Producción biotecnológica de vainillina utilizando enzimas inmovilizadas
1 párrafo. La vainillina (4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído) es el principal componente aromático de la
vainilla, dándole un olor dulce y cremoso. Su sabor y propiedades de fragancia han hecho que este
compuesto sea importante en todo el mundo, especialmente en las industrias de alimentos y
cosméticos (Rao y Ravishankar, 2000; Walton et al., 2003). La vainillina está disponible en los frijoles de
la orquídea de vainilla a través de la extracción. Sin embargo, el rendimiento de la vainillina es muy bajo
porque se acumula a niveles bajos en la planta (Rao y Ravishankar, 2000, Walton et al., 2003). La
producción biotecnológica de vainillina utilizando microorganismos ha atraído mucha atención como
una alternativa a la extracción de granos de vainilla (Gallage y Møller, 2015; Kaur y Chakraborty, 2013;
Priefert et al., 2001). Por ejemplo, la vainillina puede producirse a partir de isoeugenol, que se produce
en algunos aceites esenciales, por microorganismos (Priefert et al., 2001; Wangrangsimagul y col.,
Yamada et al., 2007). El ácido ferúlico es un material de partida más práctico para la producción
biotecnológica de vainillina, ya que una gran cantidad de este compuesto puede recuperarse de
desechos agroindustriales incluyendo el trigo y el salvado de arroz (Di Gioia et al., 2007). Muchos
microorganismos que convierten el ácido ferúlico en vainillina han sido aislados y estudiados
extensivamente para la producción de vainillina (Priefert et al., 2001; Hua et al., 2007; Ma y Daugulis.
2 parrafo. Además de los microorganismos, el uso de enzimas inmovilizadas es prometedor en los
métodos utilizados para la producción de vainillina. Las enzimas en las células microbianas y las
enzimas libres de células son a menudo inestables cuando se usan como biocatalizadores. Por el
contrario, las enzimas inmovilizadas pueden ser más operativamente estables debido a la rigidización
de su estructura mediante la interacción directa con portadores apropiados. Además, las enzimas
inmovilizadas pueden separarse fácilmente de las soluciones de reacción, lo que permite un uso
repetitivo y rentable (Brady y Jordaan, 2009; Hilterhaus et al., 2008; Sheldon y van Pelt, 2013).
Aunque la producción de vainillina utilizando microorganismos ha sido ampliamente estudiada, no ha
habido informes sobre la producción utilizando enzimas inmovilizadas. Esto se debe en parte a la
complejidad del sistema enzimático en los microorganismos que convierten el ácido ferúlico en
vainillina. Una vía bien conocida en microorganismos consiste en la conversión de ácido ferúlico en
feruloyl-CoA, catalizada por feruloyl-CoA sintetasa, seguida por la conversión de feruloyl-CoA en
vainillina por enoil-CoA hidratasa / aldolasa; El primer paso requiere ATP y CoA como coenzimas
(Achterholt et al., 2000, Barghini et al., 2007, Lee y otros, 2009, Narbad y Gasson, 1998). Estas
costosas coenzimas tienen que ser suministradas para continuar las reacciones enzimáticas acopladas
cuando la sintetasa y la hidratasa / aldolasa se usan como catalizadores inmovilizados.
3 párrafo. Recientemente, hemos desarrollado una ruta a la vainillina de ácido ferúlico que no requiere
ninguna coenzima (Fig. 1). Esta ruta artificial consiste en una descarboxilasa independiente de la
coenzima (Fdc) que convierte el ácido ferúlico en 4-vinilguaiacol (2-metoxi-4 vinilfenol), y el paso
subsiguiente con una oxigenasa independiente de la coenzima (Cso2) que convierte el 4-vinilguaiacol en
Vainillina (Furuya et al., 2014, Furuyaet al., 2015, Muschiol et al., 2015). El ácido ferúlico descarboxilasa
Fdc de Bacillus pumilus cataliza la descarboxilación no oxidativa de ácidos carboxílicos aromáticos
(Barthelmebs et al., 2001, Yang et al., 2009). La 4-vinilguaiacol-oxigenasa Cso2 de Caulobacter segnis
pertenece a la familia de la oxigenase de la carotenoide-disociación y cataliza la escisión oxidativa de un
enlace C2 conjugado (Furuya et al., 2014, Kloer y Schulz, 2006). Hemos demostrado que Escherichia coli
células que expresan Fdc y Cso2 producido vainillina de ácido ferúlico a través de 4-vinilguaiacol (Furuya
et al., 2014). Cso2 también convierte el isoeugenol en vainillina de una manera independiente de la
coenzima (Furuya et al., 2014) (Figura 1). Esta característica independiente de la coenzima sería
ventajosa para la producción de vainillina usando enzimas inmovilizadas. En el presente estudio, se
investigó la producción biotecnológica de vainillina utilizando Fdc y Cso2 inmovilizados.
Higo. 1. Síntesis de vainillina independiente de la coenzima. La vainillina se sintetiza a partir de
isoeugenol por oxigenasa Cso2 (A) y de ácido ferúlico vía 4-vinilguaiacol por descarboxilasa Fdc y
oxigenase Cso2 (B).
4 parrafo. En primer lugar se examinó un soporte adecuado para la inmovilización de Cso2, una
enzima clave para la producción de vainillina, que es relativamente lábil. La oxigenase Cso2 exhibe
una alta actividad en el intervalo de pH 9,0-10,5, mientras que el punto isoeléctrico de Cso2 es pH 5,3
(Furuya et al., 2014). Esta propiedad indica que Cso2, con una carga negativa al pH óptimo, sería
inmovilizado en los portadores de intercambio aniónico. Se ensayaron cuatro vehículos de
intercambio aniónico. La matriz, el grupo funcional y el tamaño de partícula de cada portador se
muestran en la Tabla 1. Cuando se incubó cada portador con solución de Cso2, todos fueron capaces
de adsorber la proteína (0,04 a 0,10 mg mg-portador-1) (figura S1A en datos suplementarios ).
Además, se examinó la actividad productora de vainillina de estos portadores después de la adsorción
de Cso2. Cuando cada uno se incubó con isoeugenol, el Cso2 inmovilizado en Sepabeads EC-EA
convirtió eficientemente este sustrato en vainillina (figura S1B en datos suplementarios). Por el
contrario, Cso2 en los otros portadores pierde la actividad catalítica. Estos resultados sugieren que
Cso2 es compatible con la matriz de polimetacrilato y el grupo etilamina de Sepabeads EC-EA (Tabla
1).
5 parrafo. A continuación intentamos producir vainillina a partir de isoeugenol usando Cso2 inmovilizado
en Sepabeads EC-EA (Figura 1A). La actividad del catalizador de Cso2 inmovilizado se comparó con la de
un catalizador de E. coli de wholecell que expresaba Cso2. Cada catalizador se incubó con una solución
que contenía el sustrato isoeugenol. Las células enteras produjeron vainillina 8,4 mM a partir de
isoeugenol 10 mM durante 24 h de biotransformación (figura S2A en datos complementarios), mientras
que la enzima inmovilizada produjo sólo vainillina 4,6 mM (figura S2B en datos complementarios). Se
confirmó que una porción del sustrato de isoeugenol y el producto de vainillina se unieron al portador,
lo que condujo a un rendimiento reducido de vainillina por la enzima inmovilizada que las células
enteras. Después del primer ciclo de reacción, las células. La enzima inmovilizada se recogió de la mezcla
de reacción Y se añadió a una mezcla de reacción fresca (Figura 2). En el segundo ciclo de reacción,
todas las células produjeron sólo 4,9 mM de vainillina. Después de la reacción del tercer ciclo, la
actividad de la célula entera se perdió casi. Aunque la Cso2 oxidasa tiene una alta actividad en la
reacción de pH 9,0, la enzima es relativamente inestable bajo presión alcalina (Furuya et al., 2014). Sin
embargo, la enzima inmovilizada permitió producir vainillina 6,3 mM durante el segundo ciclo de
reacción. Además, más del 50% de la actividad Incluso en el séptimo ciclo de reacción. Esto da como
resultado la estabilidad del Cso2 se mejoró significativamente inmovilizando en Sepabeads EC-EA. La
cantidad total de vanilina producida a partir de iso eugenol por el catalizador de Cso2 inmovilizado
alcanzó 6,8 mg a la escala de 1 ml después de diez ciclos de reacción, pero las células totales produjeron
sólo 2,5 mg (figura 2).
figo. 2. La producción de vanilina a partir de isoeugenol por el uso repetitivo de Cso2 inmovilizado. Se
incubó Isoeugenol (10 mM) con 50 mg de células enteras o 7 mg de proteína inmovilizada sobre 100 mg
del vehículo en la mezcla de reacción (1 ml) durante 24 h en cada ciclo. La cantidad de proteína (7 mg)
fue casi igual a la obtenida a través de la disrupción de 50 mg de células enteras. Se muestra la vainillina
producida en cada ciclo por las células completas (barras grises) y la enzima inmovilizada (barras
blancas). También se muestra la cantidad total de vainillina producida por las células enteras (círculos
grises) y la enzima inmovilizada (círculos blancos). Los datos son el promedio de tres experimentos
independientes, y las barras de error indican la desviación estándar de la media.
6 parrafo. Como se confirmó que el Cso2 inmovilizado en Sepabeads EC-EA tenía una estabilidad
operativa superior, se utilizó el catalizador Cso2 inmovilizado en la síntesis en cascada de vainillina a
partir de ácido ferúlico vía 4-vinilguaiacol (Figura 1B). Se encontró que el primer paso Fdc fue tan
fácilmente inmovilizado en Sepabeads EC-EA como Cso2 fue. Se confirmó que 5 mg de proteína
inmovilizada en 50 mg del vehículo convirtieron eficazmente el ácido ferúlico en 4-vinilguaiacol (figura
S3 en datos complementarios). Ası, el catalizador de Fdc inmovilizado y el catalizador de Cso2
inmovilizado se a~nadieron a una solución que contenıa el substrato de ácido ferúlico. Aunque una
parte del sustrato y el producto se unen al portador como se ha descrito anteriormente, el Fdc y el
Cso2 inmovilizados convirtieron eficazmente el ácido ferúlico a vainillina a través de 4-vinilguaiacol.
Las enzimas inmovilizadas produjeron 2,8 mM de vainillina durante 24 h de biotransformación (Fig. S4
en datos complementarios). Después del primer ciclo de reacción, las enzimas inmovilizadas se
recogieron de la mezcla de reacción y se añadieron a una mezcla de reacción fresca (Figura 3). En el
segundo ciclo de reacción, las enzimas inmovilizadas produjeron vainillina 3,5 mM. En el tercer y
cuarto ciclos de reacción, las enzimas inmovilizadas mantuvieron su actividad, produciendo vainillina
3,1 mM y 2,4 mM, respectivamente. En ciclos 4-vinil-guaiacol intermedio se acumulaba en la mezcla
de reacción. La cantidad total de vanilina producida a partir de ácido ferúlico por los catalizadores de
Fdc y Cso2 inmovilizados alcanzó 2,5 mg a la escala de 1 mL después de diez ciclos de reacción (Figura
3). La cantidad de vanilina producida a partir de ácido ferúlico fue menor que la producida a partir de
isoeugenol.
Esta ruta artificial consiste en una descarboxilasa independiente de la coenzima (Fdc) que convierte el
ácido ferúlico en 4-vinilguaiacol (2-metoxi-4 vinilfenol), y el paso subsiguiente con una oxigenasa
independiente de la coenzima (Cso2) que convierte el 4-vinilguaiacol en Vainillina
Tabla . Proveedores de intercambio aniónico probado en este estudio
Higo. 3. La producción de vainillina a partir de ácido ferúlico por el uso repetitivo de Fdc y Cso2
inmovilizados. Se incubó ácido férrico (10 mM) con el Fdc inmovilizado (5 mg de proteína en el portador
de 50 mg) y el Cso2 inmovilizado (7 mg de proteína sobre 100 mg de vehículo) en la mezcla de reacción
(1 ml) durante 24 h en cada ciclo. Se muestra la vainillina producida en cada ciclo por las enzimas
inmovilizadas (barras blancas). También se muestra la cantidad total de vainillina producida por la
enzima inmovilizada (círculos blancos). Los datos son el promedio de tres experimentos independientes,
y las barras de error indican la desviación estándar de la media.
Es posible que el tiempo de reacción no fuera suficiente para completar la reacción en dos etapas en
cada ciclo (Figs. S2B y S4 en Datos complementarios), o que el sustrato ácido ferúlico y / o el 4-
vinilguaiacol intermedio tuvieron un efecto desfavorable En Cso2.
En conclusión, hemos demostrado que una coenzima independiente de la cascada que consiste en la
descarboxilasa Fdc y la oxigenase Cso2 fue fácilmente aplicable a un proceso enzimático inmovilizado
para la producción de vainillina. Aunque muchos estudios se han dedicado a la producción
biotecnológica de vainillina, este estudio es, a nuestro conocimiento, el primero para la producción de
vainillina utilizando enzimas inmovilizadas. El proceso enzimático inmovilizado proporciona nuevas
posibilidades para la bioproducción práctica de la vainillina, ya que la vainillina puede prepararse
mezclando solamente isoeugenol o ácido ferúlico con las enzimas inmovilizadas que puede usarse
repetitivamente. En el presente estudio, como la actividad de Cso2 no fue tan alta, se añadió una gran
cantidad de la enzima a la mezcla de reacción para la conversión de isoeugenol en vainillina. La
acumulación del 4-vinil-guaiacol intermedio después de la reacción repetitiva con ácido ferúlico indica
que la reacción de Cso2 de segunda etapa limitada aumenta adicionalmente la producción de vainillina.
Ahora estamos investigando la ampliación del proceso, así como la ingeniería genética de Cso2 para una
mayor actividad y estabilidad hacia la aplicación industrial.
