NANOBIOTECNOLOGÍA – UNIVERSIDAD NACIONAL DE QUILMES
Trabajo Práctico 2
Preparación de Nanomateriales Ingenierizados Basados en Lípidos
Objetivo
Preparar diferentes nanomateriales basados en lípidos como liposomas y nanopartículas
lipídicas sólidas. Caracterizar las muestras en función de su tamaño, pdi y potencial Z y
concentración de un marcador fluorescente hidrofóbico.
Introducción
Los nanomateriales ingenierizados basados en lípidos ofrecen varias ventajas
como sistemas de delivery de agentes terapéuticos: son biocompatibles, se autoasocian
(por lo que no requieren de síntesis química para su preparación), tienen la capacidad de
transportar grandes cantidades de fármacos y son muy versátiles, ya que se pueden
modificar una amplia gama de propiedades fisicoquímicas y biofísicas para controlar sus
características biológicas. A su vez son preparadas con lípidos biodegradables y
fisiológicos de carácter GRAS (Generalmente Reconocido como Seguro), son
relativamente económicos y pueden ser preparados de forma relativamente simple por
métodos que pueden ser fácilmente escalables.
Liposomas
Los liposomas se definen como vesículas de fosfolípidos que consisten en una o
más bicapas lipídicas concéntricas que encierran espacios acuosos discretos. Están
compuestos, principalmente, por moléculas que derivan o basan su estructura en lípidos
de membranas biológicas, moléculas anfifílicas que tienen una cabeza hidrofílica y dos
cadenas hidrófobas apolares. Cuando los fosfolípidos se dispersan en soluciones
acuosas, debido a su naturaleza anfipática, tienen una fuerte tendencia a formar
membranas. Por un lado, sus cabezas polares prefieren interactuar con el ambiente
acuoso; mientras que sus largas cadenas alifáticas apolares promueven la interacción
entre ellas. Las cadenas hidrofóbicas de cada capa se enfrentan entre sí y constituyen un
compartimento interno lipófilo que actúa como una barrera de permeabilidad. La
capacidad única de los liposomas para atrapar tanto compuestos lipófilos como hidrófilos
permite la encapsulación de una amplia gama de agentes terapéuticos. Las moléculas
hidrófobas se insertan en la bicapa y las moléculas hidrófilicas quedan atrapadas en el
interior acuoso. Los liposomas se pueden clasificar en función del tamaño (pequeño,
intermedio o grande) y lamelaridad (vesículas uni-, oligo- o multilamelares). La formación
de vesículas unilamelares (LUV) o vesículas multilamelares (MLV) depende de los
métodos de síntesis y homogenización utilizados para su preparación.
Una de las técnicas más utilizadas para la fabricación de nanovesículas es la
hidratación de la película lipídica o el método de Bangham. Brevemente, este método
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implica la disolución del lípido en un disolvente orgánico, la evaporación del disolvente y la
dispersión de la película de lípidos obtenida, en medios acuosos. Una de las desventajas
de esta técnica es que produce MLV grandes y no homogéneos que requieren procesos
de de homogenización para generar LUV pequeños monodispersos. Los métodos más
comunes para esto son la sonicación, la extrusión y la homogeneización a alta presión. La
sonicación se usa para reducir el tamaño de las vesículas al dar energía a la suspensión
de lípidos. Esto se puede obtener aplicando una irradiación ultrasónica a las
suspensiones de MLV mientras que el método de extrusión de membrana reduce el
tamaño de los liposomas (LUV grandes o MLV) haciéndolos pasar a través de un filtro de
membrana con un tamaño de poro definido.
Nanopartículas lipídicas sólidas
A principios de los 90´s, las nanopartículas lipídicas sólida (NLS) aparecieron en el
campo del drugdelivery como alternativa a los liposomas. Las NLS son emulsiones de
aceite en agua, donde el núcleo oleoso se halla sólido a temperatura corporal. En general,
las NLS están compuestas de 0,1% a 30% (m/m) de lípidos con puntos de fusión mayor a
la temperatura corporal (triglicéridos purificados, mezclas complejas de glicéridos, ácidos
grasos o ceras) estabilizados con de 0,5% a 5% (m/m) de surfactantes. Las NLS
presentan varias ventajas como sistemas de drug delivery: a) diferentes tipos de drogas
(hidrofóbicas o hidrofílicas) son atrapadas mecánicamente en las imperfecciones del
núcleo lipídico, y protegidas de la degradación química o física durante el almacenaje; b)
pueden mejorar la biodisponibilidad de moléculas altamente lipofílicas; c) de acuerdo a si
se ubican en la periferia de emulsionantes/surfactantes, en el núcleo o en ambos, las
drogas pueden ser liberadas, en estallidos, en forma prolongada o en estallido seguido de
liberación prolongada, respectivamente.
Existen diversos métodos para la producción de NLS como: la homogeneización a
alta presión en caliente o en frío, la dilución de la microemulsión, la
ultrasonicación/homogeneización y la técnica de emulsión / evaporación del disolvente, el
método de doble emulsión, entre otros.
La técnica de homogeneización/sonicación consiste en fundir los lípidos del núcleo y
homogenizarlos a altas revoluciones en una solución acuosa de surfactante, a una
temperatura por encima del punto de fusión de los lípidos, para formar una emulsión
aceite en agua (O/W). Luego la emulsión se enfría para que los lípidos solidifiquen y se
sónica con el objetivo de disminuir el tamaño de las partículas. Finalmente esto se puede
filtrar para eliminar partículas de tamaños micrometricos.
Procedimiento
Preparación de Liposomas con marca fluorescente por el Método de Hidratación de
la Película Lipídica
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1. En un balón pesar 10 mg del fosfolípido fosfatidilcolina de soja (L-A) o 10 mg de
fosfolipido con carga neta negativa (L-B), en ambos casos agregar 25 μg del marcador
fluorescente cumarina 6.
2. Disolver con 2 mL de una mezcla de solventes orgánicos y formar una película
lipídica mediante evaporación a presión reducida utilizando un rotavapor.
3. Resuspender la película lipídica con 3 mL de buffer Tris pH 7,4 con NaCl 0,9 %
m/v mediante agitación magnética hasta levantar por completo la película lipídica.
4. Homogeneizar la suspensión liposomal aplicando ultrasonido con un sonicador de
baño a 80 W, 80 KHz durante 30 minutos.
Preparación de Nanopartículas Lipídicas Sólidas con marca fluorescente por la
Técnica de Homogenización-Sonicación.
5. En un tubo de ensayo colocar 40 mg de lípido sólido Compritol 888ATO y 100 μg
del marcador fluorescente Cumarina 6. Fundir a 75º-80ºC en baño térmico (Fase lipídica).
6. En otro tubo de ensayo pre-calentar 3 mL de agua MilliQ conteniendo 12 mg de
fosfolípido fosfatidilcolina de soja (NLS A) o 9 mg de lípidos con carga neta negativa y 3
mg de SPC (NLS B); y en ambos casos agregar 30 mg del surfactante Polisorbato 80
(Fase acuosa).
7. Luego homogeneizar la Fase acuosa con homogenizador Ultra Turrax por 30
segundos e inmediatamente incorporar gota a gota a la Fase lipídica fundida con pipeta
pasteur temperada, homogeneizando a 13000 rpm por 5 minutos a 75°C-80°C.
8. Homogeneizar la emulsión aceite/agua obtenida por ultrasonido utilizando un
sonicador de baño a 80 W, 80 KHz durante 30 minutos.
9. Enfriar la emulsión obtenida a 4°C para formar las NLS.
10. Filtrar la suspensión obtenida por membrana de nylon de 1,2 µm para eliminar C6
no incorporada en las NLS.
Caracterización fisicoquímica de liposomas y NLS
El tamaño promedio y potencial Z de las diferentes muestras se determinará por
dispersión dinámica de la luz (DLS) y por análisis de fase de dispersión de luz,
respectivamente, utilizando un equipo Zetasizer Malver Instruments. A tal fin las muestras
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se diluirán hasta una concentración de 500 µg/mL de lípidos en buffer Tris 10 mM con
NaCl 0,9 % p/v pH 7,4, volumen final de 1 mL.
Para cuantificar la cantidad de C6 final en cada muestra se medirá su absorbancia
a 459 nm. Las muestras se disolverán en etanol para obtener una concentración
aproximada de 1 µg/mL de cumarina 6 con un volumen final de 1,2 mL. El coeficiente de
extinción molar de cumarina 6 en etanol a 459 nm es de 15000 cm-1/M.
