FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

✓ Alumna: Vega Vilca, Verónica de los Ángeles

✓ Docente: Rodríguez Haro, Icela Marissa

✓ Experiencia curricular: Microbiología y Parasitología

✓ Tema: Observación microscópica, características

morfológicas y culturales de las bacterias

✓ Ciclo: “5to”

TRUJILLO – PERÚ

2020
 OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA, CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS,
TINTORIALES Y CULTURALES DE LAS BACTERIAS

A. MARCO TEÓRICO

1. EL MICROSCOPIO COMO HERRAMIENTA PARA LA OBSERVACIÓN MICROBIANA

Los microorganismos, concretamente las bacterias, pueden observarse directamente al

microscopio de campo claro. Sin embargo, debido al bajo contraste entre las células y su
entorno, estos procedimientos se utilizan en ocasiones muy limitadas, como por ejemplo para
la observación de la movilidad bacteriana. Los microscopios de contraste de fases,
interferencia diferencial (DIC o la microscopía de Nomarski) y campo oscuro permiten
aumentar el contraste, empleándose para la observación de vainas, filamentos u otras
estructuras bacterianas. (Vázquez & Martín, 2010)

2. OBSERVACIONES MICROSCOPICAS

No podemos estudiar una muestra sin antes llevar a cabo una preparación del mismo para
poder observarlo. La preparación del objeto de estudio puede resultar un proceso simple o,
por el contrario, ser bastante complejo, dependiendo de la naturaleza y características de
aquello que queremos observar.
La preparación de una muestra para estudiarla al microscopio óptico es diferente según la
naturaleza del material que ha de ser observado, orgánico o inorgánico, y si es orgánico, según
queramos observar morfología y estructuras, que no se modifican cuando sobreviene la muerte
celular. (N. & P.M., 2020)

3. FORMAS Y AGRUPACIONES BACTERIANAS

Las bacterias pueden ser observadas individualmente a través de un microscopio o a simple

vista si estas están en conjunto al formar colonias. Vistas al microscopio, por lo general, las
bacterias presentan tres formas básicas: las bacterias esféricas se denominarán cocos, las
alargadas serán bacilos, las bacterias curvadas y las que tienen forma de espiral serán los
espirilos, espiroquetas, comas o vibriones; cada una de ellas presentarán distintas
características.

3.1. COCOS

Estas bacterias presentan formas casi esféricas y sus agrupaciones son

homogéneas. El tamaño de los cocos oscila entre los 0,8 a 1,0 m. y pueden
presentar y tomar diversas formas, producto de dos factores importantes como
son la tendencia de las células a mantenerse unidas, una vez sucedida la división y
el o los planos de división celular. Estas agrupaciones pueden ser:
 - Diplococos: Estos, después de su división, permanecen en pares, por ejemplo,
la Neisseria (Meningococo).

- Tétradas: Estos cocos se dividen en dos direcciones perpendiculares, formando

una agrupación de cocos en una disposición cuadrada.

- Sarcinas: Producto de la división de los cocos en tres direcciones

perpendiculares, formando una agrupación de cocos con una disposición
cúbica.

- Estreptococos: Estos cocos se dividen en un solo plano, formando una

secuencia de cuatro o más células como si se tratase de una cadena.

- Estafilococos: Formados por la agrupación irregular de cuatro o más cocos, en

ocasiones se asemejan a racimos de uvas.

3.2. BACILOS:

Estas bacterias forman agrupaciones bastante heterogéneas por su variedad de

subtipos morfológicos, que pueden ser cilíndricos, en forma de bastón, largos y
delgados, pequeños y gruesos, también pueden presentar variaciones en sus
extremos pudiendo ser rectos, afilados o redondeados. Al igual que los cocos,
pueden presentar varias formas según la tendencia que tengan células hijas para
mantenerse unidas, estas agrupaciones pueden ser:

- Diplobacilos: Formados por bacilos agrupados en pares.

- Estreptobacilos: Agrupación semejante a una cadena formada por cuatro o

más bacilos.

- Empalizado: Son bacilos agrupados lado a lado como palitos de fósforo.

- Formas filamentosas: Son bacilos que crecen en forma de fibras y toman

distintas disposiciones por lo que esta formación se denomina también letras
chinas. (Vargas Flores & Kuno Vargas , 2014)

3.3. ESPIRILOS

Los espirilos o spirilum son un grupo de bacterias caracterizadas por su forma

espiral o tipo sacacorchos. Son bacterias gram-negativas heterótrofas aeróbicas.
Prefieren generalmente un medio acuático, donde el nivel de oxígeno es menor
que en la atmósfera. Tienen una pared celular rígida y usan flagelos (un apéndice
largo, parecido a un látigo) en cada extremo para moverse. (Caldwell, 2018)
Dentro de este grupo se encuentran:
 - Espiroquetas: Presentan una forma helicoidal, pero a diferencia de los
espirilos, poseen un cuerpo flexible, se mueven con la ayuda de filamentos
axiales que son flagelos periplasmáticos, lo que les permite dar varias vueltas
completas alrededor de su propio eje.

- Vibriones: Son espirilos bastante cortos, por lo general presenta la forma de

una coma. (Vargas Flores & Kuno Vargas , 2014)

4. COLORANTES

4.1. DEFINICIÓN

Un colorante biológico es una molécula que es capaz de unirse a una estructura de

la célula y darle color. Los colorantes se emplean también en la constitución de los
medios de cultivo, como indicadores o como inhibidores.

4.2. CLASIFICACIÓN

- Colorantes naturales: Los colorantes que se extraen de productos vegetales o

animales se denominan colorantes naturales, entre los que se encuentran: el
carmín, el tornasol, el índigo y la hematoxilina.

- Colorantes artificiales: Otros, como los extraídos del alquitrán de hulla, son
anilinas sintéticas. En la actualidad, el término colorante de anilina se está
abandonando porque muchos de los colorantes sintéticos en uso, no derivan de
la anilina.

4.3. FUNCIONES

Aunque los microorganismos vivos se pueden observar directamente en fresco al

microscopio óptico, la mayoría de las veces es necesario teñirlos para que, por
medio del uso de colorantes, sea mucho más fácil su identificación; además, la
presencia de ciertas estructuras, así como su reacción a determinadas técnicas, nos
permite clasificar a las bacterias. Así pues, los colorantes tienen las siguientes
funciones:

a) Permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes

b) Revelan su forma y tamaño
c) Muestran la presencia de estructuras internas y externas
d) Producen reacciones químicas específicas
Hay un número muy elevado de colorantes que se emplean en los laboratorios de
histología con usos diversos, lo que depende de lo que queramos observar en
nuestra preparación. Los colorantes se eligen en función de su color, forma y peso
molecular, solubilidad y su capacidad para reaccionar con moléculas del tejido.
(López Jacome & Hernández Durán, 2014)
 4.4. TIPOS DE COLORANTES MÁS USADOS EN BACTERIOLOGÍA

Colorantes básicos

Los básicos son los más usados en bacteriología, debido a que las bacterias,
ricas en ácidos nucleicos, portan cargas negativas en forma de grupos fosfatos,
los que se combinan con los colorantes cargados positivamente.
Entre los colorantes básicos, los más empleados son: tionina, azul de toluidina,
azul de metileno, fucsina, violeta cristal, violeta de genciana, verde metilo,
safranina y verde de malaquita. Entre los ácidos podemos citar: naranja G, ácido
pícrico, fucsina ácida y eosina. (Llop Hernández & Váldez, 2001)

Colorantes ácidos

Los colorantes ácidos se utilizan en técnicas especiales, coloraciones negativas

o en métodos para estudiar algunas estructuras bacterianas, fundamentalmente
citoplasmáticas. La sustancia colorante esta a cargo del anión, mientras que el
catión no tiene esa propiedad. Un ejemplo es la eosina o Eosinato de sodio. El
grupo carboxilo (ácido) es el grupo funcional activo en la molécula. (Corrales
Ramírez & Caycedo Lozano, 2020)

Colorantes Neutros

Existe un grupo de sustancias, cuya base y ácido tienen carácter colorante, y son
denominadas colorantes neutros. se obtienen a partir de los precipitados
provenientes de soluciones acuosas en las que se encuentran disueltos
cromóforos con características ácidas y básicas. El colorante se produce
disolviendo el precipitado en alcohol, tal es el caso de la Giemsa. Entre ellos se
encuentra el grupo de los eosinatos: eosinato de azul de metileno, de azul de
toluidina, de violeta de metilo. (Llop Hernández & Váldez, 2001)

5. COLORACIÓN

5.1. Definición: la coloración es un proceso mediante el cual un objeto es coloreado con

la participación de uno o varios colorantes.

5.2. Tipos de coloración: De acuerdo a los objetivos que se persigan, los métodos de
coloración se clasifican en:

a) Coloración simple: Usan un solo colorante, que siempre es de tipo básico. Se utilizan
solamente para incrementar el contraste; todas las células absorberán el colorante y
quedarán teñidas del mismo color. Se emplean para la observación del tamaño, forma y
agrupación de las células.

El proceder consiste en dejar actuar, durante un tiempo, la solución colorante sobre el

frotis. Los colorantes más empleados son: azul de metileno, fucsina diluida, tionina
fenicada, azul de toluidina, safranina y cristal violeta. (Corrales Ramírez & Caycedo
Lozano, 2020)
b) Coloración compuesta o diferencial:

En estas se utilizan varios colorantes combinados, las estructuras celulares se diferencian

en función de los colorantes que fijan.
Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen distinta composición química;
y, por lo tanto, reaccionan de forma diferente frente a una tinción, lo que permite clasificar
los microorganismos en diferentes grupos. Los ejemplos clásicos serían la tinción de Gram
o la de Ziehl-Neelsen. (Corrales Ramírez & Caycedo Lozano, 2020)

6. COLORACIÓN COMPUESTA GRAM Y DE ESPORAS

Coloración Gram

En 1884, Hans Christian Gram desarrolló un método de tinción bacteriana que

coloreaba algunas células de color azul-violeta y otras que se decoloraban, se teñían con
el color de la solución colorante empleada como contraste.
En el procedimiento para la coloración de Gram se usan cuatro reactivos diferentes. El
primero es una solución de cristal violeta (cloruro de hexametil-p-rosanalina), que tiñe
todas las células de color azul-violeta.
El segundo reactivo es una solución de Lugol (yodo-yoduro de potasio). El yoduro
remplaza al cloruro en la molécula de cristal violeta y el complejo formado se vuelve
insoluble en agua. Todas las células reaccionan de igual forma.
La adición de un tercer reactivo, decolorante (acetona y etanol), remueve solamente el
colorante de las células gramnegativas. Con el fin de explicar esta manera de actuar se
han planteado diversas causas, entre ellas, diferentes uniones al magnesio, a las
ribonucleasas o al ácido nucleico. También se señalan diferencias en la permeabilidad,
que sugiere que el alcohol decolora la membrana externa de las bacterias
gramnegativas, las cuales permiten la salida del complejo cristal violeta-Lugol.
La safranina, colorante de contraste y cuarto reactivo empleado en el método, hace
visible las células gramnegativas al teñirlas de color rojo.
Se ha demostrado que la estructura de la pared bacteriana es la base de la reacción
diferencial frente a la coloración de Gram. Las bacterias teñidas de azul-violeta,
llamadas grampositivas, poseen grandes cantidades de ácido teicoico en sus paredes
celulares; y las teñidas en rojo, bacterias gramnegativas, contienen lipopolisacáridos.

Coloración de esporas

Algunos géneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen
en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las
condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas
extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, etc.) formándose una espora por cada forma
vegetativa. Al finalizar el proceso de esporogénesis, la célula vegetativa se lisa y libera
la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una
nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante años. Algunas de las
bacterias productoras de endosporas son patógenas para el hombre, por lo que su
estudio y observación son de enorme interés.
En observaciones microscópicas de preparaciones de bacterias sin teñir, las esporas se
observan como cuerpos refringentes intracelulares y si las células bacterianas están
teñidas con los métodos habituales, se aprecian como zonas incoloras en su interior.
Para la tinción de las esporas, habitualmente se utiliza el carbolfucsina o el verde de
 malaquita. El primero, en el método de Ziehl-Neelsen ya descrito, y el segundo, en el
método de Schaeffer-Fulton. En el método de Moeller se aplican los mismos colorantes
que en el procedimiento de Ziehl-Neelsen, pero se fija el frotis con alcohol absoluto y
cloroformo. Por la impermeabilidad de la pared de la espora se requiere calentar la
preparación con el fin de que el colorante penetre.
Al emplear suficiente cantidad de alcohol que permita la decoloración de la célula
vegetativa, la impermeabilidad de la pared no permite la decoloración de la espora.
(Llop Hernández & Váldez, 2001)

7. OBSERVSCIÓN DE CÁPSULA

En microbiología, la tinción negativa proporciona un resultado presuntivo de la

presencia de Cryptococcus neoformans, microorganismo causante de meningitis en
pacientes con inmunosupresión, siendo la técnica más utilizada para poner de
manifiesto su cápsula. Las cápsulas son claramente visibles al microscopio óptico pero
debido a que tienen un índice de refracción muy bajo y son además muy difíciles de
teñir para su observación se utilizan tinciones negativas o especiales para cápsulas. Que
consisten en utilizar colorantes que tiñen el fondo resaltando la cápsula (Tinción de
Buri, método de Welch, tinta china, etc. (Garcia, 2018)

8. CULTIVO DE MICROORGANISMOS

Se denomina cultivo al proceso de propagar los microorganismos, proporcionándoles

las condiciones ambientales adecuadas Los microorganismos en fase de crecimiento
realizan réplicas de sí mismos y requieren de los elementos que se encuentran en su
composición química. Se le deben brindar los elementos nutritivos en una forma
accesible desde el punto de vista metabólico. Además, los microorganismos requieren
energía metabólica con el objetivo de sintetizar macromoléculas y conservar los
gradientes químicos esenciales a través de sus membranas. Durante el crecimiento se
deben regular los factores nutricionales (carbono, nitrógeno, azufre y fósforo, elementos
trazas y vitaminas) y los factores físicos (pH, temperatura, oxígeno, humedad, presión
hidrostática, presión osmótica y radiación). (Llop Hernández & Váldez, 2001)

La propagación e identificación del agente infectante in vitro suele ser el medio más
sensible y específico de diagnóstico y, por ende, es el método más comúnmente
utilizado. En teoría, la presencia de un solo organismo vivo en la muestra puede arrojar
un resultado positivo. La mayoría de las bacterias y hongos pueden cultivarse en una
variedad de medios artificiales, pero los microorganismos intracelulares estrictos (p. ej.,
Chlamydia, Rickettsia y virus) sólo pueden aislarse en cultivos de células eucariotas
vivas. Es posible cultivar algunos parásitos, pero esto se lleva a cabo sólo en
laboratorios altamente especializados. (Kenneth & Ray, 2005)

8.1. Clasificación de los medios de cultivo de acuerdo a su utilidad

A) MEDIOS COMUNES

Son aquellos medios apropiados para el cultivo y mantención de la mayoría de las

bacterias. Sirven de base para la preparación de los medios especiales. - Ejemplo:
Caldo común, Agua peptonada, Agar nutritivo, etc.
B) MEDIOS ESPECIALES

B.1. Medios de cultivo enriquecidos o nutritivos: El componente nutritivo de

un medio está diseñado para satisfacer los requisitos de crecimiento del
organismo a fi n de permitir su aislamiento y propagación. Para propósitos
médicos, el medio ideal permitiría el crecimiento rápido de todos los agentes. No
existe tal medio; sin embargo, existen varios que son suficientes para la
propagación adecuada de la mayoría de las bacterias y hongos de importancia
médica. Estos medios se preparan con los productos digeridos enzimáticos o
ácidos de productos animales o vegetales tales como músculos, leche o soya. El
digerido reduce la proteína original a una mezcla de polipéptidos y aminoácidos
que también incluye metales traza, coenzimas y diversos factores de crecimiento
indefinidos; por ejemplo, un caldo común contiene un digerido pancreático de
caseína (proteína láctea) y un digerido papaico de harina de soya. A esta base
nutritiva se le pueden añadir sales, vitaminas o líquidos corporales como suero a
fi n de proporcionarles a los patógenos las condiciones necesarias para su
desarrollo óptimo.

B.2. Medios de cultivo selectivos: Los medios selectivos se utilizan cuando

se buscan organismos patogénicos específicos en sitios con una flora normal
extensa (p. ej., N. gonorrhoeae en muestras provenientes del cuello uterino o del
recto). En estos casos, las demás bacterias pueden desarrollarse más que la
especie etiológica sospechada en un medio nutritivo sencillo, ya sea porque el
patógeno crece más lentamente o porque se presenta en cantidades mucho más
pequeñas. Por lo general, los medios selectivos contienen pigmentos, otros
aditivos químicos o antimicrobianos en concentraciones diseñadas para inhibir
la flora contaminante pero no el patógeno sospechado. (Kenneth & Ray, 2005)

B.3. Medio de cultivo selectivo diferencial: se utilizan para poner de

manifiesto características distintivas de las colonias. Son medios que distinguen
entre distintos grupos bacterianos en función casi siempre del color de sus
colonias. Por ejemplo, el agar MacConkey es un medio sólido que permite el
crecimiento de bacilos gramnegativos fermentadores y no fermentadores de
lactosa. Los primeros adoptan una coloración rosada que la diferencia de los
segundos. Los medios diferenciales, además, pueden poner de manifiesto
mezclas y contaminaciones en los cultivos. (Cercenado & Cantón, 2010)

B.4. Medios de cultivo para identificación o medios indicadores: Los medios

indicadores contienen sustancias diseñadas para mostrar las características
bioquímicas o únicas de otro tipo de patógenos o grupos de organismos. A
menudo se utiliza la adición de uno o más carbohidratos y un indicador de pH al
medio. Un cambio de color en la colonia indica la presencia de productos ácidos
y, por ende, de fermentación u oxidación del carbohidrato por parte del
organismo. Añadir eritrocitos a las placas permite que se utilice la hemólisis que
producen algunos organismos como característica de diferenciación. En la
práctica, es muy frecuente que se combinen las propiedades nutritivas, selectivas
e indicadoras a diversos grados dentro de un mismo medio. Es posible incluir un
sistema indicador dentro de un medio altamente nutritivo y también hacerlo
selectivo al añadir los antimicrobianos adecuados.
 Estas sustancias o indicadores permiten diferenciar rápidamente una especie
microbiana de otra semejante; por este motivo se denominan medios indicadores
o diferenciales. Ejemplo: Agar Baird Parker, Agar Rambach, etc. (Kenneth &
Ray, 2005)

8.2. Medio de cultivo según su consistencia

- Sólido: se utilizan para obtener bacterias aisladas por la formación de colonias

sobre la superficie del medio de cultivo y para el estudio de la morfología de las
colonias, lo que no permiten los medios líquidos. Se diferencian porque tienen
una sustancia de sostén, que puede ser agar-agar. - Ejemplo: Agar Común, Agar
SS, Agar Cerebro Corazón, Agar Saboureaud, etc.

- Liquido: se utilizan preferentemente para favorecer el desarrollo bacteriano de

células estresadas. En determinadas ocasiones no se pueden sustituir por los
medios sólidos, por ejemplo, en la síntesis de exotoxinas, pigmentos, enzimas,
etc. - Ejemplo: Agua peptonada, Caldo común, Caldo Cerebro Corazón, Caldo
Saboureaud, etc.

- Semisólido: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos un

agente solidificante en una proporción menor que para preparar medios sólidos.
Uno de sus usos es la investigación de la movilidad de las bacterias. (González
& Cabezas, 2012)

8.3. Medios de cultivo según su composición química

- Medios sintéticos: Son aquellos que contienen en su composición

exclusivamente sustancias químicas conocidas y disueltas en agua destilada en
proporciones determinadas, resultando un medio de composición perfectamente
definida.

- Medios complejos: Fueron los primeros utilizados, y los más empleados se

preparan a partir de tejidos animales, y más raramente de vegetales. Su
composición no es exactamente definida, y por consiguiente no es
rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en
condiciones experimentales, donde la reproductibilidad no podrá ser exacta. En
la práctica corriente estos medios dan excelentes resultados y son los más
empleados.

- Medios semisintéticos o mínimos: El gran número de factores de crecimiento

exigidos para ciertos gérmenes hace que la fabricación de un medio sintético
para estos gérmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan
los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgánico complejo
(extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.). Ciertos gérmenes no crecen en
ningún medio por muy enriquecido que esté éste, haciéndolo exclusivamente en
células vivas con unas características determinadas. Ejemplos de este tipo son,
aparte de los virus, las Chlamydias, Rickettsias, etc.
8.4. Usos de los medios de cultivo

❖ Para el aislamiento de microorganismos

Una útil característica de las placas de agar es que las bacterias pueden
separarse al extender una pequeña muestra del espécimen sobre su
superficie. Las células bacterianas bien separadas de las demás crecen en
colonias aisladas que a menudo alcanzan los 2 a 3 mm de diámetro después
de incubarse durante la noche. Esto permite aislar las bacterias en un cultivo
puro porque se asume que la colonia ha surgido a partir de un solo
organismo. Las colonias varían enormemente en cuanto a su tamaño, forma,
textura, color y otras características denominadas morfología colonial. Las
colonias de diferentes especies o géneros a menudo difieren en forma
sustancial, mientras que aquellas derivadas de la misma cepa suelen ser
consistentes. Las diferencias en morfología colonial son de gran utilidad
para separar a las bacterias dentro de una mezcla y para obtener pistas en
cuanto a su identidad. En la fi gura 4-8 se muestran algunos ejemplos de
morfología colonial.

❖ Para la identificación de microorganismos

Una vez que se detecta crecimiento en cualquier medio, empieza el
proceso de identificación. La identificación implica métodos para la
obtención de cultivos puros de colonias individuales, seguidos de pruebas
diseñadas para la caracterización e identificación del aislado. Los análisis y
sus secuencias precisas varían según los distintos grupos de organismos, y
el nivel taxonómico (género, especie, sub- especie y demás) de
identificación que se necesita varía de acuerdo con la utilidad médica de la
información. En algunos casos, sólo se necesita una descripción general o la
exclusión de ciertos organismos específicos. Por ejemplo, un informe de
“flora oral mixta” en una muestra de esputo o “ausencia de N. gonorrhoeae”
en una muestra cervical puede ofrecer toda la información que se necesita.

❖ Para la propagación de microorganismo

La propagación en medios preparados en estado líquido (caldos) es evidente
cuando el número de bacterias es suficiente para producir turbidez
aglutinaciones macroscópicas. La turbidez es el resultado de la cantidad de
luz que se refleja de las bacterias; dependiendo del tamaño del organismo,
se requiere de más de 106 bacterias por mililitro de caldo. La adición de un
agente gelificante a un caldo de cultivo permite su preparación en sólido en
forma de placas en cajas de Petri. El agente gelificante universal para la
bacteriología diagnóstica es el agar-agar, un polisacárido que se extrae de
algas marinas.

❖ Para la conservación de microbios

Para conservar un cultivo durante un periodo de tiempo largo: agar
inclinado (sólido en tubo). En este formato los microorganismos tienen
mayor disponibilidad de nutrientes.

❖ Para estudios especiales

Obtención de toxinas o investigación de sus características. (Cuevas, 2016)
9. TÉCNICAS DE CULTIVO SIEMBRA Y AISLAMIENTO

Cultivo de siembra
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un
medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y
multiplicación.
Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el
crecimiento.

Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:

- Que se efectúen asépticamente

- Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estén esterilizados

- Que se realicen solo los manipuleos indispensables

- Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un

mechero o bien Flujo laminar. (Santambrosio, 2009)

Cultivo por aislamiento

El aislamiento de microorganismos implica un conjunto de técnicas empleadas para

extraer y separar a las especies de microbios de interés desde su hábitat natural hasta un
hábitat in vitro. Estas técnicas son un conjunto de muchas herramientas básicas y
necesarias para los estudios microbiológicos.
La mayor parte de los microorganismos que son conocidos y que han sido definidos por
la ciencia, son aquellos que han podido ser aislados y mantenidos en recipientes que
simulan, en parte, las condiciones intrínsecas de los lugares donde habitan.
Todos los aislamientos de microorganismos comienzan con la recolección de una
muestra en la naturaleza donde se encuentran los microorganismos de interés. Estos
lugares pueden ser heridas en tejidos animales o vegetales, suelos o sustratos, charcos,
mares, superficies como la piel, etc.

La toma de muestra se realiza tocando o apoyando un contenedor que posea un medio

con los requerimientos aptos para el crecimiento de microorganismos sobre la superficie
de la cual se desean asilar. En este recipiente se obtendrá lo que se conoce como
“cultivo” de microbios.

Generalmente, el primer cultivo que se obtiene a partir de los hábitats naturales es, sin
duda, un “cultivo mixto”, es decir, que está compuesto por una gran cantidad de
diferentes especies de microbios. (Mora, 2019)
B. OBJETIVOS

1. Identificación de las formas bacterianas y su importancia clínica

2. Conocer las técnicas de preparación de frotis, fijación y coloraciones más utilizadas
en el estudio microbiológico ya sea en muestras biológicas o cultivos bacterianos.
3. Conocer el fundamento de las respectivas coloraciones, así como la aplicación de
las mismas.

C. MATERIAL Y PROCEDIMIENTOS

➢ Pasos generales que siguen todo proceso de coloración

Materiales

- Microscopio óptico
- Placa de Petri con muestra sembrada sobre un medio de cultivo
- Portaobjetos
- Cubreobjetos
- Colorantes (Solución de azul de metileno al 1%, solución de safarina al 1%,
solución de violeta de genciana al 1%, verde de malaquita)
- Agua destilada
- Asa de siembra de platino
- Mecheros
- Papel filtro

➢ Técnicas para una tinción o coloración simple

Figura 1: Procedimiento para una tinción simple

 ➢ Coloración Gram

Paso 1: Prepárate para el

trabajo de laboratorio con Paso 2: Esteriliza un portaobjeto Paso 3: Coloca la muestra en el
indumentaria de bioseguridad de vidrio para microscopio. portaobjetos.

Paso 5: Empapar el portaobjetos

con violeta de genciana, dejar
actuar durante 1 minuto.

Paso 4: Fijar la muestra por Paso 6: Lavar el portaobjetos , después

calor. El calor fijara las empapar con solución de yodo; dejar
bacterias al portaobjetos de actuar durante 1 minuto. Antes de la
forma que no se enjuague decoloración con acetona (siguiente paso),
fácilmente durante la tinción. todos los microorganismos son violetas, es
decir, grampositivas.

Paso 8: Lavar el portaobjetos

Paso 7: Lavar el exceso de inmediatamente en agua. Después
yodo. Decolorar con acetona de la decoloración con acetona, Paso 9: aplicar segunda tinción con
durante 5 segundos aprox. (el los organismos gramnegativos, ya safarina durante 30 segundos.
tiempo depende de la densidad no son visibles
de la muestra).

Paso 10: Lavar en agua, teñir

y secar al aire. Los
microorganismos
gramnegativos se tiñen tras la Paso 11: Añadir una gota de Paso 12: Identificar las bacterias
aplicación de la segunda aceite de inmersión al Grampositivas y Gramnegativas.
tinción. portaobjetos, antes de colocarlo al
microscopio. Observar.

Figura 2: Pasos de la técnica de tinción de Gram Símbolos: = Violeta grampositivo

= Incoloro
=Rosado o rojo gramnegativo
 ➢ Procedimiento de coloración de esporas

Se emplearán cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias
produzcan las esporas. Esta tinción es delicada en su realización y para poder
obtener unos resultados satisfactorios hay que seguir cuidadosamente las
instrucciones:

Pasos Tinción de esporas

1. Prepara la frotis bacterianos

indicados
2. Teñir con verde malaquita.
Con unas pinzas de madera
colocar la muestra encima de
la llama del mechero de forma
que el colorante humee
durante 5 min. Se de be tener
en cuenta que la muestra
nohierva. Añadir más
colorante si éste se evapora; es
importante que la muestra no
se seque.
3. Lavar con abundante agua el
exceso de colorante.
4. Teñir con safranina 1 min.
5. Lavar con abundante agua el
exceso de colorante.
6. Secar la preparación.
7. Observar la preparación al
microscopio. Anotar la
disposición y la morfología de
las tres especies del género
Bacillus. Figura 3: Pasos para una coloración
de esporas

➢ Observación de esporas

Esta técnica consiste en:

1. Cultivar el microorganismo en leche tornasolada por 36 horas.

2. Colocar una gota del cultivo en el extremo de una lámina porta objetos
y al lado colocar una gota de cristal violeta, mezclar y extender con el
extremo de otro portaobjetos.
3. Secar al aire libre y no fijar al calor
4. Lavar con solución de sulfato de cobre al 20%, dejar secar al aire libre
5. Observar al microscopio con objetivo de inmersión. Buscar hacia los
extremos del extendido.

Es importante no utilizar calor ni para fijar, ni para secar, ya que ello daña la
cápsula. Tampoco lavar con agua. (Gil, Lifeder.com, 2020)
D. COMENTARIO

Ha sido un tema muy importante poder conocer sobre las bacterias, su clasificación e
importancia, debido por sus múltiples funciones y comportamientos que possen. Tienen
una gran importancia en la naturaleza, pues están presentes en los ciclos naturales del
nitrógeno, del carbono, del fósforo y de muchos elementos en la naturaleza. También
pueden transformar sustancias orgánicas en inorgánicas y viceversa.
Son también muy importantes en las fermentaciones, aprovechadas por la industria y en
la producción de antibióticos. Además, desempeñan un factor importante en la
destrucción de plantas y animales muertos. Qué interesante, ¿verdad?
En efecto, la vida en nuestro planeta, no existiría sin bacterias, las cuales permiten
muchas de las funciones esenciales de los ecosistemas. Una bacteria de tamaño típico es
tan pequeña, que es completamente invisible a la vista.
Hablar de bacterias es desprender innumerables procesos y acontecimientos.

E. CONCLUSIONES

1. Se logro identificar las diferentes formas bacterianas y se logro comprender su

importancia en el aspecto cotidiano y clínico.

2. Se logro aprender y reconocer las técnicas de frotis, fijación y coloraciones más

utilizadas.

3. Se logro conocer el fundamento de as respectivas coloraciones y su aplicación.

 ANEXOS – CUESTIONARIO

1. ¿En qué consiste el poder de resolución del microscopio y cómo se calcula?

Un microscopio es un instrumento diseñado para hacer visibles objetos que el ojo no

es capaz de distinguir. Por poder de resolución de un sistema óptico entendemos su
capacidad para distinguir como distintos y separados dos puntos muy próximos entre
sí. Es pues su capacidad de reproducir detalles. El límite de resolución de un
microscopio se define como la distancia mínima a partir de la cual ya no es posible
distinguir la separación entre dos puntos. El poder de resolución de un microscopio
óptico y por consiguiente su límite de resolución se calcula con la formula recogida en
la figura 1. En dicha figura se ve como el poder de resolución depende de la longitud
de onda de la luz empleada (Figura 2), del índice de refracción (n) del medio por el que
pasa la luz (Figura 3) y del ángulo de desviación (θ) que esta sufre y por lo tanto de la
apertura numérica (AN) del objetivo. (Herrero, 2020)

Figura : Formula del poder de resolución (PR) y de la apertura numérica (AN)

de un microscopio óptico compuesto:
𝟎. 𝟔𝟏 𝛌
𝑷𝑹 =
𝐧 𝐬𝐞𝐧 𝛉
Donde:

- 0.61 = Constante
- 𝞴 = Longitud de onda de luz usada
- n = Índice de refracción del medio
- Sen𝞱 = seno del ángulo 𝞱
- n sen 𝞱 = Apertura numérica

Figura 5: Longitudes de onda para la luz de diferentes colores

Figura 6: Ejemplo de lo que se gana en apertura numérica (AN) con la inmersión en aceite
(derecha) frente a un objeto seco (izquierda). 𝞱 es la mitad del ángulo del cono de rayos
colectores para el objetivo.

2. ¿En qué consiste una observación en fresco y cuál es su importancia?

La forma más simple de preparar un espécimen para su examen microscópico es hacer

una preparación en fresco. Existen dos técnicas, una preparación en fresco simple
("entre porta y cubre") consiste en colocar una gota de líquido con los microorganismos
sobre un portaobjetos y a continuación cubrirla con un cubreobjetos. Una preparación
en gota pendiente se realiza colocando una gota del material en un cubreobjetos y
cubriéndolo con un portaobjetos (invertido) con una excavación central (portaobjetos
excavado) (Figura 3.8). Hay que sellar la preparación con vaselina alrededor de la
excavación. La ventaja de esta última técnica, es que la preparación no se seca y puede
ser observada durante un tiempo más largo.

Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos. Por

ejemplo, para la búsqueda de Trichomonas vaginalis en secreciones vaginales. Este
protozoo de gran movilidad causa inflamación de la vagina y la uretra. Si en la
preparación se observan células en forma de huso que se mueven mediante
contracciones o sacudidas cruzando el campo, probablemente se tratará de T. vaginalis,
pudiéndose efectuar el diagnóstico.

Sin embargo, el inconveniente de la observación en fresco es que no permite aumentar

el contraste de la preparación. Por tanto, su uso, con un microscopio óptico de campo
claro, está bastante limitado. Normalmente, para observar microorganismos vivos se
utiliza alguno de los otros microscopios ópticos que hemos mencionado anteriormente.

3. ¿Por qué es importante la coloración Gram?

Esta tinción es un procedimiento de gran utilidad empleado en los laboratorios donde

se manejan pruebas microbiológicas. Es definida como una tinción diferencial, ya que
utiliza dos colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram
negativas y bacterias Gram positivas.
 Fue desarrollada por el científico danés Hans Christian Gram en 1884; hoy en día, sigue
siendo una de las tinciones más utilizadas universalmente debido a lo económico,
sencillo y eficaz que resulta. En microbiología clínica resulta de gran utilidad, ya que a
partir de muestras clínicas directas provenientes de sitios estériles se puede saber de
manera rápida las características de la muestra y hacer una diferencia de los
potenciales microorganismos causantes de una infección. Los principios de la tinción
de Gram están basados en las características de la pared celular de las bacterias, la
cual le confiere propiedades determinantes a cada microorganismo. La pared celular
de las bacterias Gram negativas está constituida por una capa fina de peptidoglicano y
una membrana celular externa, mientras que las bacterias Gram positivas poseen una
pared celular gruesa constituida por peptidoglicano, pero no cuentan con membrana
celular externa; así pues, la composición química y el contenido de peptidoglicano en
la pared celular de las bacterias Gram negativas y Gram positivas explica y determina
las características tintoriales. (López Jacome & Hernández Durán, 2014)

4. ¿Cuál es el fundamento de la tinción Gram?

Casi todas las muestras biológicas se tiñen antes de la evaluación microscópica

debido a que las bacterias sin tinción son difíciles de detectar bajo el microscopio
óptico. El procedimiento de tinción más frecuente y útil se llama tinción de Gram.
Este método divide a las bacterias en dos grupos de acuerdo con la composición
de su pared celular. Si a la muestra biológica del portaobjetos se le aplica solución
de violeta de genciana y luego yodo, las células bacterianas se teñirán de color
púrpura. Si a las células teñidas se les aplica un solvente, como alcohol o acetona,
los microorganismos grampositivos conservarán su color y los gramnegativos se
deslavarán y se tornarán incoloros. Si a las muestras se les añade
safranina, un medio de contraste, las bacterias gramnegativas transparentes
adquirirán un color rosado o rojo. Casi todas las bacterias se pueden teñir y
clasificar en uno de estos dos grupos (nota: los microorganismos que carecen de
paredes celulares, como las bacterias del género Mycoplasma, no pueden
identificarse con la técnica de Gram).

Esta técnica es importante para la terapéutica porque las bacterias grampositivas y

gramnegativas son sensibles a distintos antibióticos. Por lo tanto, sus resultados son útiles
para elegir el tratamiento inicial, que continuará hasta que se identifique el
microorganismo. Además, algunos diagnósticos se basan en la morfología de las bacterias
teñidas. Por ejemplo, ante la presencia de diplococos gramnegativos intracelulares en
muestras de pus uretral, los médicos suelen considerar el diagnóstico de gonorrea. En
muestras biológicas cultivadas in vitro, el análisis adicional
mediante tinción de Gram aporta información invaluable para la interpretación de los
resultados del cultivo. A veces, la microscopía permite detectar patógenos en muestras
que, según los resultados de los cultivos, son estériles.
Esta discrepancia puede sugerir que las muestras contienen microbios de difícil cultivo
(bacterias con requisitos nutricios complejos incapaces de crecer en los medios
empleados), organismos frágiles, como los gonococos, o anaerobios, que no sobreviven
durante el transporte. En estos casos, la visualización directa mediante la técnica de Gram
puede ser la única herramienta para obtener pistas con respecto a la naturaleza, la
variedad y el número relativo de microbios infecciosos.
 Limitaciones de la tinción de Gram: Se necesita un número relativamente
elevado de microorganismos. Para la tinción de Gram, la cifra supera los > 104
organismos/mL. Las muestras biológicas líquidas con pocos patógenos (p. ej.,
LCR) deben centrifugarse para concentrarlas. Después, el sedimento se tiñe y
se analiza. (Nau Cornelissen & Metzgar Hobbs, 2019)

5. ¿Cuál es el fundamento de la tinción de esporas?

Las esporas no se tiñen con las coloraciones convencionales debido a que poseen una
pared muy gruesa. La compleja composición de las esporas impide la entrada de la
mayoría de los colorantes. Si se estudia la espora de afuera hacia dentro se observan las
siguientes capas: en primer lugar, está el exosporium, que es la capa más fina y externa
formada por glicoproteínas. Luego viene la cutícula, que brinda resistencia a las altas
temperaturas, seguida de la corteza compuesta por peptidoglicano. Posteriormente está la
pared de la base que protege al protoplasto. (Gil, 2020)

En observaciones microscópicas de preparaciones de bacterias sin teñir, las esporas se

observan como cuerpos refringentes intracelulares y si las células bacterianas están
teñidas con los métodos habituales, se aprecian como zonas incoloras en su interior.

Para la tinción de las esporas, habitualmente se utiliza el carbolfucsina o el verde

demalaquita. El primero, en el método de Ziehl-Neelsen ya descrito, y el segundo, en el
método de Schaeffer-Fulton. En el método de Moeller se aplican los mismos colorantes
que en el procedimiento de Ziehl-Neelsen, pero se fija el frotis con alcohol absoluto y
cloroformo. Por la impermeabilidad de la pared de la espora se requiere calentar la
preparación con el fin de que el colorante penetre.

Al emplear suficiente cantidad de alcohol que permita la decoloración de la célula

vegetativa, la impermeabilidad de la pared no permite la decoloración de la espora.

En los métodos de tinción de las esporas antes señalados, se utilizan colorantes de

contraste para la célula vegetativa. Cuando teñimos la espora con verde de malaquita,
utilizamos safranina como colorante de contraste; y cuando la espora se tiñe con
carbolfucsina. la célula vegetativa se tiñe con azul de metileno. (Llop Hernández &
Váldez, 2001)

6. ¿Cuál es el fundamento de la observación de cápsula?

La tinción de cápsula es una técnica de coloración diferencial que tiene la propiedad de

resaltar la estructura polisacárida que rodea a ciertas bacterias y levaduras denominada
 cápsula. Se utiliza en los laboratorios clínicos para ayudar al diagnóstico de ciertas
patologías originadas por microorganismos capsulados.
Esta técnica utiliza nigrosina o tinta china y se fundamenta en crear un contraste
entre el fondo del preparado y la cápsula impenetrable del microorganismo. El
fondo se tiñe de oscuro y la cápsula queda incolora. De esta manera se pone en
evidencia esta estructura. (Gil, Liferder.com, 2020)

Los métodos más usados para poner de manifiesto las cápsulas bacterianas son las
coloraciones negativas o sus modificaciones. Un método de tinción de la cápsula es el
que trata las bacterias con una solución caliente de cristal violeta seguido por un lavado
con solución de sulfato de cobre, con el fin de remover el exceso de colorante, ya que el
lavado con agua disolvería la cápsula. El sulfato de cobre también imparte color al
fondo. A la observación microscópica, la célula y el fondo aparecen teñidos en color
azul oscuro y la cápsula de color azul pálido. La coloración de Anthony-Hiss emplea las
mismas soluciones colorantes antes descritas, pero en el momento de realizar el frotis,
los microorganismos se suspenden en un líquido proteico (leche, suero). Después de la
aplicación de los colorantes, el cristal violeta se fija a la proteína y destaca la cápsula de
la célula; el sulfato de cobre tiñe la cápsula. (Llop Hernández & Váldez, 2001)

7. ¿Cuál es la finalidad e importancia de la técnica de cultivo de siembra y

aislamiento?

Técnica de cultivo de siembra

Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en

un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Para sembrar en
microbiología es necesario mantener la habitación sin corrientes de aire y estar al lado
de la llama de un mechero (no más de 15 cm. de distancia). También se puede trabajar
bajo campana, o en flujo laminar, previa esterilización con luz UV.
La siembra puede realizarse en medio líquido, sólido o semisólido, utilizando ansa,
hilo, o bien hisopo o pipeta estéril. Se debe esterilizar en la llama (hasta que todo el
filamento se haya puesto al rojo vivo) el ansa o el hilo y enfriar, antes y después de
realizada la siembra. Para transferir los microorganismos, se recomienda:
a) Medio líquido a medio líquido: utilizar pipeta Pasteur o graduada, ansa o hilo.
b) Medio líquido a medio sólido: utilizar pipeta Pasteur o graduada, ansa o hilo, e
hisopo.
c) Medio sólido a medio sólido: utilizar ansa o hilo. d) Medio sólido a medio líquido:
ansa o hilo.
Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para
el crecimiento. (Santambrosio, 2009)

Técnica de cultivo por aislamiento

 Aislar es separar un tipo de microorganismo a partir de una población heterogénea de
microrganismos. En hábitats naturales raramente encontramos un solo tipo de
microorganismo en una muestra, por lo tanto, es necesario hacer algún procedimiento
de aislamiento para separar e identificar los distintos tipos de microorganismos
presentes. El objetivo del aislamiento es obtener colonias bien separadas (las colonias se
forman a partir de una sola “unidad formadora de colonias”) de las que se conseguirá un
cultivo puro. Una vez obtenidos los cultivos puros se podrán estudiar las características
macroscópicas, microscópicas, fisiológicas, etc. de un microorganismo en particular.
Hay que tener en cuenta que siempre el aislamiento se da en un medio sólido. El medio
líquido sirve para enriquecer, pero no para aislar. El aislamiento se puede lograr
directamente a partir de una muestra cuando el o los microorganismos están en una
proporción adecuada. Cuando el microorganismo que se desea aislar e identificar se
encuentra en baja proporción en la muestra, o interesa un solo tipo de microorganismo,
se lleva a cabo un procedimiento que involucra una primera etapa de aumento del
número de microorganismos del tipo que se desea aislar en relación al resto de la
población (enriquecimiento). Luego se aísla por el método de estrías o por dilución y se
identifica. (Mora, 2019)

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