Crisdavi Ortega Vergara 09/11/2022
Tema 3: Solución preguntas
1. Indica qué tipo de pretratamientos aplicarías a las siguientes muestras para iniciar un
proceso de extracción y purificación de ácidos nucleicos y qué materiales o reactivos
emplearías.
a) Cultivo celular en monocapa.
Si las células crecen en suspensión en el medio de cultivo se procede de la siguiente manera:
1. Utilizar el propio frasco para continuar el proceso de extracción para ello:
Retirar del frasco el medio de cultivo.
Lavar la monocapa Con tampón o solución salina
Iniciar In situ, en el propio Frasco el proceso de Extracción
2. Pasar la monocapa a un tubo:
Despegar la monocapa del frasco por fricción mecánica o por proceso enzimático
Lavar la monocapa con tampón o solución salina, se incuban las células con una
solución de tripsina al 0,10-0,25%
Recolectar células en un tubo
Eliminar la tripsina, lavando las células antes de continuar con la extracción.
b) Esputo.
El pretratamiento consiste en la fluidificación con un agente mucolítico (N- acetil-L-
cisteína, NALC). En una solución de citrato sódico
Si se quiere detectar una microbacteria se puede añadir hidróxido sódico para
descontaminar la muestra.
c) Sangre.
Lisis de los hematíes: consiste en romper los hematíes con una solución de
lisis comercial o un detergente suave, la proporción deber ser 1: 3 por cada
volumen de sangre 3 de la solución de lisis.
Centrifugado de la muestra: el objetivo es obtener el sedimento o Pellet y un
sobrante.
Eliminación del sobrante: consiste en eliminar el líquido sobre abundante con
una pipeta de Pasteur y con esto se eliminará los componentes del plasma y la
hemoglobina.
Conservación del sedimento: en el sedimento habrá quedado los leucocitos
que el lo que queremos para la extracción.
d) Tejido vegetal fresco.
Se pueden hacer de dos maneras por homogenización mecánica o automatizada
Se procede de la siguiente manera en Homogenización automatizada
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Tema 3: Solución preguntas
El tejido se corta en pequeños fragmentos
Se homogeniza por la acción de trituradoras mecánicas.
Se transfiere en la muestra a un tubo limpio cuando hubiere terminado la rotura
mecánica del tejido.
Es conveniente hacer el proceso en frío y de forma rápida o bien añadir inhibidores
enzimáticos para evitar la degradación de los componentes celulares por parte de las
proteasas.
Se procede de la siguiente manera en Homogenización Mecánica manual con Mortero
Se coloca fragmentos del tejido en un mortero y se cubren con nitrógeno liquido y se
congela rápidamente el tejido. Esto provocara la lisis celular por tanto la liberación de
enzimas iniciando así la degradación celular.
Con la mano del mortero se pulverizan los fragmentos congelados hasta conseguir un
polvo fino y se deja evaporar el nitrógeno liquido
El polvo obtenido se transfiere a un tubo limpio para iniciar la extracción
e) Biopsia de tejido animal fijado en formol e incluido en parafina.
El tratamiento previo en este tipo de muestra es la desparafinizaciòn que consiste en la
eliminación de la parafina en los tejidos FFPE.
Se procede:
Con in microtomo obtener cortes finos de (5 a 10 µm)
Se transfiere aproximadamente 5-10 mg de cortes a un tubo Eppendorf.
Se incuba secuencialmente con XILOL o etanoles de concentración decreciente (por
ejemplo, 100%, 96%, y 70%) y agua destilada.
Finalmente, el tejido desparafinado y rehidratado se somete una homogenización
química.
2. Respecto de la extracción de ácidos nucleicos, nombra:
a) Dos procesos fundamentales para conseguir una buena extracción.
R/: la lisis celular para liberar los ácidos nucleicos y la inactivación de nucleasas celulares
(ADNasas y ARNasas).
b) Dos detergentes utilizados en soluciones de lisis celular.
R/: El dodecilsulfato sódico (SDS) y el CTAB (más utilizado para tejidos vegétales o algunas
bacterias Gram negativas)
c) Dos agentes inactivadores de nucleasas.
R/: EDTA y Proteinasa K
d) Dos enzimas que digieran la pared bacteriana o vegetal.
R/: Lisozima o lisostafin para degradar la pared de baterías Grampositivas
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Tema 3: Solución preguntas
Liticasa o zimolasa, para células vegétales, levaduras y hongos.
3. Se quieren purificar ácidos nucleicos a partir de un lisado de células de mucosa oral
utilizando el método de purificación con solventes orgánicos. Para ello, en un tubo
limpio se mezcla 1 ml de lisado con 1 ml de una mezcla de fenol/cloroformo/alcohol
isoamílico (25:24:1). Tras agitar y centrifugar se obtienen dos fases. Reproduce un dibujo
como el de abajo indicando el nombre de cada fase y sus componentes principales, y
complétalo con los procesos implicados (casillas verdes) y los reactivos empleados
(casillas azules) hasta obtener el ácido nucleico purificado en solución.
Fase acuosa: En la parte superior contiene ácidos nucleicos, las sales y los componentes
hidrosolubles del lisado.
Fase orgánica: En la parte inferior del tubo quedan las proteínas y los lípidos
Los procesos implicados son:
Precipitación del ADN: se transfiere a un tubo limpio y el ADN se precipita añadiendo acetato
sódico e isopropanol o etanol al 100%.
Mediante la centrifugación el ADN precipitado sedimenta el fondo del tubo.
Lavado del ADN: una vez eliminado el sobrante el Pellet de ADN se lava con etanol al 70-95%
y se vuelve a centrifugar
Resuspensión del ADN: Como el etanol interfiere en casi todo las técnicas, hay eliminarlo
antes de resuspender el ADN; se puede invertir el tubo y secarlos con papel de filtro , el Pellet
de ADN se deja secar a temperatura ambiente.
Una vez seco se resuspende en H2Od o en un Tampón de Tris EDTA(TE)
4. Relaciona los métodos de purificación de ácidos nucleicos siguientes con los respectivos
fundamentos que corresponden
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5. Escribe la función que cumplen los siguientes reactivos en la purificación de plásmidos
por el método de lisis alcalina:
a) Dodecil sulfato sódico en el tampón de lisis. El SDS junto al hidróxido sódico provocan la
lisis de las bacterias y la desnaturalización del ADN, tanto el cromosómico, como el plasmídico.
b) Hidróxido sódico en el tampón de lisis: El hidróxido sódico junto al SDS provocan la lisis de
las bacterias.
c) Acetato potásico en la solución de neutralización a pH 4,8: Este tiene dos efectos; por un
lado, neutraliza bruscamente el pH lo que provoca asociaciones aleatorias en las moléculas de
ADN cromosómico y se originan así macroagregados insolubles que precipitan. Por el
contrario, hace que el ADN plasmídico recupere su estructura nativa. Por otro lado, al tener
una alta concentración salina, se precipitan las proteínas junto con la sal potásica del
dodecilsulfato. Estos producen agregados que atrapan el ADN cromosómico no renaturalizado
d) ARNasa: Las ARNasas sirven para degradar rápidamente el ADN.
6. Escribe si son verdaderas o falsas las siguientes afirmaciones relativas a la purificación de
ARN y justifica la respuesta:
a) Las ARNasas se pueden eliminar esterilizando con autoclave
Falso: a altas temperaturas se desnaturalizan y pierden su actividad, pero cuando
disminuye la temperatura, recuperan su conformación nativa y recobran su actividad.
b) La solución de lisis debe contener un agente caotrópico, como el isotiocianato de
guanidinio.
Verdadero: inactivan las nucleasas y desnaturalizan as macromoléculas, impidiendo
que realicen su actividad.
c) Las soluciones de trabajo deben contener EDTA porque inhibe las ARNasas.
Falso: porque la solución de EDTA capta magnesio y este es un cofactor necesario para
que funcionen las ADNasas, e inhibe su actividad.
d) Todos los reactivos empleados deben fabricarse con agua tratada con DEPC.
Verdadero.
e) El agua tratada con DEPC tiene que autoclavarse antes de su utilización.
Verdadero.
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7. Escribe si son verdaderas o falsas las siguientes afirmaciones relativas a la
integridad de los ácidos nucleicos tras la purificación y justifica la respuesta:
a) La electroforesis en gel de agarosa es la técnica de elección para
comprobar la integridad de los ácidos nucleicos.
Verdadero
b) En la electroforesis de una muestra de ARN total no degradado de un
organismo eucarionte se observan dos bandas nítidas correspondientes a los
ARNr 28S y 18S, junto con un ligero smear por el ARNm.
Verdadero.
c) La mejor muestra para purificar ADN es el tejido fijado en formol e
incluido en parafina, porque la fijación con formol conserva perfectamente la
integridad de los ácidos nucleicos.
Falso: si se fija en formol incluido en parafina, provoca que el ADN se
fragmente, haciendo que no tenga sentido valorar la integridad de la muestra.
d) Cuando el ADN se degrada, en la electroforesis se observa un smear, cuya
amplitud e intensidad dependen del grado de fragmentación y degradación
del ADN.
Verdadero.
e) En la electroforesis de ADN plasmídico íntegro se observan múltiples
bandas por la formación de dímeros, trímeros, tetrámeros, etc.
Falso: se debería obtener una única banda que haga corresponder el plásmido
con su estructura original.
8. Analiza la pureza de las siguientes muestras: En las muestras en las que
consideres que hay contaminación, explica cuáles pueden ser los posibles
contaminantes y propón soluciones para eliminarlos.
Muestra 1:
A260/A280 = (0,352-0,025)/(0,265-0,025)=0,327/0,24=1,36
A260/A230 = (0,352 – 0,025) / (0,182 – 0,025) = 2,08
Resultado: muestra de ADN contaminado con proteínas y fenoles. La posible
solución sería aplicar proteinasa K, para posteriormente precipitar, lavar y
resuspensión del ADN.
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Muestra 2:
A260/A280 = (0,436-0,020)/(0,248-0,020)=0,416/0,228=1,82
A260/A230 = (0,436 – 0,020) / (0,235 – 0,020) = 1,93
Resultado: muestra ADN con grado de pureza adecuado.
Muestra 3:
A260/A280 = (0,312 – 0,029) / (0,166 – 0,029) = 2,07
A260/A230 = (0,312 – 0,029) / (0,229 – 0,029) = 1,41
Resultado: muestra de ARN está contaminado por sales, carbohidratos,
fenoles. Solución, precipitar y lavar de nuevo el ARN con etanol, dejarlo secar y
resuspender otra vez.
9. En un tubo eppendorf tenemos 50 µl de una solución de ADN genómico
humano. Para calcular su concentración se diluyen 5 µl de la solución con 195
µl de tampón TE y se mide la absorbancia de la dilución a 260 nm, 280nm y
320 nm. Los valores obtenidos son los siguientes:
A260 = 0,469. A280 = 0,265. A320 = 0,019.
Calcula:
- La concentración de la solución original en ng/µl.
Vinicial=5ul
Vtotal=5ul+195 ul tapón TE=200 ul
5ul/200ul=1/40 (dilución de la muestra).
(0,469nm—0,019nm x (50 ng/ul dilución /1nm) x ( 40 ul dilución/1ul
sol.original) =900 ng/ul
- La pureza del ADN.
A260/A280 = (0,469 – 0,019) / (0,265 – 0,019) = 1,83 pureza óptima.
- La cantidad total de ADN en µg en la solución original.
900ng/ul · 50 = 45000 ng = 45μl.
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10. Para realizar una técnica de biología molecular necesitamos añadir a una
mezcla de reacción 600 ng de ARN. En un tubo tenemos 100 µl de una
solución de ARN cuya concentración no es conocida. Se diluyen 4 µl de la
solución con 196 µl de agua destilada y se mide su absorbancia a 260 nm,
dando un valor de 0,125. ¿Qué volumen de la solución original de ARN habrá
que añadir a la mezcla de reacción?
Concentración = (A260 – A230 ) X FDilución X FConversión = 0,125 x 50 x 40 =
250ng/μl
250ng → 1μl
600 ng → X
X = 600ng x 1 μl / 250ng = 2,4 μl (volumen de la solución original de ARN habrá
que añadir a la mezcla de reacción).
