Manual de Trabajos Prácticos de Microbiología Aplicada.

V Semestre Ingeniería Agroindustrial__________ 1

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL AIRE,

MANIPULADORES Y EQUIPOS INDUSTRIALES.

I.- INTRODUCCIÓN

Durante la fabricación de alimentos se hace necesario el control

microbiológico del aire, de manipuladores y de los equipos industriales implicados en
el procesamiento o manufacturación de los alimentos, para determinar la eficacia de
los procedimientos y ciclos de saneamiento de las áreas y equipos de proceso. Así
mismo es posible descubrir fuentes de microorganismos generadores de
contaminación y posteriormente de infección.
A. Control microbiológico del aire (Garcia, 1987).

El aire en las áreas de llenado o de envasado de productos alimenticios puede

ser una de las mayores fuentes de contaminación. Estas áreas deben presentar
ciertas características de construcción y de diseño que ofrezcan una seguridad
máxima, es decir; los techos, paredes y pisos deben ser de fácil limpieza y puedan
ser tratados con desinfectantes apropiados.Los análisis microbiológicos del aire
deben ser practicados al inicio, durante y al final del llenaje de los productos.

Requisitos microbiológicos de áreas asépticas (Normas Nestlé).

 Aerobios mesófilos ( UFC / cm2 / min ) máx 10.

 Mohos y levaduras ( UFC / cm2 / min ) máx 10.

B. Control microbiológico de manipuladores (Garcia, 1987).

Los operarios de equipos y alimentos deben mantener estrictas condiciones

higiénicas de sus manos y uniformes. Se debe controlar por lo tanto la carga

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microbiana de sus manos mediante el método de contacto directo sobre agares

apropiados o por el método de enjuague.

Especificaciones microbiológicas.(Normas Nestlé).

 Aerobios mesófilos ( UFC / ml ) máx 10.

 Mohos y levaduras ( UFC / ml ) máx 10.

 Coliformes fecales ( UFC / 0,1 ml ) ausente.

C. Control microbiológico de equipos (Garcia,1987).

El control microbiológico de los equipos e implementos utilizados durante el

procesamiento de alimentos, sirve para evaluar las buenas prácticas de manufactura
y desinfección de los mísmos. Esta evaluación se puede realizar mediante el método
de enjuague de envases y tuberías de la línea de producción o a través del método
del hisopo, en ciertas zonas de los equipos como hendiduras, esquinas, grietas o
zonas en donde el hisopo es más efectivo para tomar los microorganismos.

Requerimientos microbiológicos (Normas Nestlé):

Ausencia total de microorganismos.

II. - PRE – LABORATORIO

A continuación el estudiante deberá revisar la información teórica correspondiente al
control microbiológico del aire, las superficies que entran en contacto con las materias primas
y productos terminados (comidas servidas), así como las manos de los operadores
encargados de manufacturar y procesar en forma directa los productos ofrecidos al
consumidor, a objeto de asistir a la correspondiente sesión de prácticas debidamente
informado. El conocimiento de esta información puede ser objeto de evaluación antes del
inicio de la sesión de laboratorio, a discreción del Profesor de la asignatura.

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III.- LABORATORIO

1.- Materiales y Equipos:

El Laboratorio dispondrá de:
1. Papel absorbente.
2. Placa con agar plate count ( PCA ).
3. Placa con agar levadura glucosa cloranfenicol ( YGC ).
4. Cilindros graduados de 1000 mL
5. Botellones de 7 L de capacidad
6. Frascos de dilución
7. Tapones de goma bihoradados
8. Tubos y mangueras para conexiones
9. Bolsas plásticas con 100 ml solución de enjuague.
10. Agar plate count ( PCA ).
11. Agar YGC.
12. Agar Levine o Endo en cápsula de petri.
13. Pipetas graduadas de 1 ó 2 ml estériles.
14. Varilla de vidrio.
15.Solución de enjuague tamponada.
16.Envases o recipientes vacíos para alimentos.
17.Agar plate count ( PCA ), agar YGC y agar VRB o agar Mac Conkey.
18.Cápsulas de petri estériles.
19.Pipetas graduadas de 1 y 10 ml estériles.
20.Hisopos estériles.
21.Tubos de ensayo conteniendo 5 ml de solución de enjuague.
22.Agar PCA, YGC y VRB.
23.Cápsula de petri estériles.
24.Pipetas graduadas de 1 ó 2 ml estériles.
25.Equipos de laboratorio.

El estudiante traerá:

1.- Marcadores indelebles rojo y negro

2.- Tirro
3.- Textos de Microbiología Aplicada, Biotecnología y Microbiología de Alimentos
4.- Manual de Trabajos Prácticos, cuaderno de notas.
5.- Lápices de grafito, reglas, sacapuntas.
6.- Bata blanca, con botones y manga larga de Laboratorio.
7.- Guantes quirúrgicos comerciales
8.- Gorros y tapa – bocas
9.- Fósforos o encendedor.
10.- Algodón.
11.- Alcohol.

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Actividad práctica Nº 1: Control microbiológico del aire

Procedimiento:

1. Coloque una toalla de papel absorbente en la zona de muestreo.

2. Coloque horizontalmente una cápsula con agar PCA y otra con agar YGC.

3. Levante las tapas de las cápsulas de petri y colóquelas sin invertir sobre el papel
absorbente.

4. Después de 15 minutos de exposición, tape las cápsulas e incube a 30 oC por 48

horas la cápsula con PCA y a 25 oC por 4 días la cápsula con YGC.

5. Después del período de incubación cuente las colonias y registre los resultados
en UFC / área cápsula.
Area de cápsula:
A =  . r2  = 3,1416.
r = 1/2 diámetro.
A = 3,1416 x ( 4,5 cm )2 d = 9 cm.
r = 4,5 cm.
A = 63,62 cm 2

Resultados = UFC / 63,62 cm2 / 15 min.

6. Anote sus observaciones: _________________________________________

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7. Elabore un esquema de trabajo que facilite el presente procedimiento y preséntelo
al Profesor para su corrección.
Esquema:

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Actividad práctica Nº 2: Control microbiológico de manipuladores.

Método del enjuague
Procedimiento:

1. Prepare la solución de enjuague tamponada de la siguiente manera :

a. Solución madre.
Fosfato ácido de potasio 34 gr.
Agua destilada 500 ml.
pH 7,2
Esterilice a 121 oC por 15 min.

b. Solución final de enjuague :

Solución madre 1,25 ml.
Solución de tiosulfato de sodio al 10% 5,00 ml.
Tween 80 10 gr.
Lecitina 4 gr.
Agua destilada c.s.p. 1000 ml.

Distribuya 100 ml de ésta solución en frascos de vidrio y esterilice a

121 oC por 15 min. ( éstas soluciones se encuentran ya preparadas en el
laboratorio ).

2. Prepare para cada manipulador u operario una bolsa plástica estéril conteniendo
100 ml de solución de enjuague estéril.

3. Rotule la bolsa con el nombre del operario y el área de proceso a la que

pertenece.

4. Indíquele al operario que se enjuague las manos dentro de la bolsa con solución
de enjuague e inmediatamente ábrala.

5. Cierre la bolsa.

6. Inocule 1 ml del enjuague de las manos por duplicado en cápsulas de petri.

7. Agregue de 10 a 15 ml de Agar PCA y de Agar YGC por separado.

8. Incube la cápsula de PCA a 30 oC por 48 horas y la cápsula de YGC a 25 oC por

4 días.

9. Inocule 0,1 ml del enjuague de las manos sobre la superficie de una cápsula con
agar Levine o Endo, extienda el inóculo mediante una varilla de vidrio triangular.

10. Incube la placa de agar Levine a 37 oC por 48 horas.

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11. Después del periodo de incubación seleccione y cuente las colonias que
presenten coloración violeta oscuro o negro con o sin brillo metálico en el agar
Levine o colonias rojas con brillo verde metálico en el agar Endo.

12. Exprese los resultados en UFC / ml para aerobios mesófilos y hongos; en UFC /
0,1 ml para coliformes.

13. Anote sus observaciones: _________________________________________

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14. Elabore un esquema de trabajo que facilite el presente procedimiento y

preséntelo al Profesor para su corrección.
Esquema:

Actividad práctica Nº 3: Control microbiológico de equipos:

Método de enjuague.
Procedimiento:

1. Agregue 20 ml de la solución de enjuague tamponada al recipiente o envase a

analizar. Si el envase tiene una capacidad mayor o igual a 3,70 litros, agregue
100 ml de solución de enjuague.

2. Tape y agite el envase vigorosamente en forma circular.

3. Mida 10 ml de la solución de enjuague y repártalos en 3 cápsulas de petri.

4. Adicionalmente mida 2 ml e inocule 1 ml en cada una de las cápsulas de petri.

5. Agregue de 15 a 18 ml de agar plate count e incube a 30 oC por 48 horas.

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6. Repita los pasos 3 y 4, pero con agar YGC e incube a 25 oC por 4 días.

7. Inocule por duplicado 0,1 ml de la solución de enjuague en la superficie de

agar VRB o Mac Conkey.

8. Incube las cápsulas a 37 oC por 24 horas.

9. Exprese los resultados para aerobios mesófilos y hongos de la siguiente

manera : si se tomaron 10 ml para sembrar en 3 placas, multiplique el número total
de colonias por 2 para obtener el número de colonias en 20 ml de solución de
enjuague o sume el total de colonias en dos placas si se sembró 1 ml en cada una
y multiplique por 10 para obtener el número de colonias en 20 ml por envase. Si las
placas con 1 ml tienen más de 250 colonias, anote el resultado de los contajes como
más de 5000 por envase. El recuento de coliformes, debe ser ausente.

10. Anote sus observaciones: ____________________________________________

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11. Elabore un esquema de trabajo que facilite el presente procedimiento y

preséntelo al Profesor para su corrección.
Esquema:

Actividad práctica Nº 4: Control microbiológico de equipos:

Método del hisopo.

Procedimiento:

1. Humedezca un hisopo estéril en 5 ml de solución de enjuague contenida en un

tubo de ensayo.

2. Escurra el exceso de líquido del hisopo.

3. Limpie con el hisopo una superficie de 50 cm2, 3 veces cambiando de

dirección o una superficie equivalente a 2 cm de ancho por 25 cm de largo.

4. Después del muestreo de la superficie, introduzca el hisopo en el tubo y se

tapa.
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5. Agite el tubo de ensayo vigorosamente.

6. Inocule por duplicado 1 ml de la solución en cápsula de petri.

7. Agregue de 10 - 15 ml de agar PCA e incube a 30 oC por 48 h.

8. Repita el punto 6.

9. Agregue de 10 - 15 ml de agar YGC e incube a 25 oC por 4 días.

10. Inocule por duplicado 0,1 ml de la solución de enjuague en la superficie de

agar VRB para coliformes.

11. Incube a 37 oC por 24 horas.

12. Después del período de incubación, cuente y exprese los resultados

como UFC / 50 cm2 . Los 50 cm2 equivalen a 1 ml de la solución de enjuague.
13. Anote sus observaciones: ___________________________________________
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14. Elabore un esquema de trabajo que facilite el presente procedimiento y

preséntelo al Profesor para su corrección.
Esquema:

Referencias bibliográfícas.

GARCIA, CARMEN.1987. Análisis Microbiológicos de Alimentos. Publicidad Gráfica

León. Caracas.

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