BIOLOGÍA MOLECULAR

Y CITOGENÉTICA
UNIDAD DIDÁCTICA 3
Extracción y Purificación de Ácidos Nucléicos
Daniel Brell Martín
Ldo. Biología y Bioquímica
Ciclo Formativo de Grado Superior en Anatomía Patológica y Citodiagnóstico
 PRIMERA ETAPA:
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN
 INTRODUCCIÓN
 Los ácidos nucleicos se encuentran
confinados en el interior de las células:
 En el citoplasma (procariontes)
 En el núcleo (eucariontes)
 En orgánulos celulares (Mit. y Clor.)
 Se encuentran aislados del exterior por:
 Membranas celulares, las cuales:
 Se encuentran tanto en Proc.
como en Eu
 Están constituidas por una bicapa
lipídica.
 La pared celular
 PRIMERA ETAPA:
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN
 INTRODUCCIÓN
 Las membranas y paredes celulares constituyen una barrera al acceso a los ácidos nucleicos.
 Se requiere una primera etapa de extracción y purificación mediante técnicas de BM para el análisis y manipulación
de estos ácidos nucleicos.
 Extracción → permite presentar el ácido nucleico a las enzimas y reactivos utilizados según la metodología de
estudio.
 Purificación → en esta fase se eliminan las sustancias y elementos que puedan interferir en el análisis del
ácido nucleico sometido a estudio.

 La obtención de ácidos nucleicos purificados a partir de una muestra biológica concreta se suele llevar a cabo en
una secuencia de tres fases:
 Fase I → Pretratamiento de la muestra.
 Fase II → Extracción de los ácidos nucleicos.
 Fase III → Purificación de los ácidos nucleicos.
 PRIMERA ETAPA:
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN
 PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS
 Los ácidos nucleicos pueden obtenerse de prácticamente cualquier muestra biológica donde
encontremos un tejido u órgano diferenciado, o a partir de una suspensión celular (células libres y
agregados celulares flotando dispersos en el seno de un medio líquido)
 En nuestro estudio abordaremos los pretratamientos más habituales de muestras biológicas de rutina
en laboratorios de Biología Molecular.
 Sangre
 Cultivos celulares.
 Tejidos animales o vegetales frescos.
 Tejidos fijados en formol e incluidos en parafina.
 Otras muestras (esputos, células de la mucosa oral, bacterias, levaduras, etc).
 PRIMERA ETAPA:
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN
 PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS
 SANGRE
 Constituye uno de las muestras más habituales para realizar estudios de ácidos nucleicos de un individuo,
purificando éstos a partir de alguno de los componentes celulares sanguíneos.

 Obtención y conservación de la muestra

 Lo ideal es partir de sangre anticoagulada con EDTA (también actúan como anticoagulantes la
heparina y el citrato sódico).
 La extracción de ácidos nucleicos debe realizarse dentro de las 24 horas siguientes a la obtención
de la muestra.
 En caso de posponerse la extracción de los ácidos nucleicos más allá de las primeras 24 horas, debe
conservarse la muestra en refrigeración durante un mínimo de 5 días
(a los 3 días los ácidos nucleicos comienzan a degradarse → no aconsejable refrigerar más de ese
tiempo si se pretende realizar técnicas que requieren una molécula intacta de ADN (Southern blot).
 PRIMERA ETAPA:
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN
 PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS
 SANGRE - Componentes
 Composición básica de la sangre → la sangre es un tipo de tejido conjuntivo especializado formado por:
 Componente celular
 Eritrocitos (glóbulos rojos o hematíes) → células sin núcleo ni mitocondrias, que contiene el pigmento
respiratorio hemoglobina y cuya función principal es el
transporte de gases respiratorios dentro del organismo.
 Leucocitos (glóbulos blancos) → células nucleadas, de mayor tamaño que los hematíes, que intervienen en la
defensa del organismo. En base a su morfología y función distinguimos:
 Neutrófilos → constituyen el tipo más común de glóbulos blancos en sangre (50 – 70% del total de
Granulocitos

leucocitos), siendo los primeros en acudir a la zona de infección, fagocitando microorganismos

y segregando enzimas que los degradan.
 Eosinófilos → se diferencian visualmente del resto porque se tiñen con el colorantes ácidos [ej: eosina (rojo
carmín)]. Actúan en la defensa contra parásitos, durante las alergias y en la inflamación de
tejidos.
 Basófilos → Se diferencian visualmente del resto porque se tiñen con colorantes básicos (ej: hematoxilina).
[0 – 0.2%]sangre. Actúan durante la respuesta inflamatoria y combaten parásitos e insectos
vectores de enfermedades.
 PRIMERA ETAPA:
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN
 PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS
 SANGRE - Componentes
 Componente celular
 Leucocitos (glóbulos blancos)
 Linfocitos → encargados de la defensa específica o adquirida. Dos tipos:
 Linfocitos B → maduran en la médula ósea. Respuesta inmunitaria humoral. Producen Ig.
 Linfocitos T → maduran en el timo. Respuesta inmunitaria celular. No producen Ig.
 Monocitos → constituye el leucocito de mayor tamaño, con una [2 – 8%]sangre. Forma parte, junto con
los macrófagos tisulares, del SFM (sistema fagocítico mononuclear).
 Plaquetas (trombocito) → fragmentos citoplasmáticos pequeños, de morfología irregular y carentes
de núcleo, que intervienen en la coagulación sanguínea.
 Componente sérico → solución acuosa constituida por nutrientes, sales, hormonas, enzimas y
proteínas, entre las que destacan: albúminas (presión osmótica sangre-
tejidos), fibrinógeno (coagulación sanguínea), Ig (defensa), lipoproteínas
(pH sanguíneo).
 PRIMERA ETAPA:
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN
Componentes y
funciones de la
sangre
 PRIMERA ETAPA:
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN
 PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS
 SANGRE – Pretratamientos en muestras sanguíneas
1) Lisis de los hematíes → adición de solución (tampón de lisis) 1:3:

 Tampón de lisis estándar: NH4Cl 150 mM + KHCO3 10 mM + EDTA 1 mM.

 Tampón de lisis con detergente: Tris-HCl 10 mM a pH 8 + Triton X-100 al 1% + Sacarosa al 11%.

2) Centrifugado de la muestra → obtención del sedimento (pellet) y sobrenadante.

3) Eliminación del sobrenadante → extracción y descarte de la fracción líquida sobrenadante

mediante el uso de una pipeta

4) Conservación del sedimento → a partir de éste se procederá a la extracción de los ácidos nucleicos
en fases posteriores.
 PRIMERA ETAPA:
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN
 PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS
 SANGRE – Procedimiento para aislar células mononucleadas de sangre periférica.
 Las muestras sanguíneas pueden utilizarse también para detectar, aislar y estudiar ácidos nucleicos de algunos
retrovirus que infectan linfocitos (VIH o HTLV).
 Deben aislarse células mononucleadas de sangre periférica (linfocitos y monocitos) en pasos previos a la
extracción de ácidos nucleicos.
 El procedimiento es el siguiente:
1. Se dispone un tubo con medio de separación y sobre éste la sangre.
2. Centrifugación 20-30 minutos a 400-800 × g, dependiendo del reactivo usado. Durante la centrifugación:
 La polisucrosa (polisacárido componente del medio de separación) causa agregación de los hematíes facilitando su
rápida sedimentación.
 Los granulocitos (densidad > medio de separación) sedimentan también en el fondo del tubo.
 Las células mononucleadas(densidad < medio de separación) permanecen en la interfase entre este y el plasma.
3. Una vez eliminado el plasma sobrenadante, la capa de células mononucleadas se aspira cuidadosamente con una
pipeta pasteur, se transfiere a un tubo limpio y se lava con tampón o solución salina para eliminar restos de plasma
y plaquetas.
4. A partir de las células lavadas se puede continuar con el proceso de extracción de ácidos nucleicos.
 PRIMERA ETAPA:
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN

Separación de células
mononucleadas de sangre
periférica mediante
centrifugación en gradiente
de densidad.
 PRIMERA ETAPA:
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN
 PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS
 CULTIVOS CELULARES
 Métodos de obtención de células in vitro mediante siembras controladas en medios adecuados.
 Constituyen un buen material de partida para la realización de estudios genómicos y de expresión génica en
determinadas condiciones y bajo ciertos estímulos.
 El pretratamiento de este tipo de muestras consiste en la recolección de las células antes de continuar con la
extracción de los ácidos nucleidos.
 Podemos encontrar 2 tipos de situaciones principales:
 Cultivos en suspensión → cuando las células crecen en suspensión en medios de cultivo procediendo
según el siguiente esquema de procesos:
 1. Recolectar en un tubo.
 2. Eliminar el medio de cultivo mediante centrifugación (sobrenadante).
 3. Lavar las células con tampón o suero fisiológico antes de proceder a la extracción y purificación de ADN
y/o ARN.
 PRIMERA ETAPA:
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN
 PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS
 CULTIVOS CELULARES
 Cultivos en monocapa → cuando las células crecen en monocapa adheridas a la pared del frasco de
cultivo.
Encontramos 2 posibilidades:
- Utilizar el frasco para continuar con el proceso de extracción, siguiendo el siguiente
procedimiento:
1. Retirar del frasco el medio de cultivo.
2. Lavar la monocapa con tampón o solución salina.
3. Iniciar in situ, en el propio frasco, el proceso de extracción.
- Pasar la monocapa a un tubo. Para esto:
1. Despegar la monocapa de células de la pared del frasco. Para ello se puede proceder de dos maneras:
– De forma mecánica con raspador.
– Por medios enzimáticos. Tras retirar el medio de cultivo del frasco y lavar la monocapa con
tampón o solución salina, se incuban las células con una solución de tripsina al 0,05-0,25%.
2. Recolectar las células en un tubo.
3. Lavar las células antes de continuar con la extracción.
 PRIMERA ETAPA:
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN
 PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS
BIOLÓGICAS
 TEJIDOS ANIMALES O VEGETALES
FRESCOS
 La extracción de ácidos nucleicos a partir de estas
muestras requiere un pretratamiento previo de
homogeneización (proceso mecánico o químico
al que se somete un tejido para liberar las células
que lo integran).
 La cantidad de tejido a procesar dependerá:
 Del tipo muestral.
 Del método de homogeneización seleccionado.
 Del procedimiento de extracción y purificación de
ácidos nucleicos.
 PRIMERA ETAPA:
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN
 PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS
 TEJIDOS ANIMALES O VEGETALES FRESCOS
 Tipos de homogeneizaciones
 Homogeneización mecánica → proceso por el cual se somete un tejido a la acción triturado o abrasiva con
objeto de desmenuzarlo y reducirlo a constituyentes más simples.
 Distinguimos 2 tipos:
 Homogeneización automatizada → requiere el uso de máquinas o elementos mecánicos:
1. Corte previo del tejido en fragmentos pequeños y posterior homogeneizado por: a) acción
mecánica; b) adición de agentes abrasivos en agitación; c) adición de esferas de vidrio o
cerámica que colisionan violentamente con la muestra; d) por sonicación.
2. Una vez homogeneizado el tejido, se transfiere a un tubo limpio para proceder a la extracción de
los ácidos nucleicos.
Nota: es importante realizar los procesos en frío y con rapidez para evitar la degradación de
componentes celulares al liberarse proteasas y otras enzimas durante la homogeneización de
los tejidos. Otra opción es usar inhibidores enzimáticos.
 PRIMERA ETAPA:
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN
 PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS
 TEJIDOS ANIMALES O VEGETALES FRESCOS
 Tipos de homogeneizaciones
 Homogeneización mecánica → proceso por el cual se somete un tejido a la acción triturado o abrasiva con
objeto de desmenuzarlo y reducirlo a constituyentes más simples.
 Distinguimos 2 tipos:
 Homogeneización manual con mortero → minimiza el problema de la degradación
1. Se disponen los fragmentos de tejido en un mortero y se cubren con nitrógeno líquido.
2. Pulverización del tejido congelado mediante aplastamiento con el brazo de mortero y
evaporación del nitrógeno líquido.
3. Transferencia del polvo obtenido a un tubo para iniciar el proceso de extracción.
Nota: algunos protocolos contemplan la homogeneización mecánica con la muestra sumergida directamente en
tampón de lisis, simultaneándola con el primer paso del proceso de extracción de ácidos nucleicos.
 PRIMERA ETAPA:
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN
 PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS
 TEJIDOS ANIMALES O VEGETALES FRESCOS
 Tipos de homogeneizaciones
 Homogeneización química → proceso por el cual se somete un tejido a la acción de enzimas proteasas y
detergentes que degradan los componentes tisulares, disgregando las células.
 Es una técnica de uso habitual en muestras pequeñas y cortes de tejidos obtenidos en criostatos.
 El proceso contempla los siguientes pasos:
1. Adición de una mezcla de incubación (proteasas + detergentes) al tejido muestral.
2. Incubación de la muestra durante 12 – 24h, a 37 – 60 ºC, aproximadamente.
3. Una vez concluida la incubación, se inicia la fase de extracción de los ácidos nucleicos.
Nota: algunos protocolos contemplan la simultaneidad de los procesos de homogeneización del tejido con la
fase de extracción de ácidos nucleicos cuando se adicionan enzimas y detergentes a la mezcla de incubación
capaces de romper y desestabilizar las membranas celulares.
 PRIMERA ETAPA:
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN
 PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS
BIOLÓGICAS
 TEJIDOS FIJADOS EN FORMOL E
INCLUIDOS EN PARAFINA (FFPE)
 Este tipo de tejidos constituyen un material muy
útil para la realización de estudios retrospectivos.
 Los ácidos nucleicos extraídos a partir de este
tipo de muestras pueden haber sufrido procesos
de degradación durante el transcurso de las fases
de fijación.
 El primer paso a efectuar con muestras incluidas
es la desparafinización (proceso por el cual se
elimina la parafina de los tejidos FFPE):
1. Obtención de secciones finas de tejido
(5 a 10 μm) con ayuda de un micrótomo.
2. Transferencia de 5 – 10 mg de cortes de
tejido a un tubo eppendorf.
3. Incubación secuencial con xilol u otro
agente desparafinante + alcoholes de
concentración decreciente + H2O
destilada.
4. Homogeneización química del tejido
desparafinado y rehidratado.
 PRIMERA ETAPA:
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN
 PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS
 OTRAS MUESTRAS
 Cultivos de bacterias y levaduras
 El pretratamiento habitual previo a la extracción de ácidos nucleicos en este tipo de muestras contempla el
uso de un tampón de suspensión.
 Según el medio que contenga la muestra podemos distinguir 2 situaciones de partida:
 Cultivos en medio líquido.
1. Adición de la muestra a un tubo eppendorf y centrifugación para eliminar el medio de cultivo
sobrenadante.
2. Resuspensión del sedimento celular en el tampón de suspensión.
 Colonias aisladas sobre un medio sólido (placa de agar):
1. Uso de un asa de siembra para obtener muestras de la colonia.
2. Resuspensión de la colonia celular en el tampón de suspensión.
 PRIMERA ETAPA:
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN
 PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS
BIOLÓGICAS
 OTRAS MUESTRAS
 Células de la mucosa oral
 Existen sistemas de recogida y conservación de
este tipo de muestras en el mercado a disposición
del usuario, basados en métodos diversos tales
como:
 Raspado de la mucosa oral con torunda o cepillo.
 Enjuague de la cavidad oral con una solución
conservante.
1. Uso de un asa de siembra para obtener
muestras de la colonia.
2. Resuspensión de la colonia celular en el
tampón de suspensión.
 El pretratamiento de las muestras celulares
procedentes de la mucosa oral consiste en la
centrifugación de la suspensión celular (tampón
de suspensión) y eliminación del sobrenadante.
 PRIMERA ETAPA:
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN
 PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS
 OTRAS MUESTRAS
 Esputo → secreción procedente de la nariz, garganta o bronquios que se escupe de una vez por
la boca en una expectoración.
 Constituye un excelente material de partida para detectar o confirmar la presencia de microorganismos
patógenos causantes de infecciones respiratorias.
 El pretratamiento previo al aislamiento de ácidos nucleicos contempla el uso de agentes mucolíticos tipo N-
acetil-L-cisteína (NALC) en una disolución de citrato sódico, con objeto de proporcionar fluidez a la
muestra.
 Disolución mucolítica estándar:
a) N-acetil-L-cisteína (NALC) → 0.375 g
b) Disolución de citrato sódico (14.5g) en agua destilada (razón 1:2)
c) Hidróxido sódico (NaOH) → 20 g
d) Agua destilada (añadir hasta obtener un volumen de 1000 ml).
 EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
 Proceso de extracción → obtención de un lisado celular de aspecto homogéneo dentro
del cual los ácidos nucleicos se encuentran liberados de las
estructuras celulares que los contenían.

 El proceso de extracción de ácidos nucleicos

implica principalmente 2 procesos:
 Lisis celular.
 Inactivación de nucleasas celulares (ADNasa y
ARNasas).
 Ambos procesos se consiguen mediante la
incubación de la suspensión celular con una
solución de lisis.
 EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
 LA SOLUCIÓN DE LISIS → la composición dependerá del tipo celular a digerir:
 Detergentes
 Componentes principales de la solución de lisis.
 Función → romper / desestabilizar la bicapa lipídica de la membrana plasmática de las células y
desnaturalizar las proteínas asociadas a ella.
 Ej: SDS (dodecil-sulfato-sódico); constituye el detergente más usado para lisis celulares de muestras humanas y
animales, en sinergia con el EDTA.
 EDTA (ácido etilendiaminotetraacético)
 Es un agente quelante de cationes divalentes (Ca2+ ;Mg2+).
 Función → inhibe la actividad de las ADNasas.
 Proteasas
 Función → catalizan la degradación de proteínas (tanto de la MP como las citoplasmáticas) y eliminación de
nucleasas.
 Muy útiles en muestras de tejidos frescos y FFPE para simultanear digestión proteica con extracción de ác.
nucleicos.

 Agentes caotrópicos
 Función → desnaturalizan e inactivan macromoléculas
 Ej: isotiocianato de guanidinio → potente inactivador de ARNasas.
 EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
 TRATAMIENTOS EN CÉLULAS CON PARED CELULAR
 Bacterias + Levaduras + Hongos + Células Vegetales
 Dificulta la lisis celular.
 Para romper estas barrera se requieren tratamientos adicionales a la solución de lisis vista
anteriormente, tales como:
 Tratamiento enzimático

 Consiste en el empleo de enzimas para degradar la estructura proteica de la pared celular.

 Las enzimas más destacadas en este tipo de tratamientos previos a la lisis celular son:
 Lisozima → degrada la pared celular de bacterias Gram+.
 Liticasa → degrada la pared celular de células vegetales, hongos y levaduras.
 Estas enzimas pueden adicionarse a la solución de lisis para simultanear el proceso.
 EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
 TRATAMIENTOS EN CÉLULAS CON PARED
CELULAR
 Tratamiento mecánico
 Se basan en la ruptura de la pared celular por medios
mecánicos (ebullición en agua destilada; sonicación;
etc.)
 Constituye una alternativa al tratamiento enzimático.
 Tratamiento químico
 Consiste en la sustitución del SDS por CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio; detergente
iónico capaz de precipitar ácidos nucleicos y
polisacáridos ácidoscontenidos en la pared celular).
 EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
 VERIFICACIÓN DEL RESULTADO DE LA LISIS
 Esta fase requiere comprobar la obtención de una solución homogénea que garantice una lisis
celular óptima.
 Si la lisis celular ha concluido con éxito se procede a la siguiente fase analítica.
 Si la lisis celular no es homogénea se prolongará el protocolo llevado a cabo.

 CONSIDERACIONES EN LA EXTRACCIÓN DEL ADN

 Si tras la lisis celular se quiere purificar exclusivamente ADN se debe eliminar por completo el ARN
presente en la solución homogénea:
1. Adición de ARNasas al medio de reacción.
2. Incubación a 37 ºC durante 15’ – 45’.
 Nota → aconsejable en muestras de saliva, raspados celulares y biopsias de tejidos.
 PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
 Purificación → separación de los ácidos nucleicos del resto de componentes
contenidos en el lisado homogéneo.

Técnicas de purificación de ácidos nucleicos:

➢ Purificación con solventes orgánicos.
➢ Precipitación de ADN con sales (salting-out)
➢ Cromatografía de intercambio iónico.
➢ Cromatografía de adsorción.
➢ Purificación mediante esferas magnéticas.
➢ Ultrafiltración.
 PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
 PURIFICACIÓN CON SOLVENTES ORGÁNICOS
 Esta técnica analítica se basa en las distintas solubilidades que muestran los compuestos que
componen el lisado celular cuando se exponen a solventes orgánicos.
 El procedimiento analítico se compone de las siguientes fases:
1. Eliminación de compuestos solubles en solventes orgánicos → utiliza una combinación de cloroformo
(disuelve lípidos y proporciona la fase orgánica) + fenol (desnaturaliza y disuelve proteínas). Tras
centrifugación, se obtendrá una fase acuosa (superior, con los ácidos nucleicos, sales y componentes
hidrosolubles) y una fase orgánica (proteínas y lípidos).

2. Precipitación del ADN → se induce la precipitación del ADN mediante la adición de acetato sódico e
isopropanol / etanol absoluto frío, y se desecha el sobrenadante que contiene material hidrosoluble sin interés.

3. Lavado del ADN → el pellet con ADN se lava con etanol al 70 – 95% y se centrifuga nuevamente. El etanol
provoca que los restos salinos y demás componentes sin interés se vuelvan solubles y se eliminen con el
sobrenadante tras la centrifugación.

4. Resuspensión del ADN → se procede a la eliminación de etanol sobrante por secado. Posteriormente, se
resuspende el pellet en tampón de baja fuerza iónica a pH neutro (Tris-EDTA).
PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Esquema de la purificación de ADN genómico por el método del fenol/cloroformo/isoamílico.

 PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
 PRECIPITACIÓN CON SALES (SALTING-OUT)
 Esta técnica analítica se basa en la precipitación de proteínas en presencia de ↑↑ [sales].
 El procedimiento analítico se compone de las siguientes fases:
1. Precipitación de proteínas → se añade una solución salina concentrada que provoca precipitación
proteica tras centrifugación. En el sobrenadante obtendremos los ácidos nucleicos junto con componentes
hidrosolubles, mientras que en el pellet quedarán las proteínas precipitadas.
2. Precipitación del ADN → se transfiere el sobrenadante a un tubo y se añade isopropanol para provocar
la insolubilidad y precipitado del material genético.
3. Lavado y resuspensión del ADN → tras eliminar el sobrenadante, se lava el pellet (conteniendo el ADN
de interés) con etanol al 70 – 95% y se resuspende en agua destilada o tampón Tris-EDTA.
PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Esquema de la purificación de ADN genómico por el método de precipitación con sales.

 PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
 CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO
IÓNICO
 Esta técnica analítica se basa en la unión electroestática
reversible de iones en solución a grupos funcionales
cargados y unidos de forma covalente a una fase
estacionaria.
 Distinguimos entre:
 Intercambiadores iónicos → si los GF tienen carga
neta + (unirán aniones).
 Intercambiadores catiónicos → si los GF tienen
carga neta –
(unirán cationes).
 Para purificar ácidos nucleicos se requiere el uso de
Fundamento de la cromatografía de intercambio
matrices de sílice o celulosa donde se unirá el iónico. Iones en solución se unen a grupos
intercambiador aniónico (GF: MAE y DEAD) funcionales anclados a una fase estacionaria que
tienen carga de signo contrario.
 PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
 CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO
IÓNICO
 El procedimiento analítico se compone de las siguientes
fases:
1. Cargado de la columna cromatográfica → se añade la
dilución del lisado celular unida a un tampón de baja
salinidad y pH neutro.
2. Lavado de la columna cromatográfica → por adición
secuencial de tampones de concentración salina creciente.
3. Elución del ADN → separación del ADN purificado
mediante la adicción de un tampón de máxima salinidad y
alto pH y posterior precipitado con isopropanol o etanol.

 Ventajas del sistema cromatográfico Representación gráfica de la secuencia de elución

de las moléculas presentes en un lisado celular
 Permite la purificación de distintos ácidos nucleicos en desde una columna de intercambio iónico a medida
función de la carga negativa que presenten. que aumenta la [salina] del tampón de lavado.
 PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Esquema de las fases de purificación de ADN mediante cromatografía de intercambio iónico.

1) La columna se carga con el lisado, de manera que las moléculas con carga negativa son retenidas en la columna, mientras que las
proteínas, con carga positiva, eluyen de la misma; 2) La columna se lava a continuación con tampones de fuerza iónica creciente; 3)
los contaminantes con débil carga negativa se van eluyendo; 4) Finalmente, la columna se lava con un tampón de máxima salinidad;
5) El ADN se separa del intercambiador; 6) El ADN se eluye del sistema y precipita por adición de alcoholes.
 PURIFICACIÓN DE
ÁCIDOS NUCLEICOS
 CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
 La técnica analítica se basa en la capacidad de adsorción de los
ácidos nucleicos al vidrio y al sílice en presencia de sales
caotrópicas.
 La purificación de ácidos nucleicos mediante esta técnica
requiere el uso de membranas de lana de vidrio o perlas de sílice
integradas en columnas de polipropileno.
 El procedimiento analítico se compone de las siguientes fases:
Fundamento de la adsorción de ácidos nucleicos a
1. Adsorción del ADN → se añade la dilución del lisado celular la sílice en presencia de sales caotrópicas.
unida a un tampón que contiene un agente caotrópico. Tras
centrifugar, se recoge el medio líquido con las proteínas y los
componentes celulares y se desecha, conservándose los ácidos
nucleicos unidos a la membrana de la columna.
2. Lavado de la columna cromatográfica → por adición de
etanol al 70% y centrifugación.
3. Desorción del ADN → separación del ADN purificado
mediante la adicción de agua destilada o tampón Tris-EDTA. Esquema de la purificación de ácidos nucleicos
mediante columnas de adsorción a sílice.
 PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
 PURIFICACIÓN MEDIANTE ESFERAS MAGNÉTICAS
 La técnica analítica se basa en la unión (por adsorción o afinidad) de los ácidos nucleicos a microesferas
magnéticas que pueden ser retenidas mediante un imán.
 La purificación de ácidos nucleicos mediante esta técnica requiere el uso de microesferas de magnetita
recubiertas de sílice de alta afinidad encapsuladas en una matriz inerte.
 El procedimiento analítico por adsorción se
compone de las siguientes fases:
1. Adsorción del ADN a las esferas → adición del Fundamento de la adsorción de ácidos nucleicos a
lisado celular junto a un agente caotrópico y unión la sílice en presencia de sales caotrópicas.
de los ácidos nucleicos a la superficie de las
esferas.
2. Separación del ADN → las esferas con el ADN
adherido se unen a un separador magnético. Se
desecha el resto del lisado.
3. Lavado del ADN → por adición de etanol al 70%.
4. Desorción del ADN → por adición de agua
destilada o tampón Tris-EDTA e incubación.
Fig. 3.17. Fundamento de la purificación de ácidos nucleicos mediante
5. Purificación del ADN → se transfiere a un tubo adsorción a microesferas magnéticas.
limpio mientras que las esferas libres se unen a la
pared del tubo.
 PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
 ULTRAFILTRACIÓN
 La técnica analítica se basa en la retención por tamaño de las moléculas de ácidos nucleicos
mediante membranas con un tamaño de poro determinado.
 El procedimiento analítico se compone de las siguientes fases:

1. Cargado de la columna → adición de la mezcla de reacción

PCR y centrifugación. Los productos amplificados resultantes
quedarán retenidos en el filtro.
2. Lavado del ADN → mediante el uso de etanol al 70%.
3. Purificación del ADN → por resuspensión de los productos
PCR en agua destilada o tampón Tris-EDTA y transferencia a un
tubo limpio.

Esquema de la purificación de ácidos nucleicos

mediante ultrafiltración.
 PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
 PURIFICACIÓN DE PLÁSMIDOS
 Los plásmidos constituyen excelentes herramientas en Biología Molecular por su capacidad para actuar como vectores de
clonación de secuencias de interés.
 El principal inconveniente para su obtención es llevar a cabo la separación del ADN cromosómico bacteriano y del ARN
bacteriano.
 La técnica analítica se basa en la retención por tamaño de las moléculas de ácidos nucleicos mediante membranas
con un tamaño de poro determinado.
 Destacan dos técnicas principales en la purificación de plásmidos:
 Centrifugación en gradiente de densidad → se basa en la separación del ADN plasmídico (menos denso) del ADN
cromosómico bacteriano al someterse a ultracentrifugación en gradiente de densidad de CsCl.
 Lisis alcalina → método más usado actualmente. Se basa en las diferencias de desnaturalización/renaturalización de
ambas moléculas. Se compone de las siguientes fases:

1. Lisis alcalina → incubación de bacterias en una solución de lisis fuertemente alcalina (SDS + NaOH, pH = 11),
provocando que se desnaturalicen tanto el ADN cromosómico y plasmídico.
2. Neutralización rápida → renaturalización del ADN plasmídico y precipitación del ADN cromósómico y del SDS
al agregar una solución concentrada de acetato potásico a pH ácido (pH 4 – 4.8).
Centrifugación con obtención del sobrenadante y descartado del sedimento.
3. Purificación del ADN plasmídico → transferencia del sobrenadante a un tubo limpio y purificación del ADN
plasmídico por alguno de los métodos ya descritos.
 PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
 CONSIDERACIONES PREVIAS A LA EXTRACCIÓN DE ARN
 El ARN es muy sensible a la acción de ARNasas.
 Las ARN asas son enzimas altamente resistentes (no requieren Mg2+, no se eliminan por
esterilización, etc.)
 La purificación del ARN ha de hacerse en condiciones especiales:
 Uso de guantes en cabina de flujo laminar.
 Limpieza de superficies con soluciones inactivadoras de ARNasas.
 Comprobar que el material y reactivos a utilizar está exento de la presencia de ARNasas.
 La solución de lisis deberá contener agente caotrópico que inactive ARNasas (el agente de uso más
común es el isotiocianato de guanidinio).
 AUTOMATIZACIÓN DEL PROCESO DE
EXTRACCIÓN / PURIFICACIÓN
 VENTAJAS DE LA AUTOMATIZACIÓN
 Garantiza la obtención de ácidos nucleicos altamente purificados.
 Minimiza la contaminación de la muestras de interés.
 Aumenta notablemente la velocidad de obtención de ácidos nucleicos purificados.
 ALGUNOS MÉTODOS AUTOMATIZADOS ANTERIORMENTE ESTUDIADOS:
 Basados en el uso de partículas magnéticas  Basados en cromatografía de adsorción
 CALIDAD DE LOS ÁCIDOS
NUCLEICOS PURIFICADOS
 La calidad de los ácidos nucleicos purificados está
determinada por tres parámetros principales:
 Integridad → parámetro que determina si los ácido
nucleicos conservan sus estructuras y
tamaños originales.
 La mejor forma de valorar la integridad de un ácido
nucleico es someterlo a electroforesis en gel de
agarosa. Dependiendo del ácido nucleico purificado
obtendremos los siguientes resultados:
 ADN genómico:
 Si mantiene la integridad → banda única
de perfectamente definida en la zona Electroforesis de ADN genómico purificado.
superior del gel 1) ADN marcador. 2) Muestra bien purificada que
mantiene la integridad del ADN. 3) Muestra con
 Si se ha fragmentado → estela fluorescente
una ligera degradación del ADN, que se refleja en
(smear) a lo largo de la calle electroforética
la mayor anchura de la banda superior y la
Nota: en muestras FFPF siempre se observará aparición de un pequeño smear. 4) Muestra muy
degradación. degradada como lo demuestra la presencia de un
amplio smear que ocupa toda la calle.
 CALIDAD DE LOS ÁCIDOS
NUCLEICOS PURIFICADOS
 Integridad → parámetro que determina si los ácido
nucleicos conservan sus estructuras y
tamaños originales.
 ADN plasmídico: lo normal es obtener una única
banda correspondiente al plásmido con su
estructura nativa. Sin embargo, a veces aparecen
bandas débiles (pérdida de la estructura nativa) u
otras bandas asociadas a la producción de dímeros
plasmídicos.
 ARN: generalmente se observarán dos bandas
nítidas (ARNr de las subunidades mayor 28S y
menor 5S del ribosoma), junto a una tercera banda
más débil (ARNr de la subunidad mayor 5.8S y
5S + ARNt). El ARNm provoca cierto smear.

Figura superior: Electroforesis de ADN plasmídico purificado.

Figura inferior: Electroforesis de ARN purificado
1) Marcador de tamaños. 2) Muestra degradada.
3) y 4) Muestras bien purificadas
CALIDAD DE LOS ÁCIDOS
NUCLEICOS PURIFICADOS
 Pureza → parámetro que determina la ausencia de
posibles contaminantes en un ácido nucleico.
 La medida del grado de pureza de un acido nucleico se
basa en su capacidad para absorber radiación
electromagnética a una λ = 260 nm.
 Cociente 260 nm / 280 nm (A260/A280):
constituye el parámetro más utilizado para
valorar la pureza de un ácido nucleico. Se basa
en la absorbancia máxima que muestran algunos
de los principales contaminantes del ADN
(proteínas y fenoles) a 280 nm.
 A260/A280 = 1.7 – 2 → alta pureza.
 A260/A280 < 1.7 → contaminación excesiva
 A260/A280 > 1.7 → elevada [ARN].
 A260/A280 (ARN) = 1.8 – 2.1 → alta pureza.

Curvas de absorbancia de ácidos nucleicos y proteínas.

CALIDAD DE LOS ÁCIDOS
NUCLEICOS PURIFICADOS
 Pureza → parámetro que determina la ausencia de posibles contaminantes en un ácido
nucleico.
 La medida del grado de pureza de un acido nucleico se basa en su capacidad para absorber
radiación electromagnética a una λ = 260 nm.
 Cociente 260 nm / 230 nm (A260/A230): constituye un parámetro adicional (aunque no tan
específico) para valorar el nivel de pureza de un ácido nucleico. Se basa en que la máxima
absorbancia de algunos contaminantes menores del ADN (carbohidratos y sales) se
localiza a 230 nm.
 A260/A230 = 1.5 – 2.2 → alta pureza
 A260/A230 < 1.5 → presencia de contaminantes.

 Absorbancia a 320 nm (A260/A230): parámetro utilizado para medir la turbidez de la

solución (presencia de partículas en suspensión).
Para garantizar un mayor rigor en los cálculos, debe
restarse a los valores obtenidos a A230 A260 y A280 .
CALIDAD DE LOS ÁCIDOS
NUCLEICOS PURIFICADOS
 Concentración → cantidad de ácido
nucleico por unidad de volumen de
solución final.
 Los métodos más utilizados para medir
la concentración de un ácido nucleico
purificado son:
 Absorbancia a 260 nm (A260).

 Método de fluorescencia:
permite la elaboración de una
curva de calibración de cantidades
de ADN conocido a partir de la
fluorescencia emitida a una λ
determinada.
Concentración de ácido nucleico en ng/μl o μg/ml =
(A260 – A320) × factor de dilución × factor de conversión.
ALMACENAMIENTO DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
 Todo sistema de almacenamiento de muestras de laboratorio deberá cumplir con dos premisas
fundamentales:
 Garantía de su integridad.
 Registro completo y fiable de su trazabilidad.
 Para garantizar la integridad de las muestras hay que evitar o reducir al mínimo su
degradación en el tiempo. Para esto:
 Se deben usar tubos tipo eppendorf o criotubos con cierre hermético y libres de nucleasas
(ADNasas y ARNasas).
 Generalmente, se almacenan en frío:
 Las muestras de ADN, si se van a utilizar en 4-5 días se pueden almacenar en nevera a 4 ºC. Para
tiempos mayores se requiere congelación a –20 ºC o preferiblemente a –80 ºC.
 Las muestras de ARN siempre en congelación, a –20 ºC para tiempos cortos o a –80 ºC para
tiempos largos.
 Sistema de monitorización de la tª, CO2 y humedad, así como sistemas informáticos de alarma
cuando alguno de estos parámetros excedan los valores normales autorizados.
ALMACENAMIENTO DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
 Todosistema de almacenamiento de muestras de laboratorio deberá cumplir con dos
premisas fundamentales:
 Garantía de su integridad.
 Registro completo y fiable de su trazabilidad.
 La trazabilidad requiere:
 Rotulación directa de los tubos. Se deben usar tintas indelebles, resistentes a solventes orgánicos y a
bajas temperaturas.
 Uso de etiquetas con codificación alfanumérica. Las etiquetas deben aguantar temperaturas de –80 ºC.
 Uso de etiquetas con código de barras (1D) o de puntos (2D), igualmente resistentes a bajas
temperaturas.
 Uso de tubos con codificación 2D grabada en el propio tubo. Estos sistemas permiten la identificación
directa en las cajas o racks de 96 tubos con escáneres de lectura y software específico de
descodificación.
 Las cajas o racks para guardar los tubos también deben estar correctamente identificadas con código
de barras o puntos, mediante etiquetas o grabados.