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Produccion Bacteria Proteinas - Grupo #1

Este documento describe la cinética de crecimiento de la bacteria E. coli BL21(DE3) que expresa la proteína recombinante mNS1. Se estudió el crecimiento bacteriano con y sin inducción midiendo la densidad óptica a lo largo del tiempo. Se determinó la velocidad específica de crecimiento y el tiempo de duplicación celular. El documento también brinda información sobre la producción de proteínas recombinantes en bacterias.

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Produccion Bacteria Proteinas - Grupo #1

Este documento describe la cinética de crecimiento de la bacteria E. coli BL21(DE3) que expresa la proteína recombinante mNS1. Se estudió el crecimiento bacteriano con y sin inducción midiendo la densidad óptica a lo largo del tiempo. Se determinó la velocidad específica de crecimiento y el tiempo de duplicación celular. El documento también brinda información sobre la producción de proteínas recombinantes en bacterias.

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Curva de crecimiento

bacteriano en la producción de
proteínas recombinantes

Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud


Universidad Nacional de Asunción

Bq. Liz López


Tutora: MCs. Belen Infanzón Co-tutora: MCs. Alejandra Rojas
2016
Programa de Vinculación de
Científicos y Tecnólogos
Instituto de Investigaciones Biomédicas
Universidad Nacional Autónoma de México

Dra. Adriana Valdez


Departamento de Biología Molecular y
Biotecnología
Proteínas recombinantes
• Son obtenidas a partir de una especie o una línea
celular distinta a la célula original.

• La capacidad de manipular las secuencias de ADN


permite alterar los genes y expresarlos de manera a
obtener proteínas con propiedades funcionales
mejoradas.

Huésped
heterologo
Proteínas recombinantes
terapéuticas
Producto Proteína Organismo Aplicación
recombinante
Humulin Insulina E. coli Diabetes
Protropin Protropina E. coli Deficiencia hGH
Roferon A Interferón alfa-2a E. coli Leucemia linfoide
crónica
Intron A Interferón alfa-2b E. coli Cáncer, verrugas
genitales, hepatitis
Recombivax Vacuna Hepatitis B S. cerevisiae Hepatitis B
Humatrope Somatropina E. coli Deficiencia hGH
Activase TPA CHO Infarto agudo del
miocardio
Epogen Epoetina alfa CHO Anemia
*Adaptado de Sanchez-García y cols. Microb Cell Fact (2016) 15:30
Proteínas recombinantes en
diagnóstico
Producción de proteínas
recombinantes en bacterias
Vector de Purificación
expresión • Ruptura celular
• Separación de proteínas
• Número de copias bacterianas

*Adaptado de Lara A.R. Rev Mex de Ing Quim (2011) 209-223


• Promotor • Eliminación de
• Presión de selección endotoxinas

Selección de la cepa Cultivo bacteriano


productora • Diseño optimo del medio
• Altos niveles de producción • Alta densidad celular
• Buen desempeño en el proceso • Estrategias de operación
• Modificada para facilitar la
producción
Crecimiento bacteriano
• Incrementoen el numero de células o aumento de la
masa microbiana (biomasa).
Crecimiento bacteriano
• El conocimiento de como se expande la población
celular es útil para el diseño de métodos de control
para el crecimiento microbiano.

• Adquiere relevancia en el aumento de la biomasa y


en los productos que se pueden llegar a obtener.
Curva de crecimiento bacteriano
Curva de crecimiento bacteriano
• Fase lag
Representa el tiempo necesario para reiniciar el ciclo celular después de un
periodo de ayuno nutrimental.
• Fase exponencial
O de crecimiento balanceado, representa el periodo en el que hay suficientes
nutrimentos; las bacterias recuperan el ciclo celular e incrementan su número
exponencialmente.
• Fase estacionaria
Representa el periodo de crecimiento nulo. Se define operacionalmente como el
momento en el que el número de células en el cultivo no varía.
• Fase de muerte

*Ramirez J. Rev Lat de Microb, 2005


Cinética de crecimiento
• Los
microorganismos presentan un crecimiento que se
puede describir mediante la siguiente función:

Donde:
x: concentración celular (biomasa)
m: velocidad especifica de crecimiento
t: tiempo de crecimiento
Cinética de crecimiento
• El crecimiento celular es considerado una reacción
autocatalítica de primer orden, en donde en un sistema cerrado
el crecimiento es el único proceso que afecta la concentración
celular.
• Considerando m constante:
• Velocidad especifica de crecimiento
Relación del crecimiento de la célula en función de los
nutrientes del medio.

• Tiempo de duplicación celular


O tiempo de generación. Es el tiempo requerido para que
una célula se divida (o para que la población de un
organismo se duplique en numero).
Microorganismo mm (hr-1) td (hr)
Escherichia coli 2.1 0.33
Saccharomyces cerevisiae 0.45 1.5
Candida utilis 0.40 1.7
Geotrichum lactis 0.35 2.0

*Adaptado de Doran P.M. Biochemical engineering, 2013


Métodos de cuantificación del
crecimiento bacteriano
Métodos directos
• Métodos gravimétricos
• Métodos espectrofotométricos
• Métodos microscópicos de recuento celular en cámaras
• Métodos de siembra

Métodos indirectos
• Bradford
*Adaptado de Anáiz y cols. Tecnología del agua, 2000
Cinética de crecimiento de bacterias
E. coli BL21(DE3) clon pGEX-mNS1
E. coli BL21(DE3) clon pGEX-mNS1

M: Marcador de PM
1: Extracto D1 sin inducir
2: Extracto D1+IPTG
3: Extracto D5+IPTG
4: Pellet D1 sin inducir
5: Pellet D1+IPTG
6: Pellet D5 sin inducir
7: Pellet D5+IPTG
Cinética de crecimiento de bacterias
E. coli BL21(DE3) clon pGEX-mNS1
• Medio: Luria Bertani

• Temperatura: 37ºC

• Antibiótico: Ampicilina 100 mg/mL

E. coli BL21 pGEX-mNS1


Tiempo (hr) D.O. D.O D.O x D.E
1 0,17 0,08 0,15 0,13 0,04725816
2 0,2 0,13 0,18 0,17 0,03605551
3 0,46 0,5 0,52 0,49 0,0305505
4 0,68 0,7 0,76 0,71 0,04163332
5 1,54 1,56 1,86 1,65 0,17925773
6 2,19 2,11 2,6 2,3 0,26286879
7 2,53 2,36 3,32 2,74 0,51228247
8 3,13 3,38 3,92 3,48 0,40377386
Cinética de crecimiento de bacterias
E. coli BL21(DE3) clon pGEX-mNS1
Cinética de crecimiento de bacterias
E. coli BL21(DE3) clon pGEX-mNS1
Tiempo (hr) ln D.O.
2 -1,77195684
3 -0,71334989
4 -0,34249031
5 0,50077529

m= 0,719 hr-1
td= 0,96 hr
Cinética de crecimiento de bacterias E.
coli BL21(DE3) clon pGEX-mNS1 con
inducción
• Medio: Luria Bertani
• Temperatura: 37ºC
• Antibiótico: Ampicilina 100 mg/mL
• Inductor: IPTG 0,05 mM
Cinética de crecimiento de bacterias E.
coli BL21(DE3) clon pGEX-mNS1 con
inducción

m= 0,7114 hr-1
td= 0,974 hr
Perspectivas
• Obtener rendimientos favorables de la proteína
recombinante mNS1 mediante la optimización de las
condiciones de cultivo y expresión.
Otras actividades realizadas
Agradecimientos
• CONACYT

• Dra.
Adriana Valdez y equipo de trabajo IIB-
UNAM
• IICS-UNA
NS1 DENV
Cn3D 4.3.1

Gracias

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