil. Es decir, dependiendo
de la polaridad del solvente, la muestra problema será arrastrada por él o permanecerá en el
mismo lugar.

3. Las consecuencias de una columna mal empacada son: la unión de impurezas o demás
compuestos que la muestra problema pueda poseer con la sustancia que se pretende separar.

4. La diferencia entre estos dos tipos de cromatografía es la fase móvil, ya que cuando se tiene
una cromatografía de gases lo que se usa es un gas para arrastrar la sustancia que se encuentra
en la fase inmóvil, mientras que la cromatografía líquida utiliza un líquido para este fin.

5. Para el caso de las sustancias incoloras, hay placas que deben contener indicadores de
fluorescencia para facilitar la identificación de las muestras. Si no se usa un indicador y los
componentes no presentan alguna coloración, sería necesario usar técnicas de revelado.

6. Parámetros de la cromatografía líquida de alta eficiencia

- Tipo de la muestra: Cualquier sustancia puede ser potencialmente analizada, especialmente si es

de baja polaridad

- Fase estacionaria: Debe ser un sólido finamente dividido (partícula con diámetro de 3-10 m) ,
polar, con gran área superficial específica (200 m2/ g)

- Fase móvil: Alta pureza, inactividad frente a la fase estacionaria, baja viscosidad, compatible con
la muestra, que facilite la recuperación de la muestra, compatible con el sistema de detección.

- Desgasificación: Reduce el riesgo de formación de burbujas en la columna o en el detector.

-Precolumna: Se trata de una pequeña columna (0,5 – 3 cm) colocada entre el inyector y la columna.
Ayuda a prevenir la entrada de suciedad, procedente de la muestra o del eluyente, en la columna
analítica y permite alargar la duración de las columnas.

-Detectores: UV/Vis, fotodiodos, índice de refracción, fluorescencia, conductividad, dispersión de

luz y espectrometría de masas

-pH: En fase normal, debe ser usada para moléculas neutras y semi-polares. El pH no es un factor
relevante.

7. Según lo encontrado, el Diclorometano tiene una polaridad de una constante dieléctrica de 9,1
lo que indica que los compuestos se organizarán en el siguiente orden en la placa:

Fase móvil (poco polar) Fase estacionaria (polar)

El orden en el que se encontrarán (de arriba abajo) en la placa será: Naftaleno, acetato de fenilo y
ácido butírico, este orden es directamente proporcional a la afinidad de los compuestos con la fase
móvil, e inversamente proporcional a la afinidad con la fase estacionaria.

 Naftaleno (no polar)

 Acetato de fenilo (polar)

 Ácido Butírico (polar)

8. Los compuestos más afines con la fase móvil serán los de mayor Rf, esto es los compuestos
menos polares. En orden creciente de Rf será:

 Decano (no polar)

 2-octanona (no polar)

 Acetaldehído (poco polar)

 1-butanol (polar)
  Ácido acético (polar)

9. Si se siembra mucha muestra en la cromatoplaca se da un efecto de dilución con las muestras

que se encuentran al lado de ella. Es decir, a medida que la fase móvil (eluyente) va actuando,
se va dando un proceso de dilución con las muestras cercanas y, por tanto, no sería posible
lograr una buena visualización de la distancia recorrida por la mancha desde el punto de
aplicación.

10. Esto prueba que solo hay un producto presente porque, cuando hay más de dos sustancias en
la misma mezcla y se trata con el eluyente apropiado, la mancha tiende a dividirse en dos o más
fases que representan los componentes de la mezcla.

11. El proceso de saturación de la cámara en el proceso de separación es un aspecto muy

importante debido a que la distancia recorrida por la sustancia desde el punto de aplicación
puede ser afectada. Sumado a esto, para realizar cromatografía de capa fina, es de gran
importancia que no se encuentren fluyendo corrientes de aire, debido a que esto afecta la
medición de la distancia mencionada anteriormente.

Cuestionario practica 6:

1. Un colorante se piensa que puede ser azul de metileno, ¿Cómo se podría comprobar esta
suposición utilizando un procedimiento basado en una técnica cromatográfica?
Haciendo uso de la cromatografía de capa fina, se buscan diferentes eluyentes que presenten
o no afinidad con la muestra y las fases estacionarias adecuadas que estén disponibles en el
laboratorio. Se procede a determinar el valor de Rf para realizar el estudio adecuado y
determinar la composición de la muestra, y comprobar la presencia de azul de metileno en este
caso.

2. ¿Qué debe hacerse para encontrar el eluyente adecuado para una sustancia en una
cromatografía de columna?
Con la estructura de la molécula conocida se deben tener en cuenta las interacciones
intermoleculares que pueden existir entre la sustancia y tanto la fase móvil como la
estacionaria para determinar si la sustancia se moverá a través de la columna.
 3. ¿La recuperación cuantitativa del producto principal de la práctica, sería más eficiente
mayores o menores de 8 mL? ¿Por qué?
Con fracciones pequeñas se puede garantizar la separación de un solo componente, si son
grandes las fracciones puede ocurrir que el componente que se mueve tenga algo del otro
componente. En este caso sería más eficiente la fracción menor a 8 mL.

4. Indique algunas de las aplicaciones de la cromatografía en columna y de capa fina.

La cromatografía de columna sirve para la separación de componentes de plantas medicinales,
de síntesis orgánica, de colorantes. Identificación de hioscina y de morfina, separación de ácido
acético, alcohol cetilico y metil-etil cetona. Además en la producción sintética de acetaminofén,
identificación de la imina de la N-acetilbenzoquinona, entre otros.

La cromatografía de capa fina se suele utilizar para la identificación de una sustancia conocida
en una mezcla por su comparación con una sustancia patrón. Por otro lado sirve para
determinar el grado de pureza de alguna muestra.

5. Escriba una lista de eluyentes utilizados en cromatografía en columna en orden de polaridad

decreciente.
· Éter de petróleo
· Éter dietílico
· Ciclohexano
· Acetato de etilo
· Tetracloruro de carbono
· Piridina
· Benceno
· Etanol
· Cloroformo
· Metanol
· Diclorometano
· Agua
· Ácido acético

6. ¿Cuál es la diferencia entre la cromatografía en capa fina y la cromatografía en papel?

En la cromatografía sobre papel y en la cromatografía en capa fina la fase estacionaria no se
dispone en forma de columna, sino que está constituida, en el primer caso, por una hoja de
papel de filtro y, en el segundo, por una capa de absorbente finamente dividido extendida sobre
una placa de vidrio o de plástico. El principio de funcionamiento es muy similar para ambos
tipos de cromatografías. En la cromatografía en capa fina se desarrolla más rápidamente,
proporciona mejores separaciones y se puede elegir entre diferentes adsorbentes.

7. Indique la toxicidad de las sustancias que utilizó y cómo se podrían desechar.

 Éter de petróleo: Provoca irritación cutánea y daños en los órganos. Es tóxico para
organismos acuáticos, con efectos nocivos duraderos. Se sospecha que perjudica la
fertilidad. Se recomienda recoger con materiales absorbentes o en su defecto con
arena o tierra secas y depositar en contenedores para residuos para su posterior
eliminación.
  Sudán III: es nocivo en caso de inhalación, nocivo en contacto con la piel. Debe ser
eliminado en el punto de recogida de residuos especiales o peligrosos, conforme la
reglamentación local.
 Rojo de metilo: Es tóxico para los organismos acuáticos, puede provocar a largo plazo
efectos negativos en el medio ambiente acuático. Se debe evitar su liberación al medio
ambiente, desechar en recipiente adecuado.
 p-Nitrofeno: Es nocivo por ingestión, tiene peligro de efectos acumulativos. Es nocivo
para los organismos acuáticos, provocando efectos negativos en el medio ambiente
acuático. Se debe almacenar alejado de agentes oxidantes y de bases fuerte. Sin
embargo, no requiere medidas especiales.

8. ¿Qué fenómenos físico-químicos intervienen en una separación cromatográfica de

columna?
Fuerzas intermoleculares son el fundamento de la separación cromatográfica, tanto las fuerzas
de van der Waals dipolo-dipolo y puentes de hidrógeno son las que definen el movimiento de
las sustancias.

9. ¿Qué es una serie eluotrópica?¿Qué utilidad tiene en la cromatografía de columna?

La serie eluotrópica es una lista de eluyentes organizados por la polaridad. Como la
cromatografía depende de las fuerzas intermoleculares, un eluyente de mayor polaridad
arrastrará más una sustancia polar a través de la columna.

10. Realice un cuadro comparativo entre la cromatografía de capa fina y de columna.

Cromatografía de capa fina Cromatografía de columna

 La fase estacionaria es sólida La fase estacionaria puede

 Es una técnica analítica, es decir para el análisis de ser sólida o una suspensión
componentes Es una técnica de
 Se compara simultáneamente con patrones. purificación, pues permite
 Los componentes se diferenciarán en solubilidad y en la separar los componentes de
fuerza de su adsorción. una mezcla
 Consiste en una capa delgada de un adsorbente No se puede hacer una
depositada sobre un soporte plano como una placa de comparación simultánea con
vidrio, o una lámina de aluminio o de plástico. patrones.
Utiliza una columna de vidrio
vertical que se llena con un
soporte sólido

8. REFERENCIAS

C.A. Guerrero Fajardo, W. Polaina Barreto, J. Parra Santiago, Principios De Química Orgánica Guías
De Laboratorio, Editorial Académica Española, 2015.

Smith Van Ness, Introducción a la termodinámica en ingeniería química, México, Mc Graw Hill.

Jhonsson J.A., Cromatographic theory and basic principles, 1987.