UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

Facultad de Ciencias

Escuela Profesional de Biología - Microbiología

“EFECTO DE MEDIOS DE CULTIVO ELABORADOS CON FERTILIZANTE

ORGÁNICO E INORGÁNICO EN EL CRECIMIENTO Y FIJACIÓN
DE DIATOMEAS BENTÓNICAS MARINAS CON
POTENCIAL ACUÍCOLA”

Tesis

Presentada por

Bach. Jordan Ismael Huanacuni Pilco

Para optar el Título Profesional de:

Biólogo-Microbiólogo

Tacna – Perú

2016
 AGRADECIMIENTOS

Agradezco a la UNJBG por darme la oportunidad de estudiar la carrera y conocer

a personas maravillosas.

A mis maestros de la universidad que me apoyaron y estuvieron conmigo

resolviendo mis dudas con gran paciencia.

Se agradece al Fondo de Desarrollo Pesquero (FONDEPES) que me facilitaron

las instalaciones del Centro Acuícola Morro-Sama (CAMOSA) para el desarrollo del

proyecto.

Agradezco a mi asesor de tesis, el Mblgo Luis Lloja Lozano por su amistad, su

manera tan sabia de brindar sugerencias y correcciones en la tesis. A mi co-asesor el

Ing. Luis Rodríguez Ruiro que a pesar de las dificultades que se presentaron a lo

largo del desarrollo del proyecto supimos sobrellevar el trabajo en buenos términos, y

gané un buen amigo.

A mis amigos de generación, sobre todo a mis compañeros de la Carrera

Biología-Microbiología por su amistad y apoyo en todo momento.

 DEDICATORIA

El presente trabajo está dedicado a mi familia, siendo mis padres el pilar de mi

crecimiento como persona, quienes siempre han estado en cada momento de mi vida,

les agradezco todo el esfuerzo que han hecho por mí y sé que seguirán haciéndolo por

mí y mis triunfos, todo se lo debo a ustedes, me convirtieron en la persona que soy y

nunca se los podré pagar.

A mis hermanas que son mis compañeras y amigas incondicionales que me han

ayudado en momentos difíciles y compartieron mis momentos de alegría.

¡Los amo!

Su hijo y hermano mayor…

 CONTENIDO

RESUMEN ................................................................................................................... 1
ABREVIATURAS ....................................................................................................... 2
GLOSARIO ................................................................................................................. 3
I. INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 5
II. OBJETIVOS ........................................................................................................... 7
1.1. Objetivo general............................................................................................ 7
1.2. Objetivos específicos ..................................................................................... 7
III. MARCO TEÓRICO ............................................................................................. 8
3.1. MICROALGAS EN LA ACUICULTURA .................................................... 8
3.1.1. Microalgas...................................................................................................... 8
3.1.2. Cultivo de microalgas para la acuicultura .................................................. 9
3.2. MEDIOS DE CULTIVO ............................................................................... 11
3.2.1. Medio Guillard f/2 ....................................................................................... 12
3.2.2. Fertilizantes inorgánicos ............................................................................. 13
3.2.3. Fertilizantes orgánicos ................................................................................ 14
3.3. DIATOMEAS BENTÓNICAS ...................................................................... 15
3.3.1. Formación de Biopelículas ......................................................................... 17
3.4. CRECIMIENTO POBLACIONAL ............................................................. 17
3.5. PARÁMETROS DE CRECIMIENTO ........................................................ 19
IV. MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................... 23
4.1. MATERIALES ........................................................................................... 23
4.1.1. Limpieza y esterilización de materiales..................................................... 24
 4.2. MÉTODOS: ................................................................................................ 24
4.2.1. Captación de Diatomeas ............................................................................. 25
4.2.1.1. Elaboración de un sistema de Captación ........................................... 25
4.2.1.2. Colecta de muestras ............................................................................. 25
4.2.2. Aislamiento e Identificación de Diatomeas ............................................... 26
4.2.2.1. Preparación de medio Guillard f/2 en placas .................................... 26
4.2.2.2. Siembra en placa .................................................................................. 26
4.2.2.4. Tratamiento con antibiótico ................................................................ 28
4.2.2.5. Selección de las Diatomeas .................................................................. 28
4.2.2.6. Identificación de las Diatomeas Bentónicas ....................................... 28
4.2.3. Aumento progresivo de volumen. .............................................................. 30
4.2.4. Comparación de los medios de cultivo ...................................................... 32
4.2.4.1. Medio Guillard f/2 ................................................................................ 32
4.2.4.2. Medio con Fertilizante Inorgánico ..................................................... 32
4.2.4.3. Medio con Fertilizante Orgánico ........................................................ 32
4.2.5. Primera serie experimental ........................................................................ 33
4.2.5.1. Tamaño y conteo de muestra .............................................................. 35
4.2.5.2. Cálculos Poblacionales ......................................................................... 36
4.2.6. Segunda serie experimental .................................................................... 39
4.2.6.1. Conteo de muestras .............................................................................. 41
V. RESULTADOS ..................................................................................................... 43
5.2. PRIMERA SERIE EXPERIMENTAL ........................................................ 45
5.2.1. Parámetros de crecimiento de microalgas en los tres medios de cultivo 45
5.2.2. Análisis estadístico del crecimiento de diatomeas .................................... 57
5.3. SEGUNDA SERIE EXPERIMENTAL........................................................ 62
5.3.1. Parámetros de adhesión de diatomeas al sustrato. .................................. 62
5.3.2. Análisis estadístico para la fijación de diatomeas .................................... 65
VI. DISCUSIÓN ........................................................................................................ 70
VII. CONCLUSIONES ............................................................................................. 74
VIII. RECOMENDACIONES ................................................................................. 76
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 77
X. ANEXOS ............................................................................................................... 86
 ÍNDICE DE GRÁFICOS

Gráfico 1 Diagrama general de producción de microalgas ................................. 10

Gráfico 2 Medios de cultivo .................................................................................... 12
Gráfico 3 Curva de crecimiento ............................................................................. 18
Gráfico 4 Reglilla de la cámara de Neubauer de 9 mm2 ..................................... 36
Gráfico 5 Diseño de la segunda serie experimental.............................................. 40
Gráfico 6 Medidas del contenedor de vidrio y láminas de policarbonato ......... 41
Gráfico 7 Curva de crecimiento de Navicula sp1. en los tres medios evaluados47
Gráfico 8 Curva de crecimiento de Nitzschia sp1. en los tres medios evaluados
..................................................................................................................................... 50
Gráfico 9 Curva de crecimiento de Navicula sp2. en los tres medios evaluados53
Gráfico 10 Curva de crecimiento de Nitzschia sp2. en los tres medios evaluados
..................................................................................................................................... 56
Gráfico 11 Curva de fijación de diatomeas en la formación de biopelículas
multiespecíficas en los tres medios evaluados ......................................................... 64
 ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1 Lista de Materiales .................................................................................... 23

Tabla 2 Volúmenes utilizados en el aumento progresivo de los cultivo (Batch) 31
Tabla 3 Diseño de la primera serie experimental ................................................. 34
Tabla 5 Parámetros de crecimiento de Navicula sp1. en medio Guillard f/2..... 45
Tabla 6 Parámetros de crecimiento de Navicula sp1. en medio foliar ............... 46
Tabla 7 Parámetros de crecimiento de Navicula sp1. en medio humus ............. 46
Tabla 8 Parámetros de crecimiento de Nitzschia sp1. en medio Guillard f/2 .... 48
Tabla 9 Parámetros de crecimiento de Nitzschia sp1. en medio foliar ............... 49
Tabla 10 Parámetros de crecimiento de Nitzschia sp1. en medio humus ........... 49
Tabla 11 Parámetros de crecimiento de Navicula sp2. en medio Guillard f/2... 51
Tabla 12 Parámetros de crecimiento de Navicula sp2. en medio foliar ............. 51
Tabla 13 Parámetros de crecimiento de Navicula sp2. en medio humus ........... 52
Tabla 14 Parámetros de crecimiento de Nitzschia sp2. en medio Guillard f/2 .. 54
Tabla 15 Parámetros de crecimiento de Nitzschia sp2. en medio foliar ............. 54
Tabla 16 Parámetros de crecimiento de Nitzschia sp2. en medio humus ........... 55
Tabla 17 Resumen de densidades finales............................................................... 57
Tabla 18 Anova para Log10 (Densidad final) por medio de cultivo .................. 58
Tabla 19 Medias por mínimos cuadrados para Log10 (Densidad final) con
intervalos de confianza del 95 % ............................................................................. 59
Tabla 20 Pruebas de múltiple rangos para Log10 (Densidad final) por cada
medio de cultivo ......................................................................................................... 60
Tabla 21 Diferencias estimadas entre cada par de medias .................................. 61
Tabla 22 Densidad de diatomeas fijadas en la formación de biopelículas
multiespecíficas en los tres medios de cultivo evaluados. ...................................... 63
Tabla 23 Resumen de densidades finales de fijación ........................................... 65
Tabla 24 Anova para Log10 (Densidad final) por medio de cultivo .................. 66
Tabla 25 Tabla de medias para Log10 (Densidad final) por medio de cultivo
con intervalos de confianza del 95 % ...................................................................... 67
Tabla 26 Pruebas de múltiple rangos para Log10 (Densidad final) por medio de
cultivo ......................................................................................................................... 68
Tabla 27 Diferencias estimadas entre cada par de medias .................................. 69
 ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo 1 Limpieza y esterilización de materiales .................................................. 86

Anexo 2 Acondicionamiento del cepario ............................................................... 87
Anexo 3 Preparación de reactivos ......................................................................... 87
Anexo 4 Elaboración del sistema de captación ..................................................... 88
Anexo 5 Colecta de muestras ................................................................................. 88
Anexo 6 Preparación de medio Guillard en placas .............................................. 89
Anexo 7 Mantenimiento de cepas .......................................................................... 89
Anexo 8 Diagrama de Flujo de la producción de microalgas (SISTEMA
BATCH) ..................................................................................................................... 90
Anexo 9 Formulación del medio Guillard f/2 ....................................................... 92
Anexo 10 Preparación de medio Guillard f/2 ....................................................... 94
Anexo 11 Formulación del fertilizante inorgánico ............................................... 95
Anexo 12 Formulación del fertilizante orgánico .................................................. 96
Anexo 13 Preparación del medio con fertilizante orgánico ................................. 97
Anexo 14 Cultivo experimental .............................................................................. 98
Anexo 15 Dispersión de biopelícula en cultivo ..................................................... 99
Anexo 16 Toma de muestra de las unidades experimentales ............................ 100
Anexo 17 Conteo de células .................................................................................. 101
Anexo 18 Fichas de registro de crecimiento diatomeas ..................................... 102
Anexo 19 Ficha de registro de fijación de diatomeas ......................................... 103
Anexo 20 Acondicionamiento de acuario y láminas de policarbonato para la
fijación de diatomeas............................................................................................... 104
Anexo 21 Conteo de diatomeas fijadas en láminas de policarbonato ............... 105
Anexo 22 Limpieza de diatomeas......................................................................... 106
Anexo 23 Diatomeas bentónicas marinas ............................................................ 107
Anexo 24 Diatomeas bentónicas marinas para la producción de Hialotis
rufescens en el Centro de Acuicultura Morro Sama - Fondepes ........................ 108
 RESUMEN

Se realizó el aislamiento de diatomeas bentónicas marinas de origen local en el

Centro de Acuicultura Morro-Sama en la Región de Tacna, durante la estación de
otoño – invierno del 2015, las cuales fueron colectadas mediante un sistema de
captación, se seleccionó cuatro cepas de diatomeas bentónicas nativas para los
cultivos experimentales: Navícula sp1, Nitzschia sp1, Navicula sp2, Nitzschia sp2.
La primera serie experimental consistió en desarrollar experimentalmente a las
diatomeas bentónicas marinas en monocultivos axénicos estáticos de 800mL frente a
3 medios de cultivo: Medio Guillard f/2 (blanco), Nitrofoska foliar (nutriente
inorgánico) y Humus de Lombriz Eisenia foetida (nutriente orgánico) para determinar
el efecto en su productividad en condiciones controladas de temperatura (22 °C ± 1),
salinidad 35 ups, fotoperiodo 24 h, iluminación 4000 lux, y aireación de 15,8 ml.s-1,
se determinó los parámetros poblacionales en con el fin de obtener cepas
caracterizadas. El medio elaborado a base de humus de lombriz fue el mejor en el
crecimiento de microalgas produciendo una mayor densidad celular.
La segunda serie experimental consistió en determinar el efecto de los medios de
cultivos en la formación de biopelículas multiespecíficas de diatomeas bentónicas en
láminas de policarbonato, provenientes de los cultivos monoespecíficos desarrollados
en los 3 medios de cultivo evaluados. Los medios elaborados a base de humus de
lombriz y nutriente foliar presentaron mejores resultados en la adhesión al sustrato.

1
 ABREVIATURAS

MG: Medio Guillard f/2

NF: Nutriente Foliar

HL: Humus de Lombriz

ups.: Unidades prácticas de salinidad

D: Densidad celular

μ: Tasa de crecimiento específico

TD: Tiempo de duplicación

K: Divisiones por día

P.D.: Producción diaria

V.P.: Variación porcentual de densidad

2
 GLOSARIO

Diatomeas: Clase de algas unicelulares de caparazón silíceo formado por dos valvas

de tamaño desigual.

Cepario de microalgas: Lugar donde se almacenan una gran mayoría de especies de

microalgas.

Medio de cultivo: Sustrato o Solución de nutrientes que permite el desarrollo de

microorganismos

Fotoperíodo: Tiempo de exposición a la luz

Sustrato: Superficie en la que un organismo vive, puede incluir materiales bióticos o

abióticos.

Biopelícula microalgal: Organizaciones microalgales que se adhieren a las

superficies gracias a la secreción de exopolímeros.

Biopelícula microalgal monoespecífica: biopelícula compuesta por una sola especie

de microalga.

Biopelícula microalgal multiespecífica: biopelícula compuesta por una mezcla de

distintas microalgas.

Láminas de Policarbonato: Es un es un termoplástico con buena resistencia al

impacto, resistencia al calor y transparencia óptica.

Cultivo axénico: Cultivo de una especie de organismo sin contaminantes.

3
 I. INTRODUCCIÓN

El medio marino presenta una amplia variedad microbiológica, algunas de ellas

conocidas y otras más totalmente desconocidas. De las especies conocidas, se

encuentra un reducido grupo de microalgas marinas utilizadas como alimento vivo en

la acuicultura para todos los estadios de crecimiento de los moluscos, para los

estadios larvales de crustáceos, para algunas especies de peces y en la producción de

zooplancton; por ello es de gran interés, producir alimento con el perfil nutricional

adecuado para los organismos de explotación, que permita al mismo tiempo mantener

la calidad del agua en las unidades de cultivo, asimismo, la importancia del cultivo de

microalgas radica en su papel como productores primarios de la cadena trófica, y por

lo tanto, se constituyen en las primeras formadoras de materia orgánica y son de fácil

captura y digestión por multitud de organismos que se alimentan en forma directa o

indirecta del fitoplancton.

En la actualidad se consideran a las microalgas bentónicas, con especial

referencia a las diatomeas, son un grupo poco estudiado y muy rico en diversas

formas, géneros y especies, con un alto potencial para ser usado como fuente de

alimento vivo para los organismos que se cultivan con interés comercial y que

5
presenten hábitos bentónicos al menos en alguna fase de su ciclo de vida; La

producción de microalgas en muchos granjas y laboratorios comerciales son muy

costosos y es por ello que se requieren alternativas económicas para la producción de

microalgas.

Con el objetivo de optimizar el cultivo de especies marinas en nuestro país, se ha

desarrollado el presente experimento con la posibilidad de incluir microalgas

bentónicas autóctonas como suplemento alimentario de animales acuáticos con

potencial acuícola. El rango de la aplicación del presente trabajo es nacional.

6
 II. OBJETIVOS

1.1. Objetivo general

Determinar el efecto de los medios de cultivo elaborados con fertilizantes

orgánicos e inorgánicos en el crecimiento y fijación de diatomeas bentónicas

marinas.

1.2. Objetivos específicos

 Aislar e Identificar las diatomeas bentónicas para el trabajo experimental.

 Determinar la curva de crecimiento de cada especie de diatomea.

 Establecer los parámetros poblacionales de crecimiento de cada especie de

diatomea.

 Determinar la densidad de fijación de biopelículas multiespecíficas.

7
 III. MARCO TEÓRICO

3.1. MICROALGAS EN LA ACUICULTURA

3.1.1. Microalgas

Las microalgas son algas unicelulares, eucariotas, generalmente, son células

aisladas, pero pueden formar colonias o cadenas más o menos largas e incluso, tener

un aspecto dendroide. El tamaño puede variar entre 2 micras y 2 milímetros (en las

especies marinas generalmente entre 50 - 500 micras). El número de especies

aceptadas es igualmente muy variable, algunos autores establecen 10 000 – 12 000

(Hasle & Syvertsen, 1997), otros estiman aproximadamente 100 000 (Round &

Crawford, 1989).

Las microalgas representan un porcentaje muy notable del fitoplancton de los

océanos y aguas dulces, que es donde se lleva a cabo no menos del 50 % del total de

la fotosíntesis que se realiza en nuestro planeta. Son muy importantes especialmente

las diatomeas, dinoflagelados y clorofitas unicelulares porque son los principales

productores de alimentos del ecosistema marino, que es donde se encuentra la

principal reserva de alimentos y fuente renovadora del oxígeno de la atmósfera

8
terrestre (Gama, 2004).

3.1.2. Cultivo de microalgas para la acuicultura

Las microalgas juegan un papel preponderante en el desarrollo de la acuacultura,

ya que constituyen el primer alimento vivo que soporta el crecimiento de las fases

tempranas de vida de casi todos los organismos cultivados (Brown et al., 1989,

1997), tales como moluscos (durante todas las etapas de su vida), crustáceos y peces

en las primeras etapas de su desarrollo. Las microalgas son empleadas también para

producir cantidades masivas de zooplancton (rotíferos, copépodos, camarones,

artemias y otros) los cuales a su vez sirven de alimento a larvas y etapas juveniles de

peces y crustáceos (Coutteau, 1996).

La selección de la microalga depende de características como: tamaño, calidad

bioquímica, mayor crecimiento con altas densidades (Becker, 2004). Se ha

comprobado que las microalgas verdes son ricas en carbohidratos y que las diatomeas

contienen más lípidos, los cuales son aprovechados por los organismos en cultivo

(Medina et al., 2012).

Según la FAO (2011) las microalgas más utilizadas en los laboratorios de

9
acuicultura son Phaeodactylum (diatomea), Skeletonema (diatomea), Dunaliella

(clorofícea), Chlorella (Cloroficea), Tetraselmis (clorofícea), Monochysis

(Crisoficea) e Isochysis (crisofícea).

Gráfico 1 Diagrama general de producción de microalgas

Fuente: Medina et al., 2012

10
3.2. MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo utilizados comúnmente para el cultivo de microalgas

tienden a ser muy costosos y laboriosos, lo cual evidencia la necesidad de evaluar

medios nutritivos más económicos, entre los cuales están los fertilizantes agrícolas

comerciales (Fulks, 1991). La producción de microalgas en grandes volúmenes es

una de las actividades que ocupan el mayor porcentaje de los gastos de operación en

los laboratorios de los larvicultores, llegando a constituir más del 30 % - 35 % del

costo total de producción de las especies cultivadas (Lango-Alemán, 1999).

Se han desarrollado diferentes medios para el cultivo de microalgas que van desde

las fórmulas para enriquecer el agua de mar natural, hasta el uso de medios

artificiales, la selección de un medio químico adecuado es el primer paso y el más

importante para el éxito del cultivo (Paniagua-Michell et al., 1989).

La importancia de seleccionar el medio de cultivo para producir determinada

especie de microalga radica en que el uso de un sustrato adecuado puede optimizar el

valor nutricional de estos (Nieves-Soto et al., 1994).

11
3.2.1. Medio Guillard f/2

El medio Guillard f/2 es mundialmente utilizado por ser un medio completo e

idóneo para el mantenimiento de las cepas en el laboratorio, e incluso para la

producción en grandes volúmenes (Almaguer et al. 2004), sin embargo, se han

ensayado diferentes variantes de este medio y otros alternativos cuando ya se trata de

cultivos masivos, con vista a abaratar los costos de producción (Leal, et al., 2010).

MEDIOS DE CULTIVO

Medios definidos o artificiales Medios no definidos

químicamente de un
cultivo

Medios Medios
naturales enriquecidos

Extracto Medios naturales a los Composición

de suelo que se les agregan sales química conocida
minerales

Gráfico 2 Medios de cultivo

(Fuente: Alveal, 1995)

12
3.2.2. Fertilizantes inorgánicos

Como una alternativa económica y viable para reducir los altos costos en la

producción de microalgas en laboratorios comerciales, autores como Peraza (1997) y

González (1999), sugieren la utilización de fertilizantes agrícolas.

Estudios previos han demostrado que con el uso de fertilizantes agrícolas se

obtiene un mayor crecimiento, una similar composición proximal y un menor costo

que con aquellos medios que son específicos para el cultivo de microalgas como el

f/2 (Valenzuela et al., 2005).

Los ensayos con fertilizantes agrícolas han permitido obtener altas cantidades de

biomasa microalgas de una adecuada calidad nutricional. Las formulaciones basadas

en fertilizantes agrícolas han sido ensayadas en especies planctónicas y más

recientemente en especies bentónicas (Leal et al., 2010).

Según BASF (1978) en Brito et. al., (2006), menciona que Nitrofoska Foliar

presenta mayor solubilidad que los demás fertilizantes foliares, proporcionándole a

los vegetales los nutrientes necesarios para su desarrollo. Los nutrientes, en este

fertilizante se encuentra en forma quelatizado, lo que permite una absorción rápida y

13
directa por las microalgas.

3.2.3. Fertilizantes orgánicos

Los fertilizantes orgánicos son de composición química variable, al igual que su

disponibilidad y algunos tienen posibilidades de contaminantes en su contenido, se

han desarrollado diversos estudios con el propósito de evaluarlos como medios de

cultivo de microalgas marinas producidas en laboratorios. Chebil y Yamasaki

(2000).

Chebil y Yamasaki (2000) evaluaron la excreta de gallina y la harina de tiburón

para la producción masiva de la microalga Nannochloropsis sp., Muñoz et al.,

(2009), evaluaron la eficiencia del humus de lombriz y la equinaza, sobre el

crecimiento y contenido proteico de Chlorella vulgaris.

Guerra (2011) utilizó el extracto líquido de humus de lombriz roja californiana

Eisenia foetida como un nuevo medio alternativo de cultivo de las microalgas

Tetraselmis tetrathele y Chaetoceros muelleri.

Los biofertilizantes líquidos como el vermicompost, fabricado a base de humus

14
líquidos (té de humus) de lombriz de tierra fueron recomendados por Ruiz. (2011).

Según Reinés, et al., (2006) mencionado por Guerra (2011), el humus es un

estado de descomposición de la materia orgánica, es insoluble en agua. Es una fuente

importante de nutrientes. Entre los componentes más esenciales del humus de lombriz

están el nitrógeno, fósforo, potasio y el calcio. Esta composición de los nutrientes es

altamente variable, dependiendo del tipo y proporción del material presente en el

sustrato que se utilice como alimento para las lombrices, así como los factores

abióticos, fundamentalmente la temperatura, pH, grado de humedad que inciden en la

calidad del humus.

3.3. DIATOMEAS BENTÓNICAS

Las diatomeas en general son microalgas que se encuentran en todos los

ambientes y tienen una elevada tasa de reproducción si las condiciones son

adecuadas. La intensa velocidad de división que puede alcanzarse cuando las

condiciones son óptimas llega a producir densas floraciones. La presencia de sílice es

una necesidad absoluta para la división celular de las diatomeas, de modo que el

número de células se mantiene proporcional a la cantidad de dióxido de silicio

existente, siempre y cuando los demás nutrientes no sean limitantes (Sabbe et al.,

2004).

15
 Estas diatomeas segregan al exterior de su frústulo un mucílago péctico, sustancia

viscosa con función protectora. Este les permite agruparse en colonias formando una

película después de la división o estar fijadas aisladamente. (Kawamura & Hirano,

1992) y presentan dos tipos de reproducción, asexual por bipartición y sexual. Las

diatomeas son diplontes y se multiplican vegetativamente por división celular

mitótica durante la mayor parte del ciclo de vida (Sabbe et al., 2004).

A nivel mundial el estudio de las diatomeas bentónicas marinas ha sido limitado,

debido principalmente a las dificultades inherentes a la identificación de las especies.

Sin embargo, este grupo de microalgas es uno de los más conspicuos, abundantes

(Hernández & Siqueiros, 2008), con un alto potencial para ser usado como fuente

de alimento vivo para los organismos que se cultivan con interés comercial y que

presenten hábitos bentónicos, al menos, en alguna fase de su ciclo de vida. Las

especies más estudiadas están representadas por los géneros Navicula y Nitzschia,

seguidas de Amphora (Siqueiros, 1994). Además, según Griffith et al. (1992), el

valor nutricional más importante de estas diatomeas es el alto contenido de lípidos

que poseen.

16
3.3.1. Formación de Biopelículas

Las diatomeas bentónicas en cultivo tienen la capacidad de colonizar toda la

superficie del reservorio donde habiten y forman biopelículas, que al aumentar su

concentración, crean pequeños grumos de células que se desprenden y suspenden en

el agua y constituyen partículas de diferentes tamaños, de las que se pueden alimentar

algunos organismos. (Leal, 2012).

No todas las especies tienen la misma adhesión al sustrato o entre ellas, cuando

forman colonias (Kawamura & Tanaki, 2000).

3.4. CRECIMIENTO POBLACIONAL

Según Arredondo & Voltolina (2007) mencionan que una fase típica de

crecimiento posee 7 fases:

A. Fase lag: Fase de adaptación de la célula

B. Fase de aceleramiento: Fase de ligero incremento en la concentración

celular

17
C. Fase exponencial: Fase de Incremento de la división celular y

crecimiento de la biomasa.

D. Fase de desaceleración: Fase donde disminuye la división celular.

E. Fase estacionaria: Fase de Crecimiento neto de la población, las

condiciones de cultivo son limitantes y la natalidad es igual a la mortalidad.

F. Fase de muerte: Fase donde la tasa de mortalidad es superior a la de

natalidad, por lo cual la densidad celular disminuye.

Gráfico 3 Curva de crecimiento

18
 1 fase lag; 2 fase de aceleramiento; 3 fase exponencial; 4 fase de
desaceleración del crecimiento; 5 fase estacionaria; 6 fase de muerte.
(Fuente: Arredondo y Voltolina, 2007)

3.5. PARÁMETROS DE CRECIMIENTO

Al igual que cualquier otro organismo vivo, las condiciones físicas tienen gran

influencia en el crecimiento de la microalga. Cada especie presenta un particular

intervalo de temperatura, intensidad de luz, preferencias espectrales, salinidad,

bióxido de carbono y oxígeno para la producción de un máximo crecimiento.

Adicionalmente, podemos mencionar que más que la influencia de un solo parámetro

es el conjunto de parámetros lo que da lugar a una determinada respuesta en el

crecimiento de las microalgas (Cañizares et al., 1994).

A. Iluminación

Con respecto a la luz, las microalgas son fotoautótrofas encargadas de

convertir la energía luminosa en metabólica por medio de la fotosíntesis y sus

periodos de exposición a ésta. Los periodos de iluminación pueden ser

continuos (mediante luz artificial), discontinuos (periodos de iluminación

alternados con periodos de oscuridad, también con luz artificial) o en el ciclo

natural día y noche (Richmond, 1986).

19
 En la mayoría de microalgas el crecimiento se lleva a cabo durante el

periodo de luz debido a que a través de la fotosíntesis generan material orgánico

y energía suficiente para este proceso, mientras que la división celular se da en

el periodo de oscuridad, sin embargo, en las diatomeas la división celular

también se realiza en luz continua (López et al., 2009)

B. Aireación

La aireación, además de proporcionar oxígeno, asegura la distribución

homogénea de las células y los nutrientes dentro del cultivo, dejándolos

disponible para su mejor aprovechamiento, mejora la distribución de la luz

entre las células asegurando que permanezcan fotosintéticamente activas,

evitando que se sedimenten, y previene una estratificación térmica (Richmond,

1986). Además, afirma que este elemento es de gran importancia en las

diferentes especies, sin embargo, en especies bentónicas se mejora la tasa de

crecimiento debido a que se favorece la permanencia de células sin formar

colonias, lo que puede retardar el crecimiento en especies bentónicas.

C. Temperatura

Generalmente, la temperatura óptima es superior a la temperatura máxima a

la cual se encuentra la microalga en el medio natural (Abalde et al., 1995) y

20
varía según la especie (Laing & Ayala, 1990) y su hábitat (Adenan et al.,

2013).

D. Salinidad

Las microalgas tienen un rango de tolerancia muy alto a la concentración de

sales, lo cual no implica que crezcan bien a las diferentes salinidades (Brown y

col., 1996), además la salinidad óptima para una microalga dependerá de la

especie. Generalmente, para el cultivo en interiores, este parámetro no es

controlado y se maneja la salinidad presente en el agua de mar. En un cultivo a

exterior la salinidad se convierte en el parámetro control en el crecimiento de la

microalga (Abalde et al., 1995).

E. Nutrientes

Existen los macro y micronutrientes específicos, y deben tener un balance

en la proporción suministrada. Su deficiencia, invariablemente se manifiesta ya

sea como un descenso en el crecimiento o hasta la detención del mismo (Hoff y

Snell, 2001), para proporcionar estos nutrientes se debe seleccionar el medio de

cultivo que se va a utilizar. El agua marina es un medio de cultivo ideal para el

crecimiento de las microalgas marinas; sin embargo, es necesario enriquecerla

con nutrientes. Los medios de cultivo son muy diversos, pero todos coinciden

21
en una fuente principal de nitrógeno, fósforo y una mezcla de metales traza

como soluciones quelantes y vitaminas (Provasoli et al., 1957; Stein, 1973). El

medio F/2 (Guillard, 1975) es considerado como el medio que reúne los

requerimientos de nutrientes para las diversas especies de fitoplancton marino,

por lo que es ampliamente utilizado y considerado como el medio estándar.

22
 IV. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1. MATERIALES

Tabla 1 Lista de materiales

MATERIAL MATERIALES DE
REACTIVOS
BIOLÓGICO LABORATORIO
NaCO3 Pipetas graduadas de 1 mL,
NaH2P4 Diatomeas bentónicas 5 mL y 10 mL.
NaSiO3 Tubos de Ensayo de 15mL
CuSO4 EQUIPOS DE Matraces de 100 mL, 250
ZnSO4 LABORATORIO mL, 500 mL, 1000 mL, 2 L
CoCl2 Autoclave y 5 L.
MnCl2 Microscopio Compuesto Beakers de 100 mL y 500
Na2 Microscopio Invertido mL.
MoO4 Microscopio Estereoscopio Matraz Erlenmeyer de
FeCl3 Microscopio Electrónico 1000mL.
Na2EDTA Bomba de vacío Placas petri
Vitamina B12 Destilador Láminas portaobjetos
Agar Agar pH - metro Láminas cubreobjetos
Penicilina procaínica Plancha calentadora Pipetas pasteur
Eritromicina G Blower Frascos de vidrio
Ácido Clorhídrico Termómetro digital Cámara de Neubauer
H2O2 30 Vol. Refrigeradora Mechero de Alcohol
Agua destilada Refractómetro Encendedor
Ácido muriático Centrífuga Pinzas de metal
Humus de Lombriz Estufa Papel filtro 0.45 μm y 0.2
Nitrofoska Lucómetro μm
Tiosulfato Gradillas
Hipoclorito de Sodio Asa de siembra
Alcohol de 70° y 96° Asa de drigalski
Tubos de centrífuga
Bagueta de vidrio
Contómetro manual
Probeta de bouyoucos
Fuente: Elaboración propia

23
4.1.1. Limpieza y esterilización de materiales

La limpieza de los materiales de vidrio como: tubos de ensayo, probetas, pipetas,

matraces, beakers, etc. se lavaron con agua y detergente, se desinfectaron con ácido

muriático, sumergiéndolos en él por 10 minutos aproximadamente, se enjuagaron

constantemente en agua dulce y se secaron colocándolos a la estufa durante 30

minutos a 100 °C, se dejaron a enfriar, luego se cubrieron con papel kraft y pabilo, y

se esterilizó en la estufa durante 90 minutos a 180 °C.

Los materiales de plástico como son las botellas, jarras, baldes, bombonas, etc.

se lavaron con agua y detergente y desinfectaron con lejía, se enjuagaron

vigorosamente con agua dulce y se secaron en un escurridor de plástico.

4.2. MÉTODOS:

Los experimentos del cultivo de diatomeas fueron realizados en el Laboratorio

de Alimento vivo y en el Cepario de Microalgas del Fondo Nacional de Desarrollo

Pesquero (FONDEPES), Tacna, durante los meses de abril a octubre de 2015.

Pruebas auxiliares se realizaron en los Laboratorios de Química Orgánica,

Fisicoquímica y Biología de la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional Jorge

Basadre Grohmann (UNJBG), Tacna, durante los meses de diciembre y enero.

24
4.2.1. Captación de Diatomeas

4.2.1.1. Elaboración de un sistema de captación

Las muestras de diatomeas bentónicas fueron obtenidas mediante un

sistema de captación elaborada con láminas de fijación de policarbonato. El

sistema consistió en el acondicionamiento de un tanque de fibra de vidrio, con

suministro de agua de mar en forma de lluvia mediante tuberías en la parte

superior dispuestas horizontalmente con circuito abierto; en cuyo interior

estuvieron distribuidas láminas de policarbonato donde se realizó la fijación de

las células.

4.2.1.2. Colecta de muestras

Las láminas de policarbonato con biopelículas se cosecharon a las 2

semanas. Con la ayuda de un cepillo dental estéril se procedió a desprender las

células fijadas en la superficie de las láminas, en un vaso precipitado estéril.

Las muestras fueron cerradas para evitar alteraciones en la muestra y fueron

transportadas inmediatamente al Laboratorio de Microalgas.

Se observaron las muestras en fresco con la ayuda de un microscopio

compuesto. La observación se realizó en cuestión de horas.

25
4.2.2. Aislamiento e identificación de Diatomeas

El aislamiento se realizó por el método de siembra en placa de agar, se utilizó la

metodología propuesta por Leal (2007) con Guillard f/2 (Guillard, 1975).

4.2.2.1. Preparación de medio Guillard f/2 en placas

Para la elaboración del medio Guillard f/2 en placa se utilizó agua filtrada a

0,2 um y esterilizada en autoclave; se añadió los componentes del medio

Guillard: Nitratos, Fosfatos, Tris, Metales y Silicato en proporción de 1 ml/L de

medio de cultivo, se añadió agar-agar a razón de 15 g/L, se homogenizó el

medio y se llevó a la autoclave para ser esterilizado a 125 °C y 1 bar de presión

por 30 minutos.

Luego de la esterilización se dejó enfriar a temperatura ambiente hasta

llegar a 50 °C aproximadamente, se agregó la solución de Vitaminas (1 mL/L),

se homogenizó y se procedió al llenado en placas estériles (20 mL/placa).

4.2.2.2. Siembra en placa

La siembra se realizó en un ambiente aséptico cerca de un mechero. Con la

ayuda de una pipeta Pasteur se tomó una alícuota de la muestra, se colocó 1

26
gota en la placa con agar, con un asa de drigalski estéril se procedió a dispersar

la gota sobre el medio Guillard f/2 solidificado, y finalmente, se cerraron las

placas.

Las placas fueron selladas con cinta de parafina 3M, se rotularon colocando

la muestra y fecha, y se llevaron a la cámara de frio (Cepario de Microalgas),

donde se desarrollaron a temperatura e iluminación controlada hasta la

diferenciación de colonias. Al cabo de una semana aproximadamente, se

efectuó la extracción de colonias de las placas frente a un mechero de alcohol,

las cuales fueron resembradas con un aza de siembra estéril en placas con

Guillard f/2, la finalidad fue obtener cultivos monoespecíficos. Se realizó tres

resiembras en estricta asepsia acompañadas de la observación de muestras en el

microscopio compuesto.

4.2.2.3. Transferencia de muestra en placa a tubo de ensayo

En estricta asepsia, con un aza de siembra estéril se traspasó una azada de

muestra de las colonias seleccionadas a tubos con medio Guillard f/2, se

rotularon los tubos y fueron llevadas al cepario de microalgas y mantenidas a

temperatura (>23 °C) y fotoperiodo (24 h).

27
4.2.2.4. Tratamiento con antibiótico

Con el fin de obtener cepas axénicas, se realizó un tratamiento con

antibiótico en las cepas preseleccionadas en un volumen de 10 ml, El

tratamiento consistió en baños con antibiótico en un período de 8 horas con una

mezcla de penicilina G (100 ppm) y eritromicina (50 ppm) (Sánchez, 2002).

Con el fin de eliminar el antibiótico se realizaron diluciones seriadas en

Medio Guillard f/2 en tubos hasta tres veces.

4.2.2.5. Selección de las Diatomeas

Las cepas de las diatomeas fueron preseleccionadas basadas en su

morfología y la discriminación de especies ya obtenidas, una segunda

preselección estuvo basada en la forma de crecimiento (bentónica o pelágica) y

tasa de crecimiento en cultivos preliminares. Las diatomeas seleccionadas

fueron codificadas como D1, D2, D3 y D4.

4.2.2.6. Identificación de las Diatomeas Bentónicas

A. Medición en fresco

Para la caracterización de las células se observaron detalladamente al

28
microscopio compuesto, y se efectuaron mediciones de 30 células con

micrómetro ocular determinándose la longitud promedio para cada

especie en la fase exponencial del cultivo.

B. Pre-tratamiento de Diatomeas

Las muestras de diatomeas seleccionadas fueron lavadas con una

mezcla de ácido concentrado. La mezcla fue elaborada con H2SO4 y

HNO3 (1:2), dicha mezcla se agregó a la muestra de diatomea (1:1). Se

utilizó 5 mL de muestra en matraces de 50 mL.

La adición de la mezcla de ácido fue gradual, los matraces con muestra de

diatomea, se mantuvieron a 90 °C durante 3 horas, cubiertas con lunas de

reloj.

Con el fin de eliminar los restos de ácido, las muestras de diatomeas

se centrifugaron en 4 series a 4000 rpm durante 4 minutos con recambios

de agua destilada.

Con la ayuda de una pipeta Pasteur, se cogió una muestra de cada

diatomea y se colocó en láminas portaobjetos limpias, además se adicionó

una gota de alcohol y otra de agua a la lámina. Se dejó secar (24 h) a

29
 temperatura ambiente, se añadió una pequeña gota de un bálsamo

elaborado a base de totuelo y tecnopor, y se cubrió con un cubreobjetos,

finalmente, las láminas se colocaron a 60 °C durante 30 minutos a fin de

dispersar el bálsamo. Una vez fría las muestras lavadas y fijadas, fueron

observadas al microscopio compuesto y se realizó la medición de 50

células de cada diatomea con el micrómetro ocular determinándose la

longitud promedio para cada especie en la fase exponencial del cultivo.

Las muestras fueron identificadas mediante manuales de identificación de

diatomeas, además fueron enviadas a especialistas en taxonomía para la

identificación correspondiente.

El mantenimiento periódico de las cepas purificadas de diatomeas consistió

en la inoculación por triplicado en tubos de ensayo con medio f/2,

manteniéndose en la cámara de frio con temperatura (>23 °C) e iluminación (24

h) controladas.

4.2.3. Aumento progresivo de volumen.

Para el desarrollo de los cultivos se utilizó el método de aumento progresivo de

30
volumen (Sistema Batch), estableciéndose tres volúmenes de crecimiento (10 mL,

200 mL y 800 mL). El trabajo experimental se desarrolló en monocultivos cerrados y

estáticos en volúmenes de 800mL. El paso de un volumen a otro se realizó en la fase

de crecimiento exponencial de estos cultivos para asegurar que las diatomeas estén en

un estado fisiológico óptimo. En la Tabla 4 se especifican las cantidades volumétricas

que se utilizaron en cada paso del experimento.

Tabla 2 Volúmenes utilizados en el aumento progresivo de los cultivo (Batch)

VOLUMEN DE MEDIO
VOLUMEN INÓCULO VOLUMEN TOTAL
CULTIVO

1 mL 9 mL 10 mL

10 mL 190 mL 200 mL

200 mL 600 mL 800 mL

Fuente: Elaboración propia

La salinidad del agua para todos los volúmenes fue de 35 ups. Los cultivos se

mantuvieron en condiciones controladas con, temperatura (22 °C ± 1), iluminación

4000 lux, fotoperiodo de 24 h y aireación de 15,8 ml.s-1. El pH fue tomado al inicio y

al final de la prueba.

31
4.2.4. Comparación de los medios de cultivo

Se aplicó tres tratamientos que consistió en enfrentar dos medios de cultivos

elaborados con diferentes fertilizantes: fertilizante agrícola (Nitrofoska) y extracto de

líquido del humus de lombriz Eisenia foetida, ambos medios frente a un medio

patrón: medio Guillard f/2 (Guillard, 1975).

4.2.4.1. Medio Guillard f/2

La preparación del medio Guillard F/2 consistió en agregar nitrato, fosfato,

solución de metales, solución de vitaminas y silicato a razón de 1 mL/L de

medio de agua de mar UV estéril. El contenido de micronutrientes y

macronutrientes del medio Guillard f/2 se especifica en el ANEXO 9.

4.2.4.2. Medio con fertilizante inorgánico

La elaboración del medio a base de fertilizante agrícola se realizó con

nitrofoska foliar. Se modificó el proceder de Brito (2006), se utilizó agua de

mar UV, filtrada y esterilizada, y se adicionó el Fertilizante de Grado Técnico

(0,4 mL/L) para la elaboración del medio Inorgánico.

4.2.4.3. Medio con fertilizante orgánico

La elaboración del medio con fertilizante orgánico se realizó con el extracto

32
 líquido del humus de lombriz Eisenia foetida, según el procedimiento

mencionado por Guerra et. al., (2012).

Para la elaboración de dicho extracto, se pesó el humus de lombriz (200

g/L) en una Balanza analítica de 0,001 g, se añadió agua de mar microfiltrada

0,2 μm y esterilizada, se homogenizó y colocó en un matraz para su

esterilización en autoclave. Terminado el proceso, se dejó reposar la mezcla

durante 24 horas para dejar sedimentar el material sólido, se separó el

sobrenadante con filtros de membrana de 10 μm mediante una bomba de vacío.

Para la elaboración del medio Se empleó la proporción de 200 mL de

extracto líquido de humus por cada 1 L de Agua de mar microfiltrada.

Los medios de cultivo antes de ser utilizados fueron previamente

adicionados con solución TRIS (1 mL/L) para evitar precipitados y

esterilizados en autoclave.

4.2.5. Primera serie experimental

Esta serie experimental se realizó con el fin de determinar el efecto de los tres

33
medios de cultivo en el crecimiento de las cuatro diatomeas bentónicas marinas.

El experimento realizado se ajustó a un Diseño en Bloques Completos al Azar

con cuatro bloques (diatomeas), tres tratamientos (medios de cultivo) y tres

repeticiones por tratamiento. Cada unidad experimental contenía 800 mL de cultivo.

Experimento

T0 (PATRÓN): Diatomeas cultivadas en medio Guillard f/2

T1 : Diatomeas cultivadas con medio agrícola (Nitrofoska)

T2 : Diatomeas cultivadas con medio humus de lombriz

Tabla 3 Diseño de la primera serie experimental

Medio Guillard f/2 Medio agrícola Medio humus

D1

D2

D3

D4

Fuente: Elaboración propia

La distribución de las unidades experimentales fue aleatorizada con la ayuda del

34
programa STATGRAPHIC Centurión XVI.I.

El crecimiento microalgal fue evaluado durante diez días, para ello se realizó

recuentos de células diariamente (24 h).

4.2.5.1. Tamaño y conteo de muestra

Antes de tomar la muestra, se homogenizó el cultivo con la ayuda de un

cepillo modificado para disgregar la biopelícula adherida al matraz, se tomó tres

mL de muestra de cultivo y se depositó en un vial. Según el método establecido

por Leal (2012), se agregó n-pentano al 5 % para eliminar los grumos y facilitar

el conteo.

La metodología de conteo celular se ajustó a la descrita por Guillard

(1973), con el uso de un hematocitómetro o cámara de Neubauer 0,1 mm de

profundidad y un microscopio invertido. Se realizó conteos por cuadruplicado

en las tres repeticiones, obteniéndose doce conteos finales por tratamiento, se

obtuvo las medias para los cálculos estadísticos y la elaboración de la curva de

crecimiento que sirvieron para la comparación entre los tres medios de cultivo.

35
 Gráfico 4 Reglilla de la cámara de
Neubauer de 9 mm2
(Fuente: Arredondo y Voltolina,
2007)

4.2.5.2. Cálculos poblacionales

A. Cálculo de la densidad celular (D)

Según Arredondo & Voltolina (2007), se contaron todas las células

presentes en los 4 cuadros de 1 mm2 marcados como A, B, C y D, la

concentración celular se calculó de acuerdo a la fórmula:

D = N x 104 x dil

Donde:

N = promedio de células presentes en 1 mm2 (0,1 μL)

36
dil = factor de dilución

B. Parámetros poblacionales

B.1. Tasa de crecimiento específico (μ)

Es la velocidad de crecimiento y se utilizó la fórmula siguiente

propuesta por Guillard (1973), citado en Pérez Castro (1995).

μ = log10 (D2 / D1) / (t2 - t1)

Donde:

t1 = primer día

t2 = segundo día

D1 = densidad de células al día t1

D2 = densidad de células al día t2

B.2. Tiempo de duplicación (TD)

El tiempo de duplicación y/o de generación (TD) es el tiempo

necesario para que se duplique la población, y se calculó según lo

37
recomendado por Cruz y Alfonzo (1985) citado en Pérez Castro (1995)

T.D. = (Iog10 2) (t2 - t1) / (3,322) (log10 (X2 / X1))

B.3. Divisiones por día (k)

Se obtiene el valor del número de divisiones por día y se calcula de

acuerdo a Guillard (1973) y se calculó según lo recomendado por Cruz y

Alfonzo (1985) citado en Pérez Castro (1995).

K = 3,322 x (log10 (D2 / D1)) / (T2 - T1)

Donde:

3,322 es el factor de conversión del logaritmo base 2 a base 10

B.4. Producción diaria de microalgas (P.D)

Indica el incremento de células logrado en el cultivo por únidad de

tiempo y se determinó según lo recomendado por Cruz y Alfonzo (1985)

citado en Pérez Castro (1995)

PD = (D2 – D1) / (t2 – t1)

38
 B.5. Variación Porcentual de densidad (V.P)

Indica la variación diaria en la densidad del cultivo dada en porcentaje

y se determinó según lo recomendado por Cruz y Alfonzo (1985) citado

en Pérez Castro (1995)

(V.P.) = (100) (D2 - D1) / (t2 – t1)

4.2.6. Segunda serie experimental

Esta serie experimental se realizó con el fin de determinar el efecto de los medios

de cultivos en la formación de biopelículas multiespecíficas de diatomeas bentónicas

provenientes de los cultivos monoespecíficos desarrollados en tres medios de cultivo

(f/2, Nitrofoska, y Humus de Lombriz).

El experimento realizado se ajustó a un Diseño Completo al Azar con tres

tratamientos (Biomasa de los medios de cultivos) y cuatro repeticiones por

tratamiento.

Experimento

39
 T0 (PATRÓN): Diatomeas provenientes del medio Guillard f/2

T1 : Diatomeas provenientes del medio agrícola (Nitrofoska)

T2 : Diatomeas provenientes del medio humus de lombriz

Gráfico 5 Diseño de la segunda serie experimental

Fuente: Elaboración propia

Se elaboró tres contenedores de vidrio de 20 L de capacidad y láminas de

policarbonato de 25 cm2 como sustratos de adhesión de las diatomeas.

24,4 cm

24,4 cm

5 cm
25 cm
5 cm
25 cm

29,4 cm 5 cm

29,4 cm 40 5 cm
Gráfico 6 Medidas del contenedor de vidrio y láminas de policarbonato
(Fuente: Elaboración propia)

En el interior del contenedor se introdujeron láminas de policarbonato y se

inocularon las cuatro diatomeas bentónicas para obtener una muestra

homogénea (10 x 104 cel/mL), es decir 2,5 x 104 cel/mL de cada diatomea

provenientes de los monocultivos de cada medio, fueron depositaron en tres

contenedores con agua de mar UV, según el medio de cultivo del cual

provienen.

El agua de mar fue desinfectada según lo mencionado en Araya (2010), fue

microfiltrada a 10 um y desinfectada con hipoclorito de sodio 5 % a una

concentración de 25 mg/L durante 24 h, luego se neutralizó el cloro activo con

tiosulfato de sodio a 1 M.

4.2.6.1. Conteo de muestras

Se sacrificó cuatro láminas de policarbonato con diatomeas fijadas del

contenedor, en lapsos de cada 6 horas. Con la ayuda de un cepillo modificado

se disgregó la biopelícula adherida y se diluyó en 50 mL de agua de mar estéril,

posteriormente, se depositó 3 mL de la muestra en viales para el conteo

respectivo. Para el conteo de las diatomeas se utilizó la cámara de Neubauer de

41
0,1 mm de profundidad y un microscopio invertido. Se realizó conteos por

duplicado en las cuatro repeticiones, obteniéndose ocho conteos por cada

tratamiento.

42
 V. RESULTADOS

5.1. DIATOMEAS AISLADAS

Se aislaron cuatro especies de diatomeas bentónicas.

- D1: Navicula sp1

Esta diatomea fue identificada dentro de género Navicula, presenta una longitud

promedio de 20 μm y un ancho promedio de 5 μm, en condiciones de cultivos

presentó adhesión al sustrato, lo que caracteriza a una diatomea bentónica.

- D2: Nitzschia sp1

Esta diatomea fue identificada dentro de género Nitzschia, presenta una longitud

promedio de 15 μm y un ancho promedio de 6,25 μm, en condiciones de cultivos

presentó adhesión al sustrato, lo que caracteriza a una diatomea bentónica.

- D3: Navicula sp2

Esta diatomea fue identificada dentro de género Navicula, presenta una longitud

43
promedio de 22,5 μm y un ancho promedio de 8,95 μm, el tamaño es diferente a la

anterior cepa de Nitzschia, lo que nos indica que se está frente a otra especie de

diatomea, en condiciones de cultivos presentó adhesión al sustrato, lo que caracteriza

a una diatomea bentónica.

- D4: Nitzschia sp2

Esta diatomea fue identificada dentro de género Navicula, presenta una longitud

promedio de 6 μm y un ancho promedio de 2,5 μm, el tamaño es diferente a la

anterior cepa de Nitzschia, lo que nos indica que se está frente a otra especie de

diatomea, en condiciones de cultivos presentó adhesión al sustrato, lo que caracteriza

a una diatomea bentónica.

44
5.2. PRIMERA SERIE EXPERIMENTAL

5.2.1. Parámetros de crecimiento de microalgas en los tres medios de cultivo

- Navicula sp1.

Tabla 4 Parámetros de crecimiento de Navicula sp1. en medio Guillard f/2

D μ TD K P.D. V.P.
(cel/mL) (Días) (Div/Días) (cel/mL) (%)
DIA 0 22 083
DIA 1 57 917 0,418 0,216 1,391 051 35 833,33 162,26
DIA 2 98 125 0,228 0,395 0,760 659 40 208,33 69,42
DIA 3 276 667 0,450 0,201 1,495 489 178 541,67 181,95
DIA 4 234 167 -0,072 -1,251 -0,240 618 -42 500,00 -15,36
DIA 5 223 333 -0,020 -4,404 -0,068 339 -10 833,33 -4,63
DIA 6 208 333 -0,030 -3,001 -0,100 307 -15 000,00 -6,72
DIA 7 171 875 -0,083 -1,084 -0,277 540 -36 458,33 -17,50
DIA 8 137 500 -0,096 -0,935 -0,321 935 -34 375,00 -20,00
DIA 9 174 583 0,103 0,873 0,344 492 37 083,33 26,97
DIA 10 157 083 -0,045 -1,975 -0,152 389 -17 500,00 -10,02

Fuente: Elaboración propia

45
Tabla 5 Parámetros de crecimiento de Navicula sp1. en medio foliar

D μ TD K P.D. V.P.
(cel/mL) (Días) (Div/Días) (cel/mL) (%)
DIA 0 29 167
DIA 1 59 792 0,311 754 0,290 669 1,035 646 30 625 105
DIA 2 163 750 0,437 541 0,207 106 1,453 51 103 958,33 173,87
DIA 3 304 583 0,269 525 0,336 211 0,895 361 140 833,33 86,01
DIA 4 457 292 0,176 487 0,513 449 0,586 29 152 708,33 50,14
DIA 5 580 208 0,103 391 0,876 453 0,343 464 122 916,67 26,88
DIA 6 373 125 -0,191 73 -0,472 63 -0,636 926 -20 7083,3 -35,69
DIA 7 349 583 -0,028 304 -3,201 607 -0,094 025 -23 541,67 -6,31
DIA 8 289 792 -0,081 465 -1,112 346 -0,270 626 -59 791,67 -17,1
DIA 9 226 458 -0,107 098 -0,846 117 -0,355 778 -63 333,33 -21,85
DIA 10 210 208 -0,032 338 -2,802 153 -0,107 428 -16 250 -7,18
Fuente: Elaboración propia

Tabla 6 Parámetros de crecimiento de Navicula sp1. en medio humus

D μ TD K P.D. V.P.
(cel/mL) (Días) (Div/Días) (cel/mL) (%)
DIA 0 32 500
DIA 1 66 042 0,307 935 0,294 274 1,022 959 33 541,67 103,21
DIA 2 137 500 0,318 485 0,284 526 1,058 006 71 458,33 108,2
DIA 3 216 458 0,197 072 0,459 818 0,654 672 78 958,33 57,42
DIA 4 305 208 0,149 222 0,607 263 0,495 716 88 750 41
DIA 5 410 417 0,128 629 0,704 486 0,427 304 105 208,33 34,47
DIA 6 348 125 -0,071 49 -1,267 553 -0,237 489 -62 291,67 -15,18
DIA 7 405 417 0,066 166 1,369 534 0,219 805 57 291,67 16,46
DIA 8 389 167 -0,017 766 -5,100 601 -0,059 019 -16250 -4,01
DIA 9 381 042 -0,009 163 -9,889 278 -0,030 44 -8125 -2,09
DIA 10 299 167 -0,105 059 -0,862 533 -0,349 007 -81875 -21,49
Fuente: Elaboración propia

46
Gráfico 7 Curva de crecimiento de Navicula sp1. en los tres medios evaluados
Fuente: Elaboración propia

Para el cultivo de Navicula sp1., el valor más alto en la densidad de

cultivo, al tiempo de cosecha, se obtuvo con el medio NF, 580 208 cel/mL en

800 mL. El valor más bajo corresponde al medio MG con 276 667 cel/mL.

47
 - Nitzschia sp1.

Tabla 7 Parámetros de crecimiento de Nitzschia sp1. en medio Guillard f/2

D μ TD K P.D. V.P.
(cel/mL) (Días) (Div/Días) (cel/mL) (%)
DIA 0 34 583
DIA 1 141 458 0,611 762 0,148 125 2,032 272 106 875 309,04
DIA 2 246 458 0,241 115 0,375 825 0,800 984 105 000 74,23
DIA 3 314 167 0,105 417 0,859 609 0,350 194 67 708,33 27,47
DIA 4 175 000 -0,254 122 -0,356 589 -0,844 193 -139 166,6 -44,3
DIA 5 215 833 0,091 08 0,994 912 0,302 569 40 833,33 23,33
DIA 6 225 000 0,018 064 5,016 447 0,060 009 9 166,67 4,25
DIA 7 153 750 -0,165 367 -0,547 974 -0,549 35 -71 250 -31,67
DIA 8 95 417 -0,207 191 -0,437 36 -0,688 288 -58 333,33 -37,94
DIA 9 79 167 -0,081 082 -11,176 -0,269 354 -16 250 -17,03
DIA 10 64 167 -0,091 233 -0,993 25 -0,303 076 -15 000 -18,95
Fuente: Elaboración propia

48
Tabla 8 Parámetros de crecimiento de Nitzschia sp1. en medio foliar

D μ TD K P.D. V.P.
(cel/mL) (Días) (Div/Días) (cel/mL) (%)
DIA 0 21 250
DIA 1 183 750 0,936 868 0,096 723 3,112 277 162 500 764,71
DIA 2 389 792 0,326 605 0,277 451 1,084 982 206 041,67 112,13
DIA 3 371 458 -0,020 922 -4,331 095 -0,069 504 -18 333,33 -4,7
DIA 4 409 583 0,042 432 2,135 575 0,140 96 38 125 10,26
DIA 5 309 792 -0,121 273 -0,747 219 -0,402 867 -99 791,67 -24,36
DIA 6 295 000 -0,021 248 -4,264 793 -0,070 585 -14 791,67 -4,77
DIA 7 236 250 -0,096 45 -0,939 522 -0,320 408 -58 750 -19,92
DIA 8 147 083 -0,205 808 -0,440 298 -0,683 695 -89 166,67 -37,74
DIA 9 205 000 0,144 19 0,628 454 0,479 001 57 916,67 39,38
DIA 10 169 792 -0,081 837 -1,107 281 -0,271 864 -35 208,33 -17,17
Fuente: Elaboración propia

Tabla 9 Parámetros de crecimiento de Nitzschia sp1. en medio humus

D μ TD K P.D. V.P.
(cel/mL) (Días) (Div/Días) (cel/mL) (%)
DIA 0 26667
DIA 1 101 875 0,582 099 0,155 673 1,933 733 75 208,33 282,03
DIA 2 388 333 0,581 137 0,155 931 1,930 537 286 458,33 281,19
DIA 3 573 333 0,169 203 0,535 554 0,562 091 185 000 47,64
DIA 4 867 292 0,179 758 0,504 106 0,597 156 293 958,33 51,27
DIA 5 457 083 -0,278 17 -0,325 762 -0,924 08 -410 208,3 -47,3
DIA 6 406 667 -0,050 757 -1,785 319 -0,168 614 -50 416,67 -11,03
DIA 7 350 208 -0,064 912 -1,395 997 -0,215 638 -56 458,33 -13,88
DIA 8 482 292 0,138 983 0,652 0,461 702 132 083,33 37,72
DIA 9 290 000 -0,220 912 -0,410 196 -0,733 869 -192 291,6 -39,87
DIA 10 312 917 0,033 031 2,743 421 0,109 728 22 916,67 7,9
Fuente: Elaboración propia

49
Gráfico 8 Curva de crecimiento de Nitzschia sp1. en los tres medios evaluados

Fuente: Elaboración propia

Para el cultivo de Nitzschia sp1., el valor más alto en la densidad de

cultivo, al tiempo de cosecha, se obtuvo con el medio HL, 867 292 cel/mL en

800 mL. El valor más bajo corresponde al medio MG con 314 167 cel/mL.

50
Tabla 10 Parámetros de crecimiento de Navicula sp2. en medio Guillard f/2

D μ TD K P.D. V.P.
(cel/mL) (Días) (Div/Días) (cel/mL) (%)
DIA 0 15 208
DIA 1 65 833 0,636 364 0,142 398 2,114 002 50 625 332,88
DIA 2 92 083 0,145 735 0,621 793 0,484 132 26 250 39,87
DIA 3 92 292 0,000 981 92,329 168 0,003 26 208,33 0,23
DIA 4 86 667 -0,027 31 -3,318 044 -0,090 725 -5625 -6,09
DIA 5 91 875 0,025 345 3,575 308 0,084 197 5 208,33 6,01
DIA 6 64 792 -0,151 678 -0,597 43 -0,503 875 -27 083,33 -29,48
DIA 7 70 625 0,037 439 2,420 373 0,124 373 5 833,33 9
DIA 8 61 458 -0,060 378 -1,500 838 -0,200 575 -9 166,67 -12,98
DIA 9 59 375 -0,014 977 -6,050 354 -0,049 754 -2 083,33 -3,39
DIA 10 53 333 -0,046 605 -1,944 369 -0,154 821 -6 041,67 -10,18
Fuente: Elaboración propia

Tabla 11 Parámetros de crecimiento de Navicula sp2. en medio foliar

D μ TD K P.D. V.P.
(cel/mL) (Días) (Div/Días) (cel/mL) (%)
DIA 0 22 083
DIA 1 98 125 0,647 715 0,139 903 2,151 709 76 041,67 344,34
DIA 2 98 750 0,002 757 32,862 828 0,009 16 625 0,64
DIA 3 95 833 -0,013 021 -6,959 566 -0,043 254 -2 916,67 -2,95
DIA 4 99 375 0,015 761 5,749 616 0,052 357 3 541,67 3,7
DIA 5 91 250 -0,037 044 -2,446 184 -0,123 061 -8125 -8,18
DIA 6 87 083 -0,020 298 -4,464 374 -0,067 429 -4 166,67 -4,57
DIA 7 96 458 0,044 405 2,040 709 0,147 512 9375 10,77
DIA 8 75 833 -0,104 48 -0,867 319 -0,347 081 -20625 -21,38
DIA 9 101 458 0,1264 28 0,716 751 0,419 992 25625 33,79
DIA 10 91 042 -0,047 048 -1,926 076 -0,156 292 -10 416,67 -10,27
Fuente: Elaboración propia

51
Tabla 12 Parámetros de crecimiento de Navicula sp2. en medio humus

D μ TD K P.D. V.P.
(cel/mL) (Días) (Div/Días) (cel/mL) (%)
DIA 0 18 542
DIA 1 70 000 0,576 949 0,157 063 1,916 625 51 458,33 277,53
DIA 2 236 875 0,529 421 0,171 163 1,758 737 166 875 238,39
DIA 3 300 625 0,103 506 0,875 478 0,343 846 63 750 26,91
DIA 4 319 792 0,026 842 3,375 938 0,089 169 19 166,67 6,38
DIA 5 358 125 0,049 167 1,843 028 0,163 334 38 333,33 11,99
DIA 6 297 500 -0,080 548 -1,125 012 -0,267 579 -60 625 -16,93
DIA 7 251 042 -0,073 741 -1,228 854 -0,244 968 -46 458,33 -15,62
DIA 8 201 458 -0,095 561 -0,948 269 -0,317 452 -49 583,33 -19,75
DIA 9 189 167 -0,027 341 -3,314 375 -0,090 826 -12 291,67 -6,1
DIA 10 176 458 -0,030 202 -3,000 324 -0,100 332 -12 708,33 -6,72
Fuente: Elaboración propia

52
Gráfico 9 Curva de crecimiento de Navicula sp2. en los tres medios evaluados
Fuente: Elaboración propia

Para el cultivo de Navicula sp2., el valor más alto en la densidad de

cultivo, al tiempo de cosecha, se obtuvo con el medio HL, 358 115 cel/mL en

800 mL. El valor más bajo corresponde al medio MG con 92 292 cel/mL.

53
Tabla 13 Parámetros de crecimiento de Nitzschia sp2. en medio Guillard f/2

D μ TD K P.D. V.P.
(cel/mL) (Días) (Div/Días) (cel/mL) (%)
DIA 0 19 167
DIA 1 40 625 0,326 247 0,277 756 1,083 792 21 458,33 111,96
DIA 2 120 000 0,470 388 0,192 643 1,562 629 79 375 195,38
DIA 3 269 792 0,351 847 0,257 547 1,168 837 149 791,67 124,83
DIA 4 409 583 0,181 314 0,499 781 0,602 324 13 9791,67 51,81
DIA 5 328 333 -0,096 027 -0,943 66 -0,319 003 -81 250 -19,84
DIA 6 300 000 -0,039 194 -2,312 031 -0,130 202 -28 333,33 -8,63
DIA 7 219 375 -0,135 934 -0,666 625 -0,451 573 -80 625 -26,88
DIA 8 149 583 -0,166 304 -0,544 888 -0,552 462 -69 791,67 -31,81
DIA 9 137 083 -0,037 899 -2,391 044 -0,125 899 -12500 -8,36
DIA 10 138 750 0,005 248 17,265 873 0,017 435 1 666,67 1,22
Fuente: Elaboración propia

Tabla 14 Parámetros de crecimiento de Nitzschia sp2. en medio foliar

D μ TD K P.D. V.P.
(cel/mL) (Días) (Div/Días) (cel/mL) (%)
DIA 0 17 500
DIA 1 40 625 0,365 755 0,247 753 1,215 039 23 125 132,14
DIA 2 156 042 0,584 447 0,155 048 1,941 534 11 5416,67 284,1
DIA 3 296 250 0,278 418 0,325 472 0,924 904 140 208,33 89,85
DIA 4 299 792 0,005 161 17,557 378 0,017 145 3 541,67 1,2
DIA 5 317 083 0,024 354 3,720 852 0,080 904 17 291,67 5,77
DIA 6 299 792 -0,024 354 -3,720 852 -0,080 904 -17 291,67 -5,45
DIA 7 280 417 -0,029 016 -3,123 033 -0,096 39 -19 375 -6,46
DIA 8 220 000 -0,105 381 -0,859 899 -0,350 076 -60 416,67 -21,55
DIA 9 170 208 -0,111 442 -0,813 133 -0,370 21 -49 791,67 -22,63
DIA 10 110 000 -0,189 588 -0,477 968 -0,629 812 -60 208,33 -35,37
Fuente: Elaboración propia

54
Tabla 15 Parámetros de crecimiento de Nitzschia sp2. en medio humus

D μ TD K P.D. V.P.
(cel/mL) (Días) (Div/Días) (cel/mL) (%)
DIA 0 15 208
DIA 1 66 042 0,637 736 0,142 092 2,118 56 50 833,33 334,25
DIA 2 300 208 0,657 605 0,137 799 2,184 563 234 166,67 354,57
DIA 3 1 099 167 0,563 641 0,160 771 1,872 415 798 958,33 266,13
DIA 4 1 598 750 0,162 717 0,556 9 0,540 546 499 583,33 45,45
DIA 5 1 899 375 0,074 83 1,21097 0,248 586 300 625 18,8
DIA 6 1 727 708 -0,041 14 -2,202 636 -0,136 668 -171 666,67 -9,04
DIA 7 1 309 375 -0,120 406 -0,752 594 -0,399 99 -418 333,33 -24,21
DIA 8 931 667 -0,147 803 -0,613 092 -0,491 003 -377 708,33 -28,85
DIA 9 732 292 -0,104 576 -0,866 515 -0,347 403 -199 375 -21,4
DIA 10 783 125 0,029 147 3,108 969 0,096 826 50 833,33 6,94
Fuente: Elaboración propia

55
Gráfico 10 Curva de crecimiento de Nitzschia sp2. en los tres medios evaluados
Fuente: Elaboración propia

Para el cultivo de Nitzschia sp1., el valor más alto en la densidad de

cultivo, al tiempo de cosecha, se obtuvo con el medio HL, 1 899 375 cel/mL

en 800 mL. El valor más bajo corresponde al medio NF con 409 583 cel/mL.

56
5.2.2. Análisis estadístico del crecimiento de diatomeas

Se trabajó con el programa estadístico STATGRAPHICS Centurion XVI.I

 Variable dependiente: Log10 (Densidad final)

 Variable independiente: Medios de Cultivo

Diatomeas bentónicas

 Número de observaciones: 12

 Número de niveles: 3

Tabla 16 Resumen de densidades finales

DENSIDADES FINALES

MEDIOS DE CULTIVO

MG NF HL
D1 276 667 580 208 410 417
DIATOMEAS

D2 314 167 409 583 867 292

D3 92 292 101 458 358 115
D4 409 583 317 083 1 899 375

Fuente: Elaboración propia

57
Tabla 17 Anova para Log10 (Densidad final) por medio de cultivo

Suma de Cuadrado
Fuente g.l. Razón-F Valor-P
Cuadrados Medio
EFECTOS
PRINCIPALES
A: Medios de cultivo 0,489 468 2 0,244 734 6,20 0,0346

B: Diatomeas 0,664 489 3 0,221 496 5,62 0,0355

Residuos 0,236 679 6 0,039 446 4

TOTAL (Corregido) 1,390 64 11

(Nota: L indica datos para Log10 (Densidad final)

Fuente: Elaboración propia

Puesto que los 2 valores-P, Medio de cultivo = 0.0346 y Diatomeas = 0.0355 son

menores a 0.05, estos factores tienen un efecto estadísticamente significativo sobre

Log10 (Densidad final) con un 95 % de nivel de significancia.

Estos datos revelan que existe diferencia estadísticamente significativa entre medios

de cultivo y diatomeas, ello nos confirman que se ha trabajado con medios de cultivos

diferentes y diatomeas diferentes.

58
Tabla 18 Medias por mínimos cuadrados para Log10 (Densidad final) con
intervalos de confianza del 95%

Error Límite Límite

Nivel Casos Media L
Estadístico L Inferior L Superior L
MEDIA GLOBAL 12 5,565 34
MEDIO DE
CULTIVO
HL 4 5,846 01 0,099 305 5,603 01 6,089
MG 4 5,379 16 0,099 305 5,136 16 5,622 15
NF 4 5,470 85 0,099 305 5,227 85 5,713 84
DIATOMEA
D1 3 5,606 26 0,114 668 5,325 67 5,886 84
D2 3 5,682 56 0,114 668 5,401 97 5,963 14
D3 3 5,175 16 0,114 668 4,894 57 5,455 74
D4 3 5,797 38 0,114 668 5,516 79 6,077 96
(Nota: L indica datos para Log10 (Densidad final)

Fuente: Elaboración propia

Esta tabla muestra la media de Log10 (DENSIDAD FINAL) para cada uno de los

niveles de las variables independientes (Medios de cultivo y Diatomeas bentónicas).

También nos mide la variabilidad del muestreo, representada por los errores estándar

de cada media. Las dos columnas de la extrema derecha muestran intervalos de

confianza del 95.0% para cada una de las medias.

59
Tabla 19 Pruebas de múltiple rangos para Log10 (Densidad final) por cada

medio de cultivo

Método: 95 % porcentaje Duncan

MEDIOS DE Casos Media LS L Media Sigma LS L Grupos

CULTIVO (Cel/mL) Homogéneos
MG 4 5,379 16 239 420 0,0993056 X

NF 4 5,470 85 295 699 0,0993056 X

HL 4 5,846 01 701 471 0,0993056 X

(Nota: L indica datos para Log10 (Densidad final)

Fuente: Elaboración propia

En esta tabla se han identificado 2 medios de cultivo homogéneos: MG y NF

según la alineación de las X’s en columna, ello quiere decir que no existen diferencias

estadísticamente significativas a 95 % de confianza entre ambos medios de cultivo,

además señala que el medio HL es un grupo estadísticamente diferente al MG y NF.

60
Tabla 20 Diferencias estimadas entre cada par de medias

Contraste Sig. Diferencia de densidad Final L

HL - MG * 0,466 85

HL - NF * 0,375 16

MG - NF -0,091 690 2

(Nota: L indica datos para Log10 (Densidad final)

* Indica una diferencia significativa.)

Fuente: Elaboración propia

En una comparación por pares entre los diferentes medios de cultivo, la tabla nos

muestra diferencias estadísticamente significativas con un nivel de 95 % de

confianza. El asterisco que se encuentra al lado de los dos pares indica que estos

pares muestran diferencias estadísticamente significativas con un nivel del 95 % de

confianza. Los medios de cultivo MG y NF enfrentados al medio de cultivo

elaborado a base de humus de lombriz HL presentan una gran diferencia en densidad,

lo que nos indica que el medio HL es el mejor en el crecimiento de microalgas

produciendo una mayor densidad celular en los cultivos estáticos de diatomeas

bentónicas marinas.

61
5.3. SEGUNDA SERIE EXPERIMENTAL

5.3.1. Parámetros de adhesión de diatomeas al sustrato.

62
 Tabla 21 Densidad de diatomeas fijadas en la formación de biopelículas multiespecíficas en los tres
medios de cultivo evaluados.

MG NF HL

HORAS Cel/mL Cel/placa Cel/cm2 Cel/mL Cel/placa Cel/cm2 Cel/mL Cel/placa Cel/cm2

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

6 27 187,5 1 359 375 54 375 3 1250 1 562 500 62 500 25 312,5 1 265 625 50 625

12 36 875 1 843 750 73 750 66 562,5 3 328 125 133 125 51 250 2 562 500 102 500

18 39 687,5 1 984 375 79 375 64 375 3 218 750 128 750 47 187,5 2 359 375 94 375

24 85 937,5 4 296 875 171 875 73 750 3 687 500 147 500 119 687,5 5 984 375 239 375

30 147 812,5 7 390 625 295 625 107 812.5 5 390 625 215 625 107 500 5 375 000 215 000

36 155 937,5 7 796 875 311 875 104 062.5 5 203 125 208 125 95 000 4 750 000 190 000

42 162 187,5 8 109 375 324 375 109 687.5 5 484 375 219 375 117 812,5 5 890 625 235 625

48 143 437,5 7 171 875 286 875 190 937.5 9 546 875 381 875 184 687,5 9 234 375 369 375

54 139 375 6 968 750 278 750 191 562.5 9 578 125 383 125 201 250 10 062 500 402 500

60 150 937,5 7 546 875 301 875 186 562.5 9 328 125 373 125 192 187,5 9 609 375 384 375

Fuente: Elaboración propia

63
Gráfico 11 Curva de fijación de diatomeas en la formación de biopelículas
multiespecíficas en los tres medios evaluados
Fuente: Elaboración propia

64
5.3.2. Análisis estadístico para la fijación de diatomeas

Se trabajó con el programa estadístico STATGRAPHICS Centurión XVI.I

 Variable dependiente: Log10 (Densidad final)

 Variable independiente: Medios de Cultivo

 Número de observaciones: 12

 Número de niveles: 3

Tabla 22 Resumen de densidades finales de fijación

DENSIDADES FINALES

MEDIOS DE CULTIVO

MG NF HL
REPETICIONES

R1 395 000 460 000 455 000

R2 370 000 430 000 487 500
R3 407 500 475 000 515 000
R4 415 000 465 000 480 000
Fuente: Elaboración propia

65
Tabla 23 Anova para Log10 (Densidad final) por medio de cultivo

Suma de Cuadrado
Fuente g.l. Razón-F Valor-P
Cuadrados Medio
Entre grupos 0,015 891 2 0,007 945 18,09 0,000 7

Intra grupos 0,003 954 9 0,000 439

Total (Corr.) 0,019 845 11

(Nota: L indica datos para Log10 (Densidad final)

Fuente: Elaboración propia

La razón-F, que en este caso es igual a 18,09, es el cociente entre el estimado

entre-grupos y el estimado dentro-de-grupos. Puesto que el valor-P de la prueba-F es

menor que 0,05, existe una diferencia estadísticamente significativa entre la media de

Log10 (DENSIDAD FINAL) entre un medio de cultivo y otro, con un nivel del

95,0% de confianza, esto nos confirma nuevamente que se trabajó con diferentes

medios de cultivo.

66
Tabla 24 Tabla de medias para Log10 (Densidad final) por medio de cultivo
con intervalos de confianza del 95,0%

Error
MEDIO DE L Media Límite Límite
Casos Media Estadístico
CULTIVO (Cel/mL) Inferior SuperiorL
L
(S agrupada) L
HL 4 5,684 76 483 905 0,010 480 5,667 99 5,701 52

MG 4 5,598 24 396 497 0,010 480 5,581 48 5,615 01

NF 4 5,660 09 457 183 0,010 480 5,643 33 5,676 86

Total 12 5,647 7 444 324

(Nota: L indica datos para Log10 (Densidad final)

Fuente: Elaboración propia

Esta tabla muestra la media de Log10 (DENSIDAD FINAL) para cada nivel de

medio de cultivo (MG, NF y HL). También nos muestra el error estándar de cada

media, el cual es una medida de la variabilidad de su muestreo. La tabla también

muestra un intervalo alrededor de cada media de los medios de cultivo. Las dos

columnas de la extrema derecha muestran intervalos de confianza del 95,0 % para

cada una de las medias.

67
Tabla 25 Pruebas de múltiples rangos para Log10 (Densidad final) por medio

de cultivo

Método: 95.0 porcentaje Duncan

Media
Casos Media LS L Grupos
NIVEL
(Cel/mL) Homogéneos
MG 4 5,598 24 396 497 X

NF 4 5,660 09 457 183 X

HL 4 5,684 76 483 905 X

(Nota: L indica datos para Log10 (Densidad final)

Fuente: Elaboración propia

En esta tabla se han identificado dos medios de cultivo homogéneos: NF y HL

según la alineación de las X’s en columna, ello quiere decir que no existen diferencias

estadísticamente significativas a 95 % de confianza entre ambos medios de cultivo,

además señala que el medio MG es un grupo estadísticamente diferente al NF y HL.

68
Tabla 26 Diferencias estimadas entre cada par de medias

Contraste Sig. Diferencia de densidades L

HL - MG * 0,086 515

HL - NF 0,024 665 4

MG - NF * -0,061 849 6

(Nota: L indica datos para Log10 (Densidad final)

* Indica una diferencia significativa.)

Fuente: Elaboración propia

En una comparación por pares entre los diferentes medios de cultivo, la tabla nos

muestra diferencias estadísticamente significativas con un nivel de 95 % de

confianza. El asterisco que se encuentra al lado de los 2 pares indica que estos pares

muestran diferencias estadísticamente significativas con un nivel del 95 % de

confianza. Los medios de cultivo NF y HL enfrentados al medio MG presentan

diferencia significativa en densidad de células fijadas, lo que nos indica que las

diatomeas bentónicas cultivadas en NF y HL presentan mejores resultados en la

adhesión al sustrato, mientras que las diatomeas bentónicas marinas cultivadas en

MG presentan una reducida adhesión al sustrato.

69
 VI. DISCUSIÓN

Una de las dificultades que se puede presentar al momento de aislar diatomeas por

la técnica de placa es encontrarse con una diversidad de micoorganismos, entre ellos

algunas bacterias u otro tipo de contaminación presente, con esta técnica de debe

repetir varias veces la réplica de las colonias, ello significa que debemos esperar a

que aparezcan las colonias en las placas, es decir este método requiere tiempo y

puede ser complicado si no se cuenta con mucho tiempo disponible.

Para la selección de las microalgas a trabajar, fue necesario considerar los

comportamientos en condiciones de cultivo, así mismo, fue necesaria una revisión

minuciosa mediante el enfoque y toma de imágenes de diferentes aumentos con los

microscopios compuestos invertido. Las diatomeas fueron limpiadas previamente y

enviadas a un Centro de Investigación para la identificación correspondiente por

especialistas.

En la mayoría de microalgas el crecimiento se lleva a cabo durante el periodo de

luz debido a que a través de la fotosíntesis generan material orgánico y energía

suficiente para este proceso, mientras que la división celular se da en el periodo de

70
oscuridad, sin embargo, en las diatomeas la división celular también se realiza en luz

continua, por lo tanto, las densidades celulares de las diatomeas bentónicas no se

vieron afectadas por las condiciones de luz.

Al trabajar con diferentes especies, las especies dentro de los géneros presentan

distintas cinéticas de crecimiento, según las condiciones y requerimientos del medio.

Curbelo et al. (2004) trabajó con el género Navicula sp, y señala que éste tiene una

cinética de crecimiento con una densidad máxima de 9,3 x 105 células/ml en el cuarto

día. En el caso de las cepas de Navicula sp1 y Navicula sp2, se alcanzó una densidad

máxima en el día 5 con 5,8 x 105 cel/mL en el medio NF y 3,5 x 105 cel/ml en el

medio HL respectivamente.

Para la primera serie experimental, se obvió el periodo de adaptación de las

diatomeas en los diferentes medios de cultivo, y se partió de un inóculo inicial desde

un monocultivo axénico en fase exponencial con medio Guillard f/2, posiblemente la

adaptación en los nuevos medios de cultivo NF y HL haya prolongado una fase de

adaptación en los cultivos y producido un retraso en el crecimiento de la densidad.

Analizando el comportamiento y tendencia de las curvas de crecimiento

exponencial de cada tratamiento en cada diatomea evaluada, nos sugiere que la

71
cinética algal pudo haber estado influenciada por la composición del medio de

cultivo. En las curvas de crecimiento se evidencian fases de desaceleración, esto pudo

haberse producido por el agotamiento de nutrientes, al ser nuevos medios de cultivos,

no se conocen exactamente las cantidades químicas aprovechables por las diatomeas

o presencia de algún elemento o sustancia que active la muerte del cultivo.

Que un cultivo se encuentre en la fase de muerte rápidamente, pudo deberse al

efecto autosombreado debido a las altas concentraciones celulares alcanzadas y la

ligera turbidez del medio empleado que impide la penetración homogénea de la luz

(Guerra, 2011), Asimismo, con el medio HL se obtuvo grandes densidades, pero en

cultivos masivos se tendría grandes dificultades por su turbidez que presentan.

Los medios de cultivo tradicionales para el cultivo de diatomeas, presentan

fuentes de nitrógeno, fósforo, sílice y otros componentes utilizables para las

microalgas. En el presente caso, los medios de cultivo elaborados con fertilizantes

orgánico e inorgánico carecen del elemento sílice en su composición, por ello fue

necesaria la adición de Sílice en la misma proporción descrito para el medio Guillard

f/2.

Voltolina et al. (1991) concluye que el medio f/2, generalmente, produce

72
densidades por arriba de otros medios. En el experimento se consiguió densidades

superiores al MG y posiblemente se debe a que los medios NF y HL fueron

formulados según los antecedentes, pero ninguno menciona las cantidades óptimas, lo

que nos lleva a suponer que las cantidades usadas en el cultivo fueron elevadas.

Leal (2012) indica que cada especie de diatomea presenta un grado de adhesión al

sustrato y las cantidades de n-pentano pueden variar según la especie de diatomea,

por lo que fue necesario realizar ensayos preliminares con n-pentano al 5 %, 10 % y

15 %. En las concentraciones 10 % y 15 % se observó gotas de acite que dificultaron

la observación y conteo, por lo que se usó n-pentano al 5 %.

Las diatomeas bentónicas fueron identificadas hasta género, donde se clasificaron

dos especies dentro de cada género, para la identificación se obtuvo las medidas de

tamaño y forma, hubo dificultad al momento de observar las diatomeas en el

microscopio compuesto por su reducido tamaño, por ello fue necesario enviarlas al

extranjero, porque no se contó con un microscopio de alta resolución y así observar

las ornamentaciones del frústulo, que es característica de identificación.

La información sobre cultivo de microalgas, con especial referencia a las diatomeas a

nivel nacional fue escasa, por lo que se tomó como referencia información publicada

en el exterior.

73
 VII. CONCLUSIONES

 Se determinó que el medio elaborado con fertilizante orgánico humus de

lombriz Eisenia foetida, estadísticamente tuvo un efecto positivo, presentando las

mayores concentraciones de densidad celular en el crecimiento y fijación de

diatomeas bentónicas marinas en condiciones de cultivo.

 Se aisló e identificó cuatro diatomeas bentónicas marinas: Navicula sp1.,

Navicula sp2, Nitzschia sp1 y Nitzschia sp2; las cuales presentaron un tamaño

adecuado para su uso en la acuacultura y fueron fácilmente cultivables bajo

condiciones de laboratorio.

 Se determinó las curvas de crecimiento de las cuatro diatomeas en los

diferentes medios de cultivo y se evidenció mayor crecimiento en las especies

cultivadas con humus de lombríz, excepto en la diatomea Nitzschia sp1. la cual creció

mejor con el nutriente foliar.

 Se estableció los parámetros poblacionales de crecimiento de cada especie de

diatomea en los diferentes medios de cultivo y estadísticamente se obtuvo mayor

74
densidad celular en los monocultivos estáticos en el medio elaborado a base de humus

de lombriz.

 Estadísticamente se obtuvo mayor densidad de fijación en la formación de

biopelículas multiespecíficas con las diatomeas provenientes de monocultivos

estáticos en medios de cultivos elaborados a base de humus de lombriz y nutriente

foliar.

75
 VIII. RECOMENDACIONES

 Se recomienda realizar trabajos a posterior con nuevas especies de microalgas

nativas con potencial para ser utilizadas en la acuicultura marina y dulceacuícola.

 Se recomienda más evaluaciones de la composición bioquímica de las cuatro

diatomeas bentónicas marinas y ensayos de utilización como alimento vivo para

determinar su completo potencial de uso acuícola.

 Se recomienda determinar las concentraciones óptimas y la composición

química de los medios de cultivo formulados y evaluar su influencia en el crecimiento

de otras especies de microalgas de importancia comercial.

 Se recomienda emplear otras fuentes orgánicas como aditivo para la

formulación de nuevos medios de cultivos de origen orgánico y ser utilizados en la

acuicultura.

76
 IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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84
ANEXOS

85
 X. ANEXOS

Anexo 1 Limpieza y esterilización de materiales

Fuente: Elaboración propia

86
Anexo 2 Acondicionamiento del cepario

Fuente: Elaboración propia

Anexo 3 Preparación de reactivos

Fuente: Elaboración propia

87
 Anexo 4 Elaboración del sistema de captación

Fuente: Elaboración propia

Anexo 5 Colecta de muestras

Fuente: Elaboración propia

88
Anexo 6 Preparación de medio Guillard en placas

Fuente: Elaboración propia

Anexo 7 Mantenimiento de cepas

Fuente: Elaboración propia

89
Anexo 8 Diagrama de Flujo de la producción de microalgas (SISTEMA BATCH)

PLACAS

PLACAS
CEPAS

CEPAS
TUBOS CULTIVO
INICIAL
TUBOS
CULTIVO
INICIAL
200 mL

200 mL

1L

1L

CULTIVO
12 L
INTERMEDIO
12 L
CULTIVO
INTERMEDIO
18 L

18 L

CULTIVO
TANQUE INTENSIVO

TANQUE CULTIVO
INTERMEDIO

90
Fuente: Elaboración propia

91
Anexo 9 Formulación del medio Guillard f/2

- MEDIO F/2

Para 1 litro de Agua destilada.

CANTIDAD
COMPOSICIÓN SOLUCIÓN STOCK
A USAR
1,0 ml NaNO3 75,0 gr/L
1,0 ml NaH2PO4.H2O 5,0 gr/L
1,0 ml Na2SiO3.9H2O 30,0 gr/L + 5 mL de HCl
1,0 ml F/2 Solución de metales trazas
1,0 ml F/2 Solución de Vitaminas
1,0 ml Tris 250,0 gr/L +147,5 mL de HCl

- F/2 Solución de Metales Trazas (Guillard & Rither 1962, Guillard 1975)

Para un volumen de 950 mililitros de agua destilada.

CANTIDAD A USAR COMPOSICIÓN SOLUCIÓN STOCK

3,15 gr FeCl3.6H20
4,36 gr. Na2SiO3.9H2O
1,0 mL CuSO4.5H2O 9,8 gr/L
1,0 mL Na2MoO4.2H2O 6,3 gr/L
1,0 mL ZnSO4.7H2O 22,0 gr/L
1,0 mL CoCl2.6H2O 10,0 gr/L
1,0 mL MnCl2.4H2O 180,0 gr/L
Llevar a un volumen final de 1 litro con agua destilada.

92
 - F/2 Solución de Vitaminas. (Guillard & Rither 1962, Guillard 1975)

CANTIDAD A USAR COMPOSICIÓN SOLUCIÓN STOCK

1,0 mL Cyanocobalamina (B12) 1,0 gr/L

10,0 mL Biotina 0,1 gr/L

0,2 gr Thiamina HCl

Disolver todas las concentraciones en 1 L de agua destilada y posteriormente

congelar, por cada litro de agua de mar añada ½ litro de solución de vitaminas.

93
Anexo 10 Preparación de medio Guillard f/2

Fuente: Elaboración propia

94
Anexo 11 Formulación del fertilizante inorgánico

- Nitrógeno 100 g/L

- Fósforo 40 g/L
- Potasio 70 g/L
- Magnesio 2 g/L
- Hierro 0,15 g/L
- Cinc 0,005 g/L
- Manganeso 0,015 g/L
- Boro 0,02 g/L
- Cobre 0,025 g/L
- Molibdeno 0,003 g/L

95
Anexo 12 Formulación del fertilizante orgánico

- Biohumus Composición química:

Nitrógeno total (N) contenido, (% en masa en base seca): 1,47

Fosfato disponible (P2O5) contenido, (% en masa en base seca): 1,14
Potasio (K2O) contenido, (% en masa en base seca): 0,52
Contenido de agua, (% en masa en base seca): 58,1
Contenido de materia orgánica, (% en masa en base seca): 38,80
PH de la solución de sal, pH: 7,6
Ca (% en masa en base seca): 0,86
Mg (% en masa en base seca): 0,30

Fuente: Google imágenes

96
 Anexo 13 Preparación del medio con fertilizante orgánico

Fuente: Elaboración propia

97
Anexo 14 Cultivo experimental

Fuente: Elaboración propia

98
 Anexo 15 Dispersión de biopelícula en cultivo

Fuente: Elaboración propia

99
Anexo 16 Toma de muestra de las unidades experimentales

Fuente: Elaboración propia

100
Anexo 17 Conteo de células

Fuente: Elaboración propia

101
Anexo 18 Fichas de registro de crecimiento diatomeas

Fuente: Elaboración propia

102
Anexo 19 Ficha de registro de fijación de diatomeas

Fuente: Elaboración propia

103
Anexo 20 Acondicionamiento de acuario y láminas de policarbonato para la
fijación de diatomeas

Fuente: Elaboración propia

104
Anexo 21 Conteo de diatomeas fijadas en láminas de policarbonato

Fuente: Elaboración propia

105
Anexo 22 Limpieza de diatomeas

Fuente: Elaboración propia

106
Anexo 23 Diatomeas bentónicas marinas

Fuente: Elaboración propia

107
Anexo 24 Diatomeas bentónicas marinas para la producción de Hialotis
rufescens en el Centro de Acuicultura Morro Sama - Fondepes

Fuente: Elaboración propia

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 ______________________ _______________________
Bach. Jordan Ismael Huanacuni Pilco Mblgo. Luis Lloja Lozano
TESISTA ASESOR

TACNA, MAYO DEL 2016

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