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Actividad Enzimática de La Succinato Deshidrogenasa 2020 - 2

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Actividad enzimática de la Succinato Deshidrogenasa

Introducción

La enzima succinato deshidrogenasa, también llamada succinato coenzima Q


reductasa o complejo II, es una flavoproteína cuya actividad es dependiente de la
unión a la coenzima Flavin Adenina Dinucleótido (FAD), que cataliza la conversión
de succinato a fumarato a través de una reacción de óxido-reducción en el paso 6
del ciclo de Krebs. Este complejo enzimático es el único del ciclo que está en la
membrana mitocondrial, esto se debe a que también participa en la cadena de
transporte de los electrones, los cuales se transfieren al FAD y se introducen
directamente en la cadena, gracias a la unión estable entre la enzima y el cofactor
mismo [1], [2].

La reacción de conversión de succinato a fumarato es la siguiente:

Succinato Flavin Fumarato


Adenina
Dinucleótido
Imagen 1: Reacción de conversión de succinato a fumarato

De acuerdo con los procesos metabólicos y condiciones específicas de la reacción en


la célula no es posible evidenciar la reducción del FADH2, sin embargo, al hacer la
extracción de la enzima es posible usar un aceptor artificial de electrones como el
azul de metileno cuya decoloración permite establecer la actividad enzimática de la
succinato deshidrogenasa, teniendo en cuenta que el azul de metileno reducido es
incoloro y oxidado es azul.

Objetivos

El estudiante:
● Reconocerá las propiedades catalíticas de la enzima succinato
deshidrogenasa.
● Verificará el comportamiento de inhibidores sobre la enzima succinato
deshidrogenasa.
Tareas de aprendizaje para el preinforme

● Consultar las reacciones que hacen parte del ciclo de krebs e identifique en
cual reacción partipa al succinato deshidrogenasa.
● Explicar el mecanismo de la reacción de óxido-reducción en la que participa
la enzima succinato deshidrogenasa.
● Explicar por qué la enzima succinato deshidrogenasa tiene especificidad
estereoquímica.
● Responder la pregunta: ¿Cuál es la secuencia de reacciones que muestra la
óxido-reducción entre el azul de metileno y el FADH2?

Materiales, equipos y reactivos

Tabla 1. Materiales por cada subgrupo de trabajo

Materiales y Equipos Cantidad


Mortero 1
Pipeta graduada de 10 mL 1
Pipeteador 1
Tubos de centrífuga 2
Tubos de ensayo 8
Gradilla 1
Pinzas para tubo de ensayo 1
Vaso de Precipitados de 250 mL 1
Termómetro 1
Cronómetro 1
Mechero 1
Baño Termostatado a 37 °C 1
Tabla 2. Reactivos por cada subgrupo de trabajo
Reactivos Cantidad
Azul de metileno 0,02 % 10 mL
Ácido clorhídrico 6 M 5 mL
Buffer de fosfatos 0,1 M, pH 7,4 20 mL
Aceite mineral o glicerina 10 mL
Malonato de sodio al 1 % en buffer fosfatos 5 mL
Succinato de sodio al 1 % en buffer fosfatos 20 mL
1 Baño de hielo 1

*Material que deben traer los estudiantes: 20 g de corazón fresco de pollo, un bisturí
nuevo y 25 g de arena lavada. La arena debe ser lavada previamente, para lo cual
la debe dejar 2 horas en agua, inicialmente tibia, agitar cada media hora, realizar
una separación con ayuda de un tamiz o tela, secar a temperatura ambiente. Este
proceso genera una pérdida de arena inicial por lo cual debe tomar al menos el doble
de lo requerido para la práctica.

Procedimiento

Preparación del extractos enzimáticos


Descartar el tejido graso del corazón de pollo, lavar 5 g con agua destilada y cortar
en pequeños trozos con el bisturí nuevo. Agregar la arena lavada en el mortero,
adicionar los trozos de corazón de pollo y macerar. Adicionar 5 ml de solución buffer
pH 7,4 frío y continuar macerando hasta obtener una pasta suave. Adicionar 10 ml
más de la solución buffer frío y transfiera la mezcla a un tubo de centífuga de 15mL,
enfriar en baño de hielo por 15 minutos.
Preparación de Extracto E1
Centrifugar el tubo de 15 mL por 5 min a 1800 rpm, transferir el sobrenadante a un
tubo nuevo marcado como E1 y descartar el sólido. Mantener el extracto
enzimático en hielo el mayor tiempo posible.

Preparación de Extracto E2

Tomar 1,5 ml del extracto enzimático (E1) y calentar al mechero sin que alcance la
temperatura de ebullición.
Preparación de Extracto E3

Tomar 1,5 ml del extracto enzimático (E1) y adicionar 5 gotas de HCl 6 N.

Verificación del comportamiento de la enzima

Marcar 6 tubos y adicionar los reactivos según la tabla 3:

Tabla 3. Preparación de tubos de ensyo

Reactivo/Tubo 1 2 3 4 5 6
Azul de metileno (mL) 1 1 1 1 1 1
Buffer fosfato (mL) 4 2 2 2 2 1
Succinato de sodio (mL) - 1 1 1 1 1
Malonato de sodio (mL) - - - - - 1
Extracto enzimático E1(mL) - 1 - - 1 1
Extracto enzimático E2 - - 1 - - -
Extracto enzimático E3 - - - 1 - -
Aceite Mineral ( gotas )* 8 8 8 8 8 8
Incubar a 37ºC 10’ 10’ 10’ 10’ 10’ 10’

*A todos los tubos adicionar 8 gotas de aceite mineral o glicerina, agitar y anotar la
hora en que se da el inicio de cada reacción, esto es, cuando se adiciona el extracto
enzimático.

Escribir sus observaciones en las tablas de reporte de datos pasados 2, 5 y 10


minutos de reacción en cada uno de los tubos. Recuerde que este tiempo debe ser
contado desde el momento en que se adiciona el extracto enzimático.
Reporte de datos

Preparación del extracto enzimático

Tabla 4. Reporte de datos obtenidos


Observaciones en la extracción
Preparación del
extracto
enzimático

Verificación del comportamiento de la enzima

Completar la tabla 5, según las observaciones.

Tabla 5. Reporte de datos obtenidos

Tubo Hora de inicio Tiempo de Observaciones


de la reacción (min)
reacción
1 2
5
10
2 2
5
10
3 2
5
10
4 2
5
10
5 2
5
10
6 2
5
10

Preguntas para la construcción del informe

● ¿Cómo se explica la diferencia en el comportamiento de la reacción en todos


los tubos ?
● ¿Cómo se relacionan los resultados de cada uno de los tubos de ensayo?
● ¿Cuál es el propósito de la adición de aceite mineral o glicerina en cada uno
de los tubos?
● ¿Cómo se evidencia que la enzima tuvo actividad sobre el respectivo sustrato?
● ¿Qué efecto tiene los inhibidores sobre la reacción enzimática? y ¿cuáles son
los inhibidores empleados en la práctica?
● Identifique la función de cada reactivo y justifique su empleo durante la
prática.

Bibliografía

[1]. D. L. Nelson and M. M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry. New York:


WH Freeman, 2009.
[2]. H. R. Horton L. A. Moran, K. G. Scrimgeour, M. D. Perry, and J. D. Raw. Principios
De Bioquímica. México: Pearson Education. 2008.

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