Informe Resultados. Metabolismo Fermentativo
Informe Resultados. Metabolismo Fermentativo
TEMA: METABOLISMO FERMENTATIVO, ESTUDIO DEL BOMBEO DE PROTONES Y DE LA CADENA TRANSPORTADORA DE ELECTRONES EN LEVADURAS.
(máximo 6 páginas)
PRESENTADO POR: Esli Jessel Fonseca Rodríguez, Edwin Leonardo Acuña Guerrero.
1. Introducción al tema, el porqué de la selección de las pruebas que se hicieron y en general los resultados obtenidos (no olvide incluir
bibliografía):
Un gran número de microorganismos utilizan la ruta glucolítica para degradar los hidratos de carbono (por regla general azúcares: como por ejemplo la
glucosa, la fructosa, la sacarosa, sirve con cualquier sustancia que tenga la forma empírica de la glucosa, es decir, que sea una Hexosa.); mediante una
secuencia de reacciones catalizadas enzimáticamente, la hexosa es dividida en dos moléculas de piruvato con formación afín de NADH 2 extrayéndose
solo una pequeña parte del elevado contenido energético de esta molécula. En los organismos anaeróbicos facultativos como la levadura el NADH 2
producido durante el proceso glucolítico debe ser reoxidado para mantener el equilibrio de oxidoreducción, esto se logra mediante reacciones
subsecuentes propias de cada organismo y de las condiciones de crecimiento; así, a partir del piruvato se pueden formar una variedad de productos
consiguiéndose en algunos casos generar energía adicional en forma de ATP, estas reacciones ocurren en ausencia de oxigeno y el proceso completo se
denomina fermentación1.
Entre los principales tipos de fermentación se encuentra la fermentación alcohólica, en donde comprende una serie de reacciones bioquímicas a través
de las cuales algunos microorganismos, por medio de un conjunto de enzimas producidas por ellos, realizan una transformación de azúcares para
convertirlos en etanol, dióxido de carbono y energía (ATP). Las diferentes pruebas como lo son efecto de la fuente de Carbono, obtención de
Intermediarios metabólicos por variación del pH, obtención de Intermediarios metabólicos por agentes atrapantes, reconocimiento de Intermediarios
Metabólicos son de ayuda para poder entender a mayor cabalidad las reacciones que se llevan a cabo en el proceso de fermentación alcohólica, tal
como es identificar el piruvato a diferentes condiciones de pH y poder identificar en que ambiente se obtiene con mayor eficacia. Así mismo, poder
identificar el etanol y la importancia de usar agentes atrapantes.
Por otra parte, la cadena de transporte de electrones mitocondrial está formada por un conjunto de complejos que son los encargados del proceso de
fosforilación oxidativa, en donde el complejo I, también denominado NADH deshidrogenasa o NADH ubiquinona oxidorreductasa, se produce la
oxidación del NADH a NAD+, proceso en el cual se transfieren 2 electrones a la molécula de ubiquinona (o coenzima Q) reduciéndola de este modo a
ubiquinol lo que va acompañado del transporte de 4 protones al EIM. Este NADH puede provenir del generado en la matriz mitocondrial mediante el
ciclo de Krebs o del citoplasma a través de las lanzaderas mitocondriales 2. Mediante las pruebas realizadas se estudia a más profundidad la función de
la coenzima NADH y el efecto que tienen los diferentes inhibidores y acoplantes en este proceso.
Tubo 1 2 3 4 5
Carbohidrato glucosa sacarosa fructosa lactosa maltosa
Tiempo en que 15 min 25 min 13 min No hubo 24 min
desaparece la coloración decoloración
azul
Altura (en tubo) gas 5 mm 4mm 5 mm 0 mm 4 mm
formado una vez
finalizada la incubación
2.2. ¿Cuál es el fundamento químico para el empleo del azul de metileno en el efecto de la fuente de carbono en el proceso de fermentación?,
por qué ocurre la decoloración en cada tubo?
El azul de metileno puede servir como un indicador para el proceso de fermentación de cada uno de las fuentes de carbono, ya que este penetra
fácilmente en las células de levadura, en donde se reduce a un compuesto incoloro por la eliminación de oxígeno ya que contienen enzimas capaces de
reducir el azul de metileno. Las células muertas donde la enzima es inactiva, esto no ocurre y, por consiguiente, permanece azul 3.
La decoloración de los tubos 1 y 3 se debe a que ha ocurrido un proceso de fermentación alcohólica en plena ausencia de aire (oxígeno - O 2), originado
por la actividad de la levadura que procesan los hidratos de carbono (ejemplo la glucosa, la fructosa, la sacarosa, sirve con cualquier sustancia que
tenga la forma empírica de la glucosa, es decir, que sea una Hexosa; dando como productos finales etanol y dióxido de carbono, y así mismo como se
explicó anteriormente el azul de metileno es el indicador de este proceso por medio de la reducción de este mismo. Por otra parte, en los tubos 2 y 5 el
proceso de fermentación se logra al producir enzimas de la levadura, algunas de estas enzimas convierten los azúcares complejos (sacarosa y maltosa)
en azúcares simples y otras enzimas cambian los azúcares simples en dióxido de carbono y alcohol, observándose así el proceso de decoloración.
2.3. Sustente los resultados obtenidos. ¿Cuál es el carbohidrato de preferencia a fermentar por las levaduras?, por qué?
En el tubo 4 no observa ninguna decoloración ya que la levadura no genera la fermentación de la lactosa, este es otro tipo de fermentación
denominada fermentación láctica en la que es propiciada por otros microorganismos para producir ácido láctico. En los demás tubos ocurrió el proceso
de fermentación alcohólica por medio de la levadura, en donde la levadura degrada el azúcar para convertirlo en etanol y dióxido de carbono como
productos finales y esto se puede evidenciar en la altura del gas desprendido una vez finalizada la incubación. Como se muestra en la reacción general
de la fermentación alcohólica:
Por otra parte, el carbohidrato de preferencia a fermentar teniendo en cuenta el tiempo en que desaparece la decoloración y la altura del dióxido de
carbono desprendido es la fructosa, una hexosa de formula empírica de la glucosa, a continuación viene la glucosa y finalmente la maltosa y sacarosa,
ya que estos son disacáridos compuestos por dos unidades de glucosa y glucosa y fructosa respectivamente, por lo que el proceso de fermentación es
mas lento ya que es necesario primero convertirlos en unidades mas simples y a continuación si realizar el proceso de fermentación.
2.4. ¿Desde un punto de vista bioquímico explique la diferencia entre la velocidad de fermentación alcohólica de la levadura y bajo qué condición
se producirá más etanol?
La glucólisis es la primera etapa de la fermentación, en donde el carbohidrato se convierte en 2 moléculas de piruvato para luego convertirse en etanol
y dióxido de carbono por acción de la levadura que degrada el carbohidrato, así que la diferencia entre las velocidades se debe a que los disacáridos
necesitan convertirse primero en monosacáridos por medio de la enzima invertasa, encargada de acelerar el proceso de la hidrólisis de los
carbohidratos de la sacarosa, transformándolos en glucosa y fructosa y de la maltasa en el caso de la maltosa 4; por lo cual esto va a permitir que el
proceso de fermentación se demore más.
Las levaduras son microorganismos mesófilos, esto hace que la fermentación pueda tener lugar en un rango de temperaturas desde los 13-14ºC hasta
los 33-35ºC. Dentro de este intervalo, cuanto mayor sea la temperatura mayor será la velocidad del proceso fermentativo siendo también mayor la
proporción de productos secundarios. Sin embargo, a menor temperatura es más fácil conseguir un mayor grado alcohólico, ya que parece que las altas
temperaturas que hacen fermentar más rápido a las levaduras llegan a agotarlas antes. Por encima de 33-35ºC el riesgo de parada de fermentación es
muy elevado, al igual que el de alteración bacteriana ya que a estas elevadas temperaturas las membranas celulares de las levaduras dejan de ser tan
selectivas, emitiendo substratos muy adecuados para las bacterias 5. Otro aspecto importante para producir mas etanol es el PH, ya que en condiciones
alcalinas es mas favorable la degradación de los carbohidratos por acción de las levaduras.
3. Obtención de intermediarios metabólicos por variación del pH (piruvato) y del producto final por agentes atrapantes (etanol).
3.1. Resultados obtenidos
Tubo 1 2 3 4
Piruvat + -
o
Etanol + - + -
3.2. ¿Cuál es el efecto del pH en la fermentación?, qué sucede con la generación de piruvato, ¿según los tubos 1 y 2?
El pH es un factor inhibidor en el proceso de la fermentación ya que las levaduras se encuentran afectadas claramente por el ambiente, bien sea
alcalino o ácido. Por regla general el funcionamiento de las levaduras está en un rango que va aproximadamente desde 3.5 a 5.5 pH, así mismo para
que ocurra una acumulación de piruvato y poderlo detectar, la fermentación debe ocurrir en condiciones medianamente alcalinas para que se pueda
inactivar la enzima piruvato descarboxilasa 6, por esta razón, en el tubo 2 que se encuentra a un pH 8, la formación del piruvato es negativo, así mismo
el tubo 1 se encuentra a un pH de 5, se encuentra en condiciones optimas y por lo tanto obtuvimos el piruvato.
3.3. ¿Por qué para la evaluación del efecto del pH en la fermentación es necesaria la adición de sulfato de amonio y de nitroprusiato de sodio?
¿Cuál es el efecto de cada uno de ellos?
El sulfato de amonio actúa como un activante de la fermentación, porque aporta a las levaduras el nitrógeno de forma amoniacal necesario para que
estas se multipliquen. Por otra parte, el nitroprusiato de sodio se utiliza con un agente atrapante para que “atrape” el intermediario piruvato y que
forme un compuesto que no puede metabolizarse. El piruvato descarboxilasa no es activa en soluciones ligeramente alcalinas, de manera que el
piruvato se acumula y su presencia puede demostrarse por la reacción con nitroprusiato de sodio, en donde el nitroprusiato de sodio reacciona con el
piruvato formando un anillo verde, es por esto que uso es necesario para determinar el efecto del pH en el proceso de fermentación 7.
3.4. Indique la reacción general, con estructuras químicas, de la prueba positiva para la presencia de piruvato.
NAD
3.5. ¿Cuál es el efecto del pH en la producción de etanol? H
Las células de levadura utilizadas en la fermentación pueden tolerar un pH de 4.0 a 8.5, pero funcionan mejor cuando el pH está entre 4.0 y 6.0. Esto
significa que las células de levadura requieren un ambiente ligeramente ácido para hacer su mejor fermentación, es por esto que el tubo 1 a un pH 5 da
un resultado positivo para la obtención de etanol, así mismo esto porque las condiciones optimas de las levaduras es entre 3,5 a 5,5 favoreciendo así
mayormente la degradación de la glucosa para la obtención de etanol.
3.6. ¿Cuál es el efecto del sulfito de sodio en la producción de etanol? ¿Qué es un agente atrapante en términos de un proceso fermentativo?
El sulfito de sodio actúa como un agente atrapante, teniendo en cuenta la reacción descrita hacia la oxidación estequiométrica del etanol se requiere
un medio alcalino y un agente de captura para eliminar el producto de reacción de acetaldehído (generalmente por reacción con una amina para
formar una base de Schiff)8.
4. Fermentación Alcohólica.
4.1. Considerando el montaje realizado, ¿cuál fue la función del Ba (OH)2 y del KOH?
El uso del hidróxido de Bario es crear una prueba para la detección del CO 2 la cual consiste en hacer burbujear el gas en cuestión a través de una
solución de hidróxido de bario. Un ejemplo calve es el tubo Eldredge, que es un dispositivo para atrapar CO 2 en hidróxido de bario, se puede utilizar
para la detección cualitativa (observación de un precipitado) y cuantitativa (recuperación del precipitado) de CO 2. Sin embargo, estos procedimientos
dependen de la evolución de CO2 gaseoso del medio de crecimiento que no siempre ocurre debido a la alta solubilidad del CO 2 en agua.9
Por su parte el Hidróxido de potasio cumple dos funciones importantes durante el procedimiento, el hidróxido de potasio, hidróxido de sodio y ácido
clorhídrico se pueden utilizar para ajustar el pH antes y durante la fermentación. 10 El hidróxido de sodio o potasio conducen a una menor generación de
sal insoluble. En el impacto del catión en la fermentación de la levadura, el sodio afecta más que el potasio. El hidróxido de potasio es una buena base
para la neutralización del hidrolizado de ácido con mayor rendimiento de etanol. 11
4.3. ¿Justifique por qué al destilado obtenido es necesario el proceso de alcalinización? Qué indica químicamente la adición posterior de lugol?.
Es necesario el proceso de alcalinización con el fin de generar un medio apto; los microorganismos crecen favorablemente, un cambio en las
condiciones de crecimiento como temperatura, presión osmótica, intoxicación alcohólica, infección bacteriana, alcalinización del medio afectará la
propagación de los mismos.13
La adición de Lugol se debe realizar con el fin de determinar las observaciones de los microorganismos responsables bajo el microscopio de campo claro
y tinción con reactivo de Lugol, o bajo microscopía de contraste de fase. Es importante poner de manifiesto la inmovilidad de las células de levadura al
microscopio. Así mismo este reactivo se adiciona con el fin de determinar cualitativamente la producción de etanol por el método de yodoformo, la
presencia de etanol se observa por la aparición de un precipitado amarillo correspondiente a la formación de yodoformo. Las células son penetradas
por el cristal violeta es añadida a la solución de yodo-lugol para formar un complejo (azul violeta-yodo), de modo que el colorante no sea removido
fácilmente del interior de la célula. Este paso se conoce comúnmente como la fijación del colorante. 14
4.4. Explique cómo se formaron y a qué corresponden los cristales obtenidos (se hayan o no logrado experimentalmente) al final de la
fermentación alcohólica.
A medida que se produce dióxido de carbono en el proceso de fermentación, el gas burbujea a través del tubo y entra en la solución de rojo de fenol en
el tubo de ensayo. A medida que el CO 2 burbujea a través de la solución, el pH de la solución disminuye continuamente. Cuando el pH desciende por
debajo de 7.0 neutro, el rojo fenol se vuelve amarillo. Este burbujeo y cambio en el rojo fenol es una clara indicación del dióxido de carbono producido
durante la fermentación. La prueba de yodoformo opcional proporciona una demostración clara del otro producto resultante de la fermentación de
levadura: el alcohol etílico.
Durante el procedimiento se deben agregar varias gotas de hidróxido de potasio al destilado junto con una pequeña cantidad de gotas de lugol,
posteriormente el reloj de vidrio se calienta suavemente lo que conlleva a la formación de cristales de yodoformo. 15
5.
6. Glicólisis Anaerobia.
6.1. Resultados obtenidos
Volumen glucosa al 10% empleado? 150 mL
Suspensión Tiempo 0 2 4 6 8 10 12 15
levaduras + (min)
glucosa Vol. (mL) 0 1 3 7 15 25 26 27
CO2
6.2. Grafico tiempo vs producción CO2
Tiempo (min) vs Vol. CO2 (mL)
30
25
20
15
10
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
6.3. Realice y analice la estequiometria de la reacción. Indique el rendimiento de la misma transcurridos 15 min (final de reacción).
La gráfica anterior nos ayudó a observar de manera general el aumento en la concentración CO 2. En la gráfica se observa un comportamiento
exponencial de este gas.
A pesar de parecer, a nivel estequiométrico, una transformación simple, la secuencia de transformaciones para degradar la glucosa hasta dos moléculas
de alcohol y dos moléculas de bióxido de carbono es un proceso muy complejo, pues al mismo tiempo la levadura utiliza la glucosa y nutrientes
adicionales para reproducirse.
Primero, necesitamos convertir el volumen de gas (CO2) producido durante la fermentación en moles de CO 2. El volumen de un mol de gas depende de
la presión y la temperatura. El volumen / mol se proporciona a menudo para "temperatura y presión estándar" (STP): 22,4 litros / mol de gas.
(
mol
) −3
( 0,027 L CO2 )∗ 0,042 L =1,134 x 10 moles de CO 2
Por cada molécula de etanol producida, se libera 1 molécula de gas CO 2. Entonces, si se producen 1,134X10-3 moles de CO 2, entonces se producen
1,134X-13 moles de etanol.
1 80 g de C6 H 12 0 6 → 92 g CH 3 CH 2 OH +88 g CO2
06∗88 g CO 2
Rendimiento teorico=10 0 g de C 6 H 12
1 80 g de C 6 H 12 06
Rendimiento teorico=48,88 g de CO2
Teniendo en cuenta lo anterior, procederemos a calcular la masa de CO 2 presente en los 27 mL de CO2 liberado por medio de la solución de glucosa al
10%
06∗88 g CO2
1 6,577 g de C 6 H 12
180 g de C 6 H 12 06
g experimentales de CO 2=8,10 g de CO2
El rendimiento teórico estequiométrico para la transformación de glucosa en etanol es de 0.511 g de etanol y 0.489 g de CO 2 por 1 g de glucosa. Este
valor fue cuantificado por Gay Lussac. En la realidad es difícil lograr este rendimiento, porque como se señaló anteriormente, la levadura utiliza la
glucosa para la producción de otros metabolitos. El rendimiento experimental varía entre 90% y 95% del teórico, es decir, de 0.469 a 0.485 g/g. Los
rendimientos en la industria varían entre 87 y 93% del rendimiento teórico. Otro parámetro importante es la productividad (g/h/l), la cual se define
como la cantidad de etanol producido por unidad de tiempo y de volumen. 16
7. Estudio del bombeo de protones, efecto de los inhibidores de la cadena de transporte de electrones y de los desacoplantes.
7.1. ¿Qué es un inhibidor de la cadena transportadora de electrones?, cómo actúan? Cite tres ejemplos.
Los inhibidores de la transferencia de electrones son moléculas que impiden el flujo de electrones entre los transportadores bloqueando su habilidad
de cambiar de forma reversible entre la forma oxidada y la forma reducida y, por lo tanto, la síntesis de ATP. Ejemplos:
Los inhibidores del complejo I como rotenona, amital y piericidina A impiden la transferencia
electrónica a la ubiquinona completamente oxidada (UQ), al igual que el inhibidor del complejo II 2-
thenoyltrifluoroacetona.
Los inhibidores del complejo III como la antimicina A, impide el paso de electrones desde el
citocromo bH a la Ubiquinona, y el mixotiazol, el cual impide la transferencia de electrones desde la ubiquinona completamente reducida
(UQH2) a la proteína de Rieske.
El cianuro es un potente veneno que inhibe la cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa bloqueando el paso de
electrones del citocromo α3 al oxígeno en el complejo IV. Esto bloquea la cadena de transporte de electrones, lo que conlleva que no se
genere el gradiente de protones y por tanto no se produzca la obtención de ATP con la consiguiente acumulación de NADH y FADH 2. El
monóxido de carbono (CO) y el azida, los cuales se unen al Fe en el hemo α3; bloquean la forma férrica y el CO la forma ferrosa 2.
7.2. ¿Qué es un desacoplante de la cadena transportadora de electrones?, cómo actúan? Cite tres ejemplos.
Son sustancias que disipan el gradiente electroquímico al facilitar la entrada de protones a la matriz a través de “atajos” proporcionados por esas
sustancias y por esa razón ocurre el transporte de electrones, pero no la fosforilación oxidativa. Los desacopladores de la cadena de transporte de
electrones, como su propio nombre indica actúan desacoplando el transporte de electrones de la formación de ATP. Son moléculas hidrofóbicas con un
protón disociable que atraviesan la membrana mitocondrial interna (MMI) transportando protones del espacio intermembrana (EIM) a la matriz,
disipando de este modo el gradiente de protones. La energía se libera en forma de calor y, por tanto, no se produce ATP. Ejemplos: En este grupo se
encuentran el 2,4-dinitrofenol (DNP), el carbonyleyanida-p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP) o el dicumarol 2.
7.3. Resultados obtenidos. El grafico pH vs tiempo da cuenta de un proceso fermentativo de levaduras en una solución de glucosa al 20%, bajo 3
condiciones diferentes e independientes: control (línea azul), adición de dinitrofenol (línea roja) y adición de ferricianuro de potasio (línea
negra). Sustente el comportamiento de cada condición.
El uso de inhibidores de la cadena ha permitido trazar el paso de los electrones a través de la cadena y
determinar el punto de entrada de diversos sustratos. La velocidad a la cual el oxígeno es consumido por una suspensión de mitocondrias es una
medida del funcionamiento de la cadena de transporte de electrones. Inhibidores específicos se han usado para distinguir el sistema de transporte de
electrones del sistema de fosforilación oxidativa, y ha ayudado a definir la secuencia de los transportadores redox en la cadena. Si la cadena se bloquea
en un punto, todos los transportadores anteriores quedan más reducidos, y los posteriores más oxidados. La velocidad puede ser medida mediante un
electrodo de oxígeno17. Así, el Ferricianuro de potasio actúa como un inhibidor en la cadena de transporte de electrones por lo que es evidente que el
gráfico permanezca casi constante.
Por otra parte, el dinitrofenol es un desacoplante de la cadena de transporte, es decir, desencaja la cadena de transporte de electrones de la
fosforilación oxidativa, el desacoplamiento se produce ya que el dinitrofenol hace permeable a los protones de la membrana interna mitocondrial
deshaciendo la relación obligada entre la cadena respiratoria y la fosforilación oxidativa. El efecto de esta sustancia por tanto es la inhibición de la
producción de ATP al no generarse el gradiente de pH, pero si permite que la cadena de transporte de electrones continúe funcionando.
8. Conclusiones (presentadas a partir de los objetivos planteados por cada uno, incluir los resultados generales obtenidos. El límite inferior de
conclusiones es de 5).
1) Se observó correctamente el proceso de fermentación el la glucosa, fructosa, sacarosa y maltosa por medio de la prueba cualitativa con azul de
metileno, observando el proceso la decoloración de éste ya que atraviesa por un proceso de reducción por las enzimas que tienen la levadura y así
mismo en la lactosa no hubo proceso de fermentación por lo cual el azul de metileno permaneció en su forma oxidada.
2) Se determinó la presencia del intermediario metabólico piruvato por medio de la variación de pH en donde se determinó que las condiciones en
donde se produce el piruvato son en condiciones medianamente alcalinas, es decir, en el pH de 8,0.
3) Se determinaron las condiciones de pH necesarias para la obtención de etanol en el proceso fermentativo en donde las mejores condiciones es en
un pH ligeramente ácido a un pH de 5.0.
4) Se determinó la utilidad de usar un agente atrapante en la producción de etanol como lo es el sulfito de sodio ya que este tiene como fin de
eliminar el producto de reacción del acetaldehído, en donde generalmente puede generar una base de Schiff.
5) El desprendimiento de CO2 como desecho metabólico de la fermentación nos ayuda de manera importante a entender el funcionamiento de este
proceso metabólico, ya que este producto evidencia la cantidad de sustrato fermentado por la levadura, lo que ofrece información valiosa sobre el
alimento que favorece el crecimiento de este organismo.
6) Se observó que, en el estudio del bombeo de protones por levaduras, el efecto de los inhibidores a medida que aumentaba el tiempo el pH
disminuía.
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