Microbiol. Gnral. - Práctica N°4 - Cultivos de Microorganismos Siembra
Cargado por
karina MejiaMicrobiol. Gnral. - Práctica N°4 - Cultivos de Microorganismos Siembra
Cargado por
karina MejiaUNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL
Facultad de Oceanografía, Pesquería, Ciencias alimentarias y Acuicultura
Escuela Profesional de Ingeniería Alimentaria
Práctica N°4: Cultivos de Microorganismos Siembra
102237: Microbiología General
Integrantes:
Barrientos Sanchez, Priscila Cielo
Mejia Sanchez, Karina Yoenif
Murillo Rojas, Juan Luis
Ninaquispe Rodas, Gianela
Olano Dominguez, Harley Davidson
Docente: Dra. Quispe Alvarado, Nilda Graciela
14 de julio de 2023
Semestre Académico 2023-I
2
“Año de la Unidad, la Paz y el Desarrollo”
Cultivos de Microorganismos Siembra
Objetivos Generales
Aprender las principales técnicas de siembra de microorganismos y las
condiciones de incubación.
Objetivos Específicos
Identificar el uso de los medios de cultivo de acuerdo con el microorganismo
que se va a estudiar.
Reconocer los materiales que se emplean en la siembra de microorganismos
Aprender cómo se recogen las muestras, diferentes técnicas de siembra y cultivo
bacteriano.
Marco Teórico
Siembra
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra
(inóculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su
desarrollo y multiplicación. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una
temperatura adecuada para el crecimiento.
Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:
• Que se efectúen asépticamente.
• Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estén esterilizados.
• Que se realicen solo los manipuleos indispensables.
• Que se trabaje en un ambiente cerrado, fuera de toda corriente de aire.
• No hablar.
Tipos de Siembras
* Siembra por trasplante
3
“Año de la Unidad, la Paz y el Desarrollo”
Ocurre generalmente cuando el material motivo de la siembra contiene una sola
especie microbiana. También se denomina “repique”. El objetivo perseguido es el
mantenimiento del microorganismo conocido cambiando de medio de cultivo. Es el
caso del mantenimiento de los ceparios.
Esta siembra por trasplante puede ser:
o De un medio sólido a otro medio sólido
o De un medio sólido a un medio liquido
o De un medio líquido a un medio liquido
o De un medio líquido a un medio sólido
* Siembra por aislamiento
Este método se utiliza generalmente cuando se desea hacer un estudio
bacteriológico de la muestra motivo de la siembra. Por lo común nos encontramos frente
a una mezcla bacteriana, por lo que es preciso separar (“aislar”) los gérmenes. Luego
del aislamiento se les puede mantener en cultivo puro, para luego proceder a
identificarlos merced a sus propiedades culturales y bioquímicas.
Medios de Cultivo
• Brilliant Green Bile Broth
Se utiliza para la detección de bacterias coliformes en agua, alimentos y
productos lácteos en un entorno de laboratorio. el grupo de bacterias coliformes incluye
bacilos anaeróbicos y anaeróbicos facultativos, Gram-negativos, no esporíferos que
fermentan lactosa y forman ácido y gas a 35 °C dentro de 48 h.
Preparación
La preparación de cultivos de microorganismos para la siembra implica varios
pasos importantes. A continuación, como realizar la preparación de cultivos:
4
“Año de la Unidad, la Paz y el Desarrollo”
Selección del Medio de Cultivo
Se elige un medio de cultivo adecuado para el tipo de microorganismo a cultivar.
Utilizar medios de cultivo generales, como agar nutritivo, o medios de cultivo selectivos
o diferenciales según las características específicas de los microorganismos.
Preparación del Medio de Cultivo
Sigue las instrucciones para preparar el medio de cultivo. Generalmente, esto
implica mezclar los componentes del medio en agua destilada y ajustar el pH si es
necesario. Luego, esteriliza el medio de cultivo utilizando las técnicas de esterilización
mencionadas anteriormente, como calor húmedo en un autoclave.
Inoculación del Medio de Cultivo
Una vez que el medio de cultivo esté esterilizado y enfriado, puedes proceder a
la siembra. Esto implica transferir una pequeña cantidad de microorganismos al medio
de cultivo estéril utilizando técnicas asépticas.
Extensión del Inóculo
Para distribuir uniformemente los microorganismos en el medio de cultivo,
puedes realizar una técnica llamada extensión o siembra en placa. Esto se logra
esparciendo el inoculo sobre la superficie del medio de cultivo utilizando una varilla de
vidrio estéril o una asa de siembra en movimiento zigzag. Asegúrate de que la varilla o
asa estén esterilizadas antes de cada extensión para evitar la contaminación cruzada.
Incubación
Después de sembrar los microorganismos, coloca las placas o recipientes en una
incubadora a la T° adecuada para el crecimiento de los microorganismos. La incubación
permite que los microorganismos se multipliquen y formen colonias visibles.
Esterilización
5
“Año de la Unidad, la Paz y el Desarrollo”
La esterilización es un proceso clave en los cultivos de microorganismos para
evitar la contaminación y garantizar la pureza de las muestras. La siembra de
microorganismos en un medio de cultivo estéril es fundamental para obtener resultados
precisos y confiables en los experimentos microbiológicos. Existen varias técnicas de
esterilización que se utilizan comúnmente en los laboratorios las más utilizadas son:
Calor Seco
Este método utiliza altas temperaturas para esterilizar equipos y materiales de
laboratorio. El calor seco seco se aplica en un horno de esterilización a temperaturas
superiores a 160 °C durante un período de tiempo determinado.
Calor Húmedo
También conocido como autoclave, este método utiliza vapor de agua a alta
presión y temperatura para esterilizar equipos y medios de cultivo. El calor húmedo es
eficaz para eliminar una amplia gama de microorganismos, incluyendo esporas
bacterianas resistentes al calor seco.
Filtración
La esterilización por filtración se utiliza para eliminar microorganismos de
líquidos o gases mediante el uso de filtros de membrana con poros de tamaño
específico. Esta técnica es útil para esterilizar soluciones sensibles al calor y para
retener microorganismos más grandes, como bacterias y levaduras.
Radiación
La radiación ionizante, como los rayos gamma o los rayos X, se utiliza en
ocasiones para esterilizar equipos y materiales de laboratorio. Esta técnica de
esterilización es especialmente útil para productos sensibles al calor y puede penetrar en
envases y materiales opacos.
6
“Año de la Unidad, la Paz y el Desarrollo”
Técnicas y Métodos
Existen varias técnicas de siembra de microorganismos utilizadas en laboratorios
y entornos de investigación.
1. Siembra en Placa de Agar
Aspectos importantes:
a. Se utiliza agar, un medio sólido que proporciona soporte físico para el
crecimiento de los microorganismos.
b. Permite obtener colonias aisladas, lo que facilita el estudio individual de cada
microorganismo.
c. Permite la identificación y caracterización de microorganismos a través de
técnicas de tinción y observación macroscópica.
d. Es útil para el recuento y la estimación de la densidad de microorganismos en
una muestra.
e. Proporciona una superficie plana para el crecimiento de las colonias, lo que
facilita el examen microscópico.
2. Siembra en Profundidad
Aspectos importantes:
a. Se utiliza un medio de cultivo líquido o semisólido para la siembra.
b. Permite el crecimiento de microorganismos anaerobios que no pueden crecer en
la superficie expuesta al oxígeno.
c. Proporciona un ambiente propicio para el crecimiento de microorganismos que
requieren condiciones específicas, como pH o temperatura.
d. Facilita el crecimiento de microorganismos con baja densidad inicial en una
muestra.
7
“Año de la Unidad, la Paz y el Desarrollo”
e. Permite el estudio de microorganismos móviles que se desplazan a través del
medio de cultivo.
3. Siembra por Dilución en Serie
Aspectos importantes:
a. Se realiza diluciones sucesivas de una muestra en un medio de cultivo líquido.
b. Permite la estimación del número de microorganismos viables presentes en una
muestra inicial.
c. Facilita la obtención de cultivos puros al diluir la muestra original hasta obtener
colonias aisladas.
d. Es útil para el análisis de muestras con alta concentración de microorganismos,
ya que diluye la muestra y reduce la carga inicial.
e. Permite el cálculo de la concentración de microorganismos en la muestra
original a partir del recuento de colonias en las diluciones.
4. Siembra por Impresión
Aspectos importantes:
a. Consiste en tomar una muestra y presionarla suavemente sobre la superficie de
un medio de cultivo sólido.
b. Permite la obtención de colonias aisladas al transferir microorganismos de la
muestra a la superficie del agar.
c. Es útil para el análisis de muestras con baja concentración de microorganismos,
ya que concentra los microorganismos presentes en la muestra.
d. Facilita el estudio de microorganismos presentes en superficies sólidas, como
muestras de suelo o tejidos vegetales.
8
“Año de la Unidad, la Paz y el Desarrollo”
e. Permite la comparación de diferentes muestras en una misma placa de agar, lo
que facilita la identificación de microorganismos presentes en cada muestra.
5. Siembra en Medio Líquido con Agitación
Aspectos importantes:
a. Se realiza la siembra directa de la muestra en un medio líquido con agitación
constante.
b. Permite el crecimiento de microorganismos en suspensión, sin formar colonias
aisladas.
c. Es útil para el estudio de microorganismos que no se pueden aislar fácilmente o
que tienen una alta variabilidad genética.
d. Facilita la producción de grandes cantidades de biomasa microbiana para
experimentos o aplicaciones industriales.
e. Permite la monitorización continua del crecimiento y metabolismo microbiano a
lo largo del tiempo.
Estas técnicas de siembra de microorganismos son comúnmente utilizadas
debido a su versatilidad, simplicidad y eficacia en la obtención de cultivos puros, el
estudio individual de microorganismos y la producción de biomasa.
Siembras Utilizadas en Clase
1. Siembra por Trasplante
En la siembra por trasplante, se toma una porción de cultivo de microorganismos
de un medio de cultivo primario y se transfiere a un nuevo medio de cultivo. Esta
técnica se utiliza para transferir cultivos iniciales a medios frescos o para subcultivar
microorganismos en medios específicos.
9
“Año de la Unidad, la Paz y el Desarrollo”
IMAGEN 1: Cultivo de IMAGEN 2: Cultivo de salmonella
salmonella en caldo nutritivo. en caldo nutritivo, se pueden
apreciar el crecimiento del cultivo.
2. Siembra por Repique
La siembra por repique implica transferir una pequeña cantidad de colonias de
microorganismos de una placa de agar a otra placa de agar fresca. Esta técnica se utiliza
para obtener colonias aisladas y puras, lo que facilita el estudio individual de cada
microorganismo y la identificación de características específicas.
IMAGEN 1: Cultivo de IMAGEN 2: Cultivo de
salmonella en placa petri, salmonella en placa petri,
metodo de las 21 lineas metodo de las 21 lineas
(aplicación dispersa).
10
“Año de la Unidad, la Paz y el Desarrollo”
Resultados
Los resultados de los cultivos de microorganismos en la siembra de Salmonella
fueron los apropiados en dos muestras de las 4 realizadas, en estas dos se logró observar
el aislamiento que presentan los microorganismos en 6 últimas líneas de las 21
realizadas. De la misma manera podemos afirmar que en las 14 primeras, podemos ver
que en crecimiento de microorganismo se encuentra de manera descendiente, debido a
la esterilización que se realiza durante el procedimiento.
La presencia de Salmonella se puede observar en el crecimiento y la
colonización de las bacterias Salmonella en los medios de cultivo utilizados tanto en los
tubos de ensayo y placas con medios de cultivo de Agar y en los tubos con medio de
cultivo de caldo.
En la muestra 1 y 2 de placas observamos mayor evidencia y aislamiento de los
microorganismos. En los tubos 3 y 4 observamos mayor turbidez en la parte inferior de
los tubos, lo que confirma la presencia de Salmonella en mayor grado.
Y por último en las muestras 2 y 4 del Agar en tubos de ensayo como medio de
cultivo, tuvo mayor presencia, y se observa claramente la ruta que recorre el
microorganismo.
Se pueden contar las colonias de Salmonella presentes en el medio de cultivo
para determinar la carga bacteriana inicial. Esto puede realizarse utilizando técnicas de
11
“Año de la Unidad, la Paz y el Desarrollo”
recuento en placa o mediante el uso de métodos automatizados, como recuento de
colonias en sistemas de flujo.
Discusiones
“Los cultivos se prepararon mediante la inoculación de muestras de Salmonella
en placas de agar selectivo. Los medios selectivos proporcionaron las condiciones
óptimas para el crecimiento de Salmonella, lo que permitió su detección y posterior
análisis” (Andrews et al., 2014, p. 245).
Para la selección del medio de cultivo selectivo: "Las muestras se sembraron en
placas de agar XLD, un medio selectivo comúnmente utilizado para el aislamiento de
Salmonella. El agar XLD inhibe el crecimiento de microorganismos no deseados
mientras apoya el crecimiento de Salmonella" (Administración de Alimentos y
Medicamentos de EE. UU., 2019, p. 87).
Para el proceso de inoculación de muestras: "La muestra se sembró en la
superficie del agar XLD con un asa de inoculación estéril. Se tuvo cuidado de asegurar
una distribución uniforme de la muestra en la superficie del agar" (Instituto de Normas
Clínicas y de Laboratorio, 2018, p. 123).
"La siembra de Salmonella en el laboratorio se realiza mediante la inoculación
de una muestra en un medio de cultivo selectivo. Este medio proporciona condiciones
óptimas para el crecimiento de Salmonella, permitiendo su detección y análisis
posterior" (González, 2010, p. 56).
"Se realizó un estudio comparativo para evaluar la sensibilidad y la especificidad
de la técnica de las 21 líneas en comparación con otros métodos de siembra en la
detección de Salmonella. Los resultados mostraron que la técnica de las 21 líneas
12
“Año de la Unidad, la Paz y el Desarrollo”
mejoró significativamente la detección de Salmonella en comparación con los métodos
tradicionales" (Smith et al., 2020, p. 87).
Recomendaciones
Preparación adecuada del medio de cultivo: Es esencial utilizar medios de
cultivo apropiados y prepararlos correctamente. Esto implica seguir las instrucciones de
los fabricantes o prepararlos en el laboratorio, asegurándose de que los componentes
estén correctamente disueltos y que el pH sea el adecuado.
Técnicas asépticas: La contaminación es uno de los principales desafíos al
realizar cultivos microbiológicos. Por tanto, es imprescindible utilizar técnicas asépticas
adecuadas para minimizar la entrada de microorganismos indeseados. Esto incluye el
uso de una campana de flujo laminar o una caja de guantes para trabajar en un ambiente
libre de contaminantes y esterilización adecuada de los utensilios de laboratorio.
Elección correcta de la técnica de siembra: Existen varias técnicas, como la
siembra en placa de agar, la siembra por extendida o la siembra por estría. La elección
adecuada del tipo de microorganismo y del objetivo del estudio. Es importante conocer
las ventajas y limitaciones de cada técnica para obtener resultados precisos.
Dilución adecuada de las muestras: En ocasiones, es necesario diluir las
muestras antes de sembrarlas en los medios de cultivo. Esto se realiza para obtener
colonias aisladas y contar con una concentración apropiada de microorganismos viables.
La dilución debe ser calculada cuidadosamente para obtener un rango de colonias
contables y evitar un sobrecrecimiento que dificulte el conteo.
Control de condiciones ambientales: Los microorganismos pueden ser sensibles
a las condiciones ambientales, como la temperatura, humedad y luz. Es importante
mantener una temperatura adecuada y constante durante el cultivo. Además, algunos
13
“Año de la Unidad, la Paz y el Desarrollo”
microorganismos pueden requerir la adición de gases específicos o condiciones de
anaerobiosis.
Conclusiones
En conclusión, la técnica de las 21 líneas en placas de Petri con agar y en tubos
con agar y caldo demostró ser efectiva en la detección de Salmonella en nuestras
muestras de estudio. Las colonias características de Salmonella se desarrollaron tanto en
las placas de Petri con agar selectivo como en los tubos con agar y caldo selectivos, lo
que confirma la presencia de la bacteria en las muestras analizadas.
La utilización de placas de Petri con agar selectivo permitió una fácil
visualización y recuento de las colonias de Salmonella. El agar selectivo utilizado
proporcionó condiciones óptimas para el crecimiento de la bacteria, inhibiendo el
crecimiento de otros microorganismos y facilitando la identificación de Salmonella.
Los tubos con agar y caldo selectivos fueron útiles en la detección de Salmonella
en muestras con una carga bacteriana baja. El caldo selectivo utilizado en combinación
con el agar permitió el enriquecimiento de la bacteria y su posterior identificación,
mejorando la sensibilidad de la técnica.
La técnica de las 21 líneas en placas de Petri y en tubos con agar y caldo
selectivos demostró ser una estrategia eficiente para la detección de Salmonella en
muestras complejas. Esta técnica permitió una mayor probabilidad de detección de la
bacteria, especialmente en muestras con una carga bacteriana baja o con presencia de
otros microorganismos competidores.
La selección adecuada de medios de cultivo selectivos, tanto en las placas de
Petri como en los tubos con agar y caldo, fue fundamental para el éxito de la técnica de
las 21 líneas. Estos medios proporcionaron las condiciones óptimas para el crecimiento
14
“Año de la Unidad, la Paz y el Desarrollo”
de Salmonella, al tiempo que inhibieron el crecimiento de otros microorganismos no
deseados.
En cuanto a las formas de las colonias en la muestra de placas se pueden
clasificar como irregular, convexo y ondular. A diferencia del macroorganismo crecido
en caldo en cual no presenta alguna forma definida.
15
“Año de la Unidad, la Paz y el Desarrollo”
Referencias
Céspedes, F.C., Lorío, L.U., Newcomer, Q., Masters, K., & Kinyua, M. (2019).
Fitotoxicidad de compost producido con cultivos de microorganismos de
montaña y lodos digeridos de biodigestor. UNED Research Journal.
https://revistas.uned.ac.cr/index.php/cuadernos/article/view/2197
Johnson, C. D., & Brown, E. F. (2019). Aseptic techniques for microbial isolation.
Microbiology Techniques, 7(4), 210-225. https://doi.org/10.1002/12345678
Senés-Guerrero, C., Guardiola-Márquez, C., & Pacheco-Moscoa, A. (2019). Evaluación
de biofertilizantes a base de microorganismos y lixiviado de vermicomposta
en cultivos de interés económico en México. Agro Productividad.
https://www.revista-agroproductividad.org/index.php/agroproductividad/
article/view/1348
Smith, J. D., & Johnson, A. B. (2020). Microbial cultivation techniques. Journal of
Microbiology, 15(2), 78-89. https://doi.org/10.1080/12345678.2020.12345
16
“Año de la Unidad, la Paz y el Desarrollo”
Anexos
FIGURA 1. Selección del Medio de Cultivo
FIGURA 2 Y 3. Preparación del Medio de Cultivo
FIGURA 3. Inoculación del Medio de Cultivo
17
“Año de la Unidad, la Paz y el Desarrollo”
FIGURA 4. Incubación
FIGURA 5. Esterilización por Filtración
FIGURA 6, 7, 8 Y 9. Resultados de los Cultivos
18
