EVALUACIÓN DEL USO DEL GLIFOSATO SOBRE LA MICROBIOTA DEL

SUELO, EN LA ZONA DE AMORTIGUACIÓN DEL PARQUE NACIONAL

NATURAL PARAMILLO, EN CÓRDOBA, COLOMBIA.

UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO
TRABAJO DE GRADO
BOGOTÁ D.C.
2019- I

3
EVALUACIÓN DEL USO DEL GLIFOSATO SOBRE LA MICROBIOTA DEL
SUELO, EN LA ZONA DE AMORTIGUACIÓN DEL PARQUE NACIONAL
NATURAL PARAMILLO, EN CÓRDOBA, COLOMBIA.

DEBBYE CAROLINA CASTAÑEDA NEUTA

ANGELICA MARIA CONTRERAS GARZON
INGRID DANIELA AGUILAR LOPEZ

Mg. LIGIA CONSUELO SÁNCHEZ LEAL

Asesora
Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca

UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO
TRABAJO DE GRADO
BOGOTÁ D.C.
2019- I

4
DEDICATORIA

Especialmente a mi madre, por su amor incondicional y fuerza inquebrantable,

te mereces el mundo entero.
A mi padre por su esfuerzo y trabajo constante, gracias por plasmar en mi tu
arranque.
A Luis Angel, por su cariño, tiempo y paciencia, a lo largo de estos años nunca
me has dejado combatir sola en el campo de batalla.
A ti mi pequeña niña “Sammy Kaori” por ser luz en la oscuridad, por ser mi
maestra de la vida y mi mayor ejemplo.
A mis compañeras Angelica y Daniela, por los cientos de anécdotas juntas que
siempre recordaré con amor.
Debbye

Este trabajo se debe al esfuerzo y apoyo de muchas personas, que me

acompañaron en este camino. Dedico este trabajo a Dios por hacer posible la
realización de este proyecto.
A mis padres Melba y Oswaldo, por estar presentes en cada uno de las etapas
de mi vida y en los pasos que me llevaron a la culminación de esta etapa de mi
vida.
A mis hermanos Ángela y Santiago por la compañía, la paciencia y por sentir
mis logros como propios.
A mis abuelitos José y Luisa, por su amor, apoyo y compañía en todos los
momentos importante de mi vida.
A mi novio, por estar presente en cada una de las facetas de este trabajo y
brindarme su apoyo incondicional.
A mis compañeras de tesis, Angélica y Debbye, por ser amigas incondicionales
y por afrontar con paciencia y dedicación la realización de este proyecto.
Daniela

5
Dedico este trabajo primeramente a Dios por permitirme culminar esta etapa de
mi vida.
A mis papas Amanda y Saul, por su amor y apoyo incondicional especialmente
en estos últimos 5 años, gracias por sus buenos consejos y por ser los
principales promotores de este sueño
A mis hermanos por su confianza y colaboración en todo momento
A mi novio por ser un compañero y amigo incondicional y sobre todo por su
motivación constante
A mi bebe que estuvo en mi vientre y me acompaño en cada momento para
poder culminar esta meta
A mis compañeras de tesis Daniela y Debbye por compartir momentos
inolvidables a lo largo de la carrera y especialmente por su dedicación para
realizar este trabajo.
Finalmente, a todos aquellos familiares y amigos por sus consejos y palabras
que me acompañaron a lo largo de mi carrera.
Angelica

6
AGRADECIMIENTOS

A la universidad Colegio Mayor de Cundinamarca por habernos prestado sus

instalaciones para la culminación de este proyecto y ser escenario de
diferentes conocimientos y experiencias a lo largo de nuestra carrera

A la profesora Ligia Consuelo Sánchez por ser nuestra asesora y depositar su

confianza, tiempo, esfuerzo y paciencia, por siempre escucharnos y
aconsejarnos para cumplir nuestros sueños, especialmente la culminación de
nuestro proyecto.

A la profesora Martha Lucía Posada, por su colaboración, consejos y

disposición para transmitirnos sus conocimientos con paciencia, respeto y
cariño.

A Don Agustín Hernández por permitirnos llevar a cabo este proyecto en su

maravilloso hogar, por su amabilidad, compañía y guianza.

A Luis Angel Canchila, por su tiempo y disposición para ayudar desde el inicio
de este gran camino.

A nuestras familias y amigos por el apoyo en todos los momentos de alegría y

tristeza.

7
 TABLA DE CONTENIDO
PAG

INDICE DE FIGURAS ...................................................................................... 11

INDICE DE TABLAS ........................................................................................ 12
RESUMEN ....................................................................................................... 13
INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 16
OBJETIVOS ..................................................................................................... 19
OBJETIVO GENERAL .................................................................................. 19

OBJETIVOS ESPECIFICOS ......................................................................... 19

1. ANTECEDENTES ...................................................................................... 20
2. MARCO REFERENCIAL ........................................................................... 25
2.1 Municipio de Tierralta .............................................................................. 25

2.1.1 Parque Nacional Natural Paramillo ................................................... 26

2.1.2 Vereda Tuis Tuis, finca Tuti Fruti .................................................. 27

2.1.3 Zona de amortiguación Parque Nacional Natural Paramillo ............. 28

2.2 Generalidades de Glifosato ..................................................................... 29

2.2.1 Mecanismo de acción ................................................................... 31

2.2.2 Toxicidad ...................................................................................... 32

2.3 Historia en Colombia ........................................................................... 33

2.4 Generalidades del suelo...................................................................... 35

2.4.1 Propiedades físicas del suelo ....................................................... 36

2.4.2 Propiedades químicas del suelo ................................................... 36

2.4.3 Microorganismos del suelo .............................................................. 37

2.4.3.1 Bacterias..................................................................................... 38

- Bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPB) .................... 38

2.4.3.2 Actinomicetos ............................................................................. 39

2.4.4 Grupos funcionales presentes en el suelo ........................................ 39

2.4.4.1 Microorganismos fijadores de nitrógeno ..................................... 39

8
 2.4.4.2 Microorganismos celulolíticos ..................................................... 40

2.4.4.3 Microorganismos amilolíticos ...................................................... 41

2.4.4.4 Microorganismos proteolíticos .................................................... 41

2.4.4.5 Microorganismos solubilizadores de fosfato ............................... 42

2.4.5 Vía del shikimato............................................................................... 42

2.5 Metagenómica como alternativa para conocer el microbioma de un

ambiente ....................................................................................................... 44

2.5.1 Pasos de la metagenómica .......................................................... 45

2.5.1.1 Extracción de ADN metagenómico ............................................. 45

2.5.1.2 PCR ............................................................................................ 46

2.5.1.3 Electroforesis .............................................................................. 47

2.5.1.4 Secuenciación de próxima generación ....................................... 48

- Illumina............................................................................................. 48

- Ilumina Miseq .............................................................................. 49

2.6 Identificación Procariota por ARNr 16S ................................................... 49

2.7 Bioinformática ......................................................................................... 51

2.7.1 BLAST ........................................................................................... 51

2.7.2 QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology) ..................... 52

2.7.3 DADA2........................................................................................... 52

3. DISEÑO METODOLÓGICO ...................................................................... 54

3.1 Tipo de investigación .............................................................................. 54

3.2 Universo, población, muestra .................................................................. 54

3.2.1 Universo ............................................................................................ 54

3.2.2 Población .......................................................................................... 54

3.2.3 Muestra ............................................................................................. 54

3.3 Variables, indicadores ............................................................................. 54

3.3.1 Variable independiente: .................................................................... 54

3.3.2 Variable dependiente: ....................................................................... 55

9
 3.3.3. Indicadores ...................................................................................... 55

3.4 Hipótesis ................................................................................................. 56

3.5 Técnicas y procedimientos ...................................................................... 56

3.5.1 Ubicación de la zona de muestreo .................................................... 56

3.5.2 Recolección de muestras .................................................................. 57

3.5.3 Conservación de muestras ............................................................... 59

3.5.4 Análisis físico químico....................................................................... 59

3.5.5 Extracción de DNA genómico ........................................................... 60

3.5.6 PCR .................................................................................................. 61

3.5.7 Electroforesis .................................................................................... 61

3.5.8 Cuantificación ................................................................................... 62

3.5.9 Secuenciación .................................................................................. 62

3.5.9.1 Preparación de la biblioteca 16S ................................................ 62

3.5.9.2 Secuenciación ............................................................................ 63

3.5.10 Análisis bioinformático .................................................................... 63

4 RESULTADOS .............................................................................................. 64
4.1 PCR y electroforesis ............................................................................... 64

4.2 Análisis físico químico ............................................................................. 65

4.3 Análisis metagenómico ........................................................................... 67

4.3.1 Secuencias obtenidas ....................................................................... 68

4.3.2 Análisis metagenómico del gen ARNr 16S ....................................... 68

5 DISCUSIÓN .................................................................................................. 75
6 CONCLUSIONES........................................................................................ 100
7. RECOMENDACIONES .............................................................................. 101
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ............................................................... 102
ANEXOS ........................................................................................................ 117

10
 INDICE DE FIGURAS

PAG

FIGURA 1. MAPA DEL MUNICIPIO TIERRALTA, CÓRDOBA, COLOMBIA .. 25

FIGURA 2. MAPA DEL PARQUE NACIONAL NATURAL PARAMILLO,
CÓRDOBA, COLOMBIA ............................................................................ 26
FIGURA 3. MAPA DE LA FINCA TUTI FRUTI ................................................. 27
FIGURA 4. MAPA DE LA VEREDA TUIS TUIS ............................................... 28
FIGURA 5. FORMULA ESTRUCTURAL DE GLIFOSATO Y SAL ISOPROPIL
AMINA DE GLIFOSATO. ........................................................................... 29
FIGURA 6. MECANISMO DE ACCIÓN DEL GLIFOSATO .............................. 31
FIGURA 7. RUTA DEL SHIKIMATO ................................................................ 43
FIGURA 8. RUTA DE CORISMATO ............................................................... 43
FIGURA 9. REGIONES ENCONTRADAS EN EL ARNR 16S. ......................... 50
FIGURA 10. UBICACIÓN GEOGRÁFICA DEL DEPARTAMENTO DE
CÓRDOBA................................................................................................. 56
FIGURA 11. MAPA VEREDA TUIS TUIS ......................................................... 57
FIGURA 12. MAPA DE LA FINCA TUTI FRUTI ............................................... 58
FIGURA 13. PCR DE LA REGIÓN 16S DEL ARNR DE MUESTRAS DE
SUELO DE LA ZONA DE AMORTIGUACIÓN DEL PARQUE NACIONAL
NATURAL PARAMILLO, CÓRDOBA......................................................... 64
FIGURA 14. MAPA DE CALOR DE LA COMPOSICIÓN E IDENTIFICACIÓN
PROCARIOTA A NIVEL DE FILO. ............................................................ 69
FIGURA 15. MAPA DE CALOR DE LA COMPOSICIÓN E IDENTIFICACIÓN
PROCARIOTA A NIVEL DE CLASE. ......................................................... 70
FIGURA 16. MAPA DE CALOR DE LA COMPOSICIÓN E IDENTIFICACIÓN
PROCARIOTA A NIVEL DE ORDEN......................................................... 71
FIGURA 17. MAPA DE CALOR DE LA COMPOSICIÓN E IDENTIFICACIÓN
PROCARIOTA A NIVEL DE FAMILIA........................................................ 72
FIGURA 18. MAPA DE CALOR DE LA COMPOSICIÓN E IDENTIFICACIÓN
PROCARIOTA A NIVEL DE GÉNERO ...................................................... 73
FIGURA 19. MAPA DE CALOR DE LA COMPOSICIÓN E IDENTIFICACIÓN
PROCARIOTA A NIVEL DE ESPECIE ...................................................... 74

11
 INDICE DE TABLAS
PAG

TABLA 1. INDICADORES ................................................................................ 55

TABLA 2. DESCRIPCIÓN DE ZONAS DE MUESTREOS. .............................. 58
TABLA 3. CICLAJE Y TEMPERATURA DE LA PCR ....................................... 61
TABLA 4. RESULTADOS ELEMENTOS MAYORES DE MUESTRAS DE
SUELO DE LA ZONA DE AMORTIGUACIÓN DEL PARQUE NACIONAL
NATURAL PARAMILLO, CÓRDOBA......................................................... 65
TABLA 5. RESULTADOS RELACIONES CATIÓNICAS DE MUESTRAS DE
SUELO DE LA ZONA DE AMORTIGUACIÓN DEL PARQUE NACIONAL
NATURAL PARAMILLO, CÓRDOBA......................................................... 66
TABLA 6. RESULTADOS DE OTROS PARÁMETROS ANALIZADOS EN
MUESTRAS DE SUELO DE LA ZONA DE AMORTIGUACIÓN DEL
PARQUE NACIONAL NATURAL PARAMILLO, CÓRDOBA ..................... 67
TABLA 7. NÚMERO DE SECUENCIAS OBTENIDAS ..................................... 68

12
 UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO

EVALUACIÓN DEL USO DEL GLIFOSATO SOBRE LA MICROBIOTA DEL

SUELO, EN LA ZONA DE AMORTIGUACIÓN DEL PARQUE NACIONAL
NATURAL PARAMILLO, EN CÓRDOBA, COLOMBIA.

RESUMEN

El glifosato es un herbicida de amplio espectro utilizado para la erradicación de

cultivos ilícitos y para el control de malezas en cultivos lícitos de importancia
agrícola. En Colombia, en los últimos años, su uso ha tenido un gran auge,
debido al incremento de cultivos de coca, marihuana y amapola, ocasionando
variaciones en la microbiota presente en el suelo, de acuerdo con
investigaciones previas. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del uso
de glifosato sobre la diversidad de poblaciones microbianas presentes en el
suelo de la zona de amortiguación del parque Nacional Natural Paramillo,
Córdoba, Colombia. La metodología incluyó la recolección de muestras de
suelo de dos zonas diferentes del parque: suelo impactado con glifosato y

13
suelo sin contacto previo con glifosato, para esto se tuvo en cuenta el formato
de concepto técnico sobre daño ambiental emitido por el Parque Nacional
Natural Paramillo. Se realizó extracción de ADN mediante el kit comercial
ZymoBIOMICS™ DNA Miniprep, el cual fue analizado mediante la plataforma
de secuenciación de segunda generación Illumina Mi Seq, a partir de las región
16S del rRNA de procariotas. Para el suelo con glifosato se obtuvieron 55414
secuencias crudas y 219 OTU y para el suelo sin glifosato se obtuvieron 56656
secuencias crudas y 405 OTUs, respecto a los parámetros taxonómicos
predominantes se encontró: Filo Proteobacterias (30.8% y 34.9%), Clase
Alphaproteobacteria (18.27% y 24.56%), Orden Rhizobiales (12.2% y 15.2%),
Familia Xanthomonadaceae (2.9% y 0.0%), Género Acidothermus (4.2% y
4.5%) y finalmente Especie defluvii-equi-niigatensis (2.0% y 0.9%).

SUMMARY

Glyphosate is a broad-spectrum herbicide used for the eradication of illicit crops

and for the control of weeds in licit crops of agricultural importance. In
Colombia, in recent years, its use has had a great boom, due to the increase in
coca, marihuana and poppy crops, causing variations in the microbiota present
in the soil, according to previous research. The objective of this work was to
evaluate the effect of the use of glyphosate on the diversity of microbial
populations present in the soil of the buffer zone of the Parque Nacional Natural
Paramillo, Córdoba, Colombia. The methodology included the collection of soil
samples from two different areas of the park: soil impacted with glyphosate and
soil without previous contact with glyphosate, for this the format of the technical
concept on environmental damage emitted by the Parque Nacional Natural
Paramillo was taken into account. DNA extraction was carried out using the
commercial kit ZymoBIOMICS ™ DNA Miniprep, which was analyzed using the
second generation sequencing platform Illumina Mi Seq, from the 16S region of
prokaryotic rRNA. For the soil with glyphosate 55414 crude sequences and 219
OTU were obtained and for the soil without glyphosate 56656 crude sequences
and 405 OTUs were obtained, with respect to the predominant taxonomic
parameters found: Phylum Proteobacteria (30.8% and 34.9%), Class

14
Alphaproteobacteria ( 18.27% and 24.56%), Order Rhizobiales (12.2% and
15.2%), Family Xanthomonadaceae (2.9% and 0.0%), Genus Acidothermus
(4.2% and 4.5%) and finally Species defluvii-equi-niigatensis (2.0% and 0.9% ).

PALABRAS CLAVES: Glifosato, sistemas agroforestales, microbiota,

metagenómica, ARN, secuenciación de segunda generación, ilumina, Parque
Nacional Natural Paramillo.

Estudiantes Ingrid Daniela Aguilar López

Debbye Carolina Castañeda Neuta

Angélica María Contreras Garzón

Docentes Ligia Consuelo Sánchez Leal

Fecha 2019-I Institución UCMC

15
 INTRODUCCIÓN

El glifosato es un herbicida no selectivo de amplio espectro utilizado a nivel

mundial desde los años 70, principalmente para el control de malezas o
arvenses en diversos cultivos de importancia agrícola como el arroz, oliva, caña
de azúcar, sorgo, entre otros (1). Algunas investigaciones afirman, que se han
producido daños irreversibles en el ambiente, como la contaminación de
fuentes hídricas, disminución de la biodiversidad de flora y fauna presentes en
las zonas; afectando la salud de los pobladores, en especial a los cultivadores
poniendo en peligro la seguridad alimentaria al afectar los cultivos
comerciales(2). Todo esto implica una alteración en el ecosistema del suelo
debido al efecto directo sobre varios componentes del microbioma, como
bacterias, hongos y actinomicetos, las cuales son comunidades esenciales
porque son los encargados de los ciclos biogeoquímicos. En este sentido, el
uso del glifosato afecta las reacciones bioquímicas propias de cualquier planta,
incidiendo en el desarrollo y la nutrición vegetal (3). Por otro lado, también se
han reportado beneficios en el uso del glifosato para la producción de cultivos
importantes para consumo humano, ya que asegura la eliminación de las
malezas invasivas y nocivas que afectan o disminuyen su rendimiento (4). Sin
embargo, los residuos de glifosato en cualquier alimento no presentan riesgos
para los consumidores siempre y cuando cumplan con las tolerancias
establecidas por la EPA (Agencia de Protección Ambiental de Estados
Unidos)(5).

Al respecto, un estudio realizado en plantaciones de olivo, en la provincia de

Córdoba, Argentina demuestra que la aplicación de glifosato puede producir
una rápida y duradera reducción de la actividad microbiana total y alterar su
estructura, con un mayor impacto en suelos sin historial de aplicación de
herbicidas (6). La metagenómica es una herramienta de última generación que
se utiliza en la actualidad para realizar el análisis de las diferentes especies
que conforman un nicho ambiental, sin utilizar un proceso de aislamiento y
recuperación por microbiología tradicional. Los datos que se obtienen permiten

16
construir librerías para la identificación de nuevos microorganismos y los ya
descritos, mediante técnicas de secuenciación.

De acuerdo con los datos recolectados para esta investigación, el día 12 de

enero del año 2013, la Dirección Nacional de Estupefacientes realizó por
primera y única vez la fumigación aérea con glifosato en la vereda Tuis Tuis del
municipio de Tierralta, donde fueron afectadas áreas de establecimiento de
sistemas agroforestales en la finca Tuti Fruti, ubicada en la zona de
amortiguación del Parque Nacional Natural Paramillo. Los cultivos que ha
producido esta finca, son variedades forestales maderables de gran valor
comercial, forestales no maderables y varias plantaciones frutales. En total, el
área afectada fue de aproximadamente 2 hectáreas y se registraron en total mil
seiscientos cincuenta (1.650) árboles afectados. Dichos datos obtenidos a
partir del inventario forestal realizado por el Parque Nacional Natural Paramillo,
constituyen la justificación para la presente investigación. El objetivo fue
evaluar el efecto que tiene el uso de glifosato sobre la diversidad de
poblaciones microbianas en suelos de dos zonas diferentes de la finca Tuti
Fruti; 1) zona con vegetación, animales y suelo impactado con glifosato por
error, en proceso de reforestación desde el año 2014 y 2) zona sin impacto con
glifosato, mediante análisis metagenómico. Para determinar la diferencia entre
los dos suelos se tuvo en cuenta el concepto técnico sobre daño ambiental
ocasionado por la fumigación aérea con glifosato sobre área con sistemas
agroforestales, emitido por la oficina de Tierralta del Parque Nacional Natural
Paramillo, donde se realizó un inventario forestal al cien por ciento, para tener
precisión de la cantidad de árboles afectados y los datos silviculturales de cada
uno de ellos.

Los resultados del análisis metagenómico permiten establecer que para la

muestra de suelo con glifosato y suelo sin glifosato, predominan los Filos
Proteobacteria (30.8% y 34.9%), Acidobacteria (15.7% y 33.0%) y
Actinobacteria (13.9% y 8.7%), a nivel de Clase se presentó alta abundancia de
Alphaproteobacteria (18.3% y 24.6%), Acidobacteria (14.7% y 32.7%) y
Actinobacteria (11.3% y 7.1%), a nivel de Orden tuvo mayor relevancia
Acidobacteriales (5.7% y 10.6%), Rhizobiales (12.2% y 15.2%) y

17
Rhodospirillales (5.8% y 9.0%), en el caso de las familias se encontró en mayor
cantidad Xanthobacteraceae (4.8% y 8.2%), Planctomycetaceae (7.1% y 3.9%),
a nivel de género predominó Acidothermus (4.2% y 4.5%) y Solibacter (1.1% y
4.6%) y finalmente las especies más representativas fueron defluvii-equi-
niigatensis (2.0% y 0.9%) y paradoxus (0.1% y 1.8%).

18
 OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Evaluar el efecto que tiene el uso de glifosato sobre la diversidad de

poblaciones microbianas presentes en el suelo de la zona de amortiguación del
Parque Nacional Natural Paramillo, en Córdoba, Colombia.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

 Caracterizar las diferentes comunidades procariotas presentes en el

suelo de áreas de establecimiento de sistemas agroforestales, de la
zona de amortiguación del Parque Nacional Natural Paramillo, en
Córdoba, Colombia por medio de metagenómica.
 Relacionar las propiedades fisicoquímicas de los diferentes suelos: suelo
impactado con glifosato y suelo sin contacto previo con glifosato, con los
resultados obtenidos del análisis metagenómico.
 Comparar la microbiota presente en el suelo con previa exposición a
glifosato, frente a la microbiota presente en el suelo que no ha sido
tratado con dicho herbicida.

19
 1. ANTECEDENTES

El uso de herbicidas para control de malezas es reconocido ampliamente a

nivel mundial, en el manejo de cultivos de importancia para el consumo
humano desde hace más de 30 años. Dentro del grupo de los herbicidas, el
más importante y de mayor uso es el glifosato (2). Diversos estudios han
centrado sus investigaciones en evidenciar el impacto que tiene el uso del
glifosato sobre los seres vivos y en particular en las comunidades microbianas
presentes en el suelo. Los interrogantes sobre si este herbicida altera o no la
microbiota ha sido tema de diversas discusiones, debido a los diferentes
resultados y conclusiones de los investigadores.

Malty JS, Siqueira JO, Moreira FMS en 2006 (7) centraron sus investigaciones
en el efecto que tiene la aplicación in vitro de glifosato en concentraciones
crecientes (0–454 µM) sobre Bradyrhizobium elkanii, Bradyrhizobium japonicum
y sobre tres especies de hongos micorrízicos arbusculares (AMF): Gigaspora
margarita, Glomus etunicatum y Scutellospora heterogaman, donde se
encontró que el glifosato inhibió el crecimiento de las cepas de Bradyrhizobium
spp y AMF en los medios de cultivo solo cuando las concentraciones fueron
mayores a 7µM, concentración recomendada para el uso en el campo.

Un estudio realizado en Colombia por Cuervo Andrade JL en 2007 (1),

demostró la interacción del glifosato con la microbiota del suelo y su
comportamiento en suelos utilizados para fines agrícolas en el departamento
del Tolima. Este estudio se realizó por microbiología convencional en materas y
bajo condiciones de invernadero que simulaban las condiciones de uso del
herbicida en cultivos de arroz. Como resultado se obtuvo que las bacterias
fueron el grupo más sensible al glifosato en comparación con los hongos y
actinomicetos, aunque diversos morfotipos bacterianos fueron tolerantes al
compuesto, a concentraciones más altas del herbicida, las poblaciones
microbianas se redujeron de manera considerable y en muchos casos
desaparecieron.

Por otra parte, Martínez Nieto P, Bernal Castillo J, Fonseca Agudelo E, Bernier
Lopez S. en 2012 (8), evaluaron la degradación del glifosato y la resistencia
que presentan determinadas bacterias a diferentes concentraciones de este
20
compuesto, como Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens,
Burkholderia gladioli y Flavimonas oryzihabitans, mediante técnicas analíticas
como la curva de crecimiento bacteriano, prueba turbidimétrica, pruebas de
antagonismo, toxicidad y cromatografía. En este estudio, se obtuvo como
resultado diferentes patrones de tolerancia al herbicida; en el caso de P.
aeruginosa se obtuvo un 10%, P. fluorescens y B. gladioli un 2.0 % y para F.
oryzihabitans 0.25%. En el caso de los consorcios B. gladioli + P. fluorescens +
F. oryzihabitans se observó una tolerancia del 20% en relación al consorcio P.
fluorescens + P. aeruginosa, el cual presento una tolerancia del 30%.

Un estudio similar, ejecutado por Chaves Bedoya G, Ortíz Moreno ML, Ortiz
Rojas LY en 2013 (9), en cultivos de arroz en los Llanos orientales de
Colombia, demostró que la aplicación de glifosato, así como de otros
agroquímicos, pueden impactar de diferentes maneras los microorganismos
que se encargan de la descomposición de la materia orgánica en el suelo. En
el caso del suelo con glifosato, se encontró que poblaciones como los
actinomicetos no fueron afectadas de forma negativa, en comparación con los
microorganismos solubilizadores de fosforo, los cuales disminuyeron su
abundancia cuando se comparó el suelo control ( UFC/g) con el suelo
tratado con glifosato (< UFC/g). Por otro lado hongos como Penicillium y
Fusarium fueron eliminados completamente por este herbicida.

Uno de los puntos más importantes que parece tener mucha importancia por la
toxicidad que se produce, es la tolerancia que presentan ciertos cultivos a
herbicidas como el glifosato, ya sea a su ingrediente activo o a la formulación
comercial. A partir de esta premisa, Allegrini M, Zabaloy MC, Gómez Edel V.
en 2015 (10) evaluaron la tolerancia al glifosato por parte de la microbiota
mediante la extracción y cuantificación de ADN, PCR en tiempo real y
electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE). Se encontró, que
en suelos con previa exposición al herbicida existe una mayor tolerancia al
glifosato en comparación con suelos sin historial de exposición.

21
Aunque se han llevado a cabo investigaciones sobre la respuesta a corto plazo
al glifosato, aún se dispone de poca información sobre los efectos a largo
plazo, es por esto que Newman MM, Hoilett N, Lorenz N, Dick RP, Liles MR,
Ramsier C, et al. en 2016 (11) investigaron los cambios en la comunidad
bacteriana de la rizosfera después de la aplicación de glifosato a largo plazo en
plantas de maíz y soja de invernadero, haciendo uso de secuenciación de
próxima generación en la que se comparó la composición bacteriana entre
rizosferas tratadas y no tratadas con glifosato, después de 4 periodos de
crecimiento. Se encontró que en microorganismos como las Proteobacterias su
abundancia aumentó, mientras que en las Acidobacterias la abundancia
relativa, disminuyó, en las rizosferas tratadas con glifosato

Como se puede evidenciar, hay diferencias entre los resultados obtenidos en

las distintas investigaciones. La investigación realizada por Nguyen DB, Rose
MT, Rose TJ, Morris SG, van Zwieten L. en 2016 (12), en donde se hizo un
meta-análisis, y se evaluaron variables como: la concentración de glifosato, el
pH del suelo, el carbono orgánico (CO), presencia o ausencia de plantas y
además, si el experimento se realizó en campo abierto o maceta. Los
resultados obtenidos en ese estudio, no pudieron confirmar que el glifosato
tenga un impacto positivo o negativo en las comunidades microbianas del
suelo, pero se determinó, que el impacto del glifosato sobre la microbiota
presente en el suelo y su respiración es muy variable y depende de parámetros
experimentales específicos, como la dosis de glifosato aplicado, el tiempo de
incubación y las características del suelo, incluyendo carbono orgánico y pH.

En países como Dinamarca, el uso del glifosato representa el 35% de todos los
pesticidas utilizados con fines agrícolas. Imparato V, Santos SS, Johansen A,
Geisen S, Winding A en 2016 (13), evaluaron el efecto indirecto del glifosato en
las plantas y comunidades microbianas de la rizosfera en plantas de cebada. El
estudio se llevó a cabo mediante la utilización de diferentes técnicas, que van
desde cultivo microbiológico tradicional hasta técnicas moleculares como el
análisis del gen ARNr 16S por medio de la electroforesis de gel de gradiente
desnaturalizante (DGGE). Como resultado se obtuvo que las raíces se ven
afectadas con la aplicación de este herbicida; por otro lado, se evidencio que la

22
aplicación foliar del herbicida a concentraciones idóneas duplicó la abundancia
tanto de bacterias como de protistas cultivables en la rizosfera.

El desarrollo de la metagenómica, metatranscriptómica y metabolómica como

parte de las técnicas moleculares permite tener una información a través de la
cual se realiza el análisis del material genético total (metagenoma) de las
comunidades pertenecientes a un nicho ambiental específico, su distribución y
funcionalidad. Estas nuevas tecnologías estudian la interacción de diferentes
compuestos con la cantidad y diversidad de microorganismos que se
encuentran en el suelo.

Por su parte, Newman MM, Lorenz N, Hoilett N, Lee NR, Dick RP, Liles MR,
et al. en 2016 (14) investigaron los cambios en la expresión de genes
bacterianos de microorganismos presentes en la rizosfera, después de la
aplicación de glifosato en plantas de maíz tolerantes al herbicida y plantas de
soja como respuesta a un tratamiento de largo plazo en condiciones de
invernadero, por medio del análisis de ácidos grasos derivados de fosfolípidos
(PLFA) a partir de 2g de suelo, utilizando una mezcla de una sola fase de
cloroformo, metanol y tampón de citrato acuoso para su extracción,
posteriormente dichos lípidos fueron separados por medio de columnas de
ácido salicílico y analizados por Cromatografía de Gases (CG) y análisis de
ARN-Seq . Como resultado se encontró que, el tratamiento con glifosato
aumentó la expresión de 22 genes relacionados con el metabolismo de
aminoácidos y carbohidratos; sin embargo, se evidencio una disminución de los
biomarcadores bacterianos (PLFA) y de todos los hongos después del
tratamiento con dicho herbicida a largo plazo.

Por otra parte, una de las investigaciones más recientes realizada por Zabaloy
MC, Allegrini M, Tebbe DA, Schuster K, Gomez Edel V. en 2017 (15)
evaluaron el efecto del glifosato en la actividad microbiana global y la actividad
de nitrificación de los microorganismos presentes, mediante la extracción de
ADN y el uso de técnicas como PCR cuantitativa y electroforesis. En este
estudio, se determinó que las procariotas nitrificantes no se vieron afectadas
por la aplicación de glifosato, ni por el tiempo de incubación al que fue

23
expuesto; por el contrario, el tiempo de incubación mostró una interacción
significativa de los microorganismos con el herbicida, que influyó en la
abundancia de bacterias oxidantes de amoniaco y Arqueas.

24
 2. MARCO REFERENCIAL

2.1 Municipio de Tierralta

El Municipio de Tierralta está ubicado en la parte sur-occidental del

Departamento de Córdoba, Colombia (Figura 1); por el norte, con una latitud de
8° 10´ y por el oeste con una longitud 76° 04´ del meridiano de Greenwich.
Presenta una altitud de 51 metros sobre el nivel del mar y una superficie
territorial de 5.079 km², lo que lo convierte en el municipio más extenso del
departamento (16).

El Municipio se encuentra en la zona de influencia de la cuenca alta del rio

Sinú, el cual, en su recorrido, es alimentado por sus principales afluentes: El
Rio Verde, El Río Esmeralda y el Rio Manso (17).

Figura 1. Mapa del municipio Tierralta, Córdoba, Colombia (18)

25
 2.1.1 Parque Nacional Natural Paramillo

El Parque Nacional Natural Paramillo es una de las 59 áreas protegidas del

Sistema de Parques Nacionales Naturales de Colombia, creada en el año
1977, reservándose 460.000 ha. Este parque busca conservar la diversidad
biológica, el patrimonio cultural y los servicios ambientales de la nación y en
particular de la región noroccidental de Colombia. Tiene una ubicación
privilegiada pues allí nacen los ríos Sinú y San Jorge, con ecosistemas de
páramo, ciénagas, entre otros. Recibe su nombre de Paramillo, debido al área
protegida de páramos que se encuentra en Antioquia, más específicamente en
el municipio de Ituango y que hace parte del parque (Figura 2) (19).

Figura 2. Mapa del Parque Nacional Natural Paramillo, Córdoba, Colombia(20)

El parque Paramillo integra diversidad de ecosistemas y concentración de

biodiversidad, siendo una de las más importantes del país. Tiene elementos de

26
ecosistemas ubicados en el Caribe y Chocó. Se destaca su importancia para la
cultura al estar en el punto exacto de la unión entre centro y Suramérica, la
última ramificación de los Andes y ser una conexión entre Oriente y Occidente
colombiano. Aunque es un parque muy especial e importante para Colombia,
es uno de los menos conocidos del país, de los menos estudiados y con más
problemáticas de tipo ambiental como la minería, ocupación campesina, entre
otras (19).

2.1.2 Vereda Tuis Tuis, finca Tuti Fruti

La finca Tuti Fruti (Figura 3) se encuentra ubicada en la Vereda Tuis Tuis

(Figura 4), del municipio de Tierralta en el departamento de Córdoba, haciendo
parte de la zona amortiguadora del Parque Nacional Natural Paramillo, la cual
es considerada una de las reservas forestales turísticas más visitadas de la
región. En la actualidad la vereda Tuis Tuis, junto con los demás
corregimientos del municipio se encuentran inmersos en el Plan de Desarrollo
Municipal 2016-2019 y el anterior Plan de Desarrollo Ambiental 2012-2015, los
cuales se vienen trabajando en los últimos años con el fin de reconocer,
indagar y dar solución a los diferentes problemas tanto socioeconómicos como
ambientales del municipio.

Figura 3. Mapa de la finca Tuti Fruti

Foto Tomada del cuaderno topográfico de la vereda

27
Figura 4. Mapa de la Vereda Tuis Tuis (21)

2.1.3 Zona de amortiguación Parque Nacional Natural Paramillo

“Las áreas de amortiguación son zonas externas, aledañas y circunvecinas a

las áreas protegidas del Sistema de Parques Nacionales Naturales para el caso
de Colombia. Tienen un régimen de uso y manejo diferente, con el fin de
atenuar las perturbaciones causadas por la actividad humana en las zonas
circunvecinas de las áreas protegidas, para impedir que se causen disturbios o
alteraciones en la ecología o en la vida silvestre” (22)

Las áreas protegidas tiene como objetivo conservar una gran diversidad
biología de los recursos naturales de la zona, por medio de la implementación
de acciones de control y vigilancia, debido a los procesos de degradación
ambiental causados por el hombre. La zona amortiguadora del Parque
Nacional Natural Paramillo se localiza en la jurisdicción de once municipios; 3
localizados en el departamento de Córdoba y ocho en Antioquia. Para el plan
de manejo se identifican trece áreas dentro de la zona propuesta como
amortiguadora de los once municipios: Tierralta, Puerto Libertador,
Montelíbano, Tarazá, Ituango, Peque, Dabeiba, Mutatá, Chigorodó, Carepa y
Apartadó. Se trabaja con las autoridades ambientales regionales como:
Corporación Autónoma Regional de Los Valles del Sinú y el San Jorge- CVS-,

28
La Corporación para el Desarrollo Sostenible del Urabá-Corpourabá- y la
Corporación para el Desarrollo del Centro de Antioquia-Corantioquia- (23).

2.2 Generalidades de Glifosato

El glifosato (N-fosfonometil glicina) con formula molecular C3H8NO5P, es un

herbicida de amplio alcance utilizado especialmente por los agricultores para
erradicar plantas consideradas maleza y cultivos ilícitos que puedan crecer en
el área rural (24). Las plantas absorben el glifosato y dejan de producir
aminoácidos que son esenciales para su crecimiento como: Tirosina,
fenilalanina y triptófano; de esta manera, el producto impide el desarrollo de la
planta (25). Dicho herbicida es formulado comercialmente como sal
isopropilamina (Figura 5) y pertenece al grupo de las glicinas, está constituido
por tres componentes básicos: 1) Sal isopropilamina de glifosato, que es su
ingrediente activo, 2) Un agente tensoactivo, donde el más común es el POEA
(Polioxietil amina) y 3) agua (1).

Figura 5. Formula estructural de Glifosato y sal isopropil amina de glifosato (1).

El glifosato fue patentado por primera vez por la compañía estadounidense

Stauffer Chemical en 1964, era utilizado como un quelante de metal para la
limpieza y descalcificación de calderas comerciales y tuberías que eliminaban
minerales como: calcio, magnesio, manganeso, cobre y zinc (26). En 1970 fue
patentado por la empresa Monsanto de origen estadounidense; su uso se
incrementó sustancialmente a través del tiempo, principalmente por la aparición
de las semillas de soya transgénicas que son resistentes a este producto (27).
La empresa Monsanto aplicó un audaz plan de negocios con su producto
estrella: el glifosato, para lo cual invirtieron en innovación de semillas

29
transgénicas de diversos rasgos genéticos; éstas debían ser resistentes al
plaguicida para asegurar la venta tanto de las semillas como del glifosato. Es
por esto que Monsanto se conoció por mucho tiempo como el “zar de los
transgénicos y del glifosato” (28).

El uso de este tipo de productos se debe al crecimiento demográfico que

conlleva a la necesidad de más alimentos por lo que los productores deben
asegurar el éxito de sus cosechas y el rendimiento de la producción para evitar
pérdidas tanto económicas como de alimentos. En este sentido, el glifosato es
utilizado como uno de los métodos de prevención y/o emergencia contra plagas
que permitan satisfacer la demanda de productos agrícolas (8).

Sin embargo, la preocupación por los efectos que puedan causar estos
plaguicidas en la salud de forma directa o indirecta ha venido en aumento en
los últimos años. Al respecto, la Organización Mundial de la Salud en el año
2015 reclasificó el glifosato como probablemente cancerígeno para los
humanos (29). En 2016 un Tribunal de San Francisco, California, condenó a la
compañía Monsanto, quien produce el conocido Round up (nombre comercial
del glifosato) por 286 millones de dólares, al encontrar que la línea de atención
médica de Monsanto había ignorado las solicitudes de información sobre la
relación del glifosato y el cáncer de linfoma no hodgkiniano que hizo Dewayne
Johnson, un jardinero que usó el producto durante dos años. “Una vez
diagnosticado, Johnson siguió usando el producto, lo que según el dictamen
médico agravó su estado de salud y derivó en que su cáncer pasara de tratable
a terminal” (30). Para el año 2018 un estudio realizado por la Universidad de
Oxford encontró que personas con una exposición continua al glifosato mayor a
108 días tienen mayor riesgo de desarrollar leucemia mieloide aguda (31). En
el último comunicado de prensa publicado por la EPA (Agencia de Protección
Ambiental de los Estado Unidos) el día 30 de Abril del año 2019, se declara
que el glifosato no presenta ningún riesgo para la salud pública, siempre y
cuando sea utilizado de la forma correcta, siguiendo las especificaciones
descritas en el producto (32).

30
 2.2.1 Mecanismo de acción

“El glifosato es una sal isopropilamina de N-(fosfonometil) glicina, con un peso

molecular de169.073 g/mol , el cual es un herbicida no selectivo, sistémico de
acción foliar” (2), por lo que es absorbido por la planta mediante sus hojas y
una vez dentro, se desplaza por el tejido vegetal donde es poco metabolizado.

El mecanismo de acción del glifosato consiste principalmente en la inhibición

de la biosíntesis de aminoácidos aromáticos (triptófano, fenilalanina y tirosina)
en las plantas, además de inhibir la enzima 5-enolpiruvil- shikimato-3-fosfato-
sintetasa (EPSPS), disminuyendo la producción y desarrollo de proteínas.
Posteriormente, se altera el proceso de catálisis por la enzima EPSPS en la vía
del shikimato, reduciendo la biosíntesis de otros compuestos tales como;
tetrahidrofolato, ubiquinona y vitamina K (Figura 6) (2).

Figura 6. Mecanismo de acción del glifosato (33)

Esto puede explicar, por qué las plantas a las que se les aplican herbicidas tipo
glifosato no continúan el proceso de fotosíntesis, incluso antes de que la
inhibición de la síntesis de aminoácidos sea descubierta. Todos estos procesos
en conjunto son los que originan poco a poco la muerte de las plantas que son
expuestas al glifosato, primero muestran clorosis y luego necrosis.

31
 2.2.2 Toxicidad

“En el aspecto regulatorio la Agencia de Protección Ambiental de los Estados

Unidos de América (EPA) considera al glifosato como de toxicidad clase II,
toxicidad aguda dérmica y oral relativamente baja (los químicos de clase I, son
los de mayor toxicidad en la escala de I a IV)” (34).

En el uso de glifosato, la verdadera toxicidad la causa el surfactante con el cual

se mezcla para ser aplicado en las plantas. El surfactante más utilizado es el
POEA que desacopla elementos de la fosforilación oxidativa, provocando
estrés oxidativo (2).

Por otro lado, un estudio realizado por Camacho A. y Mejia D (35), donde
analizaron un conjunto de datos recopilados por el Ministerio de Salud,
demostró el aumento en el número de consultas médicas asociadas a
problemas dermatológicos, respiratorios y abortos involuntarios. Estos
problemas se han relacionado con el daño en el material genético de los
individuos, desencadenando mutaciones involucradas en el desarrollo de
cáncer y aborto. Así mismo, diferentes investigaciones han basado sus
estudios en el surfactante POEA, ya que puede causar daño gastrointestinal,
dificultad para respirar, afecciones al sistema nervioso central y destrucción de
eritrocitos (2)

Si bien el glifosato y sus metabolitos han demostrado tener potencial tóxico de

manera individual, también es conocido que las preparaciones comerciales sí
son más citotóxicas que el glifosato como tal, lo cual refuerza la idea de que
son los aditivos que componen las formulaciones comerciales los que
aumentan la toxicidad que se le atribuye a los productos herbicidas a base de
glifosato (2).

32
 2.3 Historia en Colombia

El gobierno de Colombia desde el año 2000 ha estado utilizando fumigaciones

con herbicidas a gran escala con el propósito de acabar con los cultivos
ilegales de coca y plantas de amapola. Sin embargo, este mecanismo ha sido
ampliamente cuestionado, principalmente desde la perspectiva de los derechos
humanos. El inicio fue con el Plan Colombia del presidente Pastrana quien
quería lograr la paz mediante las negociaciones. Además, su plan de Gobierno
contemplaba una lucha antinarcóticos en todas las fases de este negocio,
desde la producción hasta la comercialización. Por ello, un mecanismo fue la
fumigación de los cultivos con herbicidas, asegurando que si destruyen la
materia prima, reduciría el suministro o la producción. Posteriormente, con la
llegada de Álvaro Uribe a la presidencia, el Plan Colombia inicia otra etapa,
pues, aunque no se logró la paz negociada, si se logró una lucha contra el
narcotráfico, especialmente de drogas ilícitas. Así, en el gobierno de Uribe, se
aumentó la erradicación de estos cultivos, mediante fumigación aérea y manual
por parte de los campesinos que accedían de manera voluntaria (36).

Más de 1.8 millones de hectáreas de coca han sido fumigadas con glifosato en
el país desde 1994, y 282.075 hectáreas en el Departamento del Putumayo
desde 1997. Las variaciones climáticas, la velocidad del avión, errores
humanos y tecnológicos, junto con otros factores, hicieron que bosques,
suelos, pastos, animales, cuencas, cultivos de consumo propio y personas
fueran constantemente rociados con glifosato en Colombia. Respecto a la
normativa en Colombia en la Resolución 1065 del 26 de noviembre de 2001, el
entonces Ministerio del Medio Ambiente, impuso el Plan de Manejo Ambiental
presentado por la Dirección Nacional de Estupefacientes (DNE), para la
actividad denominada “Programa de Erradicación de Cultivos Ilícitos mediante
la Aspersión Aérea con el herbicida Glifosato (PECIG), en el territorio nacional.
De acuerdo con los datos aprobados por el Instituto Colombiano Agropecuario
(ICA), el Ministerio acogió la dosis de 8 Litros/ha de la mezcla (Roundup 480
SL + Cosmoflux 411), siendo la máxima dosis a aplicar. De acuerdo a los

33
estudios realizados por el ICA, la DNE repetía la evaluación a los dos, tres, y
seis meses siguientes a la aspersión, con el fin de observar el estado de
recuperación de las plantas (37).

Mediante la Resolución 1214 del 30 de septiembre de 2015, la Autoridad

Nacional de Licencias Ambientales (ANLA), ordenó la suspensión del
Programa de Erradicación de Cultivos Ilícitos mediante la aspersión aérea con
Glifosato, en el territorio nacional. Sin embargo, en el año 2016 mediante la
Resolución 708 del 11 de julio, la ANLA, modificó el Plan de Manejo Ambiental
impuesto a la DNE en el sentido de autorizar la inclusión de una intervención
piloto inicial del Programa de Erradicación de Cultivos Ilícitos mediante
Aspersión Terrestre con el Herbicida Glifosato (PECAT), en las zonas
focalizadas por la Dirección de Antinarcóticos de la Policía Nacional, en los
departamentos de Antioquia, Córdoba, Norte de Santander, Santander, Bolívar,
César, Caquetá, Putumayo, Valle del Cauca, Cauca, Nariño, Chocó, Guaviare,
Meta y Vichada. El producto comercial a utilizar para el PECAT es el herbicida
CUSPIDE 480 SL, con base en el ingrediente activo grado técnico Glifosato. La
erradicación de cultivos por aspersión terrestre se realizará una vez al año por
lote, y será desarrollada por fases, definidas como: “FASE: periodo de trabajo
establecido para realizar la erradicación de cultivos ilícitos por un término de 60
días ” La dosis a utilizar en la aplicación no superará los 10,4 L/ha de producto
formulado, la cual es la autorizada en el registro del producto CUSPIDE 480
SL, en las modalidades: aspersora de espalda y aspersora Estacionaria y
EATBAND(38)(25).

Para el año 2017 el personero del municipio de Nóvita en Chocó, interpuso una
tutela (sentencia T-236 de 2017) en la que se reclamó la protección de los
derechos humanos, a la salud, a la identidad cultural y étnica y a la libre
determinación de los pueblos indígenas y afrodescendientes asentados en
varios corregimientos del municipio, ya que estas poblaciones fueron afectadas
por la aspersión aérea de glifosato que se venía desarrollando en el
departamento, debido a su presentación comercial en estado líquido, este por

34
medio de vientos y lluvia “van a parar a los cultivos lícitos, de los agricultores, a
las fuentes hídricas y a las zonas habitadas” (39).

En la actualidad, la sentencia T-236 DE 2017 sigue en proceso de investigación

por la Corte Constitucional, encargada de discutir el grado de avance en la
implementación de la misma, verificando el cumplimiento de las órdenes para
la reanudación correcta del PECIG (Programa de Erradicación de Cultivos
Ilícitos mediante la aspersión aérea con el herbicida Glifosato) en Colombia.
Por último, se encontró que la audiencia pública realizada el 7 de marzo del
2019 llevada a cabo en la Corte Constitucional, consideró que los derechos de
los pueblos indígenas, afro descendientes y campesinos de Nóvita, Chocó
fueron vulnerados (39).

2.4 Generalidades del suelo

El suelo es la capa superficial que envuelve la corteza terrestre, siendo uno de

los recursos naturales más importantes en el planeta. Se forma a partir de la
meteorización de las rocas a lo largo del tiempo, bajo condiciones ambientales
determinadas y sometido a la actividad de organismos vivos. Su importancia
radica en que es un elemento natural vivo y dinámico que constituye la interfaz
entre la atmósfera, litosfera, biosfera y la hidrosfera, sistemas con los cuales
mantiene un continuo intercambio de materia y energía. Así mismo, se
considera como un elemento frágil del medio ambiente, un recurso natural no
renovable ya que su velocidad de formación y regeneración es muy lenta,
mientras que los procesos que contribuyen a su degradación, deterioro y
destrucción son mucho más rápidos, por lo tanto, es clave en el desarrollo de
los ciclos biogeoquímicos, además de contribuir a elementos ambientales,
ecológicos, económicos, sociales y culturales (40).

35
 2.4.1 Propiedades físicas del suelo

Las propiedades físicas del suelo pueden observarse y medirse sin alterar
químicamente la composición del suelo, son el resultado de la interacción con
diversos elementos por ejemplo agua y aire, estas condiciones determinan la
rigidez, fuerza de sostenimiento, facilidad para la penetración de las raíces,
aireación, capacidad de drenaje y de almacenamiento de agua, plasticidad, y la
retención de nutrientes (41).

Una de las principales propiedades físicas del suelo es su estructura, la cual

hace referencia a la disposición física de las partículas (arena, limo y arcilla),
los poros que pueden ser macroporos o microporos y a la capacidad de las
partículas para formar agregados (42). Dicha estructura se encuentra
estrechamente relacionada con la textura del suelo y la disponibilidad de agua.
Otra característica física importante en el suelo, es el color, el cual puede
usarse para identificar algún tipo de suelo, está relacionado con los procesos
de pedogénesis y depende de factores como humedad, humus, materia
orgánica, compuestos minerales como: óxidos, sulfuros, sulfatos, carbonatos
que pueden estar presentes (41).

2.4.2 Propiedades químicas del suelo

Las propiedades químicas de los suelos son importantes para su fertilidad; por
ejemplo, la disponibilidad de nutrientes y la capacidad de intercambio de
cationes como: calcio, potasio y magnesio. Además, características químicas
de la solución del suelo llegan a afectar el pH y la salinidad del mismo(43).

En relación con el pH, su función es medir la concentración de iones de

hidrógeno cargados positivamente (H+) en la solución del suelo en una escala
logarítmica que va de 0 a 14. La solución del suelo puede ser neutra, ácida o
alcalina; cuando una solución de suelo contiene más iones H+, es ácida y
cuando hay menos iones H+ y hay más iones hidroxilo (OH-) la solución del

36
suelo es alcalina. El nivel de acidez o alcalinidad en un suelo afecta la
disponibilidad de nutrientes, la actividad de los microorganismos del suelo y el
nivel de aluminio intercambiable(43)(44).

Por otro lado, se encuentra la materia orgánica que incluye residuos vegetales
y animales en diferentes estados de descomposición, tejidos y células de
organismos que viven allí y sustancias producidos por estos. La materia
orgánica interviene en procesos como el suministro de elementos nutritivos, la
liberación de nitrógeno, fósforo, azufre y micronutrientes disponibles para las
plantas; así mismo contribuye a la estabilización de la acidez del suelo por su
poder amortiguador, regulariza la disponibilidad de nutrientes principales y
elementos menores (45). Dentro de los procesos que se dan en el suelo, uno
de los más importantes es el intercambio iónico, es por esto que la capacidad
de intercambio catiónico (CIC) representa la cantidad de cationes que la
superficie total puede retener como calcio, potasio, sodio, magnesio, entre
otros (45).

Por último, se encuentran los nutrientes del suelo, divididos en dos categorías:
macronutrientes, los cuales se dividen en nutrientes primarios y secundarios, y
los micronutrientes o microelementos. Dentro de los macronutrientes primarios
se encuentra el nitrógeno, fósforo y potasio, respecto a los nutrientes
secundarios está el magnesio, azufre y calcio. (46). Los micronutrientes o
microelementos son el hierro, el manganeso, el zinc, el cobre, el molibdeno, el
cloro y el boro, estos son absorbidos en cantidades minúsculas, su
disponibilidad en las plantas depende principalmente de la reacción del suelo.
Algunos microelementos pueden ser tóxicos para las plantas en
concentraciones mayores a lo normal. En la mayoría de los casos esto ocurre
cuando el pH es bajo o muy bajo (46).

2.4.3 Microorganismos del suelo

Los efectos de los microorganismos en numerosas propiedades del suelo son

de gran alcance, representan el grupo biótico más diverso, con una estimación

37
de un millón a unos mil millones de microorganismos por gramo de suelo. La
microbiota ayuda a la estructura del suelo al rodear físicamente partículas y
'pegarlas' a través de la secreción de compuestos orgánicos, principalmente
azúcares. Los microbios del suelo incluyen bacterias, protozoos, algas, hongos
y actinomicetos (47).

2.4.3.1 Bacterias

Las bacterias poseen una gran variedad de funciones en el suelo. La

descomposición de animales, plantas y residuos microbianos es llevada a cabo
por bacterias heterótrofas. Estas bacterias tienden a ser los miembros más
numerosos de la comunidad microbiana y su selectividad de los sustratos varía
de una especie de bacteria a otra. Las bacterias quimioautótrofas del suelo,
juegan un papel importante en los ciclos de nutrimentos. La composición de la
población bacteriana del suelo frecuentemente puede indicar las condiciones
físicas y químicas del mismo (3)(48).

- Bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPB)

Las bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPB) se asocian con todas
las especies de plantas, y se encuentran presentes en una gran variedad de
ambientes. El grupo más estudiado de PGPB son las llamadas PGPR´s (Plant
Growth Promoting Rhizobacteria) que colonizan la superficie de la raíz y el
suelo adherido denominado rizósfera. Estas bacterias pueden ser de vida libre
o asociativas; aerobias, anaerobias o facultativas y, generalmente, han sido
aisladas de suelos y de climas en donde predomina la vegetación gramínea,
como pastos de zonas tropicales, templadas, de suelos salinos y pastizales de
zonas áridas, así como de gramíneas cultivadas (49)

Cuando se reconoció el papel de las bacterias de la rizósfera en la promoción

del crecimiento vegetal, su efecto se atribuyó a su facultad para fijar nitrógeno.
Sin embargo, en las últimas décadas se ha destacado su importancia como
promotoras del desarrollo debido a su capacidad para sintetizar sustancias

38
reguladoras del crecimiento, llamadas fitohormonas. Estas sustancias son
compuestos naturales que afectan los procesos metabólicos de las plantas a
concentraciones más bajas de las que presentan los nutrientes o las vitaminas.
Entre los principales géneros bacterianos pertenecientes a este grupo tenemos
a: Azospirillum, Herbaspirillum, Gluconacetobacter, Enterobacter, Bacillus,
Alcaligenes, Klebsiella, Azotobacter, Pseudomonas, Rhizobium,
Bradyrhizobium, Beijerinckia y Clostridium, entre otros (49).

2.4.3.2 Actinomicetos

Muchos de los actinomicetos del suelo, son saprófitos de vida libre, capaces de
descomponer una gran cantidad de sustratos carbonados. Tienen la habilidad
para degradar compuestos altamente recalcitrantes tales como quitina, celulosa
y hemicelulosa, en condiciones particulares de valores altos de pH del suelo, lo
que hace que los actinomicetos sean altamente especializados (48). En el
suelo, el tamaño y número de la comunidad de actinomicetos depende de
diversos factores, principalmente de las características físicas y químicas como
pueden ser la textura, humedad, pH y contenido de materia orgánica. Cuando
se aíslan actinomicetos del suelo mediante medios de cultivo, el género
predominante suele ser Streptomyces, con el 70 al 90% de las colonias,
seguido por Nocardia con 10 a 30%, y el tercero puede ser Micromonospora
que constituye del 1 al 15% de actinomicetos (50). Entre los actinomicetos del
suelo se encuentran especies patógenas, como es el caso de Streptomyces
scabies (48).

2.4.4 Grupos funcionales presentes en el suelo

2.4.4.1 Microorganismos fijadores de nitrógeno

Las bacterias en simbiosis con una planta hospedante fijan el nitrógeno del
aire, es decir, originan compuestos solubles por las plantas, como amoniaco,
entrando en la cadena alimenticia mediante su incorporación a los aminoácidos
y proteínas. El proceso de fijación lo realizan organismos procariontes, que son

39
capaces de reducir el nitrógeno molecular a amonio, tanto en vida libre como
en simbiosis con organismos superiores como: Clostridium, Desulfotomaculum,
Desulfovibrio, Methanosarcina, Chromatium, Thiopedia, Ectothiorhodospira,
Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter, Erwinia, Badilas, Propionibacterium,
Rhodospirillum, Rhodopseudomonas , Azospirillum, Aquaspirillum, Azotobacter
Azomonas, Beijerinckia, Derxia, Rhizobium, Agrobacterium, Thiobacillus,
Corynebacterium, Gloeocapsa, Anabaena, Calotrhix, Nostoc, Spirulina,
Oscillatoria, Lyngbya, entre otras (51).

2.4.4.2 Microorganismos celulolíticos

La celulosa es un importante constituyente carbonado de las plantas superiores

y probablemente el compuesto orgánico más abundante en la naturaleza,
debido a que gran parte de la vegetación que pasa a formar parte del suelo es
celulósica, la descomposición de este carbohidrato tiene una importancia muy
especial en el ciclo biológico del carbono, consecuentemente los
microorganismos del suelo que catabolizan la hidrólisis del material vegetal
influyen en el flujo de energía desde este hasta la formación de CO2 y su
liberación a la atmosfera (52).

Los microorganismos degradadores de celulosa incluyen hongos y bacterias,

aerobios y anaerobios, mesofílicos y termofílicos. Entre los hongos celulolíticos
se destacan: Trichoderma reesei, Phanerochaete chrysosporium, Fusarium
solani, Penicillum funiculosum, Trichoderma koningii, Sporotrix sp., Alternaria
sp., Geotrichum sp., Rhizoctonia sp., Trametes sp., Paecilomyces sp., Mucor
sp., Cladosporium sp., Bulgaria sp., Chaetomium sp., Helotium sp., Aspergillus
sp., Las bacterias más abundantes y conocidas son las aerobias entre las
cuales están: Cellulomonas sp., Microbi sp orabispora, Thermomonospora sp.,
Cytophaga sp., Corynebacterium sp., Vibrio sp., Bacillus sp., Pseudomonas sp.,
Thermobifida sp. Además, se encuentran algunas anaerobios como: Acetivibrio
cellulolyticus, Butiri vibrio sp., Bacteroides cellulosolvens, Bacteroides
succionogenes, Clostridium cellulovorans, Clostridium thermocellum,
Ruminococcu salbus, Tuminococcus flavefaciens (52).

40
 2.4.4.3 Microorganismos amilolíticos

El almidón y la celulosa son las dos fuentes de carbono más distribuidas en la

naturaleza. Estos polímeros están compuestos de unidades de glucosa y se
requieren de diferentes sistemas enzimáticos para degradarlos. Los grupos
microbianos con actividad amilolítica juegan un papel fundamental en el ciclaje
de nutrientes a nivel de suelo, pues actúan sobre el almidón gracias a la
producción de enzimas extracelulares denominadas amilasas, liberando
glucosa que es un sustrato más fácilmente asimilable por el resto de las
poblaciones heterótrofas de microorganismos (53).

Los microorganismos degradadores de almidón incluyen diversos grupos de

hongos y bacterias en los que se encuentran: Aspergillus niger, Aspergillus
flavus, Aspergillus sp., Fusarium sp., Alternaria sp., Trichoderma sp.,
Paecilomyces sp., Penicillium sp., Monilia sp., Curvularia sp. y Cladiosporium
sp., y Bacillus sp., Klebsiella sp., Micrococcus sp., Lactobacillus sp.,
respectivamente (54).

2.4.4.4 Microorganismos proteolíticos

Los microorganismos proteolíticos fragmentan las proteínas en unidades

menores hasta aminoácidos libres. Esta etapa se puede considerar como un
primer paso dentro del complejo proceso de la degradación de la materia
orgánica, en el que interviene una amplia variedad de microorganismos con
actividades enzimáticas dispares y específicas para cada sustrato orgánico. La
microflora proteolítica actúa en las etapas iniciales de la mineralización de los
compuestos orgánicos nitrogenados y a continuación participan los
microorganismos amonificantes que rinden amonio como producto final del
proceso degradativo. Existen bacterias y hongos que poseen enzimas
proteolíticas como: Bacillus, Pseudomonas, Clostridium, Serratia y
Micrococcus, Alternaria, Aspergillus, Mucor, Penicillium y Rhizopus,
respectivamente (55)

41
 2.4.4.5 Microorganismos solubilizadores de fosfato

La solubilización del fosforo en el suelo es el proceso por el cual las reacciones

de precipitación se revierten, liberando fósforo en la solución del suelo,
mediado generalmente por la acción metabólica de los microorganismos y las
raíces de las plantas. Dentro de las bacterias solubilizadoras de fosfato están:
Pseudomonas sp., Burkholderia cepacia, Burkholderia gladioli, Xanthomonas
sp., Stenotrophomonas maltophilia, Pantoea agglomerans , Chromobacterium
sp. Entre los hongos solubilizadores de fosfato se encuentra: Penicillium sp., P.
implicatum, P. citreo-viridae, Paecilomyces sp., Aspergillus niger, A. fumigatus,
Scopulariopsis sp., Moniliella sp. y Mortierella sp. (56).

2.4.5 Vía del shikimato

La vía del shikimato es común en las bacterias, hongos y plantas, pero no se

encuentra en los animales. Se caracteriza por convertir dos metabolitos, el
fosfoenolpiruvato (PEP) de la vía de la glucólisis y el eritrosa 4- fosfato (E4-P)
proveniente de la ruta de la pentosa fosfato, en corismato. La conversión de
PEP y E4-P en corismato comprende siete reacciones catalizadas por seis
enzimas (Figura 7). La primera enzima de la vía es la 3-deoxy-d-arabino-
heptulosonato-7-fosfato sintasa (DAHPS) convirtiendo PEP y E4-P en 3-deoxy-
d-arabino-heptulosonato-7-fosfato, la segunda enzima de es la 3-dihidroquinato
sintasa, que convierte el 3-deoxy-d-arabino-heptulosonato-7-fosfato en 3-
dihidroquinato. Los pasos enzimáticos tercero y cuarto son catalizados por la
enzima bi-funcional 3-dihidroquinato deshidratasa / shikimato 5-dihidrogenasa
(DHQ / SD), lo que lleva a la formación de shikimato. El quinto paso enzimático
es catalizado por shikimato quinasa (SK), que convierte shikimato en shikimato
3-fosfato. La sexta etapa enzimática es catalizada por 5-enolpiruvil-shikimato-3-
fosfato sintetasa (EPSPS) lo que conduce a la síntesis de 5-
enolpiruvilshikimato 3-fosfato (EPSP). El paso final en la ruta del shikimato es
catalizado por corismato sintasa (CS), que convierte EPSP en corismato (57).

42
Figura 7. Ruta del Shikimato (57)
El corismato, es el metabolito terminal de la vía del shikimato sirve como
metabolito iniciador para la síntesis de aminoácidos aromáticos como:
fenilalanina, triptófano y tirosina, sirviendo de sustrato de dos enzimas la
Antralinato sintasa y Corismato mutasa que actúan para definir diferentes rutas
específicas terminales que conducen a la formación de dichos aminoácidos.
(Figura 8) (58).

Figura 8. Ruta de corismato (58)

43
 2.5 Metagenómica como alternativa para conocer el microbioma de
un ambiente

La metagenómica es una rama de la genómica que se encarga del aislamiento

y estudio del metagenoma asociado a un determinado ambiente natural (59)
Tradicionalmente, los estudios utilizados para caracterizar la diversidad
bacteriana en diferentes ambientes, se basaban principalmente en el cultivo
microbiológico; sin embargo, sólo entre el 0.1 y el 10% de las bacterias del
ambiente son cultivables (60), además, hay microorganismos que a pesar de
ser cultivables, por estrés ambiental pueden no recuperarse por cultivo,
denominándose “viables pero incultivables” (61).

El hecho de que la mayoría de microorganismos del suelo (más del 90%) no

sea cultivable, se ha relacionado principalmente con el hecho de que no se
conocen los requerimientos nutricionales y ambientales específicos necesarios
para su aislamiento y posterior crecimiento. Por otro lado, se cree que los
organismos desarrollan una relación simbiótica con otros microorganismos y
con su microambiente, lo que genera un desequilibrio al ser aislados
individualmente, esto obstaculizara su cultivo y desarrollo in vitro, y por ende,
los procesos del laboratorio (62).

El análisis metagenómico tiene como objetivo analizar fragmentos de ADN

contenidos en las muestra de suelo, previamente sometidos a un proceso de
extracción, con los cuales se espera secuenciar todos los genomas a la vez, y
en algunos estudios, compararlas con huella genéticas o también llamadas
librerías metagenómicas, almacenadas en diferentes bases de datos (63)

El uso de la metagenómica como herramienta de identificación molecular

basada en el análisis del ADN, permite obtener información de la composición
genética y filogenética de la comunidad de microorganismos que habitan en el
lugar muestreado, sin importar si son cultivables o no (64). Una de las
características de la utilización de la metagenómica, es que se pueden obtener

44
genes de microorganismos al azar, provenientes de ambientes extremos, sin la
necesidad de identificar previamente el tipo de microorganismos, estos genes
posteriormente podrán expresarse y obtener de esta manera una proteína
específica, mediante la clonación de vectores, lo que es de ayuda en diversos
procesos biotecnológicos y de biorremediación (65).

2.5.1 Pasos de la metagenómica

La metagenómica se desarrolla en una serie de pasos secuenciales, que dará

como resultado una caracterización apropiada y confiable de los
microorganismos presentes en una muestra estudiada. Por lo general, el
proceso metagenómico, inicia con la elección del sitio de muestreo y la
recolección del espécimen a estudiar; en segunda instancia la muestra se
somete a los procesos propios del laboratorio. Finalmente, las secuencias
obtenidas en los procedimiento se comparan con distintas bases
bioinformáticas o se procede a la construcción de una librería metagenómica
(66).

2.5.1.1 Extracción de ADN metagenómico

La extracción de ADN es el primer paso en el análisis molecular de una

muestra. Para obtener el ADN a estudiar, se cuenta con diferentes técnicas que
tienen como objetivo separar los componentes celulares, para finalmente
obtener una muestra de alta pureza, integridad y calidad (67), para esto se
debe seguir cuatros pasos esenciales: ruptura celular, remoción de proteínas y
ARN, concentración de ADN y determinación de la pureza y calidad del ADN
(68). Dentro de los métodos utilizados para la extracción de ADN encontramos
métodos físicos y químicos. Existen diferentes métodos físicos empleados para
la extracción de ADN, tal es el caso de la congelación-descongelación,
homogeneización en una base de perlas, ultrasonicación, entre otros; sin
embargo, los tratamientos físicos pueden fragmentar el ADN en tamaños de 5-
10 kb e incrementar el riesgo de la formación de quimeras durante la
subsecuentes PCR. Los métodos químicos incluyendo el SDS (dodecilsulfato
45
sódico) proporcionan un mayor rendimiento de ADN en comparación con
algunos métodos físicos. La combinación de métodos químicos y físicos indica
un mayor rendimiento en la extracción de ADN, dependiendo del hábitat natural
y de la diversidad microbiana presente (66).

El proceso de extracción de ADN variará de acuerdo a la muestra y a la

investigación que se esté llevando a cabo; sin embargo, se recomienda que la
muestra se seque en un lugar fresco y con ausencia de luz durante 24 horas.
Adicionalmente se recomienda homogenizar la muestra y eliminar los restos de
tejidos vegetales, insectos y piedras. Posteriormente, se realiza la extracción
de ADN, por cuestiones de facilidad y calidad, en la mayoría de
investigaciones, se utiliza un kit comercial siguiendo las recomendaciones del
fabricante. Finalmente para verificar la extracción exitosa y cantidad del ADN
metagenómico, se somete el ADN extraído a una electroforesis en gel de
agarosa (69)(70).

2.5.1.2 PCR

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una reacción enzimática in

vitro que tiene como objetivo obtener la mayor cantidad de copias de un
fragmento de ADN a partir de un mínimo, donde la secuencia blanco es
copiada fielmente (71). El ADN metagenómico que se aísla en las diferentes
muestras, se utiliza como molde para amplificar, alguna región específica en el
genoma, para esto se utilizan cebadores o primers universales, los cuales son
secuencias de ADN cortas que se utilizan para hibridar el ADN de la muestra y
definir la región del ADN que será amplificada. También se utiliza una
polimerasa termoestable, que es capaz de sintetizar la cadena complementaria
de cada una de las hebras de ADN, a partir de los primers.

Para la realización de la PCR se necesita un termociclador, el cual permite la

repetición de ciclos de: desnaturalización, hibridación y polimerización del ADN,
lo que genera la separación y amplificación del ADN en millones de copias del
fragmento inicial (72). La PCR varía de acuerdo al tipo de microorganismo

46
(bacterias, virus u hongos) y al tipo de la muestra que se esté trabajando o que
sean de interés para el investigador (73).

2.5.1.3 Electroforesis

La electroforesis es la técnica que permite la migración de solutos bajo la

influencia de un campo eléctrico; estas partículas (proteínas, aminoácidos,
péptidos, nucleótidos, ácidos nucleicos) migran hacia el cátodo (-) o ánodo (+),
dependiendo de factores como su carga, peso molecular y estructura
tridimensional. El tipo de electroforesis que más se utiliza es la zonal, que es
útil para separar componentes de mezclas complejas; para la utilización de
esta técnica se requiere un soporte (celulosa, almidón, poliacrilamida, agarosa,
acetato de celulosa, entre otros) y una solución tampón. El soporte por lo
general está constituido por polímeros, los cuales forman un gel poroso que
limita el movimiento de las moléculas durante la electroforesis (74). Al generar
un campo eléctrico en el gel, las moléculas empiezan a desplazarse en forma
de pequeñas bandas (zonas), dependiendo de su tamaño, forma, carga y peso
molecular, generando así patrones de diferentes tamaños y distancia en el gel.
La distancia recorrida por la molécula, es inversamente proporcional al peso
molecular. Para la medición de los patrones observables sobre el gel, es
importante utilizar marcadores de tamaños ya conocidos, que servirán de
puntos de referencia y ayudarán a calcular los pesos moleculares de la muestra
problema (72),

Existen diferentes tipos de electroforesis, entre ellas se encuentra la

electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) que permite la
separación de fragmentos de ADN del mismo tamaño, pero con diferentes
secuencias nucleotídicas, lo que permite obtener un perfil representativo de las
comunidades analizadas, puesto que habrá una separación por la secuencia
nucleotídica de la muestra (73).

Sin importar el tipo de electroforesis que se utilice, es de suma importancia

comprobar el producto de la PCR por medio de la electroforesis en gel,

47
asegurando la presencia de un único fragmento y del tamaño adecuado, para
la realización de los subsecuentes pasos en el análisis metagenómico (74).

2.5.1.4 Secuenciación de próxima generación

La secuenciación de próxima generación (NGS, por sus siglas en inglés: Next-

Generation Sequencing) es una herramienta emergente para estudiar
comunidades de microorganismos no-cultivables; por su capacidad de
obtener grandes volúmenes de datos de secuencia, con lo cual aumenta la
accesibilidad de los recursos genéticos contenidos, por ejemplo, en un suelo.
Los estudios con plataformas de NGS en ácidos nucleicos extraídos de
rizósfera proveen un amplio espectro de los microorganismos que la habitan,
además de obtener y amplificar fragmentos a partir del DNA genómico de
la comunidad y ser analizados por técnicas cultivo-independientes,
capaces de mostrar la composición de la microbiota bacteriana en la
rizósfera (75).

La secuenciación de próxima generación ha abierto la posibilidad de detectar

de manera rápida y eficiente el genoma de microorganismos, de forma
simultánea, masiva y con bajos costos (76); esta metodología permite la
producción de grandes volúmenes de datos de secuencias nucleotídicas en
magnitud de que pueden alcanzar un terabytes de información para una sola
muestra de suelo (77).

- Illumina

llumina es la tecnología de secuenciación basada en pirosecuenciación, más

utilizada hoy en día debido a que ofrece plataformas efectivas (MiniSeq o
HiSeq XTen, entre otras) capaces de ofrecer resultados competentes a precios
razonables. Esta metodología se caracteriza por el uso de nucleótidos
marcados con fluoróforos que bloquean de forma reversible la elongación de la
cadena. De tal modo, tras la detección de la incorporación del fluoróforo, y la
eliminación del mismo, es posible continuar con un nuevo ciclo de adición de
48
un nuevo nucleótido esto se conoce como secuenciación por síntesis. Illumina
ha permitido disminuir los costes y ofrecer lecturas más largas, sin embargo,
se requiere de una gran inversión inicial y de mantenimiento, para poder
adquirir y mantener uno de los equipos que ofrece (78).

- Ilumina Miseq

El sistema Illumina MiSeq es una herramienta de secuenciación de próxima

generación, que realiza diferentes procesos de manera rápida, integral y
rentable; tiene la capacidad de combinar la generación de grupos, la
amplificación, la secuenciación y el análisis de datos en un único instrumento.
El sistema illumina Miseq utiliza la tecnología de secuenciación por síntesis
(SBS) de illumina, la cual se basa en terminadores reversibles que detectan
bases a medida que se incorporan a cadenas de ADN masivamente paralelas.
Los colorantes fluorescentes de los terminadores se fotografían con la adición
de cada dNTP y se eliminan para permitir la incorporación de la siguiente base.
El resultado es una secuenciación base por base que elimina los errores
específicos del contexto de la secuencia. El sistema Miseq puede secuenciar
bibliotecas rápidamente, producir cientos de Gb de datos y realizar análisis de
datos en una única ejecución de secuenciación integrada. Una sola ejecución
puede producir datos de salida de hasta de 15 Gb en tan solo 4 horas de
tiempo de ejecución, dependiendo de las longitudes de lectura, y puede
generar hasta 25 millones de lecturas únicas y 50 millones de lecturas de
extremo pareado(79)(80).

2.6 Identificación Procariota por ARNr 16S

El ARNr 16S es un polirribonucleótido de aproximadamente 1500 nucleótidos

codificado por el gen rrs, también denominado ADN ribosomal 16S. El ARNr
16S se pliega y adquiere una estructura secundaria que se identifica por tener
segmentos de doble cadena que permiten la formación de asas y hélices. Se
caracteriza por presentar regiones comunes a todos los organismos, pero
contienen además variaciones que se concentran en zonas específicas. El

49
ARNr 16S contiene nueve regiones (V1-V9) menos conservadas o
hipervariables, que son las que aportan información útil para estudios de
filogenética y taxonomía (Figura 9). Las regiones conservadas son de gran
ayuda para diseñar iniciadores universales que permitan la amplificación de
diversas regiones hipervariables de la gran mayoría de los ARNr 16S de los
microorganismos presentes en una comunidad (81).

Figura 9. Regiones encontradas en el ARNr 16S.

En color rojo se evidencian las regiones hipervariables y en azul las regiones
conservadas. Por otro lado, se evidencian las regiones necesarias para las
diversas técnicas de secuenciación (82).

El ácido ribonucleico ribosomal 16S, fue presentado por Pace et al. en 1986
(83), como una buena opción para la clasificación de bacterias y Archaea, esto
ha permitido que las secuencias del ARNr 16S sean utilizadas como una
herramienta importante en la reconstrucción de relaciones filogenéticas. Pese a
algunas controversias y dificultades técnicas, el ARNr 16S sigue siendo
utilizado como un excelente marcador molecular.

50
 2.7 Bioinformática

La bioinformática es una ciencia interdisciplinaria, donde se combina diferentes

áreas como biología, matemáticas, informática y estadística para desarrollar
métodos de almacenamiento, recuperación y análisis de datos. El término
"Bioinformática" fue utilizado por primera vez en 1970 por el biólogo Holandés
Paulien Hogeweg, refiriéndose al uso de la tecnología de la información para
estudiar sistemas biológicos (84). Sin embargo, uno de los primeros
acercamientos a la bioinformática se le atribuye al trabajo de Margaret O.
Dayhoff, Richard V. Eck y Robert S. Ledley, quienes produjeron la primera
colección de secuencias de proteínas basada en computadora, publicaron en
1965 una compilación de secuencias de aminoácidos, con el nombre de Atlas
of Protein Structure and Sequence, como resultado de recolectar, comparar y
analizarlas computacionalmente, cuyo fin era producir conocimiento sobre la
estructura, función y evolución de las proteínas (85).

2.7.1 BLAST

BLAST o “Basic Local Alignment Search Tool” es un programa informático que

permite el alineamiento de secuencias problema (secuencias query o blanco)
frente a secuencias caracterizadas con anterioridad (secuencias target u
objetivo) que se encuentran en una base de datos, permitiendo inferir
relaciones funcionales, estructurales o evolutivas entre dos secuencias. La idea
fundamental del algoritmo BLAST es que, en cualquier alineamiento
estadísticamente significativo, suelen existir pares de segmentos muy similares
(denominados como HSPs o High Scoring Pairs). BLAST busca todos los HSP
entre la secuencia de búsqueda y las secuencias de la base de datos, utiliza el
algoritmo Smith-Waterman para que el alineamiento encontrado sea óptimo,
además de utilizar matrices tipo BLOSUM o PAM que permite a BLAST dar una
puntuación a los alineamientos que realiza, ya sea un nucleótido o un
aminoácido (86) (87).

51
 2.7.2 QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology)

Es una aplicación de software de código abierto que por sus siglas traduce
"conocimientos cuantitativos sobre ecología microbiana”, realiza el análisis de
las comunidades microbianas interpretando datos de secuencias de ácidos
nucleicos de comunidades de hongos, virus, bacterias y arqueas. Se basa
principalmente en datos de secuenciación de amplicones de alto rendimiento
generados en una variedad de plataformas, pero también en análisis de otros
tipos de datos, como los datos de metagenómica balística (88)

Un análisis QIIME estándar comienza con datos de secuencia de una o más

tecnologías de secuenciación, como Sanger, Roche / 454, Illumina u otras. El
uso de QIIME para analizar datos de comunidades microbianas consiste en
escribir una serie de comandos en una ventana terminal y luego ver la salida
gráfica y textual, con el fin de proporcionar un flujo de trabajo de principio a fin,
comenzando con lecturas de secuencias multiplexadas y terminando con
perfiles taxonómicos, filogenéticos y comparaciones de las muestras en el
estudio. Con esta información, es posible determinar factores biológicos y
ambientales que alteran la ecología de la comunidad microbiana (89).

2.7.3 DADA2

“Divisive Amplicon Denoising Algorithm” Es un paquete de software que

implementa un algoritmo el cual modela y corrige los errores generados
durante la secuenciación de amplicones realizado por Illumina, utiliza ese
modelo de error para deducir la verdadera composición de la muestra. DADA2
reemplaza el paso tradicional de "selección de OTU" en los flujos de trabajo de
secuenciación de amplicones, generando en su lugar tablas de mayor
resolución de variantes de secuencias de amplicones (ASV) (90).

El punto de partida de DADA2 es un conjunto de archivos demultiplexados

fastq correspondientes a las muestras estudio de secuenciación, esperando
que haya un archivo individual para cada muestra. Una vez que los archivos
demultiplexados fastq sin nucleótidos no biológicos están disponibles, el

52
programa procede de la siguiente manera: 1) Filtrar y recortar, 2) Deduplicar, 3)
Conocer las tasas de error, 4) Inferir composición de la muestra, 5) Fusionar
lecturas pareadas, 6) Hacer tabla de secuencias, 7) Remover las quimeras.
Como resultado se obtiene una tabla de características de variantes de
secuenciación de amplicones (una tabla de ASV), esta tabla es análoga a la
tabla OTU tradicional con una resolución más alta (91).

53
 3. DISEÑO METODOLÓGICO

3.1 Tipo de investigación

Estudio cuantitativo, de tipo descriptivo exploratorio.

3.2 Universo, población, muestra

3.2.1 Universo

Suelo del departamento de Córdoba, Colombia

3.2.2 Población

Suelo de la zona de amortiguación del Parque Nacional Natural Paramillo.

3.2.3 Muestra

Suelo de 2 zonas diferentes de la finca Tuti Fruti, en la vereda Tuis Tuis,

municipio de Tierralta, Córdoba en el Parque Nacional Natural Jaramillo,
recolectadas en el mes de Julio del año 2018.

3.3 Variables, indicadores

3.3.1 Variable independiente: suelo de dos zonas diferentes de la finca

Tuti Fruti, Tierralta, Córdoba, Colombia

54
 3.3.2 Variable dependiente: Familias, géneros y especies de
microorganismos presentes en el suelo de dos zonas diferentes de la
finca Tuti Fruti ubicada en el municipio de Tierralta en el departamento
de Córdoba, Colombia

3.3.3. Indicadores

Tabla 1. Indicadores

Objetivo Resultado Indicador

Caracterizar las diferentes Comunidades de Número de
comunidades procariotas microorganismos microorganismos
presentes en el suelo de presentes en el suelo de la identificados y organizados
áreas de establecimiento de zona de amortiguación del en phylum, clase, orden,
sistemas agroforestales, de Parque Nacional Natural familia, género y especie
la zona de amortiguación Paramillo identificadas en las
del Parque Nacional Natural muestras, por
Paramillo, en Córdoba, metagenómica
Colombia por medio de
metagenómica.

Relacionar las propiedades

fisicoquímicas de los
diferentes suelos: suelo Establecer la relación Géneros y especies
impactado con glifosato y existente entre las presentes en los dos suelos
suelo sin contacto previo propiedades fisicoquímicos y su relación con los
con glifosato, con los del suelo y la microbiota resultados fisicoquímicos
resultados obtenidos del presente.
análisis metagenómico. .

Comparar la microbiota Comparación de los Número y tipo de

presente en un suelo con microorganismos microorganismos
previa exposición a glifosato identificados en zonas identificados en las dos

55
frente a la microbiota expuestas a glifosato de zonas analizadas.
presente en el suelo que no las que no han estado en
ha sido tratado con dicho contacto con dicho
herbicida. herbicida.

3.4 Hipótesis

1. La diversidad y distribución de la microbiota está relacionada con la

aplicación de glifosato.

2. Existe relación entre la microbiota encontrada y las características

fisicoquímicas de los suelos analizados.

3.5 Técnicas y procedimientos

3.5.1 Ubicación de la zona de muestreo

Las muestras de suelo fueron recolectadas en la finca Tuti Fruti, en la vereda

de Tuis Tuis, municipio de Tierralta en el departamento de Córdoba, Colombia
En la Figura 10 se observa la ubicación geografía del departamento de
Córdoba, Colombia; el municipio de Tierralta (Figura 1) y la vereda Tuis Tuis
(Figura 11).

Figura 10. Ubicación geográfica del departamento de Córdoba

Tomado de gobernación de Córdoba(92)

56
Figura 11. Mapa Vereda Tuis Tuis, realizado por el topógrafo de la vereda
Foto Tomada del cuaderno topográfico de la vereda

3.5.2 Recolección de muestras

El muestreo de realizó en el mes de Julio del año 2018, para este periodo de
tiempo la región se encontraba en temporada de sequía. Se recolectaron
muestras de suelo utilizando como referencia dos zonas diferentes de la finca
Tuti Fruti (Figura 12). De acuerdo con las instrucciones recibidas por el dueño
de la finca y un biólogo, quienes hacen parte de diversos programas de la
Corporación Autónoma Regional de los Valles del Sinú y del San Jorge (CVS)
en alianza con la alcaldía de Tierralta para la reforestación, cuidado y
conservación de flora y fauna de la región, con el fin de poder establecer
diferencias o semejanzas entre ellas. Las dos zonas utilizadas para la
recolección de muestras fueron: 1) zona con vegetación, animales y suelo
impactado con glifosato por error, en proceso de reforestación desde el año
2014 y 2) zona sin impacto con glifosato. Para esto se tuvo en cuenta el
formato de concepto técnico sobre daño ambiental emitido por el Parque
Nacional Natural Paramillo, la distancia entre las dos zonas muestreadas fue
de aproximadamente 1Km

57
Para la recolección de los suelos a utilizar en el análisis metagenómico y físico
químico, el muestreo se realizó de acuerdo con el protocolo en zigzag
recomendando por el centro de Bio-sistemas de la Universidad Jorge Tadeo
Lozano (UJTL) (93).

Figura 12. Mapa de la finca Tuti Fruti

El punto azul: Indica la zona donde se realizó el muestreo del suelo sin
aplicación de glifosato, mientras que el punto naranja indica la zona donde se
realizó el muestreo del suelo con aplicación de glifosato.
Foto Tomada del cuaderno topográfico de la vereda

Tabla 2. Descripción de zonas de muestreos.

Zonas de Descripción
muestreo
Se tomaron 10 submuestras de suelo, a una profundidad
entre 0-25 cm con un barreno para la zona impactada con
glifosato y zona sin impacto de glifosato. Las muestras se
depositaron en un balde plástico, donde fueron mezcladas,
finalmente de cada zona se recolectó 1.0 Kg de suelo para
su posterior análisis.

58
Zona
impactada con
glifosato

Zona sin
impacto de
glifosato

3.5.3 Conservación de muestras

Las muestras fueron conservadas en bolsas plásticas de 1.0 Kg, debidamente

marcadas y refrigeradas de 4-6 °C hasta la realización de los análisis.

3.5.4 Análisis físico químico

Para el análisis físico químico fueron enviadas al Laboratorio de Suelos y

Aguas del Centro de Bio-sistemas de la Universidad JorgeTadeo Lozano UJTL
2 bolsas plásticas con cierre ziploc, cada una con 1.0 Kg de suelo de las 2
zonas muestreadas.

59
 3.5.5 Extracción de DNA genómico

Se utilizó el Kit ZR Soil Microbe DNA MiniPrep™ (Zymoresearch, CA, USA)

siguiendo las instrucciones del fabricante, como se muestra a continuación:

1) Adicionar la muestra acorde con la referencia (250 mg) al

ZymoBIOMICS Lysis Tube. Agregar 100 µl de ZymoBIOMICS Lysis
Solution junto con la muestra.
2) Agitar en vortex por 30 minutos.
3) Centrifugar el ZymoBIOMICS Lysis Tube en una microcentrifuga a
10000 rpm por 1 minuto.
4) Transferir 400µl del sobrenadante al Zymo-Spin IIIF Filter en un tubo de
colección y centrifugar a 8000 rpm por 1 minuto.
5) Agregar 1200µl de ZymoBIOMICS DNA Binding Buffer al tubo de
colección del paso 4.
6) Transferir 800µl de la muestra del paso 5 al Zymo-Spin IIC-Z Column en
un tubo de colección y centrifugar a 10000 rpm por 1 minuto.
7) Descartar el fluido del tubo de colección y repetir el paso 6.
8) Agregar 400µl de ZymoBIOMICS DNA Wash Buffer 1 a la columna al
Zymo-Spin IIIC-Z en un nuevo tubo de colección y centrifugar a 10000
rpm por 1 minuto. Descartar el fluido.
9) Agregar 700µl de ZymoBIOMICS DNA Wash Buffer 2 a la columna al
Zymo-Spin IIIC-Z en un nuevo tubo de colección y centrifugar a 10000
rpm por 1 minuto. Descartar fluido.
10) Agregar 200µl de ZymoBIOMICS DNA Wash Buffer 2 a la columna al
Zymo-Spin IIIC-Z en un nuevo tubo de colección y centrifugar a 10000
rpm por 1 minuto.
11) Transferir el Zymo-Spin IIIC-Z Column a un tubo limpio de
microcentrifuga 1.5 ml y agregar 100µl de ZymoBIOMICS™
DNase/RNase Free Water directamente a la columna e incubar durante
1 minuto. Centrifugar en 1000 rpm por 1 minuto para eluir el ADN.
12) Colocar un filtro Zymo-Spin III-HRC en un nuevo tubo de recolección y
agregar 600 µl ZymoBIOMICS HRC Prep Solution. Centrifugar a 8000
rpm por 3 minutos.

60
 13) Transferir el ADN eluido (Paso 11) a un filtro preparado Zymo-Spin III-
HRC en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpio y centrifugar a
exactamente 16000 rpm por 3 minutos.

3.5.6 PCR

Para verificar la calidad del ADN extraído, se realizó una PCR (Tabla 3) para
procariotas utilizando primers universales de la región 16S del ADNr (16S-8F
5‟- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3‟ y 16S-1492R 5‟ –
CGGTTACCTTGTTACGACTT - 3‟). Se utilizó la enzima OneTaq Quick Load
2X Master Mix With Standard Buffer (New England Biolabs, Inglaterra). La PCR
se llevó a cabo en el termociclador Labnet Multigene Optimax (Labnet, USA),
en un volumen final de reacción de 12.5 µL.

Tabla 3. Ciclaje y temperatura de la PCR

Proceso Temperatura Tiempo Total de ciclos

94.0°C 10:00 Min
Desnaturalización
94.0°C 0:30 Seg
Anillamiento 50.0°C 1:30 Min 30 ciclos
Extensión 72.0°C 2:00 Min
Extensión final 72.0°C 15:00 Min

3.5.7 Electroforesis

Se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 0.5%, teñido con GelGreen®

Nucleic Acid Gel Stain y corrido en buffer TBE 0.5X para observar los
productos de PCR.

61
 3.5.8 Cuantificación

El producto final de la extracción de ADN fue enviado a la Universidad Nacional

de Colombia, donde se empleó el equipo Thermo Scientific™ NanoDrop 2000
(Thermo Scientific, USA) para su cuantificación.

3.5.9 Secuenciación

El ADN genómico fue llevado a una concentración de 40l para la elaboración

de las genotecas. Las muestras se procesaron y analizaron con el servicio de
secuenciación dirigida ZymoBIOMICS ® para análisis de microbiomas (Zymo
Research, Irvine, CA), incluyendo los siguientes pasos:

3.5.9.1 Preparación de la biblioteca 16S

La secuenciación dirigida del gen del ARN ribosomal 16S bacteriano se realizó
con el kit de preparación de biblioteca Quick -16S ™ Primer Set V3-V4 (Zymo
Research, Irvine, CA). Los cebadores 16S bacterianos amplificaron la región
V3-V4 del gen 16S rRNA. Estos cebadores fueron diseñados por Zymo
Research para brindar la mejor cobertura del gen 16S a la vez que mantienen
una alta sensibilidad. Los primers utilizados fueron descritos por Klindworth et
al. 2013 (94).

La biblioteca de secuenciación para 16S, se preparó realizando ensayos de

PCR en tiempo real para controlar ciclos y, por lo tanto, evitar la formación de
quimeras de PCR. Los productos finales de PCR se cuantificaron con lecturas
de fluorescencia (qPCR). Después de la PCR, se realizó la limpieza de la
librería usando Selecta Size DNA Clean & Concentrator (Zymo Research,
Irvine, CA), luego se cuantificó con TapeStation® (Agilent Technologies, Santa
Clara, CA) y Qubit® (Thermo Fisher Scientific, Waltham , WA).

62
 3.5.9.2 Secuenciación

La biblioteca final se secuenció en Illumina® MiSeqTM con un kit de reactivo v3

(600 ciclos). La secuenciación se realizó con un aumento del 10% de PhiX.

3.5.10 Análisis bioinformático

Las secuencias de amplicón únicas se infirieron a partir de lecturas sin

procesar utilizando el programa Dada2. Las secuencias quiméricas también se
eliminaron con Dada2. La asignación de taxonomía se realizó utilizando Uclust
de Qiime v.1.9.1. Taxonomy se asignó con la Base de datos de investigación
Zymo, una base de datos 16S que está diseñada y curada internamente, como
referencia.

Los análisis de visualización de la composición, diversidad alfa y diversidad

beta se realizaron con Qiime v.1.9.1. Si corresponde, la taxonomía que tiene
una abundancia significativa entre los diferentes grupos se identificó por LEfSe
utilizando la configuración predeterminada. Otros análisis, como mapas de
calor, Taxa2SV_deomposer y gráficos de PCoA se realizaron con scripts
internos.

63
 4 RESULTADOS

4.1 PCR y electroforesis

Después de haber realizado la extracción del ADN y PCR, se evaluó la calidad

del producto obtenido por medio de electroforesis en gel de agarosa al 0.5%,
donde se evidencio que tanto el suelo con glifosato y el suelo sin glifosato
presentaron un producto de aproximadamente 1.5Kb, equivalente a una masa
de 36ng (Figura 13).

Figura 13. PCR de la región 16S del ARNr de muestras de suelo de la Zona de
amortiguación del Parque Nacional Natural Paramillo, Córdoba.
Electroforesis en gel de agarosa 0.5% en TBE 0.5X. (Voltaje 100V, Tiempo
60m).
CG: Suelo impactado con glifosato
SG: Suelo sin contacto previo con glifosato
CP: Control positivo
PM: Marcador de peso molecular (1kb ADN Ladder. New England. BioLabs )

64
 4.2 Análisis físico químico

Respecto a los resultados obtenidos del análisis físico químico realizado en el

Laboratorio de Suelos y Aguas del Centro de Bio-sistemas de la Universidad
Jorge Tadeo Lozano, se analizaron diferentes parámetros entre ellos:
elementos mayores (Tabla 4) donde se evidencia una deficiencia de estos
elementos en los dos suelos analizados a excepción del Nitrógeno y Magnesio;
este último solo se encontró en exceso en el suelo con glifosato. Por otro lado,
en los resultados obtenidos de las relaciones catiónicas (Tabla 5) se puede
evidenciar que en el suelo con glifosato estas relaciones estaban en exceso,
excepto la relación Ca/Mg que se encontró deficiente en el suelo con glifosato,
mientras que en el suelo sin glifosato los resultados fueron óptimos para las
relaciones catiónicas de Mg/K y (Ca+Mg)/K, pero las relaciones Ca/Mg y Ca/K
fueron deficientes. Finalmente se analizaron otros parámetros de la muestra
como porcentaje de agua, porcentaje de saturación, porcentaje de carbón
orgánico, porcentaje de materia orgánica y capacidad de intercambio catiónico
(Tabla 6).

Tabla 4. Resultados elementos mayores de muestras de suelo de la Zona de

amortiguación del Parque Nacional Natural Paramillo, Córdoba.

ANALISIS FISICOQUÍMICO
Elementos Mayores
Elemento/parámetro Suelo con Suelo sin
analizado aplicación de aplicación de
glifosato glifosato
pH 5.2 4.6
C.E. 0.11 dS/m 0.15 dS/m
Extracto de
saturación.

N-NH+4 30.0 mg* ó 30.0 mg* ó

Amonio ppm ppm

65
 N-NO-3 8.4 mg* ó 11.1 mg* ó
Nitrato ppm ppm
N-Min. 38.4 mg* ó 41.0 mg* ó
Nitrógeno ppm ppm
P 3 mg* ó ppm 2 mg* ó ppm
Fosforo
K 91 mg* ó ppm 136 mg* ó
Potasio ppm
Ca 1269 mg* ó 574 mg* ó
Calcio ppm ppm
Mg 480 mg* ó 223 mg* ó
Magnesio ppm ppm
Na 13 mg* ó ppm 15 mg* ó ppm
Sodio
Al 1.16 cmol+*kg1 4.21 cmol+*kg1
Acidez Int
S 0.5 mg* ó 0.6 mg* ó
Azufre ppm ppm
Cl- 15 mg* ó ppm 44 mg* ó ppm
Cloruro

Tabla 5. Resultados relaciones catiónicas de muestras de suelo de la Zona de

amortiguación del Parque Nacional Natural Paramillo, Córdoba.

ANALISIS FISICOQUÍMICO
Relaciones catiónicas

Elemento/parámetro Suelo con Suelo sin

analizado aplicación de aplicación de
glifosato glifosato
Ca/Mg 1.60 1.56
Ca/K 27.32 8.26

66
 Mg/K 17.03 5.30
(Ca+Mg)/K 44.35 13.56

Tabla 6. Resultados de otros parámetros analizados en muestras de suelo de

la Zona de amortiguación del Parque Nacional Natural Paramillo, Córdoba

ANALISIS FISICOQUÍMICO
Otros análisis y parámetros de la muestra

Elemento/parámetro Suelo con Suelo sin

analizado aplicación de aplicación de
glifosato glifosato
Porcentaje de agua 2.0 % 2.5 %
Pw %
Porcentaje de 58.2 % 80.0 %
saturación Ps%

%carbón orgánico 0.83 % 1.12 %

% materia orgánica 1.43 % 1.93 %
Capacidad de 26.3 cmol+* 30.0 cmol+*
Intercambio Catiónico
CIC
Capacidad de 11.7 cmol+* 9.3 cmol+*
intercambio catiónico
efectiva CICe

4.3 Análisis metagenómico

El análisis de la secuenciación del gen 16S es de gran utilidad al momento de

conocer la composición de los diferentes microorganismos encontrados en un
nicho ambiental, permitiendo la reconstrucción filogenética e identificación
bacteriana. La presencia del gen 16S en todas las bacterias y la conservación
de algunas regiones universales, permite la elaboración de primers capaces de

67
 amplificar regiones específicas para la identificación de bacterias a nivel
taxonómico desde filo hasta especie.

4.3.1 Secuencias obtenidas

En la Tabla 7 se pueden observar las secuencias obtenidas en cada una de las

fases del procesamiento en el análisis bioinformático.

Tabla 7. Número de secuencias obtenidas

SECUENCIAS OBTENIDAS DURANTE EL PROCESAMIENTO DEL ANÁLISIS DEL ARNr 16S

Secuencias Secuencias
Secuencias
Secuencias Análisis Secuencias libres de Secuencias después de
Muestra crudas OTUs
recortadas Dada2 quiméricas secuencias únicas la filtración
generadas
quiméricas de tamaño
Suelo
con 55414 52626 25846 558 25288 230 25220 219
glifosato
Suelo
Sin 56656 53450 22112 1698 20414 476 19925 405
glifosato

4.3.2 Análisis metagenómico del gen ARNr 16S

La caracterización metagenómica dirigida al 16S, en las muestras de suelo

indicó predominancia de once Filos: Acidobacteria (15.7% y 33.0%),
Actinobacteria (13.9% y 8.7%), Bacteroidetes (0.9% y 0.0%), Chloroflexi (9.1%
y 8.0%), Firmicutes (5.8% y 0.4%), Fusobacteria (1.3% y 0.0%),
Gemmatimonadetes (1.6% y 0.7%), Nitrospirae (6.2% y 2.7%), Planctomycetes
(7.4% y 3.9%), Proteobacteria (30.8% y 34.9%) y Verrucomicrobia (3.6% y
3.0%), en el suelo con glifosato y suelo sin glifosato respectivamente (Figura 14
y Anexo 1.1).

68
 CG SG

Figura 14. Mapa de calor de la composición e identificación procariota a nivel

de Filo.
A nivel de Clase, la comunidad microbiana de los suelos analizados presentó
alta abundancia de: Acidobacteria (14.7% y 32.7%), Actinobacteria (11.3% y
7.1%), Thermoleophilia (1.5% y 0.7%), Chloroflexia (1.3% y 0.3%), Bacilli (5.2%
y 0.4%), Fusobacteriia (1.3% y 0.0%), Gemmatimonadetes (1.6% y 0.7%),
Nitrospira (6.2% y 2.7%), Planctomycetacia (7.1% y 3.9%), Alphaproteobacteria
(18.3% y 24.6%), Betaproteobacteria (1.4% y 2.3%), Deltaproteobacteria (7.1%
y 4.6%) y Gammaproteobacteria (4.1% y 3.4%), el suelo con glifosato y suelo
sin glifosato respectivamente (Figura 15 y Anexo 1.2).

69
 CG SG

Figura 15. Mapa de calor de la composición e identificación procariota a nivel

de Clase.

A nivel de Orden, la comunidad microbiana de los suelos analizados presentó

alta abundancia de: Acidobacteriales (5.7% y 10.6%), Corynebacteriales (1.9%
y 0.5%), Frankiales (5.4% y 4.5%), Micrococcales (3.0% y 0.9%),
Streptomycetales (0.2% y 0.9%), Chloroflexales (1.3% y 0.0%), Bacillales (5.2%
y 0.4%), Fusobacteriales (1.3% y 0.0%), Gemmatimonadales (1.6% y 0.7%),
Nitrospirales (6.2% y 2.7%), Planctomycetales (7.1% y 3.9%), Rhizobiales
(12.2% y 15.2%), Rhodospirillales (5.8% y 9.0%), Burkholderiales (0.2% y
2.1%), Pseudomonadales (0.5% y 1.4%) y Xanthomonadales (3.6% y 2.0%),
70
enel suelo con glifosato y suelo sin glifosato respectivamente (Figura 16 y
Anexo 1.3).

Figura 16. Mapa de calor de la composición e identificación procariota a nivel

de Orden.
A nivel de Familia, la comunidad microbiana de los suelos analizados presentó
alta abundancia de: Corynebacteriaceae (1.9% y 0.0%), Acidothermaceae
(4.2% y 4.5%), Micrococcaceae (2.2% y 0.9%), Bacillaceae (3.1% y 0.4%),
Gemmatimonadaceae (1.6% y 0.7%), Planctomycetaceae (7.1% y 3.9%),
Bradyrhizobiaceae (2.3% y 1.0%), Xanthobacteraceae (4.8% y 8.2%),
Pseudomonadaceae (0.5% y 1.4%) y Xanthomonadaceae (2.9% y 0.0%), en el

71
suelo con glifosato y suelo sin glifosato respectivamente (Figura 17 y Anexo
1.4).

Figura 17. Mapa de calor de la composición e identificación procariota a nivel

de Familia

A nivel de Género, la comunidad microbiana de los suelos analizados presentó

alta abundancia de: Solibacter (1.1% y 4.6%), Corynebacterium (1.9% y 0.0%),
Acidothermus (4.2% y 4.5%), Pseudarthrobacter (2.0% y 0.9%), Streptomyces
(0.2% y 0.3%), Parafilimonas (0.9% y 0.0%), Roseiflexus (1.3% y 0.0%),
Bacillus (3.1% y 0.4%), Gemmatimonas (1.0% y 0.1%), Nitrospira (6.0% y
2.2%), Bradyrhizobium (1.2% y 0.0%), Pseudolabrys-Variibacter (1.3% y 3.5%),
Variovorax (0.1% y 1.8%), Pseudomonas (0.5% y 1-4%), Acidibacter (0.7% y
1.9%), en el suelo con glifosato y suelo sin glifosato respectivamente (Figura
18 y Anexo 1.5).

72
 CG SG

Figura 18. Mapa de calor de la composición e identificación procariota a nivel

de Género
A nivel de Especie, la comunidad microbiana de los suelos analizados presentó
una abundancia relativa de: aggregans-modestus (0.0% y 0.4%), coyleae-
pilbarense (1.9% y 0.0%), defluvii-equi-niigatensis (2.0% y 0.9%), niacini-soli
(1.5% y 0.1%), canariense-lupini (0.8% y 0.0%), paradoxus (0.1% y 1.8%),
azotoformans-fluorescens-synxantha (0.0% y 1.4%), en el suelo con glifosato y
suelo sin glifosato respectivamente (Figura 19 y Anexo 1.6).

73
 CG SG

Figura 19. Mapa de calor de la composición e identificación procariota a nivel

de Especie

74
 5 DISCUSIÓN

El uso de glifosato como herbicida responde a la necesidad creciente de

producir con más eficacia cultivos que puedan generar alimento para la
población en general que crece exponencialmente. En Colombia, además de
asegurar los cultivos de consumo, este herbicida es utilizado principalmente
para la erradicación de cultivos ilícitos, un problema al que se ha enfrentado el
país durante muchas décadas y que ha supuesto un verdadero inconveniente
para el gobierno nacional. Si bien las propiedades del glifosato son varias, e
inicialmente su función es brindar un beneficio para el que lo implementa, no se
puede ignorar que ha traído consecuencias negativas en la salud no solo del
suelo y de los microorganismos que lo habitan, sino en la salud de los animales
y humanos que han estado expuestos al contacto con este compuesto.

Por otro lado se sabe que el suelo es uno de los ambientes naturales más
biodiversos que existe en nuestro planeta, siendo el hogar de una gran
cantidad de microorganismos de diferente naturaleza. Los microorganismos
son responsables de una parte importante de los ciclos biogeoquímicos, y por
lo tanto, influyen significativamente en la vida terrestre. Sin embargo, el
conocimiento que se tiene acerca de la vida microbiana, y el papel que ésta
juega en el ambiente, es todavía poco entendido. En particular, se ha
propuesto que entre 80-90% de los microorganismos que habitan en el suelo
son desconocidos. Es por esto que en la actualidad la metagenómica ha
tomado un papel relevante en los estudios en los cuales el suelo es el campo
de investigación, debido a que gracias a esta tecnología se ha logrado conocer
y estudiar de manera más detallada todo el material genómico desconocido y
su interacción en diversos ambientes y frente a diferentes sustancias que
pueden llegar a afectarlo de manera positiva o negativa como es el caso del
glifosato (95).

Teniendo en cuenta los parámetros anteriores como: el impacto que tiene el

glifosato en el suelo y el uso de la metagenómica para conocer las
comunidades microbianas de un ecosistema especifico, los resultados
obtenidos en el presente estudio evidencian la presencia de determinadas
75
comunidades bacterianas en los dos suelos analizados: suelo impactado con
glifosato y suelo sin impacto de glifosato.

El filo de las Acidobacterias y la clase Acidobacteria, son uno de los linajes

bacterianos que más se ha asociado a muestras ambientales, se caracterizan
por ser heterótrofos y sus especies ser aeróbicas o microaerófilas y algunas
anaerobias facultativas, poseen glucosidasas, enzimas encargadas de la
degradación de polisacáridos especialmente celulosa y almidón, además de
utilizar como fuente de nitrógeno el amonio. Finalmente se caracterizan por la
producción de exopolisacáridos (EPS), utilizados para la producción de
celulosa bacteriana, se ha sugerido que esta propiedad les confiere una
protección para sobrevivir largos períodos en el suelo (96).

Respecto al filo Acidobacteria se obtuvo un porcentaje de 15.7% y 33.0%, a

nivel clase Acidobacteria 14.7% y 32.7% y en el género Solibacter 1.1% y 4.6%
para el suelo con glifosato y suelo sin glifosato, respectivamente. Se puede
evidenciar que el suelo con glifosato presento una disminución de
Acidobacteria respecto al suelo sin glifosato, teniendo en cuenta la información
anterior, este filo y clase están relacionados con las condiciones del suelo. En
los resultados obtenidos del análisis físico químico (Tabla 4), se evidencia que
el suelo sin glifosato tiene un pH ácido (4.6) lo que se relaciona con el aumento
de este filo en dicho suelo, resultado que concuerda con lo expresado por
Rampelotto PH, de Siqueira Ferreira A, Barboza ADM, Roesch LFW, donde se
concluye que el pH del suelo regula la abundancia del filo y clase Acidobacteria
(97). Por otro lado, en este mismo estudio se evaluaron las comunidades
bacterianas por medio de pirosecuenciación de alto rendimiento del gen 16S en
el suelo brasileño, caracterizado por tener pH ácido y ser pobre en nutrientes,
como resultados se encontró una predominancia de los filos Proteobacteria,
Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteriodetes, Firmicutes, y Gemmatimonadetes.
Los datos anteriores resultan similares a los obtenidos en nuestro estudio, ya
que los suelos analizados presentaron un pH ácido, una deficiencia de
nutrientes (Tabla 4 y 5) y se evidencio una abundancia de algunos de los filos
mencionados anteriormente. Sin embargo, un estudio realizado en 2016 por
Newman MM, Hoilett N, Lorenz N, Dick RP, Liles MR, Ramsier C, et al.
en rizosferas de maíz y soja se encontró abundancia de los filos
76
Proteobacterias, Acidobacterias y Actinobacterias. Por otro lado, la abundancia
relativa de Acidobacterias disminuyó en respuesta a la exposición al glifosato
de dichos cultivos, datos que presentan similitud a lo encontrado en el suelo
con glifosato, donde el filo y clase Acidobacteria disminuyeron en relación al
suelo sin glifosato, resaltando la importancia de algunos miembros de las
Acidobacterias que están involucradas en procesos biogeoquímicos, y una
disminución en su abundancia podría llevar a cambios significativos en el
estado nutricional de la rizosfera (11).

Las Actinobacterias constituyen uno de los filos y clases más importantes entre
las bacterias Gram positivas con un alto contenido de G+C en su genoma.
Están ampliamente distribuidas en los ecosistemas terrestres y acuáticos,
especialmente en el suelo, donde desempeñan un papel crucial en el reciclaje
de biomateriales refractarios por descomposición y formación de humus (98).
La mayoría de las Actinobacterias que viven en el suelo pasan la mayor parte
de sus ciclos de vida como esporas semiactivas, especialmente en condiciones
de nutrientes limitados. Factores como la temperatura, el pH y la humedad del
suelo, influyen en su crecimiento, las Actinobacterias son en su mayoría
mesófilas, tienen un crecimiento óptimo a temperaturas entre 25 y 30°C. La
mayoría crecen en suelos con un pH neutro. Sin embargo, algunas cepas de
Streptomyces se han aislado de suelos ácidos (99).

Dentro del filo Bacteroidetes, sus miembros se caracterizan por ser bacterias
Gram negativas, abarcan una mezcla de diversos tipos fisiológicos, desde
Bacteroides estrictamente anaeróbicos hasta Flavobacterias estrictamente
aeróbicas. Los miembros del filo Bacteroidetes han colonizado diversos nichos
ecológicos como: suelo, océano, sitios de agua dulce y el tracto gastrointestinal
de los animales, donde presentan diversas funciones biológicas. En particular,
son degradadores conocidos de la materia orgánica polimérica y desempeñar
funciones de oxigenación (100). Se cree que los Bacteroidetes ambientales
están especializados en la degradación de la materia orgánica compleja en la
biosfera, especialmente en forma de polisacáridos y proteínas, que pueden
usar como fuente de energía y carbono (101).

77
Respecto a los resultados obtenidos, el suelo con glifosato presento una
abundancia relativa de los filos Actinobacteria 13.9% y Bacteriodetes 0.9%, y
las clases Actinobacteria 11.3% y Thermoleophilia 1.5% en comparación con el
suelo sin glifosato 8.7%, 0.0% y 7.1%, 0.7%, respectivamente. En relación a
estos resultados, en un estudio realizado en suelos de diferentes ecosistemas
por medio de secuenciación metagenómica, se encontró que los filo
Actinobacteria, Bacteroidetes y Cyanobacteria fueron más abundantes en los
suelos con pH cercano a la neutralidad en comparación con los suelos más
ácidos, esto concuerda con lo encontrado en nuestro estudio ya que el suelo
con glifosato presenta un pH de 5.2 en comparación con el suelo sin glifosato
que presenta un pH más ácido (4.6) (102). Resultados que también son
respaldados por un estudio realizado por Lauber CL, Hamady M, Knight R,
Fierer N., donde encontraron abundancias relativas de Actinobacteria y
Bacteroidetes cuando el pH del suelo fue mayor o cercano a la neutralidad,
mientras que la abundancia relativa de Actinobacteria se vio afectada cuando el
pH disminuyó (103).

Por otro lado, el suelo con glifosato presento una abundancia de

Actinobacterias y Bacteriodetes, esto se encuentra relacionado con un estudio
donde se evidencia que los suelos con aplicación de glifosato tienen un
aumento de dichos filos en relación a suelos sin aplicación de dicho herbicida
(104), lo que puede explicar también el aumento de la clase Thermoleophilia
perteneciente al filo Actinobacteria en el suelo con glifosato. Sin embargo, en el
orden Acidobacteriales los resultados fueron diferentes al encontrarse un
porcentaje menor de dicho orden en el suelo con glifosato 5.7% en relación al
suelo sin glifosato 10.6%.

El filo Chloroflexi estaba predominantemente ocupado por bacterias fototróficas

anoxigénicas a finales del siglo XX, una gran cantidad de organismos no
fototróficos pertenecientes al filo se encontraron y se propusieron durante la
última década, la mayoría de sus miembros son ahora bacterias no fototróficas.
El filo contiene seis clases de las cuales Chloroflexia, es la más relevante. Los
fotótrofos solo se encuentran en la clase Chloroflexia, mientras que otras cinco
clases están totalmente compuestas por bacterias no fototróficas (105).

78
Algunos resultados han demostrado que los miembros del filo Chloroflexi son
degradadores de celulosa y la utilización de polímeros vegetales puede estar
generalizada en todo el filo (106).

En los resultados observados en nuestro estudio se encontró una abundancia

del filo Chloroflexi 9.1% y 8.0% y la clase Chloroflexia 1.3% y 0.3%, para suelo
con glifosato y suelo sin glifosato respectivamente, aunque en los dos suelos
se presentó altos porcentaje de este filo y clase, el suelo con glifosato presento
un mayor porcentaje en relación al suelo sin glifosato. En la actualidad no se ha
encontrado una relación significativa del filo Chloroflexi con las propiedades
físico químicas del suelo por lo que no se puede determinar si el pH o alguna
propiedad físico química de los suelos tuvo un impacto en estas comunidades
microbianas.

Por otro lado, al analizar el resultado que presento el suelo con glifosato en el
filo Chloroflexi con otros estudios, se encontró que una investigación realizada
por Lancaster SH, Hollister EB, Senseman SA, Gentry TJ, donde evaluaron el
impacto del glifosato sobre las comunidades microbianas, determino que el filo
Chloroflexi mostro una disminución en los suelos que presentaban alguna
aplicación de dicho herbicida, datos que difieren a los encontrados en nuestro
estudio, donde se evidencio un mayor porcentaje de dicho filo en relación al
suelo sin glifosato (104). Similar a los resultados encontrados para el orden
Chloroflexales donde su porcentaje fue mayor en suelo con glifosato 1.3% en
relación al suelo sin glifosato 0.0%.

Las bacterias del orden Frankiales son bacterias Gram positivas, no móviles
que se caracterizan por fijar el nitrógeno y establecer nódulos radiculares en
plantas y suelo (107). Respecto a los resultados obtenidos se presentó un
mayor porcentaje de dicho orden en el suelo con glifosato 5.4% en relación al
suelo sin glifosato 4.5%, permitiendo establecer que el suelo con glifosato tiene
una buena fijación del nitrógeno en relación a esta comunidad microbiana.

La familia Corynebacteriaceae está compuesta por el género Corynebacterium

con casi 90 especies y el género monoespecífico Turicella , ambos taxones se

79
encuentran en el orden Corynebacteriales, se ha informado una variabilidad
significativa en el contenido de G+C en el ADN genómico que varía desde
aproximadamente 46% en moles hasta 74% en moles. Los miembros de la
familia Corynebacteriaceae se encuentran en diversos entornos, se
caracterizan por ser microorganismos fijadores de nitrógeno y celulolíticos
(108).

Respecto a los resultados obtenidos se encontró que en el orden

Corynebacteriales, este presentó en el suelo con glifosato un valor de 1.9% y
de 0.5% en el suelo sin glifosato, mientras que la familia Corynebacteriaceae
presento una porcentaje en el suelo con glifosato de 1.9% en relación al suelo
con glifosato 0.0%, donde en este último no se evidencio presencia de esta
comunidad, datos que evidencian que el suelo con glifosato presenta una
óptima fijación del nitrógeno y una mejor capacidad celulítica, procesos
importantes en el ciclo biológico del carbono (52).

La familia Micrococcaceae se define por una amplia gama de propiedades

morfológicas y quimiotaxonómicas, como los lípidos polares, los ácidos grasos,
los aminoácidos de peptidoglicano y los azúcares de células que se utilizan
para la delineación de géneros y especies. Los miembros de la familia se
encuentran principalmente en la piel de mamíferos, muestras clínicas,
hemocultivos y en varias muestras de suelo, así como en ambientes marinos.
Se caracterizan por que lo microorganismos pertenecientes a este orden
presentan características proteolíticas (109).

Respecto a los resultados obtenidos se encontró que para el orden

Micrococcales el suelo con glifosato presento un valor de 3.0% en relación al
suelo sin glifosato de 0.9%, similar a los resultados encontrados para la familia
Micrococcaceae en el suelo con glifosato 2.2% y 0.9% para el suelo sin
glifosato, resaltando la importancia de estos microorganismos proteolíticos en
el suelo con glifosato, donde pueden desempeñar mejor las funciones de
degradación de la materia orgánica, además de actuar en etapas iniciales de la
mineralización de los compuestos orgánicos nitrogenados (54).

80
El orden Streptomycetales se caracteriza por tener bacterias Gram positivas del
suelo que forman micelios, desempeñan un papel importante en los procesos
de mineralización en la naturaleza y son productores abundantes de
metabolitos secundarios. Las condiciones de laboratorio permiten determinar
una temperatura de crecimiento entre 28 a 30°C (110). Se consideran
saprofitos de vida libre capaces de descomponer una gran cantidad de
sustratos carbonados, tienen la habilidad para degradar compuestos altamente
recalcitrantes tales como quitina, celulosa y hemicelulosa, en condiciones
particulares de valores altos de pH del suelo (48). En el suelo, el tamaño y
número de la comunidad depende de diversos factores, principalmente de las
características físicas y químicas como pueden ser la textura, humedad, pH y
contenido de materia orgánica.

Los resultados obtenidos en nuestro estudio, mostraron un porcentaje de 0.2%

en el suelo con glifosato para el orden Streptomycetales, en relación al suelo
sin glifosato 0.9% donde su porcentaje fue mayor, similar a los resultados para
el género Streptomyces donde el suelo con glifosato presento un valor de 0.2%
en relación al suelo sin glifosato 0.3%, esto puede estar relacionado con el
aumento del porcentaje de materia orgánica que tiene este suelo (1.93) y su pH
bajo (4.6) en relación al suelo sin glifosato con un valor de 1.43% para materia
orgánica y de 5.2 para pH. Por otro lado, un estudio realizado bajo condiciones
de laboratorio para investigar los efectos de los herbicidas, entre ellos el
glifosato, se encontró que el tratamiento a concentraciones altas de los
herbicidas causó una inhibición del número y actividad de diferentes
Streptomyces en el suelo, datos que se pueden correlacionar con lo encontrado
en nuestro estudio, ya que el suelo con glifosato presento un menor
porcentaje del orden Streptomycetales y género Streptomyces, en comparación
con el suelo sin glifosato (111).

El orden Corynebacteriales se caracteriza por tener bacterias Gram positivas

de morfología bacilar, poseen gránulos de polifosfato para algunas especies,
además de ser algunas anaerobias facultativas o aerobias, se caracterizan por
ser quimioorganótrofas. Las especies de Corynebacterium se han
caracterizado por tener metabolismos fermentativos, oxidativos o no

81
fermentativos, además de participar en la fijación del nitrógeno, reduciendo el
nitrógeno molecular a amonio (51). Las especies coyleae-pilbarense, se
caracterizan por ser bacterias difteroides Gram positivas, anaerobias
facultativas, no lipofilicas, quimioorganótrofas , la especie coyleae en su
genoma contiene 62–64 % en moles de G+C, mientras que no se conoce
información de la especie pilbarense (112). Respecto a los resultados
encontrados, el suelo con glifosato presento un mayor porcentaje del orden
Corynebacteriales y el género Corynebacterium de 1.9% en relación al suelo
sin glifosato 0.5% y 0.0%, datos similares para las especies coyleae-pilbarense,
en el suelo con glifosato 1.9% y suelo sin glifosato 0.0%. Respecto a la poca
información que se tiene sobre la relación de esta comunidad microbiana y las
propiedades fisicoquímicas del suelo, se puede determinar que su presencia en
el suelo con glifosato está relacionada con la función de reducir el nitrógeno
molecular a amonio.

La familia Acidothermaceae contiene bacterias termofílicas aisladas de fuentes

termales y ubicadas en el género Acidothermus. El género Acidothermus se
encontró y aisló en el Parque Nacional Yellowstone, Wyoming, EE. UU. Se han
caracterizado varios genes para la degradación de la biomasa vegetal; las
propiedades termoestables de las enzimas de A. cellulolyticus para la
degradación tanto de celulosa como de hemicelulosa tienen valor para
aplicaciones biotecnológicas (113).

Respecto a los resultados obtenidos se encontró un porcentaje de 4.2% y 4.5%

para la familia Acidothermaceae y el género Acidothermus, para el suelo con
glifosato y suelo sin glifosato respectivamente. Respecto a un estudio realizado
para comprender la relación de las comunidades bacterianas del suelo, las
propiedades físico químicas y el uso de la tierra, se encontró que los suelos
forestales exhibían alto contenido de carbono y nitrógeno, un pH ácido, además
de presentar un aumento del genero Acidothermus, resultado que presenta
relación a los datos encontrados en nuestro estudio, ya que el suelo sin
glifosato fue el que presento un mayor porcentaje de la familia
Acidothermaceae y el género Acidothermus, lo que se puede relacionar con el
aumento del carbono orgánico (1.12%), el nitrógeno (41.0 ppm) y el pH acido

82
(4.6) de este suelo en relación al suelo con glifosato donde el carbón orgánico y
el nitrógeno fueron menores y el pH fue más alto (114).

Las bacterias del género Pseudarthrobacter se caracterizan por ser Gram

positivas, tienen morfología bacilar cuando crecen exponencialmente y de
forma de coco cuando están en fase de crecimiento estacionario,
Pseudarthrobacter contiene las especies chlorophenolicus, defluvii, equi,
niigatensis, oxydans, phenanthrenivorans, scleromae, siccitolerans, y
sulfonivorans, que se caracterizan por heterótrofas y aisladas de diferentes
tipos de suelos, siendo este el hábitat preferido para este género. Son bacterias
mesófilas con preferencias de pH entre 6 y 9 (115). En general el crecimiento
de la especie defluvii se produce entre 5–37°C y con un pH entre 6-10. La
especie equii crece a pH de 6.0–9.0 y la especie nigatensis tiene un
crecimiento optimo a 30°C, con un rango de pH para el crecimiento de 6 a 11
(115).

Respecto a los resultados obtenidos el suelo con glifosato presento el mismo

porcentaje (2.0%) para el género Pseudarthrobacter y las especies defluvii-
equi-niigatensis, el suelo sin glifosato obtuvo un porcentaje de 0.9% para
ambos taxones. Sin embargo, el suelo con glifosato presento un aumento en el
porcentaje de esta comunidad microbiana en relación al suelo sin glifosato, lo
que puede estar relacionado con el pH que presentaba este suelo (5.2) ya que
se encuentra cercano al rango de crecimiento para estas bacterias.

El género Parafilimonas es una bacteria Gram negativa aeróbica no flagelada,

presentan un crecimiento a 15–40 ° C y pH 5.0–8.0. Fue aislada de un suelo de
invernadero en Yongjin – myeon, Gwangju-gun, República de Corea (116).
Respecto a los resultados obtenidos, la presencia de este género fue de 0.9% y
0.0% en el suelo con glifosato en relación al suelo sin glifosato
respectivamente. Sin embargo, se conoce poco de la importancia o relación de
este género en el suelo, lo que sugiere que la presencia de esta comunidad
bacteriana en el suelo con glifosato puede estar relacionada con el pH del
suelo (5.2), un pH que corresponde al rango de crecimiento de esta bacteria.

83
El género Roseiflexus se caracteriza por tener bacterias termofílicas,
fotosintéticas, fue aislada de una esterilla bacteriana en una fuente termal
japonesa. Crece fotoheterotróficamente bajo condiciones anaeróbica de luz y
también quimioheterótrofamente en condiciones oscuras aeróbicas. El
crecimiento óptimo ocurre a 50°C y pH 7.5-8.0 (117). En algunos estudios se
ha evidenciado su papel en el uso del nitrógeno atmosférico, donde su
actividad es más intensa durante la noche. Por lo tanto, estudios más
profundos sobre la vida en el suelo de Roseiflexus spp. y sus rasgos
funcionales contribuirían a una mejor comprensión del ciclo del nitrógeno en los
suelos (106) (117).

Respecto a los resultados obtenidos se evidencio la presencia de este género

en el suelo con glifosato (1.3%) en relación al suelo sin glifosato (0.0%), esto
puede deberse a las condiciones de crecimiento que presenta esta comunidad
bacteriana ya que su crecimiento optimo es a temperaturas de 50°C y pH de
7.5-8.0. Sin embargo el suelo con glifosato presenta un pH de 5.2 respecto al
análisis fisicoquímico, lo que sugiere que esta comunidad bacteriana puede
crecer a pH ácidos.

Respecto a la especies aggregans-modestus, fueron identificadas en un

estudio realizado por Koch IH, Gich F, Dunfield PF, Overmann J, donde se
aislaron dos cepas nuevas de Acidobacterias de dos suelos diferentes, estos
dos aislamientos corresponde a bacterias quimioheterótrofas aeróbicas, pero
solo están relacionados de manera filogenética distante con Terriglobus roseus
y Acidobacterium capsulatum, dos bacterias pertenecientes al
filo Acidobacteria (118).

En los resultados obtenidos se evidencio presencia de las especies aggregans-

modestus pertenecientes al género Edaphobacter con un porcentaje de 0.0% y
0.4%, para suelo con glifosato y suelo sin glifosato respectivamente. Respecto
a Edaphobacter modestus su contenido de G+C en el ADN genómico es de
55.8% en moles, presenta morfología bacilar entre 1.0–1 8 μm de largo y 0 5–
0 7 μm de ancho, las condiciones óptimas para su crecimiento son 30°C y pH
de 5.5. Por otro lado, Edaphobacter aggregans tiene una morfología bacilar de

84
1.5–2 1 μm de largo y 0 7–0 9 μm de ancho, las condiciones óptimas para el
crecimiento son 30 ° C y pH 5.5.(118). Las dos nuevas especies se adaptan a
bajas concentraciones de carbono y a condiciones neutras o ligeramente
ácidas, datos que se pueden relacionar con las propiedades fisicoquímicas
encontradas en los suelos analizados, ya que el suelo con glifosato y el suelo
sin glifosato presentaban un pH de 4.6 y 5.2, respectivamente. Sin embargo, el
porcentaje de estas especies fue mayor en el suelo sin glifosato 0.4% en
relación al suelo con glifosato 0.0%, donde no se encontró comunidades
bacterianas pertenecientes a este género.

El filo Firmicutes es caracterizado por su alta capacidad de resistencia a

diversas condiciones extremas como la desecación, la radiación UV, el calor,
etc.. al formar endosporas, las cuales le permiten sobrevivir en dichos
ambientes. Dentro de este filo se encuentran dos clases relevantes: Clostridia
y Bacilli, en esta última se identifica el género Bacillus que generalmente viven
en el suelo, agua del mar y ríos. Una de sus principales funciones en los ciclos
biogeoquímicos radica en la solubilización de fosfatos, necesarios para el
desarrollo vegetal, clasificado como un nutriente primario al no poder ser
sustituido por otro elemento (119). Un estudio realizado por Wolmarans K,
Swart WJ, en donde se evaluó la influencia del glifosato y otros herbicidas
sobre la microbiota del suelo, demostró que la estructura biótica del suelo se ve
afectada por la mayoría de las variables comunes en las prácticas agrícolas,
incluidas las especies de cultivos, el estrés hídrico, la fertilización, la labranza
del suelo, los regímenes de herbicidas, el pH, el contenido de arcilla y la
profundidad, convirtiéndolos así en cultivos resistentes al glifosato. Para el año
2005 casi el 90% de los 100 millones de cultivos transgénicos que se cultivan
anualmente en todo el mundo eran resistentes al glifosato los cuales se
caracterizaban por una amplia apilación de genes de Bacillus thuringiensis
(120).

En relación con nuestros resultados se puede identificar que en el suelo con

aplicación de glifosato existe una mayor abundancia en cuanto al filo Firmicutes
con 5.8% en comparación con el suelo sin aplicación de glifosato en donde su
porcentaje es de 0.4%, de la misma manera esta diferencia se puede

85
evidenciar en el género Bacillus, donde para el suelo con glifosato existe un
porcentaje de 3.1% y para el suelo sin glifosato un 0.4%. Lo anterior demuestra
que en los suelos con aplicación de glifosato existe una posible resistencia por
parte de dicho filo a la exposición del herbicida, aumentando su presencia en
suelos con históricos de aplicación de glifosato apoyando el estudio descrito
anteriormente, aún así su presencia no es suficiente para la producción
necesaria de fosfatos como se demuestra en la Tabla 4.

Las bacterias que pertenecen al filo Gemmatimonadetes constituyen

aproximadamente el 2% de las comunidades bacterianas del suelo, fue
descubierta en 2003 y en la actualidad poco se sabe de este filo (121) . Cuenta
con un único género denominado Gemmatimonas. Un estudio realizado por
Lancaster SH, Hollister EB, Senseman SA, Gentry TJ, en el que evaluaron el
efecto que tiene la aplicación repetida de glifosato en la composición de las
comunidades microbianas y la mineralización del glifosato, se encontró que el
filo Gemmatimonadetes disminuyó cuando se realizó una única aplicación del
herbicida, en comparación de repetidas aplicaciones en donde no hubo mucha
variabilidad en cuanto a esta única aplicación (104). En los resultados
obtenidos en nuestro trabajo se evidencia que el filo
Gemmatimonadetes presentó un mayor porcentaje en el suelo con aplicación
de glifosato 1.6% en contraste con los resultados obtenidos en el estudio de
Lancaster et al. Lo que sugiere que los cambios en la distribución de las
comunidades microbianas del suelo no solo dependen de la aplicación propia
del glifosato, sino de otros factores ambientales.

El filo Nitrospirae es un grupo de diversas bacterias Gram negativas que

actualmente contienen sólo tres géneros, siendo Nitrospira el más relevante
debido a que las especies pertenecientes a este género son aerobios que
oxidan el nitrito. Debido a la cantidad relativamente pequeña de información
sobre los organismos del filo Nitrospirae, es difícil determinar el potencial de
este grupo en los ciclos biogeoquímicos. Hay muchos informes de Nitrospira no
cultivable en estudios de diversidad ambiental, en las que es imposible hacer
uso de la microbiología tradicional, es por esto que en la mayoría de los casos,

86
aparte de la secuencia del gen 16S rRNA, no se sabe nada con respecto a
estos organismos (122). En la actualidad el género Nitrospira es un
microorganismo considerado quimiolitoautotrófico con la capacidad de oxidar el
amonio a través de nitrito a nitrato, debido a que su genoma codifica las vías de
oxidación de amoniaco y nitrito. Estos hallazgos encaminan a Nitrospira como
un componente clave de las comunidades microbianas que participan en el
ciclo del nitrógeno (123) En una investigación llevada a cabo por Han S, Luo X,
Liao H, Nie H, Chen W, Huang Q, en suelos de cultivos de arroz, se encontró
que la presencia del género Nitrospira en suelos es altamente sensible cuando
el pH de este es ácido, lo que se puede relacionar con los resultados obtenidos
en nuestra investigación, para lo cual se obtuvo en suelos con glifosato un
porcentaje de 6.2% tanto del filo, clase, orden y género de Nitrospira con un
pH de 5.2 y para suelos sin aplicación de glifosato un porcentaje de 2.7% para
las misma entidades taxonómicas con un pH de 4.6, sugiriendo que la acidez
del suelo si es un factor determinante en la presencia de Nitrospira en el suelo
(124).

En relación al filo Planctomycetes, su presencia se ha relacionado con diversos

ambientes naturales, pero hasta hace poco se describió en ambientes
acuáticos. Sin embargo, en un estudio realizado por Buckley DH, Schmidt TM,
en 2003, donde se utilizó el análisis molecular 16S rRNA para determinar las
comunidades microbianas presentes en suelos de agricultura, se encontró alta
prevalencia de este filo, y se determinó como uno de los más frecuentes en el
suelo dedicado a este fin. Adicional al filo Planctomycetes, se hallaron altos
porcentajes de Proteobacteria, Verrucomicrobia, Acidobacteria y
Actinobacterias, comunidades que se presentan en nuestro estudio (125).

El filo Planctomycetes se ha relacionado con la capacidad de oxidar

anaeróbicamente el ion amonio (ANAMMOX), lo que lo convierte en un actor
importante en el ciclo biogeoquímico del nitrógeno, ya que este proceso se
caracteriza por la fijación de nitrógeno atmosférico, convirtiéndolo en nitrato
para su absorción por las plantas y animales, posterior al uso de los nitratos, se

87
generarán desechos (nitritos o amonio), que podrán ser reabsorbidos o
convertidos en gas nitrógeno nuevamente, siendo esta última etapa donde las
bacterias con capacidad ANAMMOX, efectuaran su habilidad de oxidación
(126). En los resultados obtenidos en nuestro estudio, se observa que en el
suelo impactado con glifosato hay un aumento en el porcentaje de este filo
(7,4%) en comparación con el suelo sin glifosato (3,9%); basados en las
características ya mencionadas y en los resultados obtenidos del análisis
fisicoquímico, encontrados en la Tabla 4, se observa una variación importante
en las concentración de compuestos como nitrógeno y nitrito en los suelos
estudiados, donde se encontró para el nitrógeno un porcentaje de8,4% y
38,4%, y nitritos de 11,1% y 41,0% para suelo con glifosato y suelo sin glifosato
respectivamente. Correlacionando el análisis fisicoquímico y metagenómico, se
puede concluir que el suelo con glifosato presenta una menor concentración de
compuestos propios del ciclo del nitrógeno, debido al metabolismo de estos
compuestos, ligada a la abundancia del filo Planctomycetes encontrado en el
suelo.

Con respecto a la clase Planctomycetacia, orden Planctomycetales y familia

Planctomycetaceae, se han relacionados con las mismas características que
posee el filo Planctomycetes, el cual como se mencionó anteriormente, tiene
una importante participación en el ciclo del nitrógeno, gracias a su función de
oxidación anaerobia del amonio (ANAMMOX) (127). En los resultados de
nuestro estudio, se observó que hubo un mayor porcentaje de estos
microorganismos (Planctomycetacia, Planctomycetales y Planctomycetaceae)
en el suelo con glifosato (7.1%) en comparación al suelo sin glifosato (3.9%),
respondiendo de manera similar a los resultados encontrados en el filo
Planctomycetes al cual pertenecen.

El filo Verrucomicrobia se puede considerar ubicuo y bastante abundante en

diferentes tipos de suelo, lo que sugiere que son microorganismos importantes
en los ecosistemas terrestres y cumplen diversas funciones en el nicho
ambiental en el que se encuentren. En la investigación de Fierer N, Leff JW,
Adams BJ, Nielsen UN, Bates ST, Lauber CL, et al, se encontró que si bien
estaba presente en todos los suelos estudiados, hubo una predominancia en
suelos que no eran desérticos, parámetro que se relaciona con las

88
características físicas de las muestras procesadas en nuestra investigación
(102).

Respecto a los resultados hallados en nuestro estudio, se puede concluir que la

diferencia entre el porcentaje de esta comunidad microbiana en el suelo con
glifosato (3,6%) y el suelo sin glifosato (3,0%) no es relevante, puesto que sus
porcentajes son muy similares; adicional a esto, si se compara la concentración
del filo Verrucomicrobia con otros filos hallados en este estudio, se puede
determinar que su porcentaje no es muy alto. Esta aseveración se ve
relacionada con el estudio de Carbonetto B, Rascovan N, Álvarez R,
Mentaberry A, Vázquez MP, donde se determinó que este filo se encontraba en
mayores proporciones en suelos que no han sido utilizados para agricultura
(128), parámetro que concuerda con nuestros resultados, puesto que el suelo
con glifosato, ha sido manejado para el cultivo de diversas especies vegetales.
Otra investigación que corrobora nuestros resultados, fue la desarrollada por
Navarrete AA, Soares T, Rossetto R, van Veen JA, Tsai SM, Kuramae EE,
donde se estableció que Verrucomicrobia, aun estando en diversidad de
ambientes terrestres, presenta alta sensibilidad a los cambios en el ambiente y
así mismo al déficit o aumento de nutrientes presentes en el suelo (129).

Las bacterias de la clase Proteobacterias abarcan gran diversidad morfológica,

fisiológica y metabólica, siendo importantes en el ciclo de carbono, nitrógeno y
azufre, sin embargo, la gran mayoría de las Proteobacterias del suelo aún no
se han cultivado (130). Las comunidades bacterianas pertenecientes a este filo
se caracterizan por ser ubicuos y abundantes en el suelo, especialmente en los
suelos cálidos.

En los resultados obtenidos en nuestro estudio, se evidenció que los

porcentajes para este filo no variaron en gran medida, si se compara el suelo
con glifosato (30,8%) y el suelo sin glifosato (34,9 %), lo que podría deberse a
las propiedades fisicoquímicas del suelo, las cuales fueron similares en las dos
zonas de muestreo, lo que conseguiría una similitud en el crecimiento y
desarrollo de este filo, al proporcionar igualdad en condiciones y nutrientes. En
contraste con los resultados obtenidos en nuestro análisis, el estudio realizado
en 2016 por Newman MM, Hoilett N, Lorenz N, Dick RP, Liles MR, Ramsier C,

89
et al, en cultivos de maíz y soja, demostró que filos como Proteobacteria
(especialmente la clase Gammaproteobacterias) presentaron una estimulación
y posterior aumento de la población de bacterias al exponerse a
concentraciones de glifosato (11).

Al igual que las características del filo, las clases derivadas de las
Proteobacterias varían ampliamente en morfología, funcionalidad y géneros,
demostrando amplios rangos de aerobicidad, trofismo y adaptación a la
temperatura, adicionando propiedades de simbiosis con otros seres vivos,
característica fundamental para su supervivencia en el ambiente (131). Las
características y requerimientos de las diversas clases mencionadas
(Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria y
Deltaproteobacteria), por lo general responden a un mismo patrón, o muy
similar, sin embargo, en el estudio llevado a cabo por Kim HM, Jung JY,
Yergeau E, Hwang CY, Hinzman L, Nam S, et al, demostró que el pH y la
profundidad del suelo, puede afectar de manera diferente la clase de
Proteobacterias que se encuentren en la zona, mostrando que
Alphaproteobacteria, disminuyó al aumentar la profundidad del suelo, lo que en
el estudio se relacionó con la preferencia de esta clase por los nutrientes
ambientales presentes en mayor cantidad en la superficie. Con respecto al pH
se observó que clases como Alphaproteobacteria y Gammaproteobacteria,
disminuyeron al aumentar el pH, a diferencia de las Betaproteobacterias y
Deltaproteobacterias las cuales aumentaron proporcionalmente al pH,
conclusiones que se pueden relacionar con los resultados obtenidos en nuestro
análisis de datos (132).

Respecto a las clases que se presentaron con mayor abundancia, fueron

Alphaproteobacteria (18,3% y 24,6%), Deltaproteobacteria (7.1% y 4.6%)
Gammaproteobacteria, (4.1% y 3.4%) y Betaproteobacteria (1.4% y 2.3) para
suelo con glifosato y sin glifosato respectivamente, todos pertenecientes al filo
Proteobacteria, estos resultados que se relacionan con el estudio realizado por
Lauber CL, Hamady M, Knight R, Fierer N, donde por medio de
pirosecuenciación se caracterizó las comunidades bacterianas en suelos de
América del Norte y del Sur, en relación con los parámetros físico químicos,
este estudio demostró que la abundancia de Alpha y Beta /

90
Gammaproteobacterias no muestran una relación significativa con el pH del
suelo (103). Sin embargo, en un estudio realizado en el Parque Nacional Jirisan
(Corea del sur) caracterizado por tener un pH ácido la clase
Alphaproteobacteria fue predominante en relación a la clase Beta, Gamma,
Delta, Zeta y Epsilon (133)

Dentro de los órdenes más relevantes en nuestro estudio encontramos a los

Rhizobiales y Xanthomonadales, de estos dos órdenes se puede decir que
pertenecen a las Proteobacterias y que tiene capacidad de fijar nitrógeno,
convirtiéndolos en microorganismos importantes en este ciclo
biogeoquímico(132). En nuestro estudio, se observó que los porcentajes del
orden Rhizobiales presentaron valores de 12.2% y 15.2% para suelo con
glifosato y suelo sin glifosato respectivamente, estos porcentajes se asemejan
a los resultados obtenidos en las Alphaproteobacterias analizadas con
anterioridad, lo que podría relacionar las características de esta clase, con los
Rhizobiales. Mostrando un patrón diferente, en nuestro estudio de obtuvo
porcentajes variantes del orden Xanthomonadales, encontrando valores de
1.9% y 0.0% para el suelo con glifosato y sin glifosato respectivamente. En el
estudio desarrollado por Ren C, Sun P, Kang D, Zhao F, Feng Y, Ren G, et al,
se determinó que de las Proteobacterias los órdenes que más resaltaron fueron
Rhizobiales y Xanthomonadales, con una relevancia del primero (134).

El orden Pseudomonadales, la familia Pseudomonadaceae y principalmente el

género Pseudomonas, hacen parte de la clase Gammaproteobacterias y se
han caracterizado por tener una amplia diversidad de metabólica lo que permite
la colonización de diferentes nichos ambientales, como características son
bacterias Gram negativas móviles, frecuentemente relacionados con patología
en humanos, animales y plantas. En diferentes estudios desarrollados a lo
largo de la historia se ha establecido la resistencia que tienen diferentes cepas
de Pseudomonas frente a la aplicación y exposición de glifosato, demostrando
que estas bacterias son capaces de mineralizar el glifosato y usarlo como
fuente de fósforo, y de esta manera degradarlo (104)(135)(136)(137).

El orden Burkholderia hace parte de las Betaproteobacterias y se caracterizan

por ser bacterias aerobias, con morfología bacilar y Gram negativas, de la clase

91
a la que pertenecen son las más relevantes y están ampliamente distribuidas.
Ecológicamente son saprófitos que intervienen en el reciclaje de materia
orgánica (138).

Los porcentajes obtenidos del orden Burkholderiales fueron de 0.2% en suelo

con glifosato y de 2.1% en suelo sin glifosato y los resultados del orden
Pseudomonadales, familia Pseudomonadaceae y género Pseudomonas son
iguales en el suelo con glifosato (0.5%) y suelo sin glifosato (1.4%). En los dos
grupos de bacterias se ve bajas concentraciones de la comunidad en el suelo
con glifosato en comparación al suelo sin glifosato. En una primera oportunidad
se podría relacionar estos datos con el hecho de que el glifosato afectó el
desarrollo de estas comunidades, disminuyendo consistentemente la población
hallada; sin embargo, existen estudios como el realizado por Kuklinsky-Sobral
J, Araújo WL, Mendes R, Pizzirani-Kleiner AA, Azevedo JL, donde buscaban
determinar cuáles eran las comunidades bacterianas que podrían seguir su
crecimiento en un cultivo de soja que había sido tratado con glifosato, dentro de
los resultados de este estudio se encontró que géneros como Pseudomonas y
Burkholderia se encontraban en los suelos estudiados después de la aplicación
de este herbicida, carácter que difiere de nuestro resultados, al verse
disminuida las poblaciones de estas dos comunidades en el suelo impactado
con glifosato (139).

La familia Bradyrhizobiaceae y el género Bradyrhizobium son bacterias

pertenecientes a las Proteobacterias, Gram negativas y se han relacionado con
la fijación de nitrógeno, junto con otros géneros (Bradyrhizobium. Rhizobium,
Mesorhizobium, Sinorhizobium y Azorhizobium) son conocidos como rizobios y
forman nódulos en la planta anfitrión (140). En los resultado obtenidos en
nuestra investigación, se obtuvo que Bradyrhizobiaceae presentó un porcentaje
de 2.3% en el suelo con glifosato y 1.0% en el suelo sin glifosato, anexo a esto
el género Bradyrhizobium presento un porcentaje de 1.2% en el suelo con
glifosato y 0.0% en el suelo sin glifosato, si bien estos valores no son iguales
entre sí, se puede observar el incremento de estas comunidades en el suelo
con glifosato en comparación con el suelo sin glifosato. Estos resultados
concuerdan con algunas investigaciones en las que se evaluó la resistencia de
Rhizobium a la aplicación del glifosato, demostrando que son pocos los efectos

92
que tiene este herbicida sobre dicha comunidad, aunque se hace la salvedad
del aumento de su toxicidad cuando es aplicado en las primeras fases del
crecimiento de la planta, afectando el proceso de nodulación de
Bradyrhizobium (141)(142).

El género Acidibacter es un grupo de bacterias acidófilas perteneciente a las

Gammaproteobacterias, es considerado un microorganismos novedoso, ya que
se le ha atribuido cierta resistencia al arsénico y sensibilidad al cobre, el cual
disminuye su crecimiento (143). Los resultados obtenidos con respecto a estos
microorganismos en nuestra investigación, fue un porcentaje de 0.7% en el
suelo con glifosato y de 1.9% en el suelo sin glifosato; en comparación con
otros géneros, no son resultados relevantes, sin embargo su presencia en las
muestras analizadas se puede relacionar con la acidez de los dos suelos.

Otro de los géneros encontrados en los resultados fue Pseudolabrys y

Variibacter ambos microorganismos mostraron resultados porcentuales iguales
tanto para el suelo con glifosato (1.3%) y el suelo sin glifosato (3.5%), es poca
la información que se encuentra de estos géneros gracias a su reciente
descubrimiento, sin embargo se sabe, que los dos poseen solo una especie:
Variibacter gotjawalensis y Pseudolabrys taiwanensis, estos dos géneros han
sido aislados en zonas boscosas o de forestación, propiedad similar a las
características de la zona de muestreo de la investigación (144)

En las especies encontrados en el análisis, tenemos a Variovorax paradoxus, el

cual es un microorganismo de gran interés debido a sus características
metabólicas, como la biodegradación de compuestos biogénicos y
contaminantes como herbicidas y pesticidas, pertenece a las Proteobacterias y
tiene la capacidad de generar interacciones mutuamente beneficiosas con otras
bacterias y plantas (145). En los resultados obtenidos en nuestro análisis, se
observa que el porcentaje de la comunidad para el suelo con glifosato es de
0.1% y para el suelo sin glifosato de 1.8%, si bien los porcentajes de este
microorganismo en el suelo resultan bajos, estos resultados podrían
relacionarse con el hecho de que esta especie es promotora del crecimiento
vegetal por medio de sus relaciones simbiontes con otros organismos (146).

93
Respecto a las propiedades fisicoquímicas del suelo se puede evidenciar que
estas tienen un papel importante en la actividad de las comunidades
microbianas del suelo y en su estado nutricional. Uno de los parámetros que
más se ha estudiado en relación a las características del suelo, su composición
nutricional y microbiológica es el pH. En nuestro estudio se pudo determinar
que el pH fue uno de los parámetros que se asoció con la presencia o
reducción de diferentes comunidades microbianas en los dos suelos
analizados. Se evidencio que algunas comunidades bacterianas como:
Acidobacterias, Acidothermus y Alfaproteobacterias, presentaron porcentajes
mayores en el suelo sin glifosato, debido a que este suelo presento un pH
acido de 4.6. Sin embargo, en el suelo con glifosato se encontró que
comunidades como: Actinobacterias, Bacteriodetes, Pseudarthrobacter y
Nitrospirae fueron predominantes, ya que este suelo se caracterizó por tener un
pH cercano a la neutralidad. Resultados que permiten determinar que el pH en
el suelo juega un papel importante en el desarrollo de ciertas comunidades
bacterianas en diferentes nichos ecológicos.

Por otro lado, se ha relacionado el papel del pH del suelo con las
concentraciones de aluminio intercambiable. Cuando el pH del suelo se
caracteriza por ser ácido se producen una mayor concentración de aluminio
intercambiable, resultando toxico para las plantas, así mismo altera las
poblaciones y actividades de los microorganismos que intervienen en la
mineralización de la materia orgánica y en la transformación de nitrógeno y
azufre. De igual manera afecta la disponibilidad del fosforo debido a que forma
compuestos insolubles con el hierro y aluminio, dejando así de estar disponible
para las plantas (147).

Respecto a los resultados obtenidos en el análisis físico químico de los suelos

estudiados, se puede evidenciar que el suelo con glifosato presento un pH bajo
de 5.2 y una acidez intercambiable de 1.16 cmol+ *kg-1 en relación al suelo sin
glifosato que presento un pH de 4.6 y una acidez intercambiable de 4.21, así
mismo el fosforo encontrado en los dos suelos presento un valor de 3 y 2 mg *
kg-1 ó ppm para cada suelo respectivamente. Estos resultados permiten

94
determinar que el suelo sin glifosato tendría una toxicidad mayor para las
plantas que el suelo con glifosato; sin embargo, al momento de la inspección
visual realizada en el muestreo se evidencio que la zona del suelo sin glifosato
presentaba una gran diversidad de especies vegetales saludables, mientras
que en la zona del suelo con glifosato se presentaban especies vegetales con
problemas de crecimiento, clorosis y necrosis. Esto permite determinar un
patrón que difiere a lo referenciado en la literatura acerca de la relación de la
acidez intercambiable con el crecimiento vegetal.

Dentro de los macronutrientes más importantes para la nutrición y el

crecimiento vegetal se encuentra el calcio, factores como pH y CIC determinan
la disponibilidad de este macronutriente. En suelos que presenta un pH acido el
calcio no se encuentra disponible de forma rápida para las plantas, pues
conforme decrece el porcentaje de calcio en proporción a la CIC total, también
decrece la cantidad de Ca absorbido por las plantas (148). Aplicando esto a
nuestra investigación se puede evidenciar que para los dos tipos de suelos
estudiados: con y sin aplicación de glifosato, la cantidad de calcio presente es
deficiente, esto puede estar relacionado con el pH acido de los suelos, esto se
ve reflejado en los resultados obtenidos en la Tabla 4 donde el suelo sin
glifosato tiene el pH más ácido (4.6) y la cantidad de calcio es inferior (574 mg *
kg-1 ó ppm) en comparación con el suelo con glifosato que aunque presenta un
pH acido (5.2) la cantidad de calcio es de 1269 mg * kg-1 ó ppm.

En el caso del potasio podemos ver una disminución en los dos suelos
estudiados; está perdida puede deberse a los procesos de erosión y lixiviación
propios de la zona, para el suelo sin glifosato se evidencia una deficiencia de
potasio (91 mg * kg-1 ó ppm.) y para el suelo con glifosato se encuentra en
niveles bajos (136 mg * kg-1 ó ppm.), lo cual puede deberse a los procesos
nombrados con anterioridad.

Respecto a las relaciones catiónicas que se forman a partir de los diferentes

elementos presentes en el suelo como Ca, Mg o K se relacionan principalmente
con la fertilidad del suelo, por lo que es importante conocer la concentración de
estos compuestos. Estas relaciones se utilizan como indicador de los nutrientes
y fertilidad que puede presentar el suelo para el uso en agricultura, se debe

95
recordar que las relaciones catiónicas dependen de las concentraciones
individuales de estos compuestos en el suelo. En nuestro estudio, estas
relaciones presentaron variación en los suelos estudiados, en el caso de la
relación Ca/K, se observa una gran diferencia entre el suelo con glifosato y el
suelo sin glifosato, ya que en el primero se encuentra un valor de 27,32 el cual
se considera excesivo, y en el caso del suelo sin glifosato se presenta un valor
de 8,26 lo que se considera deficiente. Para la relación de Mg/K se presentó un
valor de 17,03 (exceso) en el suelo con glifosato y de 5,30 (óptimo) en el suelo
sin glifosato. Por el contrario, en el caso de la relación Ca/Mg se observó que
tanto en el suelo con glifosato (1,60) como en el suelo sin glifosato (1.56) el
valor de la relación fue deficiente, situación que difiere a las relaciones
catiónicas anteriormente nombradas. Finalmente, la relación antagónica
Ca+Mg/K que se presenta en nuestro estudio se encuentra en un valor
excesivo (44.35) en el suelo con glifosato y óptimo (13.56) en el suelo sin
glifosato, esta relación antagónica se relaciona con la gran variación que se
presenta en los valores individuales de los elementos evaluados (148) (149).

Respecto al papel del glifosato es importante conocer que Inicialmente el

glifosato se vendió como un herbicida eficaz y que no presentaba riesgos para
la salud humana, ni para el medio ambiente, si era utilizado de la manera
adecuada y bajos las recomendaciones incluidas en la etiqueta del producto;
sin embargo, en la actualidad se ha incrementado la atención del mundo sobre
el posible daño que representa el uso y exposición prolongada a este producto
químico, los cuestionamientos se presentaron en distintos años, pero tomaron
interés mundial con el caso de Dewayne Johnson un jardinero, que fue
diagnosticado con cáncer (Leucemia No Hodking) el cual pasó de ser tratable a
terminal, debido a que siguió usando el producto (30).

A lo largo de los años se han presentado diferentes investigaciones

relacionadas con el posible daño del glifosato, si bien la mayoría se enfocan en
distintas células o zonas anatómicas, finalmente todos concluyen la toxicidad
del glifosato, toxicidad que puede variar dependiendo de la concentración y
tiempo de exposición. En el estudio llevado a cabo por Martínez A, Reyes I y
96
Reyes N, en el 2007 se estableció la toxicidad in vitro de este herbicida para las
células humanas (mononucleares), se observó que las preparaciones
comerciales (Roundup®) mostraban más toxicidad que el compuesto activo, lo
que apoya la idea de que los aditivos de las preparaciones comerciales juegan
un papel importante en la toxicidad del compuesto (150).

Existen estudios centrados en la revisión de literatura y documentos que

puedan esclarecer las consecuencias del uso del glifosato sobre la salud
humana y consecuentemente cómo afecta la salud pública, algunos de estos
estudios son: Efectos del glifosato sobre la salud humana (2015) realizado por
investigadores de la Universidad libre de Colombia, el cual después de una
revisión bibliográfica de diferentes publicaciones sobre el glifosato en el
contexto nacional, concluyeron que el uso de este herbicida se relaciona con
enfermedades o afecciones respiratorias, dermatológicas, alergias, ansiedad,
cáncer, trastornos gastrointestinales, malformaciones en fetos, problemas de
fecundidad y abortos (151).

Otro de los estudios relacionados con este tipo de investigación es: Verdades
científicas sobre glifosato y salud pública (2016) realizado por la fundación
ideas para la paz, con el fin de contribuir al conocimientos sobre el tema sin
estar a favor o en contra del uso del glifosato y de esta manera invitar a
expertos a continuar el debate sobre la utilización de este herbicida. En esta
investigación se dividieron los estudios en: realizados en células (8), en
animales (7), en humanos (16) y en ecosistemas (1). En los estudios
implementados en células se evidencio que el glifosato puede acelerar la
muerte celular, disminuir el proceso de mitosis y dañar el ADN, sin embargo, se
debe tener en cuenta que este tipo de estudios se realiza exponiendo
directamente las células a la sustancia problema, además que la
concentración es diferente a la que estarían sometidas estas células en
condiciones normales, por lo que estos resultados no se consideran definitivos
en términos de evidencia de daño sobre la salud humana.

97
También es importante entender y saber que el uso de glifosato no solo podría
llevar a una afectación de la salud humana, ya que de la misma manera tiene
un impacto sobre los animales expuestos a este herbicida. Es por esto que en
diferentes estudios llevados a cabo en animales, se observó problemas en los
ciclos reproductivos en ratas y en los fetos; en especies acuáticas se evidencio
que puede afectar la capacidad de manejo del estrés oxidativo y el desarrollo
de huevos y embriones. Estos resultados permiten evaluar los daños
eventuales en la fauna silvestre o doméstica. En estudios en humanos, no se
demostró relación entre este herbicida y el desarrollo de cáncer, sin embargo
se estableció como factor de riesgo la contaminación ambiental y de fuentes
hídricas con este producto. No obstante se estableció que el riesgo de
intoxicación por el uso de glifosato en labores agrícolas es común. Con
respecto a afecciones reproductivas, se muestran conclusiones contradictorias
en algunos estudios, ya que se ha relacionado con aumentos de tasa de
abortos en las personas en contacto con el herbicida y en otros estudios se ha
establecido que no tiene relación. Finalmente, concluyeron que no es posible
comprobar bioacumulación de glifosato en tejidos animal y no hay evidencia
sólida que apoye los efectos negativos en la fertilidad, desarrollo de cáncer o
problemas mutagénicos (152).

Una revisión bibliográfica desarrollada por Campuzano C, Feijoo L, Pineda K,

Palacio M, Fonnegra J, Zapata J (2017), concluyó que el glifosato es altamente
tóxico por el compromiso negativo generado en los diversos sistemas del
cuerpo, lo que produce un factor de riesgo constante en las personas que lo
utilizan diariamente en las labores agrícolas o de jardinería (153).

Finalmente, es importante resaltar que nuestro estudio no tuvo como finalidad

evaluar el impacto que tiene el uso del glifosato sobre la salud humana y
animal, pero si su papel en la interacción con la microbiota del suelo. Adicional
a esto, basados en la interacción que se tuvo con la comunidad de la vereda
Tuis Tuis y de la inspección visual que se realizó al momento del muestreo se
pudo corroborar el daño generado en la vegetación a partir de la aspersión
aérea del glifosato realizada de manera accidental en el año 2013, lo que
condujo a un proceso de deforestación y afectación a la fauna propia de la

98
región. Es de gran importancia destacar que el mayor impacto de esta
problemática se vio reflejado en el ámbito económico, puesto que las especies
forestales maderables tienen un gran valor comercial, las no maderables
establecidas con el propósito de servir de alimento a la fauna endémica de la
región y las especies frutales que se comercializan con el fin de generar un
ingreso económico.

99
 6 CONCLUSIONES
 En el análisis metagenómico se logró identificar la diversidad procariota
de las muestras de suelo en la zona de amortiguación del Parque
Nacional Natural Paramillo, en Córdoba, para lo cual se obtuvo que el
filo más predominante fue Proteobacterias, el orden Rhizobiales, la
familia Xanthomonadaceae, el género Acidothermus y Nitrospira y
finalmente a nivel de especie defluvii-equi-niigatensis.

 Las propiedades fisicoquímicas tales como pH, materia orgánica,

Carbono orgánico y nutrientes, tienen un alto impacto sobre las
diferentes comunidades procariotas halladas, debido a que de dichas
propiedades depende el crecimiento, desarrollo, actividad, metabolismo,
resistencia o sensibilidad de los diversos microorganismos presentes en
los suelos con y sin glifosato.

 Se determinó mayor cantidad de microorganismos procariotas en el

suelo sin glifosato, las OTUs obtenidas en dicho suelo duplicó las
contenidas en el suelo con aplicación de glifosato, por ende se encontró
un mayor porcentaje en los filo, clase, orden, familia y género de este
suelo, a excepción de las Actinobacterias, quienes se presentaron en
mayor cantidad en el suelo con glifosato. Lo anterior evidencia un
impacto negativo en las comunidades procariotas del suelo cuando son
expuestas al glifosato, disminuyendo su presencia en los suelos
analizados en este trabajo.

100
 7. RECOMENDACIONES

 Hacer uso correcto de las concentraciones establecidas por el Instituto

Colombiano Agropecuario para el uso del glifosato, con el fin de evitar la
contaminación de fuentes hídricas y la sobreexposición de la persona
que lo manipule.
 Utilizar el glifosato siguiendo las recomendaciones establecidas en la
etiqueta del producto. Por ejemplo hacer uso del equipo de protección
personal al momento de la manipulación del producto y no reutilizar el
envase del mismo con fines de actividades diarias (almacenamiento de
agua o alimentos).
 Buscar nuevos métodos que sirvan como alternativa para la erradicación
de cultivos ilícitos y el aseguramiento de los cultivos lícitos.
 Debido a la gran diversidad de suelos que se encuentra en el territorio
colombiano, se recomienda que las diferentes instituciones
gubernamentales, universitarias e institutos de interés ambiental,
promuevan la investigación de la interacción del glifosato en otros tipos
de suelos y ambientes.

101
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27/2824

116
 ANEXOS

ANEXO N°1 Composición procariota 16S

1.1 Tabla de composición e identificación procariota a nivel de Filo.

117
1.2 Tabla de composición e identificación procariota a nivel de Clase.

CG SG

CG SG

118
1.3 Tabla de composición e identificación procariota a nivel de Orden.

CG SG

119
120
1.4 Tabla de composición e identificación procariota a nivel de Familia

CG SG

121
122
123
1.5 Tabla de composición e identificación procariota a nivel de Género

CG SG

124
125
126
127
1.6 Tabla de composición e identificación procariota a nivel de Especie

128
129
130
131
132
133
134
135