UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS

FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
Profesora: Luz Mery Buitrago A.
Práctica de laboratorio

PIGMENTOS: EXTRACCIÓN - SEPARACIÓN Y CUANTIFICACIÓN

En esta práctica de laboratorio se llevará a cabo la extracción y separación de los diferentes tipos de pigmentos
por cromatografía en papel en función de su polaridad relativa. Una vez separados, se analizará su migración a
lo largo de la fase estacionaria. Asimismo, se llevará a cabo la cuantificación de las clorofilas presentes en el
material vegetal.

INTRODUCCIÓN

La luz que llega al cuerpo vegetal puede ser reflejada, transmitida o absorbida, siendo sólo en este último caso
utilizable en algún proceso fisiológico de la planta. Para que sea absorbida con eficiencia las plantas usan
moléculas especializadas denominadas pigmentos, las cuales dan color a las diferentes partes del cuerpo, como
hojas o pétalos, según el tipo de luz visible que absorban o reflejen.

En las plantas los principales pigmentos son las clorofilas (a y b), así como los carotenoides, los cuales se
encuentran dispuestos de forma muy organizada en el interior de los cloroplastos. La clorofila a es una molécula
compleja, formada por cuatro anillos pirrólicos o tetrapirrólico, un ion de Mg+2 en el centro rodeado de nitrógeno
y una cadena de fitol larga; que además posee un sistema de dobles enlaces y los electrones participantes son
los responsables de la absorción de la radiación del espectro visible. La diferencia entre las distintas clorofilas
existentes se encuentran en los sustituyentes que se presentan; así la clorofila "a" (verde azulada) presenta un
grupo metilo (-CH3) en el carbono 3, y la "b" (verde amarillenta) un grupo aldehido (-CHO) en la misma posición.

Fig. 1 Estructura clorofila a y b. Tomado de: Prácticas de Fisiología Vegetal. Disponible también en:
www.almez.pntic.mec.es

La clorofila, es entonces, un pigmento que absorbe la energía solar necesaria para iniciar el ciclo fotosintético de
muchas plantas y bacterias. La principal propiedad fisicoquímica responsable de este hecho es la elevada
absorbancia que presenta la clorofila en el intervalo de longitudes de onda entre 400 nm y 700 nm. La molécula
de clorofila puede absorber un fotón de estas longitudes de onda al excitar un electrón de los que ocupan los
orbitales moleculares que forman los dobles enlaces conjugados C=C y C=N de la estructura central que rodea
al átomo de magnesio. Como se mencionó, existen dos tipos principales de clorofila: la clorofila a y la clorofila b,
que se diferencian por la presencia de un grupo CH3 o CHO, respectivamente, en uno de los anillos C4N. La
presencia de este grupo funcional altera ligeramente la estructura y energía de los dobles enlaces conjugados,
dando lugar a espectros de absorción distintos para cada tipo de clorofila. Así, la clorofila a en disolución
alcohólica presenta máximos de absorción en 430 nm y 662 nm, mientras que la clorofila b los presenta en 453
nm y 642 nm. La posición exacta de estos máximos depende del disolvente que se utilice.

Carotenoides: Son moléculas hidrocarbonadas de 40 átomos de carbono. Los carotenoides que participan en
la fotosíntesis son de dos tipos: tipo caroteno y tipo xantofila (Figura 2). Los carotenoides tipo caroteno
constan exclusivamente de carbono e hidrógeno. Los carotenoides tipo xantofila contienen oxígeno además de
carbono e hidrógeno. El sistema conjugado de dobles enlaces es el responsable de la absorción de luz en el
espectro visible. Su espectro de absorción muestra máximos de absorción entre los 450 nm y 500 nm,
correspondientes al azul y al verde, por lo que la luz roja-anaranjada-amarilla que reflejan les proporciona su
color característico.

Fig. 2 Estructura de carotenos y xantofilas. Tomado de: www.es.slideshare.net

FUNDAMENTO CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

En la cromatografía intervienen los fenómenos de absorción y disolución por lo que hay que tener en cuenta la
polaridad, tanto de la sustancia de interés como la del disolvente, si queremos tener una buena separación.
Cuanto mayor es la polaridad de los compuestos más intensamente se atraen por el material absorbente si el
mismo es polar, como es el caso de la celulosa en papel. La ecuación para determinar la polaridad de diferentes
moléculas de pigmentos se llama factor de retención (Rf). Una vez llevada a cabo la cromatografía, se calcula el
Rf de cada pigmento. Por ejemplo, se mide desde el punto de origen hasta una de las manchas, esa es la
distancia hasta esa mancha. La medida desde el mismo punto de origen hasta donde el disolvente dejó de
moverse es la distancia del frente del disolvente. Este factor Rf establece la relación existente entre la distancia
recorrida por el pigmento y la recorrida por el disolvente. Con este propósito se anotará la distancia total que el
disolvente se mueve en cm. Esta será la marca en la parte superior del papel de cromatografía. Luego se
anotará la distancia en cm que cada pigmento (color) se movió.

FUNDAMENTO ESPECTROFOTOMETRÍA

La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un

compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez
que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de medidas
se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una
solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma.

MATERIALES x GRUPO DE TRABAJO

 2 Morteros
 2 Tubos Falcon
 2 Pipetas Pasteur
 2 Pipetas graduadas (1 y 5 mL)
 1 Erlenmeyer
 1 Beacker (200 mL)
 1 Pipeteador
 5 tubos de ensayo
 1 Papel Whatman nº1
 1 capilar
 2 vidrios de reloj
 1 Agitador
 1 gradilla

Materiales por sección

 2 Cápsulas de porcelana
 1 Pinzas para cápsula
 1 Pipeta de 10 mL
 1 Probeta de 50 mL
 1 Espátula
 2 capilares
 1 Placa de Sílica gel

GRUPOS DE TRABAJO

 5 hojas grandes de espinaca

 Hojas de lengua de vaca (Rumex crispus), perejil (Petroselinum sativum) o lechuga (Lactuca sativum)
 Bisturí
 Cuchilla Minora (individual)
 Regla
 Lápiz
 Gasa
 Papel secante
 1 hoja examen
 1 Caja grande (aprox. 50 cm x 50 cm o más)

REACTIVOS

 100 mL de acetona al 80%

 200 mL de Etanol al 80%
 60 mL (acetona:éter de petróleo) 1:9

 50 mL de Metanol
 65 mL de Éter de Petróleo
 30 mL de Acetona: Éter de Petróleo (1:3)
 50 mL de Éter etílico: Éter de petróleo (2:1)

EQUIPOS

 1 Centrífuga
 1 Baño serológico
 1 Espectrofotómetro (1 micropipeta, puntas y celda)
 2 Cámaras cromatográficas
 1 Plancha de calentamiento
PROCEDIMIENTO:

1. EXTRACCIÓN, SEPARACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE CLOROFILAS:

Extracción con etanol: Extraer los pigmentos de cloroplastos de 0.5 g de hojas frescas de espinacas o de
cualquier otro material verde cortando las hojas en segmentos de aproximadamente 0.5 cm que se introducen
en un tubo de ensayo con 6 mL de etanol al 80% de modo que los segmentos queden bien sumergidos en el
etanol. Incubar durante 20 minutos en un baño a 80° para que las clorofilas salgan al exterior y se disuelvan en
el etanol. Al cabo de este tiempo los segmentos deberán quedar totalmente decolorados y el etanol queda de
color verde.

Medida de clorofila: Se toman 0.5 mL del sobrenadante obtenido anteriormente y se diluye hasta 5 mL con
etanol al 80%. Después se mide en un espectrofotómetro a longitudes de onda de 645 y 663 nm. Para calcular
las clorofilas totales se tendrá en cuenta la siguiente fórmula:

Clorofila total (μg/mL o mg/L) = (20.2 · DO645) + (8.02 · DO663)

Para la cuantificación de carbohidratos, aminoácidos, proteínas, etc., mediante el empleo de técnicas

espectrofotométricas, se requiere del auxilio de una curva patrón. En el caso de las clorofilas a, b, esto no es
necesario, puesto que se disponen de ecuaciones que permiten calcular su concentración.

2. SEPARACIÓN DE PIGMENTOS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA EN PAPEL:

Extracción de pigmentos: Realice la extracción de los pigmentos de cloroplastos de 0.5 gramos de hojas
frescas de espinacas o de cualquier otro material verde, con 5 mL de acetona al 80%, disgregando el tejido
vegetal en un mortero, de modo que se extraigan los pigmentos y se disuelvan en acetona. Cuando la acetona
está bien verde, el macerado se introduce en un tubo de centrífuga de plástico y se centrífuga a 2000 rpm
durante 10 minutos (un estudiante por sección).

Realización de la cromatografía: Se dispone de una tira de papel (ajustado al tubo de ensayo) (Whatman nº1
(fase estacionaria) en la que se dibuja con lápiz una línea a 1-2 cm de uno de sus extremos. Sobre el centro de
esta línea se deposita una gota pequeña del sobrenadante verde con una pipeta Pasteur o capilar (este
sobrenadante será suministrado por el estudiante asignado). Espere a que se seque y aplique una nueva gota
en el mismo punto de aplicación que la anterior, repitiendo la operación hasta añadir 7 a 8 gotas.

Procure no tocar demasiado el papel con las manos porque se puede contaminar.

Se introduce con cuidado la tira de papel con la muestra en un tubo de ensayo que contiene 2 mL de la fase
móvil (acetona:éter de petróleo, 1:9 en volumen). El extremo del papel que ha de quedar más próximo a la fase
móvil es el que tiene la muestra. Esta no puede quedar sumergida en la fase móvil. Se deja durante unos 30
minutos en la oscuridad. Al cabo de este tiempo se saca la tira de papel del tubo, se seca y se analizan los
resultados.

Realice el montaje de acuerdo al siguiente esquema:

Ejemplo cálculos para la obtención de Rf:

Hallar Rf según la siguiente fórmula:

𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜

𝑅𝑓 =
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟𝑙𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑚ó𝑣𝑖𝑙

El valor de Rf para cada pigmento depende de su estructura y es un valor fijo bajo condiciones específicas de
temperatura, disolvente y naturaleza química del absorbente.

3. SEPARACIÓN DE PIGMENTOS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

3.1. EXTRACCIÓN DE LA MEZCLA DE PIGMENTOS (un estudiante por sección).

Lavar bien las hojas de vegetal seleccionado (lengua de vaca) con agua destilada y macerar suavemente 1 g.
en un mortero con 10 mL de metanol, descartar el extracto y repetir el procedimiento 2 veces cada vez con 5 mL
del mismo alcohol.

Adicionar en el mortero 10 mL de éter de petróleo y continuar macerando hasta obtener una buena muestra de
la mezcla de pigmentos. Repetir esta extracción 2 veces, reunir los extractos en una capsula de porcelana y
concentrarlos mediante la evaporación del solvente en una plancha de calentamiento (nunca a la llama por
contener los extractos reactivos altamente volátiles y por supuesto combustibles).

3.2. SEPARACIÓN DE PIGMENTOS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

Colocar 25 mL del solvente acetona: éter de petróleo (1:3) en una cámara cromatográfica y tápela bien.

Sobre una placa de Sílica-gel trazar suavemente con un lápiz de grafito una línea a 1.5 cm de borde inferior.
Colocar luego sobre esta línea utilizando los capilares, las muestras del extracto vegetal en forma de puntos,
asegurándose que se observe en cada siembra un color verde oscuro.

Depositar la placa en la cámara cromatográfica a la cual se ha colocado el solvente con anterioridad con el
objeto de saturarla, Taparla y evite moverla. Esperar a que el solvente recorra la longitud de la placa
(aproximadamente el 90%), retírela y déjela secar en un sitio oscuro entre 2 y 3 minutos.

Vaciar de la cámara cromatográfica el solvente usado, lavarla con agua destilada, secarla bien y verter ahora 25
mL del solvente éter etílico: éter de petróleo (2:1).

Llevar de nuevo la placa a la cámara cromatográfica, de tal manera que los pigmentos parcialmente separados
queden lo más próximos al nivel del solvente y deje que se efectúe la separación en esta nueva dirección.
Retirar la placa una vez el solvente recorra por lo menos el 90% de la misma, dejar secar nuevamente y
observar las posiciones y los colores obtenidos de las diferentes fracciones obtenidas, trabajando a la luz difusa,
marcarlas con lápiz y medir los Rf de los pigmentos separados.

Algunos factores que afectan la relación de frente son: el grado de pureza del adsorbente, la saturación de la
cámara y la temperatura, razón por la cual es conveniente manejarlos experimentalmente.
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

PRESENTAR EN HOJA EXAMEN (MARCADA INTEGRANTES DE GRUPO)

1. Calcule los μg de clorofila que hay por gramo de hoja, extraída con cada uno de los protocolos.
2. Realice una tabla con los resultados obtenidos por todos los grupos. Compare estos resultados entre sí y
analice.
3. Indique que pigmentos fueron revelados en la cromatografía
4. Calcule los valores de Rf para cada uno de los pigmentos separados.

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