UNIVERSIDAD CÉSAR VALLEJO

FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MEDICINA

ASIGNATURA:

FUNDAMENTOS DE AYUDA DIAGNÓSTICA I

ESTUDIANTES:

• ABAD JIMENEZ, GLEIDY SILVANA

• CORDOVA CORDOVA, ANGHELLY

• LOPEZ CORDOVA, ÁNGEL ULISES

• GUERRERO RAMIREZ, CHRISTHIAN ANDRE

• MOSCOL CHUNGA, ANGIE AURORA

DOCENTE:

CARMEN LUISA ALBURQUEQUE ATOCHE

PIURA-PERÚ

2019
 Practica N 3

MEDIOS DE CULTIVO, MÉTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO BACTERIANO

I.INTRODUCCION

Un medio de cultivo ss un sustrato o una solución de nutrientes que permite el crecimiento de

microorganismos .

Puesto que la diversidad metabólica de los microorganismos es enorme, la variedad de medios de

cultivo es también muy grande .La mayoría de los medios de cultivo se comercializan en forma
liofilizada. Las sustancias termolábiles se esterilizan por filtración y se añaden al resto de los
componentes previamente esterilizados en la autoclave

La preparación de un medio de cultivo se reduce en general a pesar la cantidad de medio

disolverla en agua destilada ( libre de inhibidores del crecimiento) siguiendo instrucciones del
fabricante .

El cultivo es el proceso de crecimiento de microorganismos mediante la toma de bacterias de

un sitio de infección (el ambiente in vivo) por métodos de recolección de muestra y crecimiento en
un ambiente artificial en el laboratorio (el ambiente in vitro).

El cultivo bacteriano tiene tres propósitos principales:

-Facilitar el crecimiento y aislamiento de todas las bacterias presentes en una infección.

- Determinar cuáles bacterias que se desarrollan es más probable que sean la causa de la infección
y cuáles son contaminantes probables o colonizadores.

-Obtener desarrollo suficiente de las bacterias relevantes en clínica para permitir su identificación
y caracterización.

- Necesario para los estudios complementarios como los de la sensibilidad de las bacterias a los
distintos antibióticos.

II.OBJETIVOS

1.Conocer la importancia y los diferentes medios de cultivo para el crecimiento bacteriano

2.Realizar tomas de muestras y siembras en medios de cultivo como agar sangre

3.Observación en los medios de cultivo las diferentes colonias bacterianas en crecimiento

y realización de coloración Gram

III.MARCO TEORICO

COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

▪ Agua: destilada o desionizada

▪ Agar: se utiliza como agente solidificante. Es un polisacárido que se obtiene de ciertas algas
marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo.

▪ Azúcares: son una fuente de carbono para los microorganismos. Los más empleados son:
glucosa, lactosa y sacarosa.

▪ Extractos: son preparados de ciertos órganos o tejidos animales o vegetales, obtenidos con agua
y calor. Ejemplo: extracto de carne, de levadura, de malta.

▪ Peptonas: son proteínas hidrolizadas, se obtienen por digestión química o enzimática de

proteínas animales o vegetales.

▪ Fluidos corporales: sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguíneo, son
añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos microorganismos patógenos.

▪ Sistemas amortiguadores: son sales que se añaden al medio para mantener el pH dentro del
rango óptimo del crecimiento bacteriano. Ejemplo: fosfato disódico o dipotásico.

▪ Indicadores de pH: son indicadores ácido-base que se añaden para detectar cambios de pH en el
medio.

▪ Agentes reductores: sustancias que se añaden al medio para crear condiciones que permitan el
desarrollo de los gérmenes microaerófilos o anaerobios. Ejemplo: cisteína, Tioglicolato.

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

▪ Por su consistencia

• Medio de cultivo líquido: caldo Nutritivo, caldo Selenito, caldo Peptonado

• Medio de cultivo semisólido: agar Sulfuro, Indol y Movilidad (SIM), agar

Movilidad, Indol y Ornitina (MIO)

• Medio de cultivo sólido: agar Sangre, agar Mac Conkey, agar Manitol salado.

▪ Por su función o fines especiales

• Medios nutritivos (simples): con nutrientes mínimos para que las bacterias poco

exigentes desarrollen. Ejemplo: caldo y agar Nutritivo.

• Medios nutritivos enriquecidos: son medios simples a los que se añaden ciertos
productos a manera de suplemento nutritivo que permiten el aporte de factores de crecimiento.
Ejemplo: agar Sangre, agar Chocolate.

• Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que por su composición química

favorecen o permiten la multiplicación de unos microorganismos, inhibiendo parcialmente la de
otros. Ejemplo: caldo Selenito, caldo Peptonado alcalino.

• Medios selectivos: permiten el crecimiento sólo de la especie que se desea aislar, para lo cual se
les agrega colorantes bacteriostáticos: Azul de metileno, Verde malaquita, Verde brillante.
Ejemplos: agar Mac Conkey, agar Salmonella- Shigella (SS), agar Manitol salado.

• Medios diferenciales: contienen sustancias nutritivas y un indicador de pH que permite

detectar las reacciones bioquímicas específicas de los microorganismos. Ejemplo:
agar Triple azúcar (TSI), agar Úrea, agar Citrato de Simmons.

• Medios de transporte: permite mantener viables a los microorganismos durante el traslado al

laboratorio. Ejemplo: caldo Hafna, Cary Blair, Stuard.

METODOS DE SIEMBRA

En Microbiología se entiende como siembra al proceso mediante el cual se lleva una porción de
una población de microorganismos (inóculo), de un cultivo crecido a un medio nutritivo para su
crecimiento. Todo este proceso hay que llevarlo a cabo con instrumentos y medios previamente
esterilizados y siguiendo las instrucciones de los profesores de práctica. La principal advertencia
consiste en trabajar siempre próximos a la llama del mechero que, debido a las corrientes de
convección verticales que genera es capaz de crear un ambiente estéril en la zona inmediatamente
alrededor y debajo de la llama.

Para realizar un cultivo de microorganismos es necesario que el número de células

bacterianas (inóculo) sea transferido (inoculado) a un medio de cultivo estéril. Al querer aislar una
especie en particular a partir de una mezcla de microorganismos deben emplearse técnicas de
aislamiento lo que permite, obtenerlas en forma pura. Esto implica la utilización de medios tanto
simples como especiales, mayormente sólidos de acuerdo a la naturaleza del microorganismo.

Las técnicas de cultivo se realizan por siembra o diluciones sucesivas:

▪ Por siembra: es el procedimiento por el cual se pone en contacto al microorganismo con un

medio de cultivo, para que en condiciones óptimas de temperatura y tiempo de incubación, pueda
desarrollar y multiplicarse in vitro. La finalidad es el aislamiento para tener un cultivo puro de
bacterias a partir de una muestra problema (orina, heces, secreciones, agua servida).

La siembra puede ser:

▪ Por inoculación

▪ Por estrías simples

▪ Por dispersión o agotamiento

▪ Por puntura

▪ Por diluciones sucesivas

▪ Técnica de siembra por diluciones sucesivas

IV.MATERIALES

▪ Asa de siembra en aro y en punta

▪ Tubos de vidrio de 16 x150mm

▪ Tubos de caldo Nutritivo con cultivo mixto bacteriano: Staphylococcus aureus y

Escherichia coli

▪ Placas con agar Nutritivo, agar Sangre , agar Manitol salado , agar Mc Conkey

▪ Tubos con caldo y agar Nutritivo

▪ Suero fisiológico estéril

▪ Mechero de Bunsen

▪Placas Petri con variados medios de cultivo en los que han crecido colonias bacterianas

V.PROCEDIMIENTO

El profesor demostrará el manejo adecuado del asa y explicará las precauciones que se deben
tener en la toma de la muestra:

▪ Esterilizar el asa y dejarla enfriar para evitar quemar a las bacterias

▪ Sumergir el asa hasta el fondo del cultivo líquido, ya que en este lugar se encuentra una mayor
concentración de microorganismos.

▪ Observar que al retirar el asa del tubo esté cubierta por una película líquida.

▪ El asa de siembra se toma del mango como si fuera un lápiz

▪El tapón del tubo se toma con el dedo meñique

▪La boca del tubo se flamea después de abrirlo

 El asa de siembra se toma del
mango como si fuera un lápiz

El tapón del
tubo se toma

La boca del tubo

se flamea
después de

■ MÉTODO DE SIEMBRA POR AGOTAMIENTO: AISLAMIENTO A PARTIR DE UN CULTIVO MIXTO

▪ Con un lápiz graso marcar por detrás de la placa que contiene el agar, las líneas como está
indicado en la figura, por lo que quedarán tres sectores: el sector uno (1) el más pequeño de los
otros dos, servirá para descargar el asa.

▪ Esterilizar el asa y obtener una asada de cultivo del medio líquido, cerrar el tubo y colocarlo en la
gradilla.

▪ Con la mano izquierda levantar parcialmente la tapa de la placa de Petri y sembrar trazando una
serie de líneas en zigzag muy cerradas a todo lo ancho del sector uno(1). Esto mismo se puede
hacer colocando la placa de Petri sobre la mesa y con la palma de la mano, hacer un movimiento
rápido para levantar el fondo que contiene el medio de cultivo, como lo indicará el profesor.

▪ Esterilizar el asa en el mechero. Girar la caja 90 grados, hasta que el sector uno (1) quede a la
izquierda y el sector dos (2) hacia arriba. Sin volver a tomar el inóculo, trazar un zigzag un poco
más abierto en el sector dos (2), invadiendo el sector uno (1) en las primeras líneas del zigzag, pero
no en las últimas.

▪ Girar nuevamente la placa 90 grados, ahora el sector dos (2) estará a la izquierda y el
sector tres (3) hacia la derecha.

▪ Hacer un nuevo zigzag en el sector tres (3), invadiendo el sector dos (2). Este paso puede
repetirse sembrando un cuarto sector.

▪ Incubar las placas a 37º C durante 24 horas. Las placas ya sembradas deberán colocarse con la
tapa hacia abajo y la parte que contiene el agar sembrado hacia arriba.
 1

2 3
2

Figura Nº 1 Figura Nº 2

■ MÉTODO DE SIEMBRA EN CALDO DE CULTIVO

▪ Coger el asa de siembra en aro, esterilizarla al mechero al rojo vivo y dejarla enfriar por unos
segundos.

▪ Abrir la placa que contiene el agar con el crecimiento bacteriano y con la ayuda del asa de
siembra coger una colonia bien aislada (figura Nº 1).

▪ Luego destapar un tubo con caldo de cultivo (figura Nº 2), coger la torunda, que está dentro de
este con el dedo meñique de la mano con que se está cogiendo el asa de siembra con la colonia

▪ Introducir el asa de siembra en el tubo y agitar suavemente hasta que se despréndala colonia del
asa de siembra.

▪ Introducir la torunda, tapar el tubo, llevar a esterilizar el asa de siembra y homogeneizar bien el
caldo.

▪ Llevar a incubar a 37º C por 12 horas.

Figura N 2

Figura N 1
Transcurrido el tiempo de incubación, observar el desarrollo bacteriano en los medios de cultivo
líquido y sólido y realizar coloración Gram .

▪ Medio líquido : la turbidez indica desarrollo

▪ Medio sólido : presencia de colonias

CARACTERÍSTICAS DE LA COLONIA

Es importante destacar las características clave de una colonia bacteriana para toda identificación
bacteriana; el éxito o el fracaso de los procedimientos posteriores de identificación a menudo
dependen de la precisión de estas observaciones. Los criterios utilizados con frecuencia para
caracterizar el crecimiento bacteriano son:

-Tamaño de la colonia (por lo común calculado en milímetros o descrito en términos relativos

como cabeza de alfiler, pequeño, medio, grande)

- Pigmentación de la colonia

- Forma de la colonia (incluye forma, elevación y bordes de la colonia

- Aspecto de la superficie de la colonia (p. ej., brillante, opaca, roma, transparente)

- Cambios en los medios con agar como resultado del crecimiento bacteriano (p. ej., patrón
hemolítico en agar sangre, cambios en el color de los indicadores de pH,corrosión de la superficie
del agar)

- Olor (ciertas bacterias producen olores característicos que pueden ayudar a la identificación
preliminar )

VI.RESULTADOS

Después de incubar, realizar la lectura, observar y graficar los resultados.

Staphylococcus espirilo

VII.PREGUNTAS DE APLICACIÓN

1. ¿Por qué el agar Nutritivo es un medio de uso general para el cultivo bacteriano? ¿Qué
sustancias se le pueden agregar para hacerlo enriquecido para bacterias Gram positivas?

Porque permanece sólido incluso a relativamente altas temperaturas. Además, el

crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la superficie, por lo que se distinguen
mejor las colonias pequeñas.
En un caldo de nutrientes, la bacteria crece en líquido y aparece como una sustancia
espesa, con colonias difícilmente observables.

2. Mencione los 5 factores determinantes para la preparación de un medio de cultivo.

1. Fluidez
2. Ph
3. Esterilización
4. Tensión de oxigeno
5. temperatura

3. Cual es la composición , uso y fundamento de los siguientes medios : Agar Mac Conkey,
Agar Salmonella- Shigella (SS), Agar Manitol salado, Agar sangre , Agar chocolate y Agar
Sabouraud
 Composición y uso de Agar Mac Conkey:
o Contiene una base de peptona con lactosa. Los microorganismos Gram positivos
son inhibidos por el cristal violeta y las sales biliares. Rojo neutro como indicador.
Y es utilizado para el aislamiento y diferenciación de bacilos entéricos
gramnegativos fermentadores y no fermentadores de la lactosa.
 Agar Salmonella- Shigella (SS):
o El agar SS tiene una composición compleja; está constituido por extracto de carne,
peptona, lactosa, sales biliares, citrato de sodio, tiosulfato de sodio, citrato férrico,
agar, rojo neutro, verde brillante y agua destilada. Dada su gran selectividad se
pueden sembrar muestras con abundante flora mixta. En los laboratorios de
microbiología el medio Salmonella-Shigella es muy utilizado para investigar la
presencia de Salmonella y Shigella en muestras de heces diarreicas, aguas
residuales, agua potable y alimentos.
 Agar Manitol salado
o Compuesto por una base de peptona, manitol y rojo fenol como indicador. La
concentración de sal al 7,5% inhibe la mayoría de las bacterias. Utilizado para
Aislamiento selectivo de estafilococos.
 Agar sangre
o Agar con sustrato nutritivo (extracto de levadura, peptona, hidrolizado de hígado),
cloruro de sodio, con 5% de sangre de cordero. Utilizado para cultivo de
microorganismos con requerimientos especiales de cultivo, determinación de
reacciones hemolíticas.
 Agar Chocolate
o Es un Medio extremadamente nutritivo, preparado con adición de sangre de
cordero calentada sobre 80ºC hasta que el medio se torne parduzco, para liberar
la hemoglobina y entregar al medio todos los factores de crecimiento. Utilizado
para Cultivos de especies de Haemophilus y especies patógenas de Neisseria.
 Agar dextrosa Sabouraud
o El agar Sabouraud, también conocido como agar dextrosa Sabouraud, es un medio
de cultivo sólido, especialmente enriquecido para el aislamiento y desarrollo de
hongos, como levaduras, mohos y dermatofitos.
o El medio contiene peptona de caseína y digerido pancreático de tejido animal,
que proporcionan la fuente de carbono y nitrógeno para el desarrollo de los
microorganismos.
o También contiene alta concentración de glucosa, que actúa como fuente de
energía favoreciendo el crecimiento de los hongos por encima de las
bacterias. Todo ello mezclado con agar-agar, componente que le brinda la
consistencia adecuada.
o Por otra parte, el agar dextrosa Sabouraud puede ser selectivo si se le agrega
antibióticos.
o Con antibióticos es especialmente útil en muestras de heridas, úlceras abiertas o
cualquier muestra en la que se sospeche gran contaminación bacteriana.
EVALUACIÓN

1. ¿Qué medios de cultivo utilizaría para cultivar una secreción abdominal en la que se sospecha
de bacterias anaerobias?

 Agar sangre
 Agar chocolate
 tioglicolato

2. ¿Por qué el agar Nutritivo es un medio de uso general para el cultivo bacteriano? ¿Qué
sustancias se le pueden agregar para hacerlo enriquecido para bacterias Gram positivas?

Porque permanece sólido incluso a relativamente altas temperaturas. Además, el crecimiento

bacteriano en este agar lo hace en la superficie, por lo que se distinguen mejor las colonias
pequeñas.

En un caldo de nutrientes, la bacteria crece en líquido y aparece como una sustancia espesa, con
colonias difícilmente observables.