Práctica 5: transporte a través de la membrana

1. Introducción

La membrana celular cumple diversas funciones entre las que se incluyen: actuar como una barrera selectiva, participar
en la recepción de señales y en el movimiento celular (Alberts et al. 2013). En esta práctica nos centraremos en
establecer las propiedades de barrera selectiva que tienen las membranas celulares. Para cumplir este propósito es
necesario establecer que a través de la membrana ocurren procesos de transporte que se clasifican en dos grandes
grupos: transporte por difusión y transporte activo.

El transporte por difusión: consiste en el movimiento de un compuesto a través de la membrana a favor de su gradiente
de concentración. Es decir, pasando de las zonas de mayor concentración a aquellas de menor concentración. Este es un
proceso espontáneo que no requiere inversión de energía por parte de la célula. La difusión a través de la membrana
puede ser simple, si no se cuenta con la asistencia de proteínas o facilitada cuando el paso de los compuestos es
mediado por una proteína. Un ejemplo de difusión facilitada es el paso de iones a través de canales iónicos (Karp 2008).

Dentro del transporte por difusión, se incluye el proceso de ósmosis. Este término se aplica para el transporte de agua a
través de una membrana semipermeable desde un compartimento con menor concentración de soluto hacia un
compartimento con mayor concentración de soluto. La habilidad de una solución para causar el movimiento de agua a
través de la membrana celular se denomina tonicidad. A su vez la tonicidad de una solución está relacionada con su
osmolaridad, que corresponde a las moles de soluto presentes en un litro de solución.

Transporte activo: En el transporte activo el movimiento del soluto a través de la membrana se realiza en contra de su
gradiente de concentración, por lo que se requiere inversión de energía. El transporte activo ocurre en la célula como
primario y secundario. Dentro del transporte activo primario consideramos el transporte mediado por proteínas
transportadoras en el que la movilización de las moléculas a transportar se realiza a costa de hidrólisis directa del ATP.
Entre tanto en el transporte secundario, se acopla la movilización de un soluto en contra de su gradiente de
concentración con la movilización de un ion a favor de su gradiente de concentración (Lodish et al. 2013).

Teniendo en cuenta que en el transporte a través de las membranas participa en procesos esenciales para la
homeostasis celular como son: la adquisición de nutrientes, la regulación de la composición del medio intracelular en
cuanto agua y sales, el establecimiento de gradientes electroquímicos para la síntesis de ATP y el establecimiento del
potencial de membrana entre otros, la presente práctica de laboratorio pretende que los estudiantes alcancen los
siguientes objetivos de aprendizaje:

2. Objetivos

- Establecer el impacto que tiene el peso molecular de un determinado compuesto en su velocidad de difusión en un
medio sólido

- Evidenciar el transporte activo en la membrana de la levadura de panadería

- Establecer el impacto de la osmolaridad y la tonicidad de una solución en el movimiento de agua a través de la

3. Materiales

Proporcionados por el laboratorio

Levadura de panadería, 30 ml de Na2CO3 0.75%, 30 ml de rojo neutro al 0,02%, cristales de permanganato de potasio,
dicromato de potasio y azul de metileno, placas de Petri servidas con agar-agar o gelatina, mechero o placa calefactora,
dos Erlenmeyer, sangre canina, solución isotónica, agua destilada, soluciones de urea (0,3 M), glicerol (0,3 M),
etilenglicol (0,3 M), 10 tubos de ensayo, pipetas Pasteur, 8 pipetas de 5ml, microscopio óptico.
Proporcionados por los grupos de trabajo

Guantes de nitrilo o de látex, bata de laboratorio, tablas para la recolección de los datos disponibles en papel o de forma
digital, una hoja de papel milimetrado, cronómetro, mínimo tres portaobjetos y cubreobjetos limpios (idealmente
nuevos), un marcador permanente que marque sobre vidrio.

4. Métodos

4.1 Difusión de compuestos en medio sólido

Tome una caja de Petri previamente servida con Agar-Agar o gelatina

En la superficie de la caja ubique cristales de permanganato de potasio (KMnO 4), dicromato de potasio (K2Cr2O7 )y azul de
metileno (asegúrese que todos los cristales tengan el mismo peso) en los vértices de un triángulo equilátero imaginario
(figura 1). Monte el experimento por duplicado

Figura 1. Disposición de los cristales de KMnO 4, K2Cr2O7 y azul de metileno en la caja

Empleando una hoja de papel milimetrado determine cada 15 minutos el diámetro del halo del colorante que va
apareciendo (consigne su información en la tabla 1 disponible en los anexos a la guía)

Realice sus observaciones durante 90 minutos (minutos 15, 30, 45, 60, 75 y 90)

Para analizar en el informe: ¿Cuál es la relación entre el peso molecular de cada uno de sus compuestos y la distancia
que cada uno de los compuestos viaja por unidad de tiempo que se observa en el experimento?

4.2 Observación del transporte activo en levaduras

1.Tome dos Erlenmeyer y márquelos como A y B

2. En el Erlenmeyer A adicione 0.5 g de levadura de panadería y 15 ml de solución de carbonato de sodio mezcle bien.

3. Caliente la suspensión del Erlenmeyer hasta que esta hierva por dos minutos. Deje enfriar la suspensión y adicione 15
ml de rojo neutro. Observe el color que toma la suspensión

4. En el Erlenmeyer B adicione 0.5 g de levadura de panadería y 15 ml de solución de carbonato de sodio y 15 ml de rojo

Reporte la coloración de cada Erlenmeyer en la tabla 4.

Para analizar en el informe:

¿Cómo se explica el cambio de color observado en la suspensión que contiene células de levadura vivas?
4.3 Osmosis en eritrocitos de C. lupus familiaris (sangre humana en esta oportunidad)

4.3.1 Preparación de una suspensión de trabajo de sangre canina (humana)

1. Tome un tubo de ensayo limpio

2. Sirva 9 ml de solución isotónica de NaCl al 0.9%

3. Con un gotero adicione 1 ml de sangre

4. Tape el tubo con película de parafina y mezcle por inversión hasta tener una suspensión homogénea de sangre

5. Reserve esta suspensión de trabajo, pues la necesitará durante el resto de la práctica

4.3.2 Observación del proceso de osmosis en el microscopio óptico

1. Tome 3 portaobjetos y márquelos de la siguiente forma: agua destilada, solución isotónica y NaCl 1 M

2. Tome 1 ml de su suspensión de trabajo y dilúyala en 2 ml de solución isotónica. Mezcle por inversión

3. En el portaobjetos marcado como solución isotónica ponga una gota de esta solución

4. Adicione una gota de la suspensión de sangre preparada en el punto 2

5. Cubra con el cubreobjetos

6. Busque un sector en la preparación donde pueda observar células individuales, haga observaciones de la
morfología de las células

7. Repita los pasos del 3 al 6 para el agua destilada y la solución de NaCl 1 M

4.3.3 Relación entre permeabilidad de la membrana a un soluto y el proceso de osmosis

Prepare 6 tubos de ensayo y márquelos como A, B, C, D, E y F. En cada uno de ellos sirva 5 ml de la solución que se indica
en la tabla A

Tubo Solución

A Agua destilada

B Urea (0,3 M)

C Glicerol (0,3 M)

D Glucosa (0,3 M)

E Solución isotónica (0.9% NaCl)

F Etilenglicol (0,3 M)

Tabla A. Soluciones para servir en los tubos de ensayo para la evaluación de la tonicidad de cada una de las mismas
sobre eritrocitos parte A

Tome los tubos marcados como A y E que contienen agua destilada y solución isotónica (respectivamente) sostenga los
tubos de manera que de fondo usted tenga una página impresa (puede ser una página de la guía).
Adicione 5 gotas de la suspensión de sangre a cada uno de los tubos e inicie el cronómetro

Observe atentamente el momento en que la suspensión de células del tubo A pasa de turbia a transparente y detenga el
cronómetro justo en este punto. Este tiempo será tomado como el tiempo de hemolisis. Compare la turbidez de la
suspensión del tubo A con el tubo E.

Consigne los resultados del tiempo de hemólisis en la tabla 2 disponible en los anexos de la guía

Adicione 5 gotas de suspensión de sangre al tubo B, inmediatamente después inicie el cronómetro. Consigne en la tabla
el tiempo que la solución pasa de turbia (similar al tubo de referencia E) a transparente (similar al tubo de referencia A)

Repita el procedimiento de manera secuencial con los tubos C, D, E y F

Preguntas para analizar y consignar en el informe

¿Cuáles son las propiedades de cada uno de los solutos empleados en la práctica? Complete la tabla 3

¿Cómo se relacionan las propiedades de los solutos con la tonicidad de las soluciones?

¿Cuál es la osmolaridad de las soluciones empleadas?, ¿Es la osmolaridad el único factor que determina la tonicidad
de una solución?

Bibliografía citada

Alberts B, Bray D, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P (2013) Essential Cell Biolog.
Brahm J (2013) The permeability of red blood cells to chloride, urea and water. J Exp Biol. doi: 10.1242/jeb.077941
Karp G (2008) Cell and Molecular Biology: Concepts and Experiments. Mendeley Deskt. doi:
10.1002/bmb.2002.494030049993
Lodish HF, Berk A, Zipursky SL, Matsudaira P, Baltimore D, James D (2013) Molecular Cell Biology, 7th edition.

Otros textos de consulta

Goodman BE (2015) TRANSPORT OF SMALL MOLECULES ACROSS CELL MEMBRANES: WATER CHANNELS AND UREA
TRANSPORTERS. Adv Physiol Educ. doi: 10.1152/advan.00027.2002

Macey RI (2017) Transport of water and urea in red blood cells. Am J Physiol Physiol. doi:
10.1152/ajpcell.1984.246.3.c195

Mazur P, Miller RH (1976) Permeability of the human erythrocyte to glycerol in 1 and 2 m solutions at 0 or 20 °C.
Cryobiology. doi: 10.1016/0011-2240(76)90144-9
 Anexos

Tabla 1. Difusión de sustancias con peso molecular variable en medio sólido

Tiempo (minutos) KMnO4 K2Cr2O7 Azul de metileno

(diámetro del halo en (diámetro del halo (diámetro del halo

15

30

45

60

75

90

Peso molecular

___

Tabla 2. Resultados del tiempo de hemólisis de eritrocitos de C. lupus domesticus

Soluto Urea Etilenglicol glicerol glucosa

Tiempo de
hemólisis
Tabla 3. Propiedades de los solutos empleados en el ejercicio 4.3.3 primera parte

Soluto Peso molecular Diámetro molecular Fórmula molecular

urea

Etilenglicol

Glicerol

Glucosa

Tabla. 4. Observación del transporte activo en levaduras.

Frasco A Frasco B

Coloración de la solución