ANALISIS MICROBIOLOGICOS

“Microbiología Farmacéutica”
 Introducción
 Para alcanzar la calidad microbiológica es necesario aplicar pasos ordenados
a través de la cadena de producción. A lo largo de esta cadena se pueden
presentar una serie de inconvenientes que pueden llevar a obtener un
producto o productos que tengan características muy distintas a las esperadas,
tanto para el consumidor final como para la empresa.
 Los problemas microbiológicos suelen presentarse cuando no se alcanza el
efecto deseado durante el proceso o por los sistemas de conservación que se
tengan, y esto suele ser consecuencia de errores en la manipulación o
procesado.
 Introducción
 La Microbiología en la Industria Farmacéutica apoya en los diferentes procesos
de producción y análisis microbiológicos para garantizar la calidad de
productos farmacéuticos.
 Las preparaciones farmacéuticas pueden contaminarse con hongos
filamentosos, levaduras y bacterias. Las materias primas naturales, el
equipamiento, el agua, los operadores, el aire, y el material de empaque
pueden ser fuentes de contaminación de los productos farmacéuticos.
Control Microbiológico Ambiental durante la
fabricación de Productos Farmacéuticos:
materias primas, aire, superficies, envases y
.
 La industria farmacéutica es la que requiere un mayor
control microbiológico del ambiente, ya que los
medicamentos pueden contaminarse durante su
fabricación por el aire, equipos, superficies de trabajo o
el personal.
 Detectar fuentes y mecanismos de contaminación y
reducir
 La industria farmacéutica debe cumplir Normas de
Correcta Fabricación que garanticen la calidad
microbiológica de los medicamentos.
Materias Primas
 El deterioro microbiano podría conllevar a cambios en las características
físicas y químicas que conducirían a que el producto deteriorado no sea
apto para ser usado, afectando con ello la imagen del laboratorio
productor.
 Las materias primas y los productos farmacéuticos, deben ser sometidos a
un análisis microbiológico que demuestre que cumplen con las
especificaciones establecidas por los organismos oficiales, para garantizar
que los productos son adecuados para el uso al que están destinados.
Materias Primas
 Este análisis o control microbiológico de las materias primas y de los
productos o medicamentos no estériles, involucra la realización de
dos tipos de ensayos:
 a. Recuentos microbianos, referidos básicamente al recuento total
de microorganismos aerobios y el recuento total de mohos y
levaduras.
 b. Investigación de microorganismos específicos: bacterias Gram
negativas tolerantes a bilis, Escherichia coli, Salmonella,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Clostridium y
Candida albicans.
 Recuento de Recuento total
Microorganismos Microorganismos
microorganismos de mohos y
específicos específicos
aerobios totales levaduras
E. coli
S. aureus
•Agar Mc Conkey
Recuento en placa Recuento en placa Agar manitol Salado
•Agar Triple Azucar Hierro
(Vaciado o siembra (Vaciado o siembra •Agar soya caseina Agar soya-caseína
en profundidad). en profundidad).
Caldo cerebro-corazón

Salmonella
Clostridium
Agar Triple Azucar Hierro
Agar Sabouraud Agar Columbia
Agar soya-caseina Agar soya caseína
dextrosa Agar soya caseína
Agar XLD
Caldo de carne cocida

Pseudomonas
aeruginosa
Agar cetrimida Candida albicans
Agar soya caseína Caldo y agar Sabouraud
Dextrosa
Aire
 Para determinar la calidad microbiológica del aire de una zona limpia
con el fin de definir los niveles de contaminación máxima para esta
zona, en función del riesgo del producto, siguiendo los criterios
establecidos por las normativas para la industria farmacéutica se hacen
estudios para obtener información acerca de los posibles
microorganismos que pueden estar presentes.
Métodos
 Impacto
 Sedimentación
 Recogida en medio Liquido
 Filtración
 Las muestras se toman en distintos puntos: (área de envasado y pesado, vestuario,
esclusa de entrada y salida de materiales, área de almacenamiento de materias
primas, área de producción). Los controles microbiológicos se hacen durante días
consecutivos.
Método de Sedimentación
 Consiste en la exposición de placas de Petri al ambiente durante un cierto
tiempo.
 Las placas se depositan en el suelo en los puntos anteriormente descritos,
abiertas en toda su superficie durante treinta minutos, y después se incuban
a 30º C durante tres días.
 Agar de Triptona y Soja (T.S.A) para el recuento de aerobios.
 Para el recuento y posterior aislamiento de los hongos se utilizan placas
Petri con agar Sabouraud con cloranfenicol, incubando durante seis días a
22-24º C.
Método de impacto

 Para el método de impacto se utiliza un muestreador centrífugo

Biotest.
 La muestra se toma en el centro del área, y se recoge la cantidad de
0,5 m3 de aire a una velocidad de 40 l/min. El número de
microorganismos por volumen de aire se calcula de la siguiente
manera: Microorganismos/ m 3 de aire = nº de colonias x 25 tiempo
(min).
 Para el recuento y aislamiento de las bacterias, se utilizan tiras con
TSA, incubando a 30º C durante tres días. Para el recuento y
aislamiento de los hongos, se utilizan tiras con agar rosa de Bengala,
incubando durante seis días a 22-24º C. Los resultados se expresan en
ufc/m3.
Recogida de medio Líquido

 Consiste en hacer pasar un volumen determinado de aire en forma de

burbujas a través de un caldo de cultivo o solución isotónica, en los
cuales, teóricamente, quedan retenidos la mayor parte de los
microorganismos.
 El recuento de microorganismos se realiza a partir de la siembra de
alicuotas de esta muestra, pudiendo utilizar a continuación las
distintas técnicas de análisis cuantitativo (NMP, inclusión en agar,
filtración).
Filtración

 Se hace pasar un volumen determinado de aire a través de un filtro en el

cual quedan retenidas las partículas portadoras de microorganismos.
 Se pueden utilizar distintos tipos de filtros, siendo los más comunes los de
membrana celulósica, o los de gelatina, los cuales se llevan directamente
sobre un medio de cultivo sólido o bien se lavan, realizando posteriormente
siembras en un medio sólido a partir del líquido de lavado.
SUPERFICIES
 A) MÉTODO DE LA PLACA DE CONTACTO (PLACA RODAC)

 El método de contacto directo del agar con los microorganismos que

se multiplican (RODAC= Replicate Organisms Direct Agar Contact)
utiliza placas Petri especiales, ideales para la investigación de
gérmenes en superficies.
 Se usa medio de cultivo TSA o diferentes medios selectivos a
conveniencia. Se añade a una placa de Rodac, un medio de cultivo
sólido (seleccionado en función de los microorganismos buscados),
en ligero exceso, para que la superficie quede convexa.
B) Laminocultivo

 Permiten la determinación cualitativa y cuantitativa de los microorganismos.

 La presencia de dos medios de cultivo en un solo soporte permite efectuar
muestreos separados con un solo laminocultivo.
 El cierre hermét ico con t apón roscado disminuye l a posibil idad de
contaminación accidental y mejora la estabilidad del producto.
C) MÉTODO DEL ESCOBILLÓN O FROTIS

 Se utilizan torundas estériles de algodón; es un método especialmente

indicado para superficies de difícil acceso para las placas de contacto
o los laminocultivos, como superficies flexibles, irregulares o muy
contaminadas. La recuperación de los microorganismos depende de la
textura de la superficie, de su naturaleza y del tipo de biota.
 Se coloca una plantilla estéril en la superficie a examinar y se refriega
con cuidado la zona expuesta con un escobillón humedecido en
solución de Ringer o en Agua de Peptona Tamponada para facilitar la
toma de muestra.
PERSONAL

 Para evaluar al personal se pueden utilizar placas RODAC, las cuales

se presionan sobre su vestimenta.
 Cuando queremos detectar la presencia de microorganismos en las
manos del personal se pueden usar placas con medio de cultivo (Touch
plates).
 El personal toca el agar de dichas placas con la punta de los dedos,
luego se incuban por el tiempo y bajo las condiciones adecuadas.
Al final del periodo de incubación se cuentan las colonias.
 NOTA: El personal debe lavarse y desinfectarse las manos luego de
tocar las placas, ya que podrían quedar restos del medio de cultivo en
los dedos y favorecer el crecimiento de los microorganismos.
MGA 0100 Valoración microbiana de
antibióticos
 La potencia de un antibiótico
 Se calcula mediante la comparación de la inhibición de
microorganismos conocidos contra concentraciones
conocidas del antibiótico.
 Dos métodos:
 Cilindro placa
 Turbidimétrico
Cilindro en placa Turbidimetricos
MGA 0305 Efectividad de preservativos
antimicrobianos
 Preservativos: Sustancias que se adicionan a los medicamentos para
inhibir el desarrollo de microorganismos que pueden ingresar durante
la fabricación o el uso cotidiano (multidósis). Se emplea en formas
farmacéuticas líquidas .
 Consideraciones :
a) No son sustituto de buenas prácticas de fabricación .
b) Debe encontrarse en concentración inferior a los niveles tóxicos
para el ser humano.
c) Se requiere menor concentración cuando los ingredientes del
medicamento poseen efecto antimicrobiano
d) Deben declararse en el marbete.
 Inocular el medicamento con una cantidad conocida de
cepa (específica para cada producto).
 Incubar y realizar el método de cuenta en placa.
 Para la evaluación los preparados farmacéuticos se
clasifican en cuatro categorías en función de su vía de
administración.
Categor Productos
ía
1 Inyectables
Soluciones de irrigación, diálisis y otro tipo de parenterales
Óticos
Nasales estériles
Oftálmicos con bases o vehículos acuosos

2 Tópicos con base o vehículo acuoso

Nasales no estériles
Emulsiones, incluyendo las que se aplican en membranas
mucosas
3 Orales no antiácidos con base o vehículo acuoso
4 Antiácidos con base acuosa
MGA 0381 Esterilidad

 Esta prueba tiene como finalidad investigar la presencia de

microorganismos contaminantes en sustancias, preparaciones, o
dispositivos médicos que de acuerdo con la Farmacopea, requieren
ser estériles.
 La cantidad de muestra a analizar cambia según el medicamento.
 Dos métodos:
 D i r e c t o : Tr a n s f e r i r u n v o l u m e n d e l
medicamento directo a un medio de cultivo
 F i l t ra c i ó n p o r m e m b ra n a : F i l t r a r p o r
membrana el medicamento diluido,
posteriormente colectar la membrana y
transferir la aun medio de cultivo.
MGA0501 Indicadores biológicos

 Los indicadores biológicos se utilizan como:

 Auxiliares en la operación de la calificación física de aparatos de
esterilización
 En el desarrollo y establecimiento de un proceso de esterilización
validado para un producto
 En la verificación periódica de esterilización validada para un
producto, en la verificación periódica de esterilización de equipo
 Materiales y componentes de empaque que se empleen en
procedimientos asépticos y en programas de verificación periódica
de ciclos de esterilización previamente establecidos y
documentados.
 Los indicadores biológicos pueden presentarse principalmente en dos
formas en las cuales se utiliza un cultivo de un microorganismo de una
especie conocida.
 Determinaciones microbiológicas:
A) Indicadores: BMA, Mohos y levaduras Recuento por NMP, Filtración
por membrana o Vaciado en placa
B) Microorganismos específicos: Escherichia coli, Salmonella,
S. aureus, Clostridium, Pseudomonas
Control Microbiológico en la
producción de soluciones
inyectables y oftálmicas
(Pruebas de endotoxinas y
pirógenos).
 MGA0316 Determinación de endotoxinas
bacterianas

 Las endotoxinas de bacterias Gram negativas, son la causa más común de

reacciones tóxicas asociadas a la contaminación de productos farmacéuticos.

La prueba para determinar o cuantificar endotoxinas utiliza el lisado de

amebocitos de Limulus polyphemus o Tachypleus tridentatus.
Existen dos métodos para esta determinación:
Método A
Método B

Fotométrico, que
Formación dependiendo de la forma de
cuantificación
de un gel. • Turbimétrico, desarrollo de
turbiedad después de la ruptura de
un sustrato endógeno.
• Cromogénico, desarrollo de color
después de la ruptura de péptido-
cromógeno.
 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Utilizar por lo menos 3 muestras

Disolver, diluir o extraer la muestra usando agua purificada

Verificar el pH (6.0 y 8.0)

• El ajuste de pH se efectúa utilizando soluciones de acido clorhídrico o

hidróxido de sodio.
La prueba se considera valida si..

• El agua libre de endotoxinas (control negativo) da un resultado

negativo.

• En la concentración más baja de CEE el resultado en todas las réplicas

es negativo.
 MÉTODOS FOTOMÉTRICOS

El método turbidimétrico de punto final se basa en la relación

cuantitativa que existe entre la concentración de endotoxina y la
turbiedad (absorbancia o transmitancia) de la mezcla de reacción al
final de un período de incubación.
 Método cromogénico. En este método se mide el cromóforo
liberado de un péptido cromogénico, al reaccionar el lisado con la
endotoxina. El método de punto final, se basa en la relación
cuantitativa entre la concentración de endotoxina y la cantidad de
cromóforo liberado al final del periodo de incubación

La prueba se lleva a cabo en las condiciones recomendadas por el fabricante de

lisado (normalmente 37°C ± I°C).
 MGA0711 Prueba de pirógenos

 La prueba mide aumento de temperatura corporal,

como respuesta a la presencia de agentes pirogénicos.
Control Microbiológico de Medicamentos
no Estériles de Administración Oral y
Tópica.

La presencia de contaminantes microbianos en preparados

farmacéuticos no estériles puede afectar :

 Actividad terapéutica
 La salud del paciente.
Los productos no estériles son susceptibles de contaminarse con
microorganismos tales como bacterias, mohos y levaduras durante
el proceso de manufactura: pesada, fabricación, llenado,
almacenamiento, así como durante su uso.

El deterioro microbiano podría conllevar a cambios en las

características físicas y químicas que conducirían a que el
producto deteriorado no sea apto para ser usado, afectando con
ello la imagen del laboratorio productor
Análisis o control microbiológico de las materias primas y de
los productos o medicamentos no estériles, involucra la
realización de dos tipos de ensayos:

Recuentos microbianos (mohos y levaduras)

Investigacion de microorganismos específicos:

• Gram negativas, Escherichia coli, Salmenella, Pseudomonas, Staphylococcus,
Clostridium
Grupos indicadores
y microorganismos
específicos para
los que se
establecen
criterios de
aceptación.
 Control de Microorganismos de productos inmunológicos

Vacunas:

Las vacunas se producen por medio de diversos procesos; pueden contener virus vivos ya atenuados
(debilitados o alterados de tal manera que no provoquen enfermedades); organismos o virus inactivos
o muertos; toxinas inactivas (para enfermedades bacterianas donde las toxinas generadas por las
bacterias, y no las bacterias mismas, provoquen la enfermedad)
 Inmunosueros

Pueden ser monovalentes cuando se preparan inyectando una sola clase de antígenos y
polivalentes cuando se emplean diferentes antígenos correspondientes a gérmenes distintos o
cepas distintas de un mismo microorganismo.
Banco de Sangre

 Vías de contaminación:

 Estado persistente o transitorio de bacteriemia:

 (Staphylococcus spp,
 Streptococcus viridans o Serratia
 liquefaciens)
 Alteraciones gastrointestinales
 (Yersinia o Salmonella)
Componentes genotóxicos de los alimentos

 Micotoxinas

Las micotoxinas son metabolitos fúngicos secundarios producidos por hongos en los
géneros Aspergillus, Penicillium y Fusarium.
Muchos de estos compuestos son altamente tóxicos y exhiben actividad mutagénica,
teratogénica y estrogénica