________________________________________________________ José González Cabeza

Capítulo 7

ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN
INTRODUCCIÓN

Regularmente en todos los ambientes abiertos y en muchos sitios anatómicos del cuerpo
humano, se pueden encontrar una gran cantidad de microorganismos (bacterias, hongos y virus).
Estos microorganismos tienen a su disposición nutrientes y/o condiciones ambientales favorables,
o por lo menos adecuadas para poder crecer y multiplicarse, produciendo en ciertas situaciones
patologías infecciosas.

Por otro lado, en la naturaleza existen comunidades complejas de microorganismos que

forman poblaciones compartiendo el mismo ambiente; consecuencia de ello, y con objeto de
evitar los efectos nocivos de los microorganismos, es necesario disponer de métodos que
permitan eliminarlos, de manera que se pueda conseguir ambientes limpios, desinfectados y en
ciertas ocasiones contar con material esterilizado, exento de contaminación microbiana.

OBJETIVOS

1. Conceptualizar los términos limpieza, desinfección, antiséptico y esterilización para su

correcta aplicación en su futuro desenvolvimiento profesional.
2. Conocer la importancia de la esterilización y familiarizarse con el empleo de procedimientos
que comúnmente son utilizados en el laboratorio.
3. Aprender el procedimiento para empacar diversos materiales de uso en microbiología, así
como el procedimiento de la esterilización por calor seco de estos.
4. Conocer y aplicar el procedimiento de esterilización por calor húmedo (autoclave), así como
las ventajas que ofrece tal procedimiento.
5. Manipular sustancias químicas para eliminar microorganismos adheridos en el material de
laboratorio de microbiología.
6. Uso correcto del autoclave durante la esterilización de material microbiológico.

1. LIMPIEZA

Este procedimiento tiene por objetivo dejar un objeto libre de contaminación. En

laboratorios y centros hospitalarios, en algunas ocasiones es suficiente con la limpieza; sin
embargo, en otras es necesario proceder a la desinfección o a la esterilización. Nada debe ser
sometido a procedimientos de desinfección o esterilización si no ha sido sometido previamente a
limpieza manual o a limpieza mecánica (con lavadoras).

Entre los principales agentes de limpieza utilizados en laboratorios y centros hospitalarios,

tenemos:

• Hipoclorito sódico.
• Derivados fenólicos.
• Complejos trialdehídicos (quirúrgicos).
• Polvo abrasivo clorado.
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Cap. 7. Esterilización y Desinfección __________________________________________

Por otra parte, se debe considerar que la limpieza en centros médicos será diferente si se
trata de:

• Zonas sin contacto con enfermos.

• Zonas de hostelería y lavandería.
• Servicios y cuartos de baño.
• Áreas de hospitalización, consultas externas y servicios generales.
• Áreas críticas (quirúrgicas, intensivos, prematuros, hemodiálisis, quemados,
diagnósticas intervencionistas).
• Banco de sangre, laboratorios, hospital de día, urgencias, habitaciones con
aislamiento indicado.

El personal responsable de estos centros, debe vigilar de forma personal y continua la

limpieza de su área.

La limpieza del material hospitalario, en muchas ocasiones requiere personal

especializado, adiestrado en el manejo de aquellos materiales que por su naturaleza misma, como
en dispositivos que por ser huecos (botellas) o tubulares con diámetro pequeño (canales de
endoscopía por ejemplo), presentan dificultades especiales.

1.1. Clasificación de los materiales según su uso

Los materiales que se reutilizan en laboratorios y centros médicos se pueden clasificar en:

• Elementos Críticos. Aquellos que entran en contacto con el sistema vascular u otras
zonas estériles del cuerpo que penetran en el tejido blando (ej.: instrumental de
cirugía y traumatología, endodoncia, periodoncia catéteres intravasculares). Los
elementos críticos siempre deben estar esterilizados.
• Elemento Semicrítico. Aquellos que entran en contacto con mucosas, pero no la
penetran (ej.: instrumental de operatoria, , de ortodoncia, tubos endotraqueales). De
preferencia deben de ser esterilizados entre cada uso; si no es factible, deben ser
sometidos al menos a un proceso de desinfección de alto grado o nivel.
• Elementos no Críticos. Aquellos instrumentos que pueden tener un contacto
frecuente, usualmente con la piel intacta (ej.: cuña de orina, interruptores, llaves,
sillones). Estos elementos requieren entre paciente y paciente un nivel de desinfección
intermedio o lavado con agua y detergente dependiendo del tipo de superficie y del
grado y naturaleza del contaminante.

2. ESTERILIZACIÓN

En microbiología, se define esterilización como la destrucción o eliminación total de todos

los microorganismos vivos (incluidas las esporas bacterianas) sobre un objeto o material. La
esterilidad es un estado absoluto, no hay grados de esterilidad; esta se puede alcanzar empleando
procedimientos físicos (calor, radiaciones, filtración), o químicos).

Estos procedimientos, si bien es cierto son muchas veces necesarios, no dejan de ser
costosos y en ciertas ocasiones poco aconsejable; así por ejemplo, en la esterilización de ciertos
alimentos no es posible sin dejar de alterar o destruir las características nutritivas y
organolépticas del mismo.

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3. ANTISÉPSIS

Es el procedimiento mediante el cual se emplean los denominados antisépticos, aquellos

compuestos químicos que desarrollan su acción letal interaccionando de forma inespecífica con
los componentes celulares, de forma que no existe una acción selectiva frente a grupos
determinado de microorganismos, sino que su acción es más general.

Los antisépticos se oponen a la sepsis o putrefacción de materiales vivos, no suelen ser

demasiado tóxicos (como son usualmente los desinfectantes) y debido a ello es que pueden
aplicarse sobre tejidos vivos; esta operación va dirigida sobre todo a la eliminación de formas
patógenas. La falta de especificidad de los antisépticos los diferencia de los antibióticos, cuya
principal característica es la selectividad.

4. DESINFECCIÓN

Los desinfectantes son agentes físicos o químicos que matan los microorganismos y que
se aplican sobre objetos inanimados (mientras que los antisépticos por su menor toxicidad se
emplean sobre tejidos vivos). Dependiendo de la forma como se realice el tratamiento (Ej.:
Concentración), algunos agentes puede utilizarse como antiséptico o como desinfectante, y
usualmente se suele usar el término germicida para englobar ambos conceptos.

Los diferentes tipos de microorganismos o de sus formas de desarrollo (esporas / células

vegetativas) tienen diferentes grados de sensibilidad a los tratamientos físicos o químicos, en
muchos casos el tratamiento con agentes desinfectantes no elimina completamente los
microorganismos presentes, sino que simplemente reduce la carga microbiana, de forma que la
acción indeseable de los microorganismos se retrasa.

Las esporas bacterianas son las formas más resistentes a los antisépticos y desinfectantes
y, sólo mueren al ser tratadas con agentes con alta actividad germicida. En general, las formas
vegetativas de las bacterias son sensibles a todos los agentes desinfectantes, aunque algunos
grupos de microorganismos tales como las micobacterias pueden presentar especial resistencia.
Regularmente los hongos presentan una mayor resistencia que las bacterias, y resisten los
desinfectantes de baja actividad. Por último, los virus presentan una sensibilidad similar a las
bacterias, aunque es un poco más elevada en el caso de los virus sin envolturas lipídicas.

El término desinfección también esta referido a la técnica, que empleando sea calor o
substancias químicas, se reduce la carga microbiana o se elimina los microorganismos de las
superficies. Un término parcialmente sinónimo es el de descontaminación, que es un poco más
general, ya que en él se aplican además del calor otros métodos de eliminación de
microorganismos.

El efecto de los desinfectantes depende esencialmente del i) Agente físico o químico del
desinfectante, ii) Tipo de microorganismo a eliminar y iii) Método de ensayo del efecto. Existe una
estrecha relación entre la concentración del agente y el tiempo necesario para matar una
determinada fracción de la población bacteriana, según la siguiente expresión:

CnΔ t = K

donde:

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Cap. 7. Esterilización y Desinfección __________________________________________

C, es la concentración del agente.

n, es el coeficiente de dilución (una constante).
T, es el tiempo de actuación.

Esta ecuación nos señala qué relación existe entre la variación de la concentración del
agente y el tiempo para matar una fracción de la población microbiana. Así por ejemplo, los
fenoles poseen un coeficiente de dilución n = 5 ó 6, ello implica que pequeños cambios en la
concentración provocan cambios muy acentuados en el tiempo para lograr un mismo efecto: así,
si reducimos la concentración de fenol desde un valor dado a su mitad, necesitamos emplear 64
veces más de tiempo para conseguir matar una misma proporción de bacterias. En cambio, los
hipocloritos (constituyentes de las lejías) tienen coeficiente n = 1, lo que se refleja en que
pequeños cambios en la concentración requieren pequeños cambios en el tiempo de aplicación.
Finalmente, y refiriéndonos al tiempo, no todas las bacterias mueren al mismo tiempo, ni siquiera
cuando se aplica un exceso del agente (revisar los gráficos posteriores). Otros parámetros a tener
en consideración son los siguientes:

4.1. pH. El pH afecta tanto a la carga superficial neta de la bacteria, como el grado de ionización
del agente. En general, las formas ionizadas de los agentes disociables pasan mejor a través
de las membranas biológicas, y por lo tanto son más efectivos. Los agentes aniónicos suelen
ser más efectivos a pH ácidos; mientras los agentes catiónicos muestran más eficacia a pH
alcalinos.

4.2. Temperatura. Normalmente, al aumentar la temperatura aumenta la potencia de los

desinfectantes. Para muchos agentes, el incremento de 10ºC supone duplicar la tasa de
muerte microbiana. Aunque esto no siempre es así; como en el caso del fenol, donde la
subida de 10ºC representa multiplicar por 5 o por 8 la eficacia.

4.3. Tipo de Microorganismo y otros Factores Asociados a la Población Microbiana. La actividad

del desinfectante puede verse afectado por el tipo de microorganismo; por ejemplo,
Mycobacterium tuberculosis resiste los hipocloritos mejor que otras bacterias. Además de
ello debe considerarse otras características microbianas propias de cada especie, como la
fase de cultivo, presencia de cápsulas o de esporas (suelen conferir más resistencia) y el
número de microorganismos iniciales son también determinantes.

5. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD GERMICIDA

La determinación del efecto antiséptico o desinfectante de los diferentes productos es

complicado, porque este efecto depende de un gran número de factores externos (temperatura,
humedad, pH, etc.), así como de los diferentes tipos de microorganismos que se desea eliminar o
controlar.

Existen protocolos que regulan cómo se debe evaluar la eficacia de un compuesto germicida y
entre ellas destaca la prueba del “coeficiente del fenol” (CF), en la que se toma como referencia
de desinfectante el fenol y como microorganismos de referencia a Staphylococcus aureus y
Salmonella typhi.

CF = DF / DD

donde:

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DF (Dilución de Fenol). Es el inverso de la mayor dilución del fenol que elimina completamente la
bacteria de referencia en 10 minutos de tratamiento.
DD (Dilución de Desinfectante). Es el inverso de la mayor dilución del desinfectante problema
que elimina el microorganismo de referencia en 10 minutos de tratamiento realizado el estudio
de los supervivientes tras un cultivo de 48 horas.

Por ejemplo, si se evalúa un desinfectante, el cual muestra una DF = 1/9 y una DD = 1/450,
el CF será de 50; esto es, el desinfectante es 50 veces más activo que el fenol. El valor de CF es
simplemente indicativo, ya que se trata de una medida realizada sobre cultivos puros y en la
realidad los germicidas se usan sobre poblaciones mixtas.

Para evaluar la acción de un germicida frente a un microorganismo en particular, se

realizan test de diluciones similares a los realizados para los antibiogramas cualitativos o
cuantitativos (ver capítulos posteriores).

En función de su CF, los germicidas se clasifican de Actividad Alta, Media o Baja. Si se

desea realizar una esterilización se deberán escoger germicidas de actividad más alta o a mayores
concentraciones. Igual ocurre si en la muestra existen substancias que protegen a los
microorganismos de la acción de los germicidas (como ocurre en el caso de la sangre o en las
heces).

6. AGENTES QUÍMICOS EMPLEADOS COMO DESINFECTANTES Y ANTISCEPTICOS

6.1. AGENTES QUE ALTERAN LA MEMBRANA CELULAR. Los solventes orgánicos (fenoles,
alcoholes) y los desinfectantes tensioactivos (detergentes) alteran la integridad estructural
de la membrana (es decir, la disposición ordenada de lípidos y proteínas), de modo que
interfieren con su función, ejerciendo un efecto neto de i) Interferencia con procesos de
transporte y metabolismo energético; ii) Salida de pequeñas moléculas de la célula.

6.1.1. DETERGENTES (desinfectantes tensioactivos o surfactantes).

Los detergentes sintéticos, al igual que los jabones, contienen una porción hidrofóbica
(normalmente una larga cadena lipófila) y una porción hidrófila (un grupo polar), lo cual les
permite formar micelas en solución acuosa, así como formar capas que cubren y solubilizan
moléculas hidrófobas. Según sea la porción hidrófila, los detergentes se pueden clasificar en:

Detergentes Iónicos: A. Detergentes catiónicos (grupo activo con carga positiva), B.

Detergentes Aniónicos (grupo activo con carga negativa).

A. Detergentes Catiónicos. Son los detergentes más potentes en cuanto a su actividad

desinfectante, siendo activos contra bacterias Gram positivas y Gram negativas. Los
principales son los llamados compuestos de amonio cuaternario.

• Sales de amonio cuaternario. Aquellos que van como cloruros o bromuros. Su fórmula
general se puede representar así: Las cuatro sustituciones (R1 a R4) del N son cadenas
de hidrocarburos variados. Las sales de amonio cuaternario más activas son aquellas
que tienen tres grupos alquílicos cortos y un grupo alquílico largo: cloruro de
cetilpiridinio, cloruro de benzalconio.

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Cap. 7. Esterilización y Desinfección __________________________________________

Mecanismo de acción. La porción hidrófoba penetra en las membranas, mientras que

el grupo polar catiónico se asocia con los fosfatos de los fosfolípidos, provocando
alteraciones en dichas membranas, que se traduce en la pérdida de su
semipermeabilidad, con salida de metabolitos de N y P desde el citosol. Es entonces
cuando el detergente puede entrar al interior celular, con un efecto secundario de
desnaturalización de proteínas. Su actividad se mejora a pH alcalino. Son rápidamente
bactericidas a concentraciones muy bajas (del orden de una parte por millón, 1 ppm),
siempre que en el material a tratar no exista materia orgánica.

Usos, ventajas e inconveniente. Tienen baja toxicidad, por lo que se pueden emplear
como desinfectantes. Se emplean igualmente en la desinfección de material de la
industria alimentaría, su actividad se ve neutralizada por jabones y fosfolípidos,
precipitando en su presencia.

B. Detergentes Aniónicos. Entre ellos figuran aquellos con:

• Grupos carboxilo como porción hidrófila: Jabones / Saponinas / Sales Biliares / Ácidos
Grasos Disociables.
• Grupos sulfato como porción hidrófila: Dodecilsulfato Sódico (SDS), también llamado
laurilsulfato sódico / Sulfonato de Alquilbenceno.

Mecanismo. Provocan una gran disrupción de membranas, con efectos de lisis. Son
activos sobre todo a pH ácido, mayormente sobre bacterias Gram positivas, pero poco
sobre Gram negativas, ya que éstas quedan más protegidas por la barrera del
lipopolisacárido de la membrana externa.

Usos. Cuando los detergentes aniónicos se combinan con ácidos, se logran

desinfectantes sanitarios muy potentes (debido al efecto sinérgico de ambos
componentes) y de rápida actuación (unos 30 segundos).

Detergentes No Iónicos. No tienen actividad antimicrobiana, pero algunos tienen empleo en

otros campos de la microbiología. Ejemplo de ellos tenemos a los:

• Ésteres del Ácido Oleico (nombres comerciales como CarbowaxJ, Tween-80J). Pueden
adicionarse a medios de cultivo para evitar la formación de grumos y favorecer el
crecimiento disperso de ciertas bacterias (como Mycobacterium tuberculosis); además,
el ácido oleico puede estimular el crecimiento.

6.1.2. FENOLES Y DERIVADOS

Estos compuestos que gracias a su grupo fenólico poseen propiedades

bacteriostáticas o bactericidas. El fenol como desinfectante ha sido reemplazado por
antisépticos menos cáusticos; a pesar de ser bactericida y fungicida es poco activo
sobre las formas esporuladas y su acción puede ser favorecida por Na+ o K+; y atenuada
por la materia orgánica e inhibida en presencia de soda. Tienen baja solubilidad en
agua, por lo que se emplean en fórmulas que incluyen agentes emulsificadores
(jabones) que, además aumentan su actividad.

Son rápidamente bactericidas a bajas concentraciones, causando i) Daños a

membranas con pérdida de constituyentes citoplásmicos. ii) Inactivación irreversible
de oxidasas y deshidrogenasas de membrana. iii) Desnaturalización de proteínas.

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a. Fenol y Compuestos Fenólicos (0,5 - 3%). Agentes oxidantes que se usan para
desinfectar superficies. Históricamente fue el primer agente antiséptico utilizado en
clínica, aunque en la actualidad no se emplea como tal en ambientes hospitalarios,
sino que se usan derivados fenólicos menos cáusticos. A partir del fenol se pueden
lograr desinfectantes con mayor actividad antibacteriana y con menor toxicidad,
sustituyendo hidrógenos del anillo bencénico por radicales alquílicos o por halógenos.
Ejemplo de algunos de ello:

• Cresoles (Lysol, CF ≈ 2.3). Tienen importancia por ser tuberculocidas y activos

durante largo tiempo; sin embargo, su olor es desagradable y pueden llegar a ser
tóxicos. Los alquilfenoles con el radical alquílico que puede estar en posición orto,
meta o para, dan respectivamente el orto-cresol, el meta-cresol y el para-cresol.
Normalmente se emplea la mezcla de los tres, denominada tricresol. Se obtenidos por
destilación del alquiltrán de carbón y se emplean como emulsiones de jabón verde
bajo los nombres comerciales de Lysol y Creolín. Se usan como desinfectantes de
material de desecho bacteriológico.

• Hexaclorofeno (CF ≈ 5 - 15 para S. typhi y 15 - 40 para Staph. aureus). Es una

agente muy activo que perdura durante largo tiempo. Se usa solo para desinfectar
alberges infantiles después de brotes con estafilococos. Sin embargo, puede ser tóxico
y por eso su uso es limitado.

• Bifenoles. Lisan la membrana celular y se usan en jabones y lociones.

6.1.3. ALCOHOLES

Los alcoholes desorganizan las bicapas lipídicas penetrando en la región

hidrocarbonada de los lípidos. No afectan a las endosporas, por lo que no son
esterilizantes. Su acción desinfectante mejora conforme aumenta la longitud de la
cadena alifática de los alcoholes, hasta aquellos con 8 a 10 átomos de carbono (C8-C10),
ya que los alcoholes de cadenas más largas de C10 tienen una baja solubilidad en agua.

• Etanol. El alcohol etílico es empleado regularmente sobre la piel antes de

inyecciones cutáneas, en concentraciones de 50 - 70% en agua (CF ≈ 0.04) (para su
mejor acción se implica la intervención del agua, al 100% de pureza es poco efectivo),
así como en desinfección de los termómetros clínicos, siempre que se deje el tiempo
suficiente de contacto. Posee un efecto bactericida pero no ejerce una acción sobre las
formas esporuladas. Su mecanismo de acción es la de originar inestabilidad en los
lípidos disolviéndolos y además de ello desnaturaliza las proteínas. El alcohol metílico
es menos activo pero más nocivo para el hombre.
• Alcohol Isopropílico. Es un alcohol superior, como los butílicos y amílicos, es
menos volátil y más efectivo que el etanol, pero su baja solubilidad en agua limita su
uso. Se emplea igualmente en desinfección de termómetros. Sin embargo, su efecto
tóxico (narcótico) es mayor y más duradero.

6.2. AGENTES DESNATURALIZANTES DE PROTEINAS

6.2.1. ACIDOS Y ÁLCALIS FUERTES

Son activamente bactericidas, debido a sus grupos H+ y OH- disociados respectivamente.

En principio, su actividad es proporcional al grado de disociación, pero algunos hidróxidos

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Cap. 7. Esterilización y Desinfección __________________________________________

son más potentes de lo sugerido por su mero grado de disociación, debido a la acción tóxica
directa que puede ejercer el catión metálico.

Existen ciertas especies bacterianas que resisten relativamente bien a la acción de bases
fuertes, tal es el caso del bacilo tuberculoso. Esto se aprovecha durante su aislamiento en la
cual se licua el esputo de enfermo sospechoso en una solución 1M de sosa (NaOH) y se deja
30 minutos antes de sembrar. Bajo estas condiciones, prácticamente sólo sobrevive el
Mycobacterium tuberculosis.

• Ácidos Orgánicos. Los ácidos orgánicos que son poco disociables, ejercen su efecto en
cuanta molécula intacta (sin disociar), que penetran a la célula. El ácido benzoico y el ácido
sórbico se usan ampliamente como conservantes alimentarios. Ciertos ácidos (como el
acético, láctico, propiónico) aparecen en alimentos fermentados, actuando como
conservantes naturales. Estos mismos, así como el ácido cítrico se pueden añadir a otros
tipos de alimentos, para prolongar el periodo del posible almacenamiento de los productos.
El ácido bórico se ha usado como conservante (a veces ilegal) de alimentos, así como en
oftalmología.

6.2.2. AGENTES OXIDANTES

a. HALOGENADOS

• Cloro y Compuestos de Cloro (500 - 5000 mg/l). El cloro bajo su forma gaseosa o en
diversas combinaciones químicas, es un antiséptico muy utilizado; al respecto es necesario
señalar que bajo su forma gaseosa es un producto peligroso y delicado de manejar. Sus
compuestos líquidos como los hipocloritos y cloraminas son los más difundidos. Todos los
compuestos clorados siguen un mecanismo semejante de acción formando el ácido
hipocloroso (agente oxidante); en esta reacción el oxígeno es liberado dando así un intenso
poder oxidante que destruye instantáneamente a la mayor parte de los microorganismos que
entran en contacto con él. Las formas esporuladas son más resistentes y para su inactivación
se necesitan dosis 100 veces más elevadas que las normales. La acción de estos compuestos
clorados está relacionada con el pH del medio.
• Yodo. Es uno de los primeros compuestos que se utilizó como desinfectante, siendo
principalmente de acción bactericida y fungicida. Es poco soluble en agua pero fácilmente
soluble en alcohol o en soluciones acuosas de yoduro de potasio.
• Soluciones de Yodo. Agente oxidante que inactiva las proteínas, se usa sobre la piel, en
jabones, etc. Entre ellos tenemos:
➢ Tintura de Iodo. Solución al 2% (o más) de yoduro potásico en agua y etanol (CF ≈ 4.0 -
5.0).
➢ Solución de Yodo. Se usa en instrumental médico.
➢ Povidona Yodada (Betadine). Es un complejo de iodo con polivinilpirrolidona, de
forma que se libera el germicida lentamente, se inactiva menos por materia orgánica y
penetra mejor. Se utiliza en desinfección de la piel e incluso en lavados quirúrgicos.
• Bromo
• Flúor

b. OTROS OXIDANTES

• Agua oxigenada. Este compuesto y todos los compuestos que dan origen a ella
(perboratos y persulfatos alcalinos) son antisépticos eficaces.
• Permanganato Potásico.

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• Peróxido de Hidrógeno (H2O2). En disolución del 6 al 30% (para esterilización en este

caso), es una agente oxidante que se usa sobre la piel.

6.2.3. AGENTES REDUCTORES

a. Aldehídos

• Formaldehído (6-8%) y el Glutaraldehído (2%). Ambos desnaturalizan proteínas y se

pueden usar como agentes esterilizantes (ej.: esterilizar instrumental). El glutaraldehído a
pH alcalino (Cidex) permite una desinfección de alto grado y se aplica al material que no
puede ser sometido a la autoclave. Es un compuesto tóxico e irritante que hay que utilizar
de acuerdo con unos procedimientos especiales.

6.2.4. AGENTES TENSOACTIVOS

• Sales de Amonio Cuaternario.

• Tensioactivos anfóteros.
• Derivados minerales y organominerales.
• Dicloruro de Mercurio. Inactiva las proteínas y se usa para desinfectar mesas, suelos y
otras superficies.
• Compuestos Organomercuriales. Actúan inhibiendo las proteínas, se emplean en uso
tópico (ej.:, la mercromina o mercurocromo CF de 2.7 para S. typhi a 5.3 para Staph.
aureus).
• Sulfato de Cobre. Precipita las proteínas y se usa como alguicida y como antifúngico.
• Nitrato de Plata. Precipita las proteínas. Se usa como solución al 1% en ojos de recién
nacidos para evitar la ceguera producida por N. gonorrhoeae o por C. trachomatis.
• Clorhexidina. Antiséptico que combina la acción germicida de los compuestos yodados y
la permanencia del hexaclorofeno. Es un bactericida eficaz, aunque tiene poca eficacia
sobre micobacterias y sobre esporas. Se usa en la desinfección de la piel al 5%, en la de la
boca (0.5 - 0.1%) y en jabones.
• N-duopropenida. Compuesto formado por dos yoduros de amonio cuaternario con gran
actividad y rapidez frente a bacterias y hongos, aunque menos activo frente a
micobacterias. Es de baja toxicidad por lo que puede usarse para la esterilización de
endoscopios.

6.2.5. METALES PESADOS Y SUS SALES

Ciertos metales tienen efecto bactericida, este poder ejercido a dosis ínfimas se llama
oligodinámico y se puede explicar por una pobre ionización del metal y por la afinidad de
estos iones con las proteínas celulares.

La plata bajo su forma metálica ha sido uno de los elementos más utilizados. Las sales
de metales pesados son más eficaces y muy utilizadas; las más comunes son las sales de Ag,
Hg, Cu y Zn. Todas inactivan la célula precipitando las enzimas o combinándose con sus
grupos -SH; esto explica a su vez la actividad y toxicidad que ejercen tanto sobre las células
del hospedante como sobre las células bacterianas.

6.2.6. COLORANTES

La gran mayoría se utilizan como antisépticos de uso local y normalmente poseen una
acción selectiva ya sea sobre bacterias Gram positivas o Gram negativas, así por ejemplo el
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Cap. 7. Esterilización y Desinfección __________________________________________

cristal violeta inhibe el crecimiento de la mayor parte de las bacterias Gram positivas.
Ejemplo de ellos tenemos: Azul de Metileno, Verde de Malaquita, Verde Brillante, Violeta de
Genciana.

6.2.7. GASES

A través de este método se pueden esterilizar productos inestables al calor y entre

ellos podemos citar:

• Formaldehído. Los vapores de formaldehído se pueden obtener por calentamiento de

soluciones diluidas de formaldehído o por los productos de polimerización de este aldehído.
Estos vapores poseen un poder bactericida que aumenta con la temperatura y humedad; así
por ejemplo a 22°C en presencia de un 60-80% de humedad, el tiempo de esterilización será
de algunas horas, siendo rápidamente destruidas las formas vegetativas y más lentamente
las formas esporuladas. Debido a la toxicidad de los vapores, éstos deben evacuarse una vez
terminada la desinfección.
• Oxido de Etileno. Posee un amplio espectro de acción con un gran poder esporicida. Su
uso está ligado a una mezcla con anhídrido carbónico o freón, ya que en su estado puro es
prácticamente inutilizable debido a su alto poder inflamable. El óxido de etileno es gaseoso a
temperatura ambiente y líquido a una temperatura inferior a 10°C. Su acción en base a la
temperatura le permite entrar en contacto con los productos y objetos más diversos y su
poder penetrante asegura la esterilización de material de laboratorio, telas, plásticos (en
general para aquellos productos que no pueden ser esterilizados por calor). La utilización de
aparatos especialmente diseñados para su aplicación han ampliado su campo de acción, una
alternativa a su uso es mediante un esterilizador similar a una autoclave, que controla la
concentración de óxido de etileno, la temperatura (60ºC) y la humedad (esterilización en
condiciones de alta humedad). El óxido de etileno puede usarse puro (la duración del
tratamiento en este caso es de 3 - 4 h) o como mezcla al 10 - 20% con CO2 u otro gas reductor
(porque es explosivo). Se usa también en disoluciones de 450 - 500 mg/l. Debido a que se
diluye rápidamente en el aire, permite su eliminación fácil después del tratamiento.
• B-propiolactona. Es un compuesto líquido que a temperatura ambiente emite vapores
que son bactericidas, esporicidas y fungicidas. Es 25 veces más activo que el formol y 400
veces más activo que el óxido de etileno. Tiene la ventaja que no es inflamable ni explosivo,
posee una acción penetrante y es de rápida eliminación. Se puede utilizar para esterilizar
materiales quirúrgicos, hilo para suturas, desinfección de locales e incluso medios de cultivos.
• Esencias Volátiles (Aceites Esenciales). Las esencias naturales tienen un poder
bacteriostático limitado, que se debe a sus compuestos fenólicos y terpénicos y también en
menor medida a sus alcoholes y aldehídos.

7. AGENTES FÍSICOS EMPLEADOS COMO DESINFECTANTES Y/O ESTERILIZANTES

7.1. RADIACIONES

El efecto bactericida de las radiaciones es conocido desde hace muchísimo tiempo, así por
ejemplo se sabe que la radiación solar, o más precisamente las radiaciones ultravioletas, son
agentes naturales de esterilización. A continuación se indican los diferentes tipos:

7.1.1. RADIACIONES ELECTROMAGNÉTICAS. Las primeras radiaciones conocidas por su

actividad son las ultravioletas; éstas son las menos eficaces debido a su gran longitud
de onda (se pueden utilizar para esterilizar bolsas de polietileno o papel, además de
otros usos); la región más activa de su espectro se encuentra entre los 2.600 y 2.700 Å.
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Los Rayos X y rayos Gama liberan una energía más importante y debido a ello penetran
más profundamente. Por su poder de penetración más intenso estas radiaciones son
más eficientes, pero sus instalaciones son costosas. Además, la irradiación tiene la
desventaja que no puede localizarse en un solo objeto. Otra desventaja es que las
radiaciones ionizantes no sólo destruyen los microorganismos, sino también alteran las
sustancias que los rodean.
7.1.2. RADIACIONES ELECTRÓNICAS. Se logran por el efecto termoelectrónico que permite
obtener una emisión continua de electrones, además de la aceleración de éstos, bajo
el efecto de un campo eléctrico. Estos electrones lanzados a gran velocidad tienen un
poder de esterilización idéntico a los rayos gama. Ellos se pueden dirigir a voluntad
sobre el objeto a esterilizar, pero su efecto es más débil que el de los rayos gama y su
principal defecto es la alteración de las substancias orgánicas sometidas a su acción.

7.2. SONIDOS.

Estos no poseen una utilidad práctica en esterilización; sin embargo, es necesario señalar
que los ultrasonidos poseen el poder de matar microorganismos en una suspensión líquida
liberando su contenido endocelular; de la misma manera pueden alterar las sustancias químicas
en solución. En microbiología se utilizan para extraer constituyentes endocelulares, enzimas, o
para hacer preparados de pared celular bacteriana (proceso conocido como sonicación). El
ultrasonido también puede emplearse para limpiar grillas que se utilizan en el microscopio
electrónico.

7.3. ESTERILIZACIÓN POR CALOR

Cuando los microorganismos son sometidos a temperaturas superiores a su óptima de

crecimiento, mueren rápidamente. Esta característica permite utilizar altas temperaturas para
eliminar microorganismos por termodestrucción. Los métodos basados en el calor son quizá los
más utilizados para controlar el crecimiento microbiano.

De otro lado, la sensibilidad de los diferentes tipos de microorganismos a los tratamientos

térmicos es distinta. Las esporas y algunos virus son la formas más termorresistentes y las células
vegetativas las más sensibles. Por lo general, los microorganismos Gram positivos tienden a ser
más resistentes que los Gram negativos; por consiguiente, desde un punto de vista práctico la
esterilización por calor está destinada a matar las esporas bacterianas.

El medio en el que se encuentra un microorganismo influye en su sensibilidad al calor. Por

lo general, los microorganismos son más sensibles a las altas temperaturas cuando se encuentran
a un pH ácido, mientras que las concentraciones altas de proteínas o azúcares en el medio
disminuyen la efectividad del calor y protegen a las bacterias. Las altas concentraciones de sal
tienen efectos variables según el tipo de microorganismo.

La esterilización por calor se puede hacer usando calor seco o calor húmedo.

7.3.1. ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

El calor seco destruye los microorganismos por efectos de oxidación y se requieren

temperaturas muy elevadas.
• Horno Pasteur (Pupineles). Este equipo utiliza calor seco transmitido por el aire al
objeto en esterilización. En este caso, la temperatura más usual suele ser de 160ºC durante
una hora ó por 40 minutos a 170ºC, ó 20 minutos a 180ºC. El uso del horno Pasteur está

103
Cap. 7. Esterilización y Desinfección __________________________________________

limitado por las características del material a esterilizar y se usa de forma limitada para la
esterilización de objetos metálicos y de vidrio y, para algunos productos secos que no pueden
mezclarse con el agua. Un modo práctico de controlar la llegada de la temperatura mínima
para la esterilización, es colocando en el interior ampollas de vidrio selladas conteniendo 0,3
g de ácido d-tartárico que debe fundirse.
• Flameado. Este método es rápido y su eficacia es altísima; sin embargo tiene un uso
bastante limitado. Es bastante frecuente en las buenas prácticas microbiológicas durante la
esterilización de asas e hilos de siembra, pinzas, espátulas. Consiste en someter al material a
la llama directa del mechero Bunsen, sin que se altere ni sufra deterioro alguno (Figura 7.1).

Figura 7.1. Flameado del asa bacteriológica

• Incineración. Este procedimiento de esterilización está destinado para aquellos productos

contaminados que no importa su destrucción, como en el caso de ropas, cadáveres de
animales, apósitos etc.

7.3.2. ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO

El calor húmedo elimina los microorganismos a temperaturas menores, ya que la

presencia de agua acelera la rotura de los puentes de hidrógeno responsables de la
estructura tridimensional de las proteínas, haciendo que éstas se desnaturalicen y pierdan
por tanto su funcionalidad.

• Ebullición. El agua hirviendo (100°C) tiene acción limitada, ya que aplicada durante 10
minutos va a destruir las formas vegetativas de los microorganismos, pero las esporas
bacterianas pueden sobrevivir incluso a tratamientos prolongados. Se podría utilizar el baño
104
________________________________________________________ José González Cabeza

María o baño de agua hirviente (sólo con fines de desinfección en el laboratorio), cuando no
se necesita alcanzar la esterilidad o cuando no se dispone de otros métodos mejores, tanto
para material (pinzas, tijeras, escalpelos, etc) como para medios de cultivo que no puedan
esterilizarse en autoclave.

• Autoclavado. La esterilización por esta técnica utiliza vapor de agua saturado, que se
somete a una atmósfera extra de presión (1,1 kg / cm2 = 15 lb / pulg2) sobre la presión
atmosférica normal, elevándose con ello el punto de ebullición del agua de 100°C a 121ºC y
consiguiéndose la destrucción de todos los microorganismos (salvo los termófilos extremos)
en un tiempo de 15 a 20 minutos; también puede usarse un ciclo más rápido de 134°C por 3
minutos. Esta temperatura es también necesaria para la destrucción de las esporas
bacterianas, que presentan una alta resistencia térmica y que pueden sobrevivir. El vapor de
agua difunde por ósmosis a través de las membranas de las esporas, coagulando su
protoplasma, fenómeno que se acentúa si el vapor es saturado y a sobrepresión. Esta técnica
de esterilización requiere el uso del autoclave. El autoclave permite elevar la presión una o
dos atmósferas sobre la presión atmosférica, elevándose con ello la temperatura de
ebullición del agua que se encuentra en su interior (Tabla 7.1).

PRESIÓN (libras) TEMPERATURA (°C)

1 102,3
3 105,7
5 108,8
7 111,7
9 114,3
10 115,6
11 116,8
12 118,0
13 119,1
14 120,2
15 121,3
16 122,4
17 123,3
18 124,3
20 126,2

TABLA 7.1. Relaciones existentes entre presión (lb) y temperatura (°C) durante un proceso
de autoclavado.

➢ La Autoclave. Este equipo consta de un recipiente metálico generalmente de acero

inoxidable, similar a una gran olla en cuyo interior se introduce el material a esterilizar que es
colocado sobre una rejilla o placa cribada. Para evitar que los productos esterilizados en el
autoclave se humedezcan con el vapor de agua se deben empaquetar en bolsas
impermeables de papel Kraft o de poliamida. Después de cerrar cuidadosamente la tapa, se
conecta la fuente de calor y comienza a elevarse la temperatura en su interior. La salida
continua del chorro de vapor a través de la válvula nos indica que el aire contenido en el
interior de la autoclave ha sido eliminado. La eliminación de este aire es importante, ya que
la difusión del calor entre el vapor de agua y el aire es pobre, por lo que no se alcanzará la
temperatura esperada a la presión elegida y no se conseguirá la esterilización. La válvula se
cierra cuando sólo sale vapor de agua y, a partir de ese momento, comienza a elevarse la

105
Cap. 7. Esterilización y Desinfección __________________________________________

presión hasta una atmósfera sobre la presión normal, elevándose como consecuencia la
temperatura hasta 121°C. Transcurridos 15 - 20 minutos en estas condiciones, el material se
ha esterilizado. El incremento de temperatura por encima de los 100°C y no la presión la que
destruye los microorganismos. Si se esterilizan volúmenes grandes de líquidos, es necesario
mantener el material en la autoclave durante períodos de tiempo más prolongados, pues se
tarda más en alcanzar los 121ºC en el centro de un gran volumen. Transcurrido el tiempo
necesario, se apaga el autoclave y se deja descender la temperatura hasta que el indicador
marque menos de 80ºC, momento en el cual la presión desciende hasta la presión
atmosférica. En las autoclaves modernas es posible el secado del producto una vez
esterilizado antes de sacarlo de la autoclave. Se abre ligeramente la espita para comprobar
que no queda vapor a presión.

El autoclave se utiliza para esterilizar medios de cultivo, instrumentos, ropas,

soluciones, jeringas, etc. que puedan soportar altas temperaturas y una atmósfera de
sobrepresión. Una versión reducida de la autoclave aunque no la ideal en un laboratorio es
una olla a presión doméstica, que sin embargo tiene el inconveniente de que no es posible
secar el producto.

Puesto que el tratamiento térmico puede alterar las características del producto
tratado, en el caso de alimentos o de productos termosensibles, se han desarrollado
diferentes tipos de tratamiento industriales entre los que destacan:

• Pasteurización. La cual esta destinada a reducir las poblaciones bacterianas,

estrictamente no es una esterilización. Se emplea principalmente en el tratamiento de
alimentos (por ejemplo, leche) y tiene muy poca utilidad en clínica. La pasteurización de la
leche se realiza a 71°C durante 15 segundos y el tratamiento UHT consiste en calentar el
producto a 140–150°C durante unos pocos segundos. Este tratamiento permite un tiempo de
conservación del producto mucho más largo (hasta 8 semanas).

• Tindalización (Esterilización Fraccionada o Vapor fluente). Este procedimiento se

emplea con frecuencia para esterilizar medios de cultivo que no pueden ser sometidos a una
temperatura superior a 100°C sin que pierdan alguna de sus propiedades, como leche,
azúcares, suero, etc. Se utiliza una autoclave a presión atmosférica, con la espita abierta,
donde nunca se superan los 100°C, y se realiza el proceso durante tres días consecutivos,
dejándose a temperatura ambiente en los intervalos entre dos tratamientos. La muestra se
somete a un calentamiento entre 56 – 100°C (aunque por lo general es de 65°C) durante 30
minutos, (100°C) durante 30-45 minutos destruyéndose en este proceso las formas
vegetativas pero no las endosporas termorresistentes. Si éstas se encuentran presentes en la
muestra germinan después del calentamiento y estas formas vegetativas serán destruidas en
los siguientes ciclos. Los sistemas Arnold y de Koch son los más utilizados.

8. CINÉTICA DE TERMODESTRUCCIÓN: VALORES D y Z

La muerte de microorganismos como consecuencia de un tratamiento a altas

temperaturas sigue una cinética exponencial. Si representamos la variación del logaritmo del
número de células supervivientes a un tratamiento térmico realizado a una temperatura dada en
función del tiempo de tratamiento, se obtiene una línea recta cuya pendiente nos indica la
velocidad de termodestrucción.

106
________________________________________________________ José González Cabeza

Se define el valor D como el tiempo necesario para que el número de supervivientes

caiga al 10% del valor inicial (o, lo que es lo mismo, para que el logaritmo del número de
supervivientes se reduzca en una unidad). Si consideramos N0 como el número de células al inicio
del tratamiento y NX el número de células supervivientes después de un tratamiento de “t”
minutos a una temperatura “T”, el tiempo de termodestrucción se calcula de la siguiente manera:

Dt = X
log (N0 / Nx)

La magnitud de D es tiempo (en muchos casos se usan los minutos; pero ciertos
tratamientos son tan efectivos que resulta más práctico usar los segundos, que por otra parte, son
unidades del SI).

El tiempo de termodestrucción (D) varía para cada temperatura (de ahí el subíndice t),
de forma que a mayores temperaturas el valor de D es menor, es diferente para distintos
microorganismos, distintos entornos y diferentes condiciones fisiológicas.

Si aumentamos la temperatura de tratamiento, el valor de D disminuye de forma

logarítmica. De manera análoga a como el valor D indicaba el tiempo necesario para lograr que el
número de supervivientes se redujera al 10% de la población inicial, el valor z indica el incremento
en la temperatura (medida en número de grados) necesario para que el valor D se reduzca a la
décima parte del inicial.

Z = ΔT / [log (Dt1 / Dt2)]

donde:

ΔT = Incremento de temperatura

Dt1 y Dt2 = Valores de D a las dos temperaturas estudiadas.

107
Cap. 7. Esterilización y Desinfección __________________________________________

Los valores D y Z varían para cada microorganismo y para cada condición. Las esporas, por
ejemplo, tienen valores D mucho más altos que las células vegetativas de los mismos
microorganismos. Cuando el valor del tratamiento se realiza a 121,1°C (250°F) al valor D se le
denomina Dr y, por tanto, representa el tiempo necesario para lograr la destrucción del 90% de las
células del microorganismo tratado a esa temperatura.

9. ELIMINACIÓN MECÁNICA

9.1. Filtración. Este método es empleado para la esterilización de materiales líquidos sensibles al
calor, como algunos medios de cultivo, soluciones de antibióticos, enzimas, vacunas, etc, o
también para gases. En la esterilización por calor se destruyen los microorganismos del
medio, mientras que la filtración los retira de una forma mecánica, en vez de destruirlos. La
filtración es el paso de un líquido o gas a través de un material filtrante, con poros lo
suficientemente pequeños como para retener células microbianas. Los filtros que se utilizan
en la actualidad son generalmente, los denominados filtros de membrana y están integrados
por pequeñas piezas de material sintético, generalmente acetato de celulosa o
policarbonato, que pueden tener poros con tamaños de 0,22 y 0,45 μm, diseñados para
retener bacterias. La acción combinada de los poros, la trama del filtro y la naturaleza
química del material utilizado retiene los microorganismos, pero no el fluido. Los fluidos que
se van a filtrar pasan a través de la membrana con la ayuda del vacío o la presión generada,
por ejemplo con una bomba de vacío. Tanto los filtros de membrana como los equipos de
filtración con los que éstos se usan deben ser esterilizados por otros métodos, generalmente
el autoclave. Los virus y algunas bacterias de tamaño muy pequeño como, por ejemplo los
micoplasmas, no son retenidos por los filtros habituales.

9.2. Centrifugación. Normalmente la centrifugación se realiza a una aceleración de 5000 g y

permite separar partículas en suspensión en un medio líquido y tiene la desventaja que no se
puede aplicar a grandes cantidades de líquido; además, no permite una eliminación total de
los microorganismos.

10. ACTIVIDAD PRÁCTICA DE LIMPIEZA Y SECADO

DEL MATERIAL DE CRISTALERIA

10.1. MATERIAL.
Material de cristalería empleado en microbiología: Tubos de ensayo / Láminas portaobjetos
/ Laminillas cubreobjetos / Pipetas Pasteur / Cajas de Petri / Pipetas graduadas, etc.

108
________________________________________________________ José González Cabeza

10.2. SUSTANCIAS QUÍMICAS

Mezcla Crómica / Xilol / Extran (2%, 5%, 20%) / Alkox al 3% o 16% / Alcohol al 96%.

10.3. ETAPAS A SEGUIR

a. Prelavado. El objetivo es brindar una protección al personal que manipulará los

elementos durante el traslado al ambiente de esterilización y durante este proceso el
personal deberá tomar las precauciones correspondientes, utilizando métodos de barrera
para su propia protección (guantes resistentes, camisolín impermeable, barbijos
impermeables y protectores oculares). El mismo se realizará con un agente líquido
tensioactivo biodegradable (Enzimático o no) de uso quirúrgico, de pH neutro, no iónico y
que no deje residuos El material debe ser luego enjuagado, el procedimiento debe
realizarse en el área donde fue utilizado El material debe llegar al servicio de esterilización
en forma inmediata, libre de materia orgánica y restos de sangre visibles, debe estar
contenido en recipientes rígidos impermeables y con tapa. El prelavado facilita el proceso
posterior de esterilización.

b. Lavado. La condición fundamental que deben observar los materiales previos a la

desinfección y a la esterilización es la limpieza, que consecuentemente producirá la
eliminación de la suciedad y la disminución de la carga microbiana inicial. El lavado se hará
utilizando agentes neutros de limpieza, cepillo de cerdas blandas, agua a temperatura entre
40 - 50°C, perfectamente con el elemento sumergido.

c. Enjuagado. Se debe enjuagar muy bien y con suficiente cantidad de agua potable a
corriente. Para realizar el proceso de lavado y enjuagado el personal deberá usar guantes
resistentes, camisolín impermeable, protectores oculares y barbijos impermeables, se
deberá tener mucho cuidado de no salpicar el ambiente físico u otras personas.

d. Secado. Es muy importante realizarlo inmediatamente luego del enjuagado, para evitar
la contaminación posterior y deterioro del material. El secado manual se hará utilizando
paños de tela muy absorbente o de fibra celulosa limpios, únicamente destinados para este
fin, pudiendo también utilizarse aire filtrado, máquinas secadoras o estufas secadoras.

10.4. PROCEDIMIENTO

a. LAVADO CON MEZCLA CRÓMICA. Se trata de un preparado tóxico, corrosivo y peligroso

para el medio ambiente. Se utiliza para destruir la materia orgánica, es de gran eficacia,
debe ser descartado su uso excepto para aquellos casos en que no exista otra alternativa,
empleándolo siempre en la mínima concentración necesaria.

Debe tenerse en cuenta que el dicromato potásico está clasificado como compuesto
cancerígeno, categoría 2. La clasificación de la mezcla crómica es: Producto tóxico y
peligroso para el medio ambiente. Puede causar cáncer por inhalación y alteraciones
genéticas hereditarias. Provoca quemaduras graves y puede causar sensibilización en la
piel. Es muy tóxico para los organismos acuáticos y puede provocar a largo plazo efectos
negativos en el medio ambiente acuático.

En cuanto a su manipulación debe ser la siguiente:

1. Dejar reposar en un recipiente el material de cristalería durante 24 horas.

2. Lavar con abundante agua y jabón y dejar en agua corriente durante 24 horas.
109
Cap. 7. Esterilización y Desinfección __________________________________________

3. Colocar el material en agua destilada durante 24 horas.

4. Se mantienen por tiempo indefinido, en un recipiente cerrado con alcohol al 70%.
5. Puede procederse a un secado en horno para posteriormente esterilizarlo.

b. MEZCLA PARA EL LAVADO DE PREPARACIONES DE DESECHO. Prepare la siguiente

solución:
- Agua potable 1 parte
- Alcohol de 96% 1 parte
- Xilol 1 parte

Colocar los portaobjetos, cubreobjetos, pipetas, tubos de ensayo, cajas de Petri y

demás material de vidrio en esta mezcla durante 24 h.

Lavar con agua destilada y por último se pueden mantener por tiempo indefinido
en un recipiente con alcohol al 70 % o 96%. Se puede proceder a secar el material en
horno para llevarlo a esterilizar.

c. TÉCNICA DE LIMPÌEZA PARA MATERIAL DE CRISTALERÍA NUEVO. Prepare la siguiente

solución:
- Alcohol 96% 3 partes
- HCl (concentrado) 1 parte

1. Lavar con agua jabonosa.

2. Enjuagar con agua corriente.
3. Enjuaga con alcohol acidulado.
4. Dejar escurrir y lavar con agua destilada.
5. Seca con lienzo limpio o en horno y proceder a esterilizarlo.

d. DETERGENTE EXTRAN ALCALINO PARA LIMPIAR MATERIAL

1. Preparar solución de Extran al 2% en agua si existe una suciedad usual. Al 5% si la

suciedad es muy acentuada y al 20% si la suciedad es muy persistente.
2. Colocar el material sucio en un traste y deje reposar entre 2 y 24 horas. Si se
quiere acelerar la reacción es conveniente hervir la solución.
3. Después del tiempo requerido saque del baño, enjuague con agua potable a
corriente y después con agua destilada. Secar al aire o estufa.

e. SOLUCIÓN DETERGENTE DE ALKOX PARA LIMPIAR MATERIAL. Se disuelve en agua en

un 3% a un l6% según el nivel de suciedad que se debe eliminar. Sumerja el material en
la solución durante un periodo de 1 hora a 24 horas. Si se calienta de 45°C a 90°C es más
eficaz. Enjuagar con agua potable a corriente y finalmente con agua destilada. Secar al
aire o estufa.

f. PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL. El material que se va a esterilizar debe

prepararse de tal manera que se conserve sin contaminar una vez esterilizado, como por
ejemplo el material de vidrio (tubos, matraces, frascos, etc. los cuales se cierran con
algodón graso o tapones metálicos para evitar la entrada o salida de los
microorganismos, aunque en la actualidad la aparición del papel aluminio resuelve
muchos problemas). Además, cuando se usa algodón a de cubrirse éste con un papel
impermeabilizado. En el caso de las pipetas, se les coloca en la boquilla una pequeña
torunda de algodón que actúa como filtro, evitando la contaminación del operario con
los microorganismos de la muestra y que éste a su vez contamine la muestra. Una vez
110
________________________________________________________ José González Cabeza

preparadas, se introducen en estuches o cajas metálicas, o bien se envuelven

individualmente en papel satinado para ser posteriormente esterilizadas. Todo el
material de vidrio se esteriliza con calor seco, generalmente en un horno Pasteur. De
otro lado el material de plástico desechable ya se suministra estéril y listo para su uso,
por ejemplo, las placas de Petri se introducen en bolsas de plástico selladas y se
esterilizan con óxido de etileno o radiaciones. Las soluciones y medios de cultivo líquidos
se envasan en matraces o tubos y se esterilizan, generalmente, en autoclave. Existen
varios métodos para llevar a cabo el proceso de esterilización y la elección de uno
determinado viene condicionada por el tipo de material que se quiere esterilizar.

11. ACTIVIDAD PRACTICA DE EMPACADO DE MATERIAL

Y ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

11.1. ETAPAS PREVIAS AL EMPACADO DEL MATERIAL. Antes de iniciar el empaque del material
que se desea esterilizar, es necesario que todas las prácticas que se realicen estén en condiciones
de esterilidad y se debe en primer lugar, limpiar el área de trabajo con alguna sustancia
desinfectante y encender el mechero. Se emplearán distintos agentes germicidas y desinfectantes
(soluciones de hipoclorito de sodio, cloroxilenol, formaldehído, etc.) para desinfectar superficies.
De modo concreto se deben de seguir los siguientes pasos:

1. Lava el material de laboratorio, principalmente la cristalería con detergente Extran o

Alkox y enjuagar con abundante agua potable. En seguida, volver a enjuagar con agua
destilada.
2. Secar el material utilizando papel absorbente para acelerar el secado

11.2. EMPACADO DEL MATERIAL. El material a esterilizar se deberá de empacar correctamente

con papel estraza. Una de las razones de la importancia del papel en nuestra vida cotidiana es la
enorme cantidad de usos que se le pueden dar a este producto. De la misma manera, el papel
puede adaptarse a las diferentes utilidades que se vayan a realizar, llegando a contabilizarse hasta
457 variedades diferentes de papel. Las variedades dependen de una serie de características
físicas que hacen que el papel se pueda adaptar a diferentes usos, como impedir el ingreso de
microorganismos al interior, sellar en forma completa para evitar contaminación, soportar la
tracción y manipulación habitual sin sufrir deterioro y hacer permeable al método de
esterilización seleccionado.

Empacado Correcto del Material

• Cajas de Petri. Corta papel estraza en forma de rectángulos, adecuados para la cantidad
de 2 a 3 cajas. Colocarlos en la parte central y envolverlos como sigue: Tomar los
extremos del papel y unirlos, efectuándose un nuevo doblez, recargando ligeramente
en la caja para marcarlo. Los extremos se doblan en forma triangular y se doblan hacia
atrás quedando listas para esterilizar.
• Pipetas. Introducir una pequeña porción de algodón en el cuello de la pipeta,
procurando que quede lo suficientemente apretada. Con tiras de papel de 3 cm de
ancho envolverlas, comenzando por la punta y en forma de espiral gira hacia arriba,
hasta el final de la pipeta.
• Tubos de Ensayo. Coger el tubo con la mano izquierda y con la derecha el tapón de
algodón. Colocar algodón en la boca del tubo a 1/5 parte de la longitud del mismo
procurando que quede bien apretado. Depositarlos en recipientes adecuados (vasos), el
cual debe se tapado y atador con papel estraza.

111
Cap. 7. Esterilización y Desinfección __________________________________________

• Matraces. Tapar el cuello del matraz con algodón, lo suficientemente apretado para
evitar que se destape (se tapa en la misma forma que el tubo). Como protección se
coloca una capucha de papel estraza la cual es atada.
• Material Metálico. El ansa de platino, tijeras, bisturí, material quirúrgico no es necesario
empacarlo para su esterilización.
• (*) Nota: En la actualidad, la aparición del papel aluminio ha venido a resolver una serie
de problemas, empleándose como envoltura de matraces con medios de cultivo,
envoltura de jeringas, filtros, ansas, navajas, etc.

11.3. PROCEDIMIENTO PARA LA ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO. Como ya se ha descrito

anteriormente, la muerte microbiana conduce a una esterilización, ya sea como consecuencia de
mecanismos de transferencia de energía, además de la oxidación. En la esterilización por calor
seco existe una destrucción de los microorganismos oxidando sus constituyentes químicos,
desnaturalizando las proteínas y los ácidos nucleicos de las células, así como fragmentando las
membranas celulares.

Para materiales que deben permanecer secos, como la cristalería de vidrio (cajas de Petri,
pipetas), aceites, polvos (por ser impermeables al vapor) es suficiente una exposición de dos
horas de duración a 160°C para que quede esterilizado.

Entre los materiales que no se pueden esterilizar por calor seco son el material textil
(algodón, sedas, lino, etc.), gomas y materiales sintéticos.

11.4. RECOMENDACIONES EN LA ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

1. Las normas de procedimiento de la Institución establecerán las condiciones de trabajo,

según la carga, volumen, peso, resistencia térmica del material. Es imprescindible
respetar los parámetros obtenidos en la validación del procedimiento. La temperatura
de esterilización por calor seco deberá estar entre 160°C a 170°C y el tiempo de
aplicación será de una hora o más.
2. El material a esterilizar se deberá cargar con el esterilizador frío, teniendo en cuenta lo
siguiente:

• Cada unidad deberá quedar separada de las vecinas.

• Los materiales no deberán estar en contacto con las paredes, piso y techo del
esterilizador.
• La carga del esterilizador será homogénea y no deberá superar el 80% de la
capacidad total de la cámara.

3. Colocar el material dentro del esterilizador. Encender el esterilizador y verificar que los
instrumentos de control del ciclo, tiempo (hora) y temperatura (170°C) se encuentren en
la posición correcta. Esperar hasta que los instrumentos de medición alcancen la
temperatura seleccionada para el ciclo.

4. Cuando se alcance la temperatura seleccionada, se comenzará a descontar el tiempo de

esterilización. Cumplido el tiempo de exposición se apagará el esterilizador. La descarga
del Esterilizador se efectuará una vez que el material se haya enfriado completamente.

5. Durante el ciclo de esterilización no deberá abrirse la puerta del esterilizador porque ello
implicaría abortar el ciclo, debiendo en este caso recomenzarlo nuevamente, además de
que el cambio de temperatura rompería la cristalería.

112
________________________________________________________ José González Cabeza

12. ACTIVIDAD PRÁCTICA DE ESTERILIZACIÓN POR CALOR HUMEDO

12.1. CALOR HÚMEDO

La temperatura elevada, combinada con una humedad elevada, es uno de los métodos
más efectivos para matar microorganismos. El calor húmedo mata a los microorganismos
coagulando sus proteínas. Es mucho más rápido y efectivo que el calor seco. El vapor a
presión proporciona temperaturas por encima de las que se pueden obtener al hervir.
Tiene la ventaja de un calentamiento rápido, así como penetración rápida y abundante
humedad.

El aparato a esterilizar que utiliza vapor de agua a presión regulada se denomina

autoclave. Consta de una cámara de doble pared que se llena de vapor saturado libre de
aire y se mantiene a la temperatura indicada y a la presión establecida durante un periodo
de tiempo determinado. Generalmente el autoclave funciona a una presión de 15 lb/pulg2
a 121°C (249°F). El tiempo de funcionamiento para lograr la esterilidad depende de la
naturaleza del material que se va a esterilizar, del tipo de envase y del volumen del
material. Una temperatura de 100°C es la suficiente para matar a todas las formas
bacterianas en 2 o 3 minutos, excepto a las esporas, para matar a estas se requiere una
temperatura de 121°C durante 15 minutos y a una presión de 15 lb.

Este método es adecuado para esterilizar aparatos que tienen hule, jeringas que
contienen metal, para medios de cultivo que contienen un azúcar especial dextrosa. El
autoclave se puede sustituir por la olla de presión.

12.2. PROCEDIMIENTO DE ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO (AUTOCLAVADO)

1. Lavar el material con mezclas adecuadas como Extran, mezcla Crómica, con
concentraciones adecuadas tomando en cuenta lo sucio del material, secar en estufa o
en forma manual con papel absorbente y empacarlo. Tenerlo listo para su
esterilización.

2. Colocar el agua necesaria en la autoclave hasta la marca, e introducir las gradillas

metálicas que servirán de soporte al material a esterilizar. Colocar el material a
esterilizar dentro de la autoclave, evitando que el material toque las paredes.

3. Cerrar la autoclave cuidando de dejar abierta la válvula de salida de vapor, que

ayudará a expulsar el aire contenido dentro de ella y que éste es desplazado mas
adelante por el vapor que se produce. Si el aire no es eliminado totalmente de la
autoclave, el manómetro aumentará a 15 libras, pero la temperatura no alcanzará los
121°C; por ello debe medirse el tiempo cuando la temperatura llegue a 121°C.

4. Cerrar la válvula cuando el vapor sea continuo. La temperatura de 105°C indica que
está libre de aire. Observar el termómetro. Cuando vaya en 120°C, mantenerla durante
15 minutos para que se efectúe la esterilización (15 libras de presión). Transcurrido
este tiempo se corta la fuente de calor.

5. Dejar enfriar completamente hasta que el manómetro marque cero. Abrir la válvula de
salida de vapor para expulsar el vapor restante. Abrir el autoclave y retirar el material.

113
Cap. 7. Esterilización y Desinfección __________________________________________

6. Si el material no está en estado líquido, la válvula se puede abrir rápido a la salida de

vapor, pero si está en estado líquido (medios de cultivos) la rápida pérdida de presión
las hace hervir o bien saltar los tapones. Por lo tanto debe esperarse unos minutos a
que se enfríe perfectamente.

13. CUESTIONARIO

1. ¿Con que propósito se lava el material que se empleará en la realización de prácticas de

microbiología?.

2. ¿Que proceso de limpieza empleo en esta práctica para eliminar los microorganismos
presente en el material sucio o contaminado?

3. ¿Porque no es conveniente el lavado del material con mezcla Crómica en un laboratorio

como el nuestro?.

4. ¿Que diferencia existe entre el lavado del material y la esterilización de este?.

5. ¿Porque cree que sea indispensable la esterilización del material después de haberlo
lavado?.

6. ¿Que métodos de barrera puedes utilizar en el laboratorio al realizar un prelavado del

material?.

7. ¿Porque se recomienda que la temperatura del lavado del material sea entre 40°C y 50°C?.

8. ¿Que procedimiento emplea para secar el material?.

9. ¿Porqué antes de una esterilización es necesario lavar y desinfectar el material?.

10. ¿Es necesario un secado del material en el horno antes del empacado con papel estraza?
¿Por qué?.

11. ¿Que finalidad tiene el empacado antes de la esterilización?.

12. ¿Que objeto tienen los tapones de algodón que se colocan en los extremos de las pipetas y
de los matraces Erlenmeyer?.

114
________________________________________________________ José González Cabeza

13. ¿Que desventaja tiene el utilizar la esterilización por calor seco en este laboratorio? ¿Cómo
actúa la esterilización por calor seco en los microorganismos?.

14. ¿Cuál es la temperatura y cuanto tiempo tendrá que emplear para esterilizar por calor seco el
material de laboratorio, para asegurar la destrucción de microorganismos patógenos y
esporas?.

15. ¿Cual material se puede esterilizar por calor seco y cual no? ¿Porqué?.

16. ¿Qué tipo de material se puede esterilizar por calor húmedo?.

17. ¿A qué condiciones de temperatura y presión se destruyen todas las formas vegetativas?.

18. ¿A qué condiciones de temperatura y presión se destruyen las esporas?.

19. ¿Cuáles son las condiciones necesarias de tiempo y temperatura para esterilizar por calor
seco?.

20. ¿Cómo actúa la esterilización por calor húmedo en los microorganismos?.

21. ¿Qué tipo de esterilización es más recomendable y porque?

14. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Brock, T.; M. Madigam. -1991- MICROBIOLOGÍA. Edit. Prentice Hall Hispanoamericana. 6ta
Edic. 956 pp.
2. Jawetz, E.; Melnick, J.; Adelberg, A. -1997- MICROBIOLOGÍA MÉDICA. Edit. Moderna. México.
476 pp.
3. Liébana, J. -2002- MICROBIOLOGÍA ORAL. Ed. Mc Graw-Hill-Interamericana. 2ª Edic. Madrid.
677 pp.
4. Mendo, M. -2003- MEDIOS DE CULTIVO EN MICROBIOLOGÍA. Edic. Laborales SRL. 4ª Edic. Lima
- Perú. 237 pp.

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Cap. 7. Esterilización y Desinfección __________________________________________

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