BIOTECNOLOGIA

7mo Ciclo

Profesor:
Carlos Jácome Pilco, Ph.D.

UNIVERSIDAD ESTATAL DE BOLIVAR

CARRERA DE AGROINDUSTRIA
BIOTECNOLOGIA

SEMANA 11

UNIDAD 3: TECNOLOGIA ENZIMATICA

Clase 11:

Producción e inmovilización de enzimas

Profesor:
Carlos Jácome Pilco, Ph.D.

UNIVERSIDAD ESTATAL DE BOLIVAR

CARRERA DE AGROINDUSTRIA
Contenido:

 Industria de las enzimas

 Características de las enzimas

 Producción de enzimas
 Producción biotecnológica
 Bioprocesos para la producción
 Inmovilización de enzimas
 Sistemas de inmovilización
 Parámetros de inmovilización

UNIVERSIDAD ESTATAL DE BOLIVAR

CARRERA DE AGROINDUSTRIA
INDUSTRIA DE LAS ENZIMAS

 De las miles de enzimas conocidas, solo algunas se producen a escala industrial para emplearse en la
industria. Cada día aumenta el número de reacciones que se efectúan por rutas enzimáticas, y esta
tendencia aumenta a medida que existen mas catalizadores de este tipo en el comercio, a precios
accesibles.

 Ventajas:

 son de origen natural y por lo tanto no son toxicas;

 on muy específicas en su manera de actuar, por lo que no propician reacciones secundarias

indeseables;

 funcionan en condiciones moderadas de temperatura y de pH y no requiere de condiciones de

procesamiento drásticas que puedan alterar la naturaleza del alimento, ni de equipo muy costoso;

 actúan a bajas concentraciones de enzimas, y

 son fácilmente inactivadas una vez alcanzado el grado de transformación deseado.

 Limitante: costo y disponibilidad para su uso. Se vienen desarrollando innovaciones tecnológicas que
están logrando hacer más económicos estos catalizadores, mediante la ingeniería genética que
transforma los microorganismos y los hace sobre productores de enzimas.

 A la igual que cualquier otro aditivo alimentario, las enzimas deben cumplir con determinadas
especificaciones de calidad, sobre todo en cuanto a su toxicidad, o la del microorganismo que la
produce, en caso de que sea de origen microbiano. Debido a que las enzimas que se emplean en la
industria no son puras, es preciso tomar en consideración todos los materiales extra que contienen;
por esta razón, una preparación enzimática comercial es en realidad una mezcla de enzimas, en la que
una de ellas predomina en actividad.

 Las enzimas industriales son de origen animal y microbiológico. Tanto los hongos como las levaduras y
las bacterias que se emplean para este fin, tiene muchas ventajas en la producción de estos
catalizadores, ya que incluso se les puede alterar su sistema regulador de síntesis para que produzcan
más cantidad. Igualmente la ingeniería genética puede “diseñar” un determinado organismo, insertando
un gen extranjero que codifica la síntesis de una enzima.
Características de las enzimas

 Moléculas estrictamente proteicas

 Las sintetizan tanto los seres Autótrofos como Heterótrofos.
 Pueden actuar a nivel intracelular o extracelular.
 Actúan en el mismo lugar donde se segregan.
 Son solubles en agua y tienen gram difusibilidad en
líquidos orgánicos.

 Según su composición molecular, se distinguen en dos tipos de

enzimas: una extrictamente Protéica y otra constituida por la unión
mediante enlaces.
 Son activas a concentraciones pequeñas. Triosafosfato isomerasa
 Son catalizadores orgánicos verdaderos.
 Elevada especificidad.
 Los enzimas son catalizadores muy potentes y eficaces.
PRODUCCION DE ENZIMAS

Todas las enzimas pueden ser sintetizadas o producidas por

 Animales

 Plantas

 Microbios
Enzimas proteolíticas

Las proteasas pueden ser sintetizadas de diferentes maneras y tener una procedencia:

1. De origen animal: la tripsina, pepsina, pancreatina, colagenasa y pronasa. Se consiguen a partir de

los tejidos de diferentes organismos como el estómago o el páncreas. Las enzimas derivadas del
estómago suelen tener un pH ácido por lo que se desaconseja su uso.

2. De origen vegetal: La papaína. Se obtiene de la papaya, de ahí su nombre, aunque también se

pueden extraer de otros frutos como la piña o el higo.

3. De origen microbiano: Las proteasas de la bacteria bacillus o del hongo Aspergillus. Estas proteasas
se sintetizan por medio de estos microorganismos, pero también de las levaduras.
Enzimas lipolíticas

Se obtienen de tres formas diferentes: de origen animal, vegetal y microbiano.

En las enzimas lipolíticas encontramos:

 Lipasas
1. De origen animal, la lipasa extraída de tejidos del páncreas.
2. De origen vegetal, la lipasa derivada de germen de trigo, avena, etc.
3. De origen microbiano, sintetizadas por medio de varias especies de hongos, como el Aspergillus,
Penicillium y levaduras y, de bacterias como el Bacillus.

 Esterasas

1. De origen animal: esterasas hepáticas

2. De origen vegetal: esterasas de germen de trigo y avena
3. De origen microbiano: esterasas microbianas y fúngicas de varias especies de bacterias y
hongos
Enzimas glicolíticas, amilasas

1. De origen animal:

 La amilasa salival o ptialina se obtiene de la saliva.

 La amilasa pancreática se extrae de tejidos del páncreas.
 No se debe emplear las enzimas producidas en el estómago porque necesitan mucha acidez para
activarse y pueden provocar que los protoenzimas se activen.

2. De origen vegetal:

 Existen amilasas que podemos conseguir de los tubérculos.

3. De origen microbiano:

 La α-amilasa y β-amilasa se obtienen de diferentes microorganismos y hongos; de diversas bacterias

sobre todo del Bacillus y de hongos, en particular el Aspergillus
PRODUCCIÓN BIOTECNOLÓGICA DE ENZIMAS

Enzimas microbianas
 A lo largo de la historia las enzimas se han aislado de fuentes
naturales (vegetal, animal y microbiano) para su empleo en
diferentes procesos químicos y bioquímicos.

 A partir de la década del ‘60 las enzimas microbianas

(principalmente amilasas y proteasas) comenzaron a reemplazar
gran parte de las enzimas de origen vegetal y animal.
Microorganismos utilizados para la producción de
enzimas: (A) hongos filamentosos, (B) levaduras y (c)
bacterias.
 En la década del ‘70, con la introducción de la ingeniería
genética y la biología molecular, se lograron obtener Actualmente, la industria de
enzimas microbianas representa
microorganismos recombinantes, los cuales aumentaron la
aproximadamente un 90% del
productividad y por ende, disminuyeron los costos de los mercado de biocatalizadores
biocatalizadores microbianos..
Bioprocesos para la producción de enzimas microbianas

 El proceso para la producción de enzimas microbianas depende de la escala a la que se trabaje.

 Puede variar desde escala de laboratorio (para algunas enzimas muy específicas) a escala industrial
para la producción de enzimas de uso masivo, las cuales se consideran hoy en día commodities.

 Otro factor es la pureza requerida, ya que no es lo mismo un producto de grado farmacéutico que
una enzima para uso doméstico. A mayor pureza requerida, mayor será el número de operaciones del
proceso y por ende el costo del producto.

 Debe considerarse la fuente natural de la enzima, o sea el tipo de microorganismo que la sintetiza
(hongo filamentoso, bacteria, levadura). La morfología y la fisiología de estos microorganismos es
muy diferente y, por lo tanto, la forma en que se cultiva y sus requerimientos nutricionales serán
diferentes.

 Es fundamental conocer si la enzima que vamos a producir se trata de una enzima intracelular (si es
retenida dentro de la células) o extracelular (se excreta al medio de cultivo). De ello dependerán las
operaciones unitarias que conformarán el proceso, fundamentalmente las etapas del downstream.
Diseño de un bioproceso para la producción de enzimas

Etapas del bioproceso para la producción de enzimas

Operaciones del Upstream

 Se trata de todas las operaciones previas al proceso

fermentativo.

 Mantenimiento y propagación de la cepa para la

producción del inóculo: cultivo axénico (stock de la
cepa en condiciones cultivables: congelado,
liofilizado, etc)

 Formulación y preparación del medio del cultivo.

 Esterilización del medio de cultivo, biorreactor y todo

lo que ingresa al mismo
Fermentación

 Es el proceso en el cual se lleva a cabo propiamente la fermentación, entendiendo como tal, la etapa
(aeróbica o anaeróbica) donde acontece el crecimiento del microorganismo y la producción de
productos (enzima) a expensas de los nutrientes del medio de cultivo.

 Implica: el estudio de la estequiometría y la cinética del proceso, configuraciones de biorreactores y

sistemas de cultivo.

 Las enzimas pueden producirse en cultivo líquido sumergido (FLS) o en sustrato sólido (FSS).

 En la FLS hay una gran cantidad de agua libre disponible y los nutrientes se encuentran en solución.

 La fermentación en sustrato sólido (FSS) es aquella en la cual no hay agua libre, por lo cual el
microorganismo (usualmente hongos filamentosos) crecen sobre la superficie de un soporte sólido
húmedo (normalmente una mezcla de residuos agroindustriales).
Operaciones del Downstream

 El downstream del proceso incluye

todas aquellas etapas posteriores a la
fermentación tendientes a la
recuperación y formulación del
producto (enzima).

 Debido a que el downstream pueden

incluir un gran número de operaciones
unitarias, llega a representar
alrededor del 60% de los costos de
producción, los cuales se reflejarán en
el precio final del producto.
 Las enzimas en la industria alimenticia

INDUSTRIA ENZIMAS USOS

Enmascara el gusto a óxido.
Fabricación de leche
Láctea Tripsina. Lactasa delactosada, evita la
cristalización de leche
concentrada.
Coagulación de las proteínas de
Quimosina Lipasa (renina). Lactasa. la leche (caseína). Influencia en el
Quesería
sabor y aceleración de la maduración.

Evita la textura “arenosa”

provocada por la cristalización.
Helados Lactasa. Glucosa-isomerasa
Permite la utilización de jarabes de
alta fructosa.
Ablandamiento de carnes.
Cárnicas Papaína. Fiscina. Bromelina
Producción de hidrolizados.
Mejora la calidad del pan.
Amilasa. Proteasa. Lipoxidasa. Lactasa Disminuye la viscosidad de la pasta.
Panificación Produce una miga muy blanca Mejora
la coloración de la superficie.
 Las enzimas en la industria alimenticia

INDUSTRIA ENZIMAS USOS

Usadas para licuar la pasta de
malta. Evitan la turbidez
Cervecería Amilasas. Papaína. Pepsina
durante la conservación de
ciertos productos.

Mejoran la clarificación y
extracción de jugos. Evitan el
Vinificación Pectinasas. Glucosa-oxidasa
oscurecimiento y los sabores
desagradables.

Mejoran la clarificación de
jugos. Conversión de la glucosa en
fructosa (jarabes de alta fructuosa).
Pectinasas. Glucosa-isomerasa. Aumenta la solubilidad y disminuye
Bebidas no alcohólicas la turbidez del té. Evita el
Tannasa. Glucosa-oxidasa
oscurecimiento y los sabores
desagradables.
 ENZIMAS MICROBIANAS Y SUS APLICACIONES

Enzima Fuente Aplicación Industria

industrial
Amilasa Hongos Pan Panadería
Bacterias Almidonad en Almidón
frío ropa
Hongos Ayuda digestiva Farmacéutica.

Bacterias Elimin. Detergentes

Manchas
Lipasa Hongos Degradar grasa Lechería,
lavandería
Celulasa bacterias Suaviz. y lavandería
ablandad. Tej.
 ENZIMAS MICROBIANAS Y SUS APLICACIONES

Enzima Fuente Aplicación Industria

industrial
Proteasa Hongos Pan Panadería
bacterias Ablandador carnes
carnes
bacterias Limpieza Medicina
heridas
bacterias Detergente Lavandería
doméstico
Invertasa levadura Relleno blando Confitería
caramelo
Gluc. oxidasa hongos Elim.gluc.y O Alimentación
INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

 Se entiende por enzima inmovilizada (EI) aquella

física/químicamente asociada a, o contenida en, un
soporte/matriz no esencial para su actividad.

 La inmovilización permite la utilización de las

enzimas en procesos continuos, lo que permite
aumentar su productividad, ó bien para facilitar la
separación del catalizador de sus productos,
simplificando la etapa posterior de purificación.
 La utilización de enzimas inmovilizadas o
no dependerá de una evaluación
económica de las alternativas, donde se
considerarán datos de cinética y
estabilidad, costo, propiedades
fisicoquímicas, eficiencia de inmovilización
y carga del soporte.

 Se torna evidente que si el costo de una

enzima es muy bajo, la factibilidad de su
utilización en forma inmovilizada es poco
probable.
Ejemplos de enzimas inmovilizadas
Soportes

Un soporte para inmovilización debe tener las siguientes propiedades:

 Elevada resistencia mecánica, química y biológica

 Insolubilidad

 Hidrofilicidad

 Elevada razón área/volumen

 Regenerabilidad

 Bajo costo

Por regla, no todas estas propiedades están simultáneamente presentes en un determinado

soporte: necesario evaluar todas las alternativas.
Los soportes orgánicos presentan:
 Buena relación área/volumen

 Muy flexibles en su configuración

 Bajo costo en algunos casos (residuos orgánicos)

Los soportes inorgánicos a su vez presentan:

 Mayor resistencia

 Mayor regenerabilidad

 Propiedades físicas (ej. porosidad) controlables

SISTEMAS DE INMOVILIZACIÓN

 Las enzimas normalmente se inmovilizan a través

de algún tipo de interacción entre sus residuos
aminoacídicos y el soporte.

 Esto puede producir perdidas considerables de

actividad, al comprometer los aminoácidos en el,
o vecinos del sitio activo.

 Para minimizar este problema se inmoviliza por

intermedio de las moléculas de carbohidratos
(enzimas glicoproteicas) o por la utilización de
espaciadores.
 Los métodos de inmovilización se pueden dividir en:
Adsorción

 Este un método simple de inmovilización, en el que el soporte es mezclado con las enzimas, en condiciones
apropiadas de pH y fuerza iónica, dejados en contacto por un determinado periodo y después lavado para
remover la proteína no adsorbida.

 Este método permite valores elevados de carga enzimática (hasta 1 gramo de enzima por gramo de soporte).

 Las interacciones implicadas son resultantes de fuerzas de van der Waals, efectos hidrofóbicos y de carga
iónica

 La selección del soporte pasa por su capacidad de retener la enzima, sin dejar desorber nuevamente al seno
del liquido, actividad enzimática obtenida, posibilidad de regeneración y costo.

 Como ejemplos de soporte tenemos materias orgánicas neutras (carbón activo y celulosa) y cargadas (quitina,
intercambiadores aniónicos y catiónicos), además de materia inorgánica (bentonita, alúmina, vidrio y sílica
porosa).
 Ejemplo: preparación de invertasa inmovilizada

Soporte
DEAE-Sephadex CM-Sephadex
(intercambiador aniónico) (intercambiador
catiónico)

pH 2.5 0 100

pH 4.7 100 75

pH 7.0 100 34
Enlace Covalente

 La unión covalente se produce entre grupos funcionales del soporte y determinados grupos en los
residuos aminoacídicos de la molécula enzimática.

 Estos grupos son reactivos según la siguiente orden:

-S- > -SH > -O- > -NH2 > -COO- > -OH >> -NH3+

 La reacciones químicas que se pueden utilizar incluyen la acilación, la alquilación, la diazotación, la

disulfuración y la activación a través de sales de metales de transición.

 Ejemplo de químicos son la carbodiimida y el glutaraldeído.

 Se puede combinar la adsorción con la formación de enlaces covalente, con lo que se obtiene un
aumento sustancial de la estabilidad del catalizador.
 Como ejemplo tenemos la inmovilización de invertasa en quitina de camarón:
Inclusión en matrices

 En este método, la enzima es contenida entre las cadenas de una red polimérica, lo suficientemente
compacta para retener la enzima, pero capaz de permitir el libre flujo de reactantes.

 Esto tiene la implicación que solo es útil este tipo de inmovilización cuando se pretende procesar
sustratos y productos de muy bajo peso molecular.

 Este método es más adecuado para inmovilizar células, donde el alginato de calcio es ampliamente
utilizado.

 Otros ejemplos de matrices son los geles de poliacrilamida y el almidón.

 Estos presentan las desventajas de: ser no regenerables, una baja estabilidad, tener pobres propiedades
mecánicas y severas restricciones difusionales
Retención por membranas

 En este tipo de sistemas la enzimas permanece libre el solución, separada del medio de
reacción por una membrana protectora que solo permite el libre paso de los reactantes
(sustrato/producto).

 Como ejemplo, tenemos las membranas de ultrafiltración y diálisis.

 Otro método consiste en la microencapsulación, en la cual se produce una reacción de

polimerización en la superficie de las gotas de solución enzimática, dispersas en un solvente
inmiscibles con agua, que produce una delgada película (nylon), casi sin restricciones
difusionales.
Principales características de los métodos de inmovilización:

Características Adsorción Enlace Inclusión en Retención por

covalente matrices Membranas

Preparación Simples dificil dificil Simples

Costo bajo elevado moderado elevado

Fuerza de ligación variable fuerte flaca fuerte

Liberación de si no si no
enzima

Aplicabilidad amplia selectiva amplia Muy amplia

Problemas en la elevados bajos elevados elevados

utilización

Efectos de la matriz si si si no

Restricciones no no si si
difucionales

Protección no no si si
microbiana
PARÁMETROS DE INMOVILIZACIÓN

 Hay dos parámetros a considerar en la inmovilización: el rendimiento de inmovilización y la

capacidad de carga del soporte.

 El rendimiento de inmovilización (RI) es dada por:

 Algunos autores usan:

 Ejemplo del rendimiento de inmovilización (%) de glucoamilasa:
 La capacidad de carga (CC) del soporte se define como la actividad cargada expresada en el
catalizador (EI) por unidad de peso seco del soporte (W), lo que viene dada por:

 Ambos los parámetros, EI y CC, están frecuentemente relacionados, es decir, para aumentar
la CC se tiene que sacrificar el EI y viceversa.