Taller N°1.

ESPORULACIÓN

1. LA ENDOSPORA BACTERIANA Y LA ESPORULACIÓN

1.1 INTRODUCCIÓN A LA ESPORULACIÓN BACTERIANA

Algunas especies de bacterias Gram positivas (principalmente de los géneros Bacillus, Clostridium,
Sporosarcina y Thermoactinomyces), disponen de una notable estrategia adaptativa cuando se ven
sometidas a privación de nutrientes en su medio ambiente: si los niveles de fuentes de C, N, o P
caen por debajo de un umbral, esto constituye una señal a la célula de que se avecina un largo
período de privación de nutrientes. Entonces, la célula se implica en una serie de complejos cambios
genéticos, metabólicos, estructurales, etc. (proceso de esporulación o esporogénesis), que
conducen a la diferenciación, en el interior de la célula vegetativa original, de una célula durmiente
(la endospora). La célula-madre (o sea, la célula vegetativa original que generó la endospora)
finalmente se autolisa, liberando la espora, que es capaz de permanecer en estado criptobiótico,
durmiente, varios decenios, -incluso siglos. Las esporas son fácilmente diseminadas por el aire;
cuando caen en medios ricos en nutrientes, se desencadena su germinación, se reinicia la actividad
metabólica, de modo que cada espora genera una nueva célula vegetativa, capaz de divisón binaria,
etc.

O sea, la esporulación se puede considerar como un proceso de supervivencia “en última instancia”,
la “última carta” que se juegan ciertas bacterias Gram positivas cuando se enfrentan a condiciones
severas de hambre de nutrientes.

Significado adaptativo: Estas bacterias suelen vivir en medios nutricionalmente pobres (suelos,
hierba seca, etc.). La esporulación es un proceso muy refinado que ha aparecido evolutivamente en
una línea filogenética de bacterias Gram-positivas, y que les permite sobrevivir largos períodos de
carencia nutricional. (Atención: NO son estrictamente formas de resistencia).

Las endosporas son formas de reposo (y no formas reproductivas), que representan una etapa del
ciclo de vida de ciertas bacterias, y que se caracterizan por una estructura peculiar, diferenciada
respecto de las células vegetativas, por un estado metabólico prácticamente detenido, y por una
elevada resistencia a agentes agresivos ambientales.

1.2 OBSERVACIÓN DE LAS ESPORAS

Al microscopio óptico, en fresco (sin teñir), aparecen como cuerpos esféricos, ovoides e incluso en
algunas especies, cilíndricos, muy refringentes, libres, o aún incluidos en la célula vegetativa (célula
madre).

Esporangio = célula madre + espora

El tamaño relativo de la espora, y su situación en el esporangio. Según que el diámetro de la espora

sea o no mayor que el de la célula vegetativa:

 Esporas deformantes
 Esporas no deformantes

Según la localización de la espora dentro del esporangio:

 Terminal
 Subterminal
 Central
Tinción: No se tiñen por los colorantes normales. Hay que forzar por calor y/o mordientes (por
ejemplo, tras teñir reforzadamente con fuchsina, resisten decoloración por alcohol-ClH). Otra tinción
muy empleada es la reforzada con verde de malaquita.

1.3 ESTRUCTURA Y COMPOSICION QUIMICA DE LA ENDOSPORA

Partes que comprende la endospora:

 Protoplasto o núcleo ("core", en inglés), con la membrana citoplásmica de la espora

(membrana esporal interna).
 Pared de la espora (= Germen de la pared de la futura célula vegetativa).
 Corteza o córtex, rodeado externamente de la membrana esporal externa.
 Cubiertas.

PROTOPLASTO O NÚCLEO

El citoplasma de la espora está muy deshidratado. Sus componentes están inmovilizados en

una matriz de quelatos de iones Ca++ y ácido dipicolínico.

El citoplasma de la espora contiene altas concentraciones de ion Ca++ (1-3% del peso seco de la
espora), y de ácido dipicolínico (DPA) (10% en peso); ambos están formando un quelato, llamado
dipicolinato cálcico (DPC), una sustancia exclusiva de las esporas bacterianas.

El protoplasto contiene un cromosoma completo, condensado, y todos los componentes

indispensables para reiniciar el crecimiento vegetativo cuando la espora germine, pero carece de
muchos componentes típicos de la célula vegetativa:

 posee una pequeña dotación de ribosomas, junto con componentes estables de la

maquinaria de síntesis de proteínas (ARNt, cofactores, etc.)
 ARN polimerasa.
 nucleósidos mono- y difosfatados, pero no NTP (no hay ATP)
 carece de componentes inestables: no hay ARNm, ni enzimas biosintéticas, ni
aminoácidos ni bases nitrogenadas libres, ni cofactores reducidos (NADH; CoA).

 pero en cambio, existe una gran cantidad de una serie de pequeñas proteínas especiales
(llamadas SASP, del inglés "small acid-soluble proteins"). Cuando se produzca la
germinación, estas proteínas serán hidrolizadas rápidamente, y los aminoácidos resultantes
serán empleados en la síntesis de nuevas proteínas
 la "moneda energética" de la espora es el 3-fosfoglicerato, otra molécula estable del
protoplasto, que será convertido rápidamente a 2-fosfoglicerato, y de él a PEP (fosfo-enol-
pirúvico) al germinar la espora (el PEP es donador de P para generar ATP).

PARED DE LA ESPORA (= GERMEN DE LA PARED CELULAR DE LA CÉLULA VEGETATIVA)

Situación: inmediatamente por encima de la membrana interna de la espora

Composición: a base de un peptidoglucano (PG) similar al de la célula vegetativa, con sus
característicos enlaces entre los tetrapétidos.

Funciones: al germinar la espora, dará lugar a la pared celular de la nueva célula vegetativa,
confiriéndole, mientras tanto, resistencia osmótica.

Origen: se sintetiza a partir de la prespora, atravesando los precursores la membrana interior que
hemos citado arriba.

CORTEZA O CÓRTEX
Composición: un peptidoglucano (PG) especial, diferente en composición al PG de la célula
vegetativa:

 30% del NAM tiene tetrapéptidos normales, pero el grado de entrecruzamiento es muy bajo
 15% del NAM tiene solo la L-ala inicial, en lugar de tetrapétido.
 55% de una modificación del ácido murámico (lactama del ácido murámico), producida por
condensación del -COOH lactilo con el -NH 2, para formar la lactama correspondiente).

Origen: Se sintetiza a partir de la célula madre, con sus intermediarios ensamblados a nivel de la
membrana externa que rodea a la corteza.

Propiedades de la corteza:

1. Tiene un bajo grado de puentes entre tetrapéptidos (sólo un 6%). Ello condiciona:
a. una estructura más laxa, floja y flexible que el PG normal, capaz de expandirse en
ausencia de cationes que neutralicen sus grupos negativos (sobre todo del mDAP y
del glutámico de los tetrapéptidos). Esto es la base de su apariencia de gel.
b. su rápida autolisis, durante la germinación de la espora.
2. La lactama del murámico condiciona una gran resistencia a la lisozima.

CUBIERTAS

Composición y estructura: la composición depende de las especies, pero en general, a base de una
o varias proteínas de tipo queratina, todas muy ricas en cisteína y en aminoácidos hidrófobos, y que
llegan a constituir el 60% en peso seco de la espora.

Propiedades: son muy insolubles e impermeables, e impiden la entrada de numerosos agentes

químicos, incluyendo sustancias tóxicas. La abundancia de puentes S-S las hace muy compactas y
estables químicamente.

1.4 DESENCADENAMIENTO DE LA ESPORULACIÓN

Para que se produzca la esporulación, se necesitan dos condiciones previas:
1) los cultivos bacterianos han de estar en buenas condiciones;
2) cuando cesa el crecimiento exponencial, la mayoría de las células entran en esporulación. La
división celular típica de la fase de crecimiento exponencial y la esporulación son procesos
mutuamente excluyentes.
¿Qué estímulo es el responsable de desencadenar la esporulación? Lo que detiene el
crecimiento de estas bacterias y dispara la esporulación es un estado de inanición, de carencia de
nutrientes. El nutriente limitante que puede desencadenar la esporulación puede ser: la fuente de
carbono, la fuente de nitrógeno o incluso la carencia de fosfatos.
1.5 FASES DE LA ESPORULACIÓN

Se pueden distinguir siete fases consecutivas (además de la fase "0" anterior a la esporulación).
Cada fase se denota con un número romano, y su duración en horas se expresa como subíndice
de t, p. ej., t2. Como veremos enseguida, cada fase se distingue por un(os) evento(s) citológico(s)
peculiar(es) y por una serie de cambios bioquímicos propios:

Fase 0 (célula vegetativa):

Al final del periodo de crecimiento exponencial, la célula vegetativa contiene dos cromosomas.

Fase I (t0-t1):

 El material genético (los dos cromosomas) se condensa constituyendo un filamento

axial ancho, que ocupa el centro de la célula. Cada nucleoide está unido a uno de los
extremos de la célula.
 En vez de iniciarse una división celular simétrica (con septo central), se forman
dos espículas de la pared celular cerca de los polos hacia el interior, rodeadas de la
correspondiente invaginación de la membrana citoplásmica. Cada espícula está señalando
una zona donde se está formando el anillo de FtsZ
 Se sintetizan y se liberan al medio antibióticos y varias exoenzimas. Una serie de
proteasas se encargan del turnover de proteínas intracelulares, cuyos aminoácidos
constituyentes serán empleados para sintetizar nuevas proteínas específicas de la
esporulación.

Fase II (t1-t2):

Se termina por formar un septo transversal acéntrico, cerca de un polo de la célula, por invaginación
de la membrana citoplásmica, y deposición de nuevo peptidoglucano entre las dos membranas
adyacentes.

Cada nucleoide queda segregado en uno de los dos compartimentos que se han formado:

 un cromosoma va al compartimento pequeño (compartimento de la preespora);

 la otra copia del cromosoma va al compartimento grande (célula madre).

En esta fase continúa la síntesis de los antibióticos y de las exoenzimas (serina-proteasas, metalo-
proteasas, ribonucleasas, a-amilasa, etc).

Fase III (t2-t3):

 Independización del protoplasto de la preespora respecto de la célula madre. Para ello,

lo primero que ocurre es la degradación selectiva del PG del septo que se había depositado
en la fase II (esta degradación comienza por el centro, es decir, por donde se había cerrrado,
y sigue hacia la periferia, y en ella intervienen los productos de varios genes). Entonces, la
membrana citoplásmica de la célula madre va creciendo unidireccionalmente alrededor de
la preespora, hasta que ésta queda libre en el citoplasma del esporangio.

 A partir de esta fase el turnover (renovación) de proteínas sólo tendrá lugar en la célula
madre, deteniéndose en el compartimento de la preespora.

Fase IV (t3-t4):
  Se forma casi por completo la corteza de la espora, por deposición de peptidoglucano entre
las dos membranas. Sin embargo, este PG aún no está "maduro"
 También se deposita el peptidoglucano de la pared celular (que constituye el germen de la
pared celular de la futura célula vegetativa).
 Coincidiendo con esto, la preespora adquiere su aspecto refráctil al microscopio óptico en
fresco.
 Comienza la síntesis del ácido dipicolínico (DPA), así como la acumulación de Ca2+.

Fase V (t4-t5,5):

 Los materiales de las cubiertas (que se habían ido sintetizando durante las fases II y III en
el compartimento de la célula madre), comienzan a depositarse por fuera de la membrana
esporal externa. Al final de esta fase se adquiere la resistencia al octanol.
 Continúa la acumulación de DPA, que sigue secuestrando iones Ca++ (formación del quelato
de dipicolinato cálcico, DPC).

Fase VI (t5,5-t7):

 La preespora madura hasta espora.

 Madura la corteza (para generar el característico PG cortical, más laxo, con su bajo
porcentaje de entrecruzamientos -por actuación de endopeptidasas- y la lactama del NAM).
 Maduran las cubiertas.
 Por una serie de razones aún no totalmente aclaradas, la espora se hace resistente al calor
y al cloroformo.
 Se adquiere resistencia a las radiaciones ultravioleta (UV).
 Se adquiere resistencia a la lisozima.

Fase VII (t7-t8):

 Liberación de la espora madura por autolisis de la célula madre.

1.6 CUERPOS PARASPORALES

Algunas bacterias esporuladas, como Bacillus thuringiensis, B. popiliae y algunas especies de
Clostridium, forman cristales proteicos en el esporangio simultáneamente a la formación de la
endospora: son los llamados cuerpos parasporales, sintetizados durante la fase IV.
La función de estos cuerpos parasporales en la esporulación es desconocida. Bajo condiciones
alcalinas, se disuelven y la proteína se convierte en una poderosa toxina para larvas de lepidópteros
y otros insectos, cuando las ingieren vía oral (pero no por vía parenteral). Veamos cómo se produce
el proceso de la toxicidad:
1. La oruga come materia vegetal que lleva bacterias esporuladas. El cuerpo parasporal se libera
junto con la espora, cuando la célula madre se autolisa.
2. Los cuerpos parasporales se disuelven en el tracto digestivo de la oruga (que es alcalino), la
proteína sufre proteolisis, lo que la transforma en una toxina.
3. Esta toxina altera la permeabilidad del epitelio intestinal de la oruga, de modo que los líquidos
alcalinos del intestino pasan a la hemolinfa, que incrementa su pH por encima de 8, lo cual termina
provocando la parálisis rápida del insecto, y finalmente su muerte.
El significado biológico más probable de este fenómeno es que la producción de cuerpos
parasporales sea una variante de la esporulación que evolucionó durante la adaptación de estas
bacterias a sus nichos ecológicos, como una manera de asegurar la germinación de las endosporas:
la oruga ingiere los cristales junto con las esporas. Los cristales parasporales matan a la oruga, que
se pudre. La oruga muerta y en putrefacción aseguraría un entorno adecuado en nutrientes para que
se alimentaran y multiplicaran las células vegetativas que surgieran de la germinación de esas
esporas.
1.7 PROPIEDADES BIOLÓGICAS DE LAS ESPORAS: SU FUNDAMENTO

Las endosporas son células con una bajísima tasa metabólica (hipometabolia, la menor que existe
en el mundo vivo), y capaces de conservar su vitalidad durante larguísimos períodos. Son
muy resistentes a la acción de diversos agentes químicos (octanol, cloroformo) y físicos (altas
temperaturas, congelación, desecación, radiaciones).

1. Hipometabolia: Poseen la más baja tasa respiratoria de todos los seres vivos. Por ello son
capaces de sobrevivir en ausencia de nutrientes durante largos períodos de tiempo.
2. Dormancia: Esta propiedad se refiere al hecho de que la espora tiene una gran inercia a los
sustratos exógenos. Como veremos, la espora sólo perderá la dormancia cuando se haya
activado para la germinación.
3. Resistencia al calor: Las esporas de ciertas especies resisten 120oC durante 15 min, lo
cual condiciona los parámetros para esterilizar materiales. Esta elevada resistencia a las
altas temperaturas es un subproducto de los cambios evolutivos que condujeron a la
deshidratación como medio para lograr la hipometabolia y la dormancia.
4. Deshidratación: El muy bajo contenido en agua de la espora hace que la espora sea muy
refráctil al microscopio óptico en fresco. Ello condiciona las propiedades 1, 2 y 3.
5. Resistencia a los rayos UV: Parece que depende de varios componentes:
a. absorción de luz UV por las cubiertas;
b. por el DPC;
c. cambio en la fotoquímica del ADN de la espora: se puede explicar parcialmente
6. Resistencia a agentes químicos: La resistencia de la endospora a agentes como octanol,
cloroformo, etc. se debe a la impermeabilidad de las cubiertas, gracias a su gran grosor y
su peculiar composición a base de proteínas ricas en aminoácidos hidrófobos y con
abundantes puentes disulfuro (cistinas).

1.7 GERMINACIÓN DE LA ENDOSPORA

La germinación es el proceso por el cual una espora se convierte al estado vegetativo. Es mucho
más rápida que la esporulación (dura unos 90 minutos). Podemos considerar en ella cuatro etapas,
según el modelo de Foster y Johnstone (1990)

1. preactivación
2. activación
3. iniciación (o germinación en sentido estricto)
4. crecimiento ulterior (entrada en fase vegetativa)

PREACTIVACIÓN

Antes de que la espora esté en condiciones de germinar se requiere que sus cubiertas se alteren.
En la naturaleza esto ocurre por erosión por envejecimiento progresivo. Artificialmente, en
laboratorio, se puede recurrir a algún procedimiento para alterar esas cubiertas como lo pueden ser
altas temperaturas, pero inferiores a su inactivación (100oC durante unos minutos); radiaciones
ionizantes, pH bajos; tratamiento con sustancias que posean grupos -SH libres (p. ej.,
mercaptoetanol).

ACTIVACIÓN

La activación es una etapa aún reversible, desencadenada por un agente químico externo
(germinante) presente en el medio. Este agente es variable según las especies: Tales como: iones
inorgánicos (Mn++, Mg++); L-alanina, glucosa u otros azúcares; adenina u otras bases nitrogenadas.
El germinante es detectado por un receptor alostérico a nivel de la membrana esporal interna. Una
vez que dicho receptor se activa, adquiere una capacidad proteolítica específica que le permite
romper una proenzima que hasta ese momento se encontraba unida covalentemente al PG de la
corteza. La enzima resultante reconoce la lactama del NAM y comienza a hidrolizar el PG cortical.
La consecuencia es que comienza a entrar agua al protoplasto de la espora, por lo que la espora
pierde su característica refringencia, y se comienza a perder la resistencia al calor.

Durante toda esta etapa el metabolismo está aún latente.

INICIACIÓN O GERMINACIÓN EN SENTIDO ESTRICTO

En esta etapa la germinación se hace ya irreversible, y se rompe definitivamente el estado de

dormancia, si bien el metabolismo es endógeno (no depende todavía de sustancias externas). Los
principales acontecimientos bioquímicos son:

 se pierde DPA, lo que supone pérdida de Ca2+

 este Ca2+ pasa al córtex, donde neutraliza las cargas negativas --> se favorece la
rehidratación del protoplasto y su hinchamiento, favorecido por la concomitante contracción
del córtex, mientras continúa y se completa rápidamente la hidrólisis del PG cortical;
 el 3-fosfoglicérico (3-PG) se convierte en 2-PG, y éste en PEP, que a su vez dona su fosfato
de alta energía para producir ATP;
 las pequeñas proteínas SASPs se hidrolizan por una proteasa específica (llamada GRP) que
hasta ese momento estaba inactiva. De este modo los aminoácidos constituyentes de las
SASPs se reutilizan para la síntesis de nuevas proteínas por parte de la pequeña dotación
de ribosomas y demás moléculas accesorias;
 La ARN polimerasa comienza a sintetizar ARN (comienza la transcripción de genes
vegetativos).

TERMINACIÓN

Aparece ya el metabolismo exógeno, de modo que la espora puede tomar nutrientes del exterior y
metabolizarlos. Los eventos bioquímicos y estructurales más notorios son: se sintetiza ADN;
aumento del tamaño celular, la pared de la espora sirve para la producción de la pared de la célula
vegetativa naciente; la célula vegetativa sale por rotura de las cubiertas