Fuentes Rivera Navarro Jessica Paola Titulo Profesional 2021
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RochelFuentes Rivera Navarro Jessica Paola Titulo Profesional 2021
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RochelFACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y MATEMÁTICA
INGENIERÍA GENÉTICA DE LEVADURA Y SU APLICACIÓN BIOTECNOLÓGICA
PARA BIORREMEDIACIÓN DE MERCURIO
Línea de investigación:
Genética, bioquímica y biotecnología
Trabajo de Suficiencia Profesional para optar el Título Profesional de
Licenciada en Biología
Autora:
Fuentes Rivera Navarro, Jessica Paola
Asesor:
Salas Asencios, Ramsés
(ORCID: 0000-0002-4075-1736)
Jurado:
Bohorquez Meza, Isabel Doris
Mayanga Herrera, Ana
Rodrigo Rojas, Maria Elena
Lima - Perú
2021
Referencia:
Fuentes, J. (2021). Ingeniería genética de levadura y su aplicación biotecnológica para
biorremediación de mercurio [Trabajo de suficiencia profesional, Universidad Nacional
Federico Villarreal]. Repositorio Institucional UNFV.
http://repositorio.unfv.edu.pe/handle/UNFV/5603
Reconocimiento - No comercial - Sin obra derivada (CC BY-NC-ND)
El autor sólo permite que se pueda descargar esta obra y compartirla con otras personas,
siempre que se reconozca su autoría, pero no se puede generar obras derivadas ni se puede
utilizar comercialmente.
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
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FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y MATEMÁTICA
INGENIERÍA GENÉTICA DE LEVADURA Y SU APLICACIÓN
BIOTECNOLÓGICA PARA BIORREMEDIACIÓN DE
MERCURIO
Línea de investigación:
Genética, bioquímica y biotecnología
Trabajo de Suficiencia Profesional para optar el Título Profesional de
Licenciada en Biología
Autor(a)
Fuentes Rivera Navarro, Jessica Paola
Asesor(a)
Salas Asencios, Ramsés
(ORCID: 0000-0002-4075-1736)
Jurado
Bohorquez Meza, Isabel Doris
Mayanga Herrera, Ana
Rodrigo Rojas, Maria Elena
Lima - Perú
2021
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Agradecimientos
A Dios por la vida y por iluminar cada paso durante mi camino.
A mi familia por el apoyo incondicional desde siempre.
A la Profesora Dra. Elisabete José Vicente, jefa del laboratorio de Genética de
Microorganismo perteneciente al Departamento de Microbiología del Instituto de Ciencias
Biomédicas II de la Universidad de São Paulo, por la acogida, confianza y asesoría cientifica
durante el tiempo que permanecí en su laboratorio.
A la Profesora Dra. Ana Clara Guerrini Schenberg por la atención y colaboración
científica durante el desarrollo de los proyectos de investigación.
Al Profesor Mg. Ramsés Salas Asencios por el soporte y asesoría de este trabajo.
3
ÍNDICE
Resumen .................................................................................................................................. 4
Abstract ................................................................................................................................... 5
I. Introducción ........................................................................................................................ 6
1.1 Trayectoria del Autor ...................................................................................................... 6
1.2 Descripción de la Empresa .............................................................................................. 7
1.3 Organigrama de la Empresa ........................................................................................... 8
1.4 Áreas y Funciones desempeñadas................................................................................... 8
II. Descripción de una Actividad Específica ...................................................................... 10
2.1. Introducción .................................................................................................................. 10
2.2 Marco Teórico ................................................................................................................ 11
2.2.1 Contaminación ambiental por metales pesados tóxicos ............................................. 11
2.2.2 Mercurio como Contaminante Ambiental .................................................................. 13
2.2.3 Toxicidad del Mercurio ................................................................................................ 15
2.2.4 Biorremediación de ambientes contaminados por metales pesados tóxicos .............. 16
2.2.5 Saccharomyces cerevisiae ............................................................................................ 21
2.3 Actividades desarrolladas sobre Ingeniería genética en levadura y su aplicación
biotecnológica para Biorremediación de Mercurio .......................................................... 28
2.3.1 Construcción de un sistema de anclaje de proteína heteróloga en la superficie celular
de S. cerevisiae ...................................................................................................................... 28
2.3.2 Construcción de una cepa de levadura diseñada para la biorremediación de
mercurio ................................................................................................................................ 35
III. Aportes destacables a la empresa/institución ............................................................. 43
IV. Conclusiones................................................................................................................... 44
V. Recomendaciones ............................................................................................................ 45
VI. Referencias ..................................................................................................................... 46
4
Resumen
El objetivo del presente informe es presentar una revisión respecto a la ingeniería genética
realizada en levadura y su aplicación biotecnológica para biorremediación de mercurio.
Los organismos vivos están expuestos a niveles tóxicos de iones metálicos provenientes
principalmente de actividades antropogénicas, las cuales producen y descargan residuos
conteniendo diferentes metales pesados en el medio ambiente. El mercurio es uno de los
metales pesados más tóxico, incluso en bajísimas concentraciones, al igual que otros metales
tóxicos es difícil de eliminarlo del medio ambiente, ya que no puede degradarse química o
biológicamente. Por consiguiente, la contaminación por mercurio es uno de los principales
problemas ambientales y de riesgo para la salud humana. En las últimas décadas con los
avances en biotecnología, la biorremediación utiliza microorganismos como biosorbentes para
la remoción de metales pesados tóxicos de efluentes o aguas residuales industriales. Entre los
biosorbentes, la levadura Saccharomyces cerevisiae es un organismo útil porque se puede
cultivar fácilmente en un medio de cultivo de bajo costo, la biomasa es fácilmente obtenida a
partir de industrias de fermentación y se puede manipular fácilmente a nivel molecular.
Asimismo, la ingeniería genética es una herramienta atractiva para mejorar la adsorción de
iones metálicos en levaduras, facilitando de esta forma la remoción de metales pesados tóxicos
que contaminan el medio ambiente.
Palabras claves: mercurio, biorremediación, Saccharomyces cerevisiae, biosorción.
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Abstract
The aim of this work is to present a review on the genetic engineering performed in yeast and
its biotechnology application for mercury bioremediation. Living organisms are exposed to
toxic levels of metal ions mainly coming from anthropogenic activities, which produce and
discharge wastes containing different heavy metals into the environment. Mercury is one of the
most toxic heavy metals, even in lower concentrations, like other toxic metals, is difficult to
remove from the environment, because it cannot be chemically or biologically degraded.
Consequently, mercury contamination is one of the most serious environmental and human
health risk problems.In the last decades with the advances in biotechnology, bioremediation
uses microorganisms as biosorbents for the removal of heavy metals from wastewater. Among
the biosorbents for heavy metal removal Saccharomyces cerevisiae is a useful organism
because is easily cultivated using cheap media, biomass is easier to get from fermentation
industry and is easily manipulated at molecular level. Furthermore, genetic engineering is an
attractive tool to improve the adsorption of metal ions in yeast, thus facilitating the removal of
toxic heavy metals that pollute the environment.
Keys words: mercury, bioremediation, Saccharomyces cerevisiae, biosorption.
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I. INTRODUCCIÓN
1.1 Trayectoria del Autor
Realicé mis estudios de pregrado en la Escuela de Biología de la Facultad de Ciencia
Naturales y Matemática de la Universidad Nacional Federico Villarreal, obteniendo el grado
de Bachiller en Biología. Asimismo, realice mis estudios de posgrado en la Universidad de São
Paulo (Brasil) obteniendo el título de Magister en Biotecnología y Doctora en Ciencias.
Durante mi trayectoria profesional adquirí experiencia en el área de microbiología,
biología molecular e ingeniería genética de microorganismos, con manejo de técnicas y
procedimientos de biología molecular y microbiología aplicada a la biotecnología.
De febrero del 2004 hasta febrero del 2013 trabajé en el laboratorio de Genética de
Microorganismos del Departamento de Microbiología de la Universidad de São Paulo (USP),
en proyectos de ingeniería genética de bacterias y levaduras para aplicaciones biotecnológicas,
los cuales fueron financiados por la compañía minera VALE. Además, participé activamente
en el entrenamiento técnico y científico de estudiantes de pre grado.
De diciembre del 2013 hasta noviembre del 2017 pasé a formar parte del equipo de
investigadores del laboratorio de Biotecnología del Departamento de Ingeniería Química de la
Universidad de São Paulo, trabajando en proyectos de recuperación de áreas contaminadas por
metales tóxicos y extracción de cobre a partir de residuos mineros utilizando procesos
biotecnológicos.
El informe desaarrollado en este trabajo estará enfocado en presentar la actividad
realizada en el laboratorio de Genética de Microorganismo de la Universidad de
São Paulo referente a la “Ingeniería genética de levadura y su aplicación biotecnológica para
biorremediación de mercurio”. En las últimas décadas, las actividades antropogénicas han
propiciado el aumento de la acumulación de metales pesados en el medio ambiente, entre ellos
7
el mercurio, arsénico, plomo, entre otros. Bajo ese contexto, la biorremediación es una
alternativa para la remoción de los metales pesados acumulados en el medio ambiente,
especialmente el mercurio, el cual es altamente tóxico para el ambiente y la salud de la
población. Asimismo, la ingeniería genética es una herramienta utilizada en procesos de
biorremediación de mercurio, con la finalidad de mejorar la adsorción de este ion metálico en
microorganismos como levaduras, facilitando la reducción de mercurio en el medio ambiente.
1.2 Descripción de la Empresa
El laboratorio de Genética de Microorganismos forma parte del Departamento de
Microbiología del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de São Paulo.
El Departamento de Microbiología está localizado en el campus de la Ciudad Universitaria, en
la ciudad de São Paulo (Brasil). Presenta una excelente infraestructura de laboratorios y de
enseñanza, desarrolla investigaciones científicas y forma especialistas en diferentes áreas de
Microbiología desde 1970. Además de las actividades de investigación, el Departamento está
comprometido con la formación y capacitación de profesionales altamente calificados.
El laboratorio de Genética de Microorganismos lleva a cabo investigaciones
biotecnológicas sobre levaduras y bacterias, con el objetivo de generar cepas mejoradas para
diversas aplicaciones como producción de alcohol utilizando cepas de levaduras modificadas
genéticamente, producción de polihidroxialcanoatos (PHA) por bacterias y biorremediación de
metales tóxicos de los efluentes utilizando microorganismos modificados genéticamente.
8
1.3 Organigrama de la Empresa
El Departamento de Microbiología del Instituto de Ciencias Biomédicas II de la USP
está constituido por 31 laboratorios de investigación, el sector administrativo, el sector de
apoyo técnico, didáctico y un bioterio para el mantenimiento de animales en experimentación
(Figura 1).
Figura 1
Organigrama del Instituto de Ciencias Biomédicas II - Laboratorio de Genética de
microorganismos
1.4 Áreas y Funciones desempeñadas
El laboratorio desarrolla investigaciones y estudios con proyectos aprobados y
financiados por diferentes agencias de fomento brasilero, además de la captación de recursos
de instituciones privadas.
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Las áreas de investigación del Laboratorio de Genética de Microorganismos son las
siguientes:
Biorremediación de aguas contaminadas por metales pesados
Objetivo: Construcción de bacterias y levaduras recombinantes con capacidad aumentada
de realizar la biorremediación de agua contaminada por metales pesados tóxicos.
Expresión de proteínas heterólogas en levaduras
Objetivo: Clonación y expresión de proteínas de interés biotecnológico en levaduras, con el
fin de mejorar de la producción de bioproductos como enzimas hidrolíticas, antígenos
antivirales, hormonas de crecimiento, etc.
Desarrollo de bioprocesos y bioproductos:
Objetivo: Producir de forma más eficiente de polihidroxialcanoatos (PHA), que son
biopolímeros bacterianos, termoplásticos, biodegradables y de gran interés comercial.
Aislamiento de nuevas cepas de bacterias productoras de PHA, capaces de producir: nuevos
tipos de biopolímeros y/o biopolímeros a partir de sustratos alternativos derivados de
residuos de la agroindustria.
Las principales funciones que desempeñé en el laboratotio fueron:
- Ejecución de proyectos de investigación en el área de genética molecular de levaduras y
bacterias, referidos a la construcción de cepas recombinantes de Saccharomyces cerevisiae
desarrolladas para aplicación biotecnológica.
- Colaboración en la formación técnico-científica de estudiantes de posgrado.
- Análisis de datos y elaboración de informes técnico-científico.
- Participación en la búsqueda y redacción de patentes.
10
II. DESCRIPCIÓN DE UNA ACTIVIDAD ESPECÍFICA
Esta sección tiene como objetivo presentar el trabajo realizado en el laboratorio de
Genética de Microorganismo titulado:
“INGENIERÍA GENÉTICA DE LEVADURA Y SU APLICACIÓN
BIOTECNOLÓGICA PARA BIORREMEDIACIÓN DE MERCURIO”
2.1. Introducción
Las actividades antropogénicas como actividades industriales, agrícolas, disposición de
aguas residuales industriales o efluentes, entre otras, son las principales responsables de la
contaminación del medio ambiente por metales pesados tóxicos. Los residuos de metales
pesados tóxicos han sido desechados de forma indiscriminada en cuerpos de agua o depositados
en el suelo.
Uno de los metales pesados que más afectan al ecosistema y a la salud de la vida
humana es el mercurio. Los efectos tóxicos del mercurio en la salud se evidencian por un
retraso en el desarrollo neurológico en fetos y niños, además de provocar daños en el sistema
nervioso central de adultos. Por otro lado, las emisiones de mercurio elemental a la atmosfera,
bajo la forma de vapor pueden ser inhaladas y depositadas en los pulmones causando efectos
negativos en la salud humana. Uno de los casos más graves de envenenamiento por mercurio
ocurrió en la Bahía Minamata, Japón, donde miles de personas que consumieron pescado
contaminado con mercurio murieron y otras miles resultaron afectadas (Harada, 1985).
El mercurio es un metal pesado difícil de remover completamente del medio ambiente
porque no puede ser degradado química o biológicamente. En este contexto, la expansión de
nuevas tecnologías ha llevado a la evolución de la biorremediación como una herramienta
11
alternativa para reducir las consecuencias adversas de la enorme acumulación de metales
pesados en el medio ambiente.
La ingeniería genética es utilizada en procesos de biorremediación para mejorar las
funciones específicas de los microorganismos empleados, como biosorbentes, en este proceso,
facilitando la descontaminación de ambientes poluidos por metales pesados tóxicos.
El objetivo del presente informe es presentar una revisión respecto a la Ingeniería
genética realizada en levadura y su aplicación biotecnológica para Biorremediación de
Mercurio.
2.2 Marco Teórico
2.2.1 Contaminación ambiental por metales pesados tóxicos
Los metales pesados son descargados en la atmósfera, en los ambientes acuáticos y
terrestres, alterando el equilibrio de los ecosistemas, incluso en pequeñas concentraciones son
una amenaza para el medio ambiente.
Actualmente, el llamado "desecho electrónico" (Residuos de aparatos eléctricos y
electrónicos - RAEE) , como televisores, celulares, pilas y componentes de informática que
acaban siendo descartados y reemplazados por modelos más nuevos y sofisticados, está
creciendo asombrosamente. El problema es que tales equipos contienen muchas sustancias
peligrosas y tóxicas, principalmente metales pesados, que alcanzan suelos e incluso mantos
freáticos, contaminando de esta forma el ambiente y ocasionando serias preocupaciones sobre
el manejo de este nuevo tipo de desecho (Babu et al., 2007).
Generalmente se denominan metales pesados aquellos elementos químicos con número
atómico mayor que 20 y densidad igual o superior a 5 g/cm3. Dentro de este grupo, algunos
12
iones metálicos son importantísimos para mantener las diversas funciones bioquímicas y
fisiológicas en los organismos, cuando se encuentran en concentraciones bajísimas. Sin
embargo, algunos metales pesados se pueden convertir en nocivos cuando exceden la
concentración límite, convirtiéndose en importantes contaminantes del medio ambiente y su
toxicidad es un problema de creciente importancia por razones ecológicas, evolutivas,
nutricionales y ambientales (Jaishankar et al., 2014; Nagajyoti et al., 2010).
Los metales pesados comúnmente encontrados en aguas residuales incluyen arsénico
(As3+ y As5+), cadmio (Cd2+), cromo (Cr2+), cobre (Cu2+), plomo (Pb2+), mercurio (Hg2+) y
níquel (Ni2+), todos los cuales causan riesgos para la salud humana y el medio ambiente
(Lambert et al., 2000). Los metales pesados ingresan al entorno por medios naturales y
actividades humanas. Por lo general, algunos metales pesados tienen más de un estado de
oxidación que pueden determinar su movilidad, biodisponibilidad y toxicidad. Ante esta
situación, estos metales son tóxicos o pasan a ser tóxicos en determinada concentración o
situación y pueden ser considerados metales pesados tóxicos. La acción directa de los metales
pesados tóxicos sobre los seres vivos sucede como resultado del bloqueo de actividades
biológicas, específicamente por la inactivación enzimática, debido a la formación de enlaces
entre el metal y algunos grupos funcionales de proteínas, causando daños irreversibles en
diversos organismos (Vullo, 2003).
Las características tóxicas de los metales pesados son las siguientes: (1) pueden
permanecer por un largo período de tiempo en la naturaleza; (2) en un determinado ambiente,
algunos metales pesados pueden transformarse en especies más tóxicas, a partir de especies
menos tóxicas; (3) la bioacumulación y biomagnificación de los metales pesados tóxicos en la
cadena alimenticia pueden perjudicar la actividad fisiológica y consecuentemente poner en
riesgo la vida humana; (4) algunos metales pesados como mercurio, cadmio, arsénico, entre
13
otros, son muy tóxicos, incluso en concentraciones bajas. (Alkorta et al., 2004; Volesky, 1990a;
Wang y Chen, 2006).
2.2.2 Mercurio como Contaminante Ambiental
El mercurio se presenta en estado líquido a temperatura de ambiente, presenta
coloración plateada y su abreviatura “Hg” viene del latín Hydrargyrum (plata líquida). Es un
metal pesado y tóxico, inclusive en bajísimas concentraciones. Una vez liberado a partir de
fuentes naturales o antrópicas y emitido a la biosfera, el mercurio puede cambiar de estado y
especie, pero no desaparece como metal, además presenta una gran movilidad en los
ecosistemas, y puede entrar a la cadena trófica o alimenticia. Las principales especies de
mercurio son el mercurio elemental o metálico (Hg0), y las especies orgánicas e inorgánicas.
El mercurio elemental (Hg0) es volátil y es una especie química estable en la atmósfera,
de esta forma el vapor de mercurio puede ser transportado en escala global afectando áreas
naturales remotas, lejos de las fuentes puntuales de contaminación. Los compuestos
inorgánicos de mercurio, también llamados sales de mercurio, se forman a partir de la
combinación de iones mercuroso (Hg+) y mercúrico (Hg2+) con elementos como cloro, azufre
y oxígeno (United Nations Environment Program [UNEP], 2002).
En su forma orgánica, el ion mercúrico (Hg2+) se encuentra covalentemente unido al
carbono, formando compuestos orgánicos llamados organomercuriales. Entre los compuestos
orgánicos de mercurio tenemos: metilmercurio, dimetilmercurio, fenilmercurio y etilmercurio,
siendo el metilmercurio (CH3Hg) y el dimetilmercurio ((CH3)2Hg) los más comunes en el
medio ambiente (UNEP, 2002, 2013). La contaminación de ambientes acuáticos por mercurio
está asociada, especialmente, a la posibilidad de metilación de su forma inorgánica (Hg2+) por
bacterias, que posibilitan el mantenimiento de concentraciones relativamente elevadas en los
14
cuerpos de agua y el acceso preferente a la biota. El metilmercurio por ser liposoluble es
bastante absorbido por las membranas biológicas, así como por los tractos digestivos de
prácticamente todas las cadenas alimenticias. Estos procesos facilitan la permanencia y el
transporte del mercurio en el medio acuático, así como la transferencia de la contaminación
para ecosistemas bastante alejados de la fuente de contaminación, promoviendo la aceleración
de la bioacumulación en la cadena alimenticia y la maximización de los riesgos en los
ecosistemas naturales y en la salud humana (Porcella, 1994).
El mercurio, además de ser altamente tóxico, es capaz de sufrir biomagnificación en
casi todas las cadenas alimenticias es decir, su concentración aumenta conforme aumenta el
nivel trófico de la especie (UNEP, 2002). Esto resulta en una exposición ambiental bastante
alta para los consumidores de niveles tróficos superiores, incluyendo el hombre. Comparando
la concentración de metilmercurio (CH3Hg) en el agua, en relación a la encontrada en lo alto
de la cadena trófica, el factor de biomagnificación del mercurio está en la orden de 1 millón de
veces (Castoldi et al., 2003; Clarkson, 1997, 2002) .
Con el pasar de los años, los problemas con mercurio aumentaron debido a la
contaminación ambiental generada por las actividades humanas asociadas a los yacimientos de
oro, quema de combustibles fósiles, producción de cloro-soda, empleo de fungicidas
mercuriales, fabricación de lámparas fluorescentes; con consecuente liberación de mercurio
para los sistemas atmosféricos, acuáticos y terrestres.
En el Perú, principalmente en la región Amazónica, grandes cantidades de mercurio
son utilizados para la formación de amalgama durante la extracción de oro de forma ilegal e
informal. Después de la utilización en el proceso de extracción de oro, el mercurio residual es
descartado en las márgenes de los ríos y suelos, o eliminado a la atmosfera como vapor durante
el proceso de quema de amalgama, el cual puede ser oxidado y retornar a los ecosistemas
15
terrestres a través de las precipitaciones. Estando disponible en los cuerpos de agua, el mercurio
puede transformarse en metilmercurio y entrar en la cadena alimenticia de organismos
acuáticos, como por ejemplo peces, los cuales son uno de los mayores bioconcentradores de
este metal (De Souza y Barbosa, 2000). En el caso de Madre de Dios, la minería informal e
ilegal ha llevado a niveles críticos de contaminación y de impacto negativo al ecosistema, con
el peligro de extender la contaminación hacia grandes extensiones de bosques tropicales
aledaños, con una gran acumulación de este metal en suelos, agua y por ende, en organismos
vivos que viven en esa zona.
2.2.3 Toxicidad del Mercurio
La toxicidad del mercurio se debe a su fuerte afinidad por el grupo sulfhidrilo
(-SH) de enzimas y proteínas, causando daños irreversibles a los sistemas biológicos. El
mercurio también tiene afinidad, aunque en menor grado, por los grupos carboxilo, amida,
amina y fosforilo de enzimas, lo que contribuye para su toxicidad.
Los compuestos organomercuriales son extremamente tóxicos, no solo para el ser
humano, sino también para toda la biota. Debido al radical orgánico, este compuesto puede
entrar rápidamente en la corriente sanguínea, causando daños irreparables al sistema nervoso
central, afectando principalmente áreas específicas del cerebro, como cerebelo y lóbulos
temporales. Una vez en el organismo, el compuesto se convierte rápidamente en un complejo
proteico, manteniendo gran movilidad en los tejidos animales. La liposolubilidad de los
compuestos organomercuriales también facilita su pasaje a través de los tejidos. Estos
compuestos también pueden ser absorbidos por la piel y aproximadamente el 100% por el tracto
gastrointestinal.
La intoxicación por metilmercurio se caracteriza por ataxia (pérdida de la coordinación de los
16
movimientos voluntarios), disartria (problemas en las articulaciones de las palabras), parestesia
(pérdida de la sensibilidad en las extremidades de las manos y pies y alrededor de la boca),
visión de túnel (constricción del campo visual) y pérdida de la audición. Una contaminación
severa puede llevar a la muerte. El metilmercurio puede atravesar también la barrera placentaria
en el feto, causando daños serios al desarrollo de este, principalmente a nivel neurológico
(Micaroni, 2000).
El mercurio en la forma de vapor (Hg0) puede atravesar fácilmente la membrana
alveolar hasta alcanzar la circulación sanguínea. En la sangre, el mercurio es oxidado a la forma
divalente (Hg2+) y es rápidamente distribuido por el cuerpo, pudiendo ligarse a la albumina y
a la hemoglobina (Micaroni, 2000).
2.2.4 Biorremediación de ambientes contaminados por metales pesados tóxicos
Varias técnicas fueron usadas para la remoción y/o recuperación de metales pesados
tóxicos de ambientes contaminados. Procedimientos como: precipitación, intercambio iónico,
adsorción, oxido-reducción, osmosis reversa y tratamiento electroquímico fueron utilizados
para la remoción de estos metales de soluciones o efluentes. Sin embargo, la mayoría de estos
procesos presentan altos costos, son ineficientes, especialmente para la remoción de bajas
concentraciones del metal pesado tóxico, requieren el uso de aditivos químicos y pueden
generar flujos de residuos concentrados que deben ser eliminados
(Kiyono y Pan-Hou, 2006).
La biorremediación es un proceso que utiliza principalmente microorganismos para
reducir, remover, eliminar o transformar en compuestos menos tóxicos, contaminantes
peligrosos presentes em ambientes contaminados. La biorremediación tiene varias
aplicaciones, incluyendo la descontaminación y recuperación de suelos, aguas subterráneas,
17
ríos, lagunas, lodo y efluentes (Boopathy, 2000). Asimismo, ofrece varias ventajas: puede ser
realizada en el local, generalmente sin causar mayores alteraciones a las actividades cotidianas;
es una técnica económicamente viable; los contaminantes se eliminan de forma permanente; es
ambientalmente amigable y puede ser acoplada a otros tratamientos físico-químicos (Vidali,
2001).
En las últimas décadas, la biorremediación esta siendo aplicada en diferentes tipos de
contaminantes como hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs), trinitrobenzeno (TNT) y
bifenilos policlorados (PCBs) (Tabak et al., 2005).
En la actualidad, el proceso de biorremediación también es utilizado para restaurar
ambientes contaminados por metales pesados tóxicos, debido a las ventajas mencionadas
anteriormente. Al contrario de los contaminantes orgánicos, los metales pesados no pueden ser
degradados, permaneciendo en el ambiente por tiempo indefinido. Sin embargo, los
microorganismos pueden interactuar con algunos metales pesados tóxicos y transformarlos de
una especie química a otra, los cuales pueden ser precipitados o volatilizados en solución
(Tabak et al., 2005).
La búsqueda de nuevas estrategias de biorremediación para la remoción de metales
tóxicos de ambientes contaminados ha sido direccionada para procesos de biosorción, el cual
utiliza microorganismos como biosorbentes, por ejemplo bacterias, levaduras, fungos y algas.
Estos microorganismos tienen la propiedad de secuestrar algunos metales disueltos en
soluciones y pueden disminuir la concentración de los iones metálicos tóxicos en solución con
eficiencia y rapidez. Por consiguiente, la biosorción es una estrategia ideal para tratamiento de
efluentes, conteniendo bajas concentraciones de iones metálicos tóxicos (Ledin, 2000; Wang y
Chen, 2009; Kuroda y Ueda, 2011).
Hay dos procesos de adsorción de iones metálicos utilizados por los microorganismos
para extraerlos a partir de la solución (Figura 2):
18
El primero es la bioacumulación que consiste en la captación de iones metálicos por los
microorganismos vivos, para ser transportados, a través de la membrana plasmática, para
el citoplasma, seguido de su secuestro en un compartimiento celular. Este proceso es
dependiente del metabolismo.
Los organismos vivos presentan intrínsecamente mecanismos de homeostasis a metal que
mantienen la concentración intracelular de iones metálicos en respuesta a los iones
metálicos del ambiente.
Una vez incorporado el ion metálico al citoplasma, este puede ser secuestrado por proteínas
ricas en grupo sulfhidrilo llamadas metalotioneinas (MT), fitoquelatinas (PC) y glutatión
(GSH), o compartimentalizado dentro de vacuolas (Marrero et al., 2010).
Los iones metálicos acumulados en las células no pueden ser fácilmente recuperados sin
disrupción celular y, consecuentemente, la reutilización del biosorbente celular es
imposible. Por lo tanto, la acumulación intracelular es limitada para la recuperación de
iones metálicos acumulados (Kuroda y Ueda, 2011).
El segundo proceso es la biosorción que consiste en la ligación de iones metálicos a la
superficie celular del microorganismo, a través de interacciones fisicoquímicas entre los
iones metálicos y los grupos funcionales presentes en la superficie celular. Este proceso es
independiente del metabolismo. La adsorción en la superficie celular es activa en células
vivas y muertas; es un proceso rápido porque la superficie celular interactúa con el material
circundante. Es importante destacar que, a diferencia de la bioacumulación, no se requiere
la ruptura celular para recuperar los iones metálicos adsorbidos en la superficie celular,
permitiendo la reutilización del microorganismo en un nuevo proceso de biosorción
(Kuroda y Ueda, 2011). De esta forma, la biosorción se muestra como una alternativa para
la bioacumulación.
19
Figura 2
Adsorción de iones metálicos en microorganismos
Nota. Adaptada de “Molecular design of the microbial cell surface toward the recovery of metal
ions”, por Kuroda y Ueda, 2011, Current Opinion in Biotechnology, 22(3).
Con el objetivo de mejorar la adsorción de iones metálicos tóxicos en la superficie de
microorganismos, la ingeniería genética modificó las propiedades de la superficie celular, al
expresar péptidos o proteínas anclados en la superficie externa de la célula que se unen a iones
metálicos, (“cell surface display”), utilizando como ancla proteínas nativas de pared celular
(Kuroda y Ueda, 2011; Li y Tao, 2015).
En la superficie celular de algunos microorganismos, como Escherichia coli,
Cupriavidus metallidurans, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus carnosus y
Saccharomyces cerevisiae, fueron expresados péptidos o proteínas quelantes de metal para
biorremediar aguas contaminadas con metales pesados tóxicos (Kuroda y Ueda, 2011) (Tabla
1).
20
Tabla 1
Biosorción de iones metálicos por proteínas o péptidos anclados en la superficie celular de
microorganismos.
Péptido/Proteína anclado en Ion Proteína Microorganis
Referencia
la superficie celular metálico Ancla mo
Metalotioneina humana, Cu2+, Cd2+, Zn2+ LamB E. coli Sousa et al.,1998
Metalotioneina de levadura
Péptidos curtos unidos a metal Cu2+, Cd2+, Zn2+ LamB E. coli Kotrba et al., 1999
Hexa-histidina Cd2+ LamB E. coli Sousa et al., 1996
Fitoquelatina Cd2+ Lpp-OmpA E. coli Bae et al., 2000
Ice nucleation
MerR Hg2+ E. coli Bae et al., 2003
protein
Ice nucleation E. coli
Proteína que se une a fosfato H2PO4- Li et al., 2009
protein P. putida
Variantes de CBD
Ni2+ SPA S. carnosus Wernerus et al., 2001
seleccionados
S. xylosus, Samuelson et al.,
Péptidos Poli-histidil Cd2+, Ni2+ SPA
S. carnosus 2000
E. coli
Metalotioneina de ratón Cd2+ IgA β-domain Valls et al., 2000
R. eutropha
Hexa-histidina Cu2+, Ni2+ α-Aglutinina S. cerevisiae Kuroda et al., 2001
Metalotioneina de ratón Cd2+ α-Aglutinina S. cerevisiae Kuroda y Ueda, 2003
ModE Mo2+ α-Aglutinina S. cerevisiae Nishitani et al., 2010
Péptido NP co CXXEE Pb2+ α-Aglutinina S. cerevisiae Kotrba y Ruml, 2010
Nota: Adaptada de “Molecular design of the microbial cell surface toward the recovery of
metal ions”, por Kuroda y Ueda, 2011, Current Opinion in Biotechnology, 22(3).
Las propiedades de adsorción de los biosorbentes construidos por ingeniería genética
van a depender de las características de adsorción del péptideo o proteína que se une al metal.
Las células pueden ser dotadas con la capacidad de adsorber iones metálicos específicos por el
péptideo o proteína anclada en su superficie celular externa que puede unirse a iones metálicos
específicos (Kuroda y Ueda, 2010).
21
2.2.5 Saccharomyces cerevisiae
La levadura Saccharomyces cerevisiae es uno de los microorganismos más estudiados
y utilizados en procesos industriales, como producción de alimentos, pan, extracto de levadura,
suplemento dietético para la alimentación animal, aroma y sabor de los alimentos, bebidas,
glicerina y etanol combustible. Con el surgimiento de la tecnología del ADN recombinante,
tanto la levadura S. cerevisiae como otras levaduras relacionadas ganaron mayor importancia
biotecnológica, debido a su potencial para producir proteínas heterólogas (Walker, 1998).
S. cerevisiae es reconocido por la FDA americana (“Food and Drug Administration ")
como un organismo seguro," GRAS ("Generally Recognized As Safe"), para ser empleado
como suplemento nutricional para humanos y animales, no ofreciendo riesgos de
contaminación por sustancias tóxicas o alergénicas normalmente presentes en otros
microorganismos (Romanos et al., 1992). Esta levadura fue el primer eucariota que tuvo su
genoma secuenciado (Goffeau et al., 1996).
Por ser un organismo unicelular, S. cerevisiae presenta las mismas facilidades de
manipulación y condiciones de crecimiento que las bacterias. Sin embargo, ofrecen también
una serie de ventajas adicionales, en lo que se refiere a la producción de proteínas heterólogas,
entre ellas: ambiente intracelular favorable para la correcta formación de proteínas; y la
capacidad de procesar modificaciones postraduccionales para la producción de proteínas
heterólogas, como: glicosilación, acilación y fosforilación (Kukuruzinska et al., 1987;
Miyamoto et al., 1985; Towler et al., 1988). Estas características contribuyen al mantenimiento
de la integridad estructural, solubilidad, actividad biológica y localización celular de proteínas
recombinantes. A partir de la primera publicación mostrando la expresión de un gen heterólogo
en S. cerevisiae (Hitzeman et al., 1981), ese microorganismo viene siendo empleado
frecuentemente como sistema hospedero (Romanos et al., 1992).
La extensión y diversidad de productos expresados en este microorganismo son significativas,
22
variando desde simples enzimas a hormonas, factores de crecimiento, proteínas sanguíneas o
estructuras complejas como anticuerpos. De esta forma, los productos obtenidos no están
limitados a procesos fermentativos tradicionales, sino que abarcan diversos sectores como
alimentos, químicos, enzimáticos, farmacéuticos, agricultura y ambiente (Walker, 1998).
2.2.5.1 S. cerevisiae como biosorbente. La biomasa de levaduras fue utilizada como
biosorbente para la remoción de iones metálicos como Ag+, Au3+, Cd2+, Co2+, Cr3+, Cu2+, Ni2+,
Pb2+, U2+ y Zn2+ de soluciones acuosas (Tabla 2). Levaduras del género Saccharomyces sp.,
Candida sp., y Picchia sp., son eficientes biosorbente para la remoción de metales pesados
tóxicos. La mayoría de las levaduras pueden adsorber una amplia gama de iones metálicos o
ser estrictamente específicas en relación a un ion (Wang y Chen, 2009).
Tabla 2
Biosorción de algunos iones metálicos en S. cerevisiae.
Tipo de metal Metal Referencias
Goksungur et al., 2005, Özer, Özer, 2003; Suh et al., 1999a,b;
Pb2+
Bakkaloglu et al. ; 1998; Wang, 2002b
Cu2+
Bakkaloglu et al., 1998
Zn2+
Gomes et al., 2002; Park et al., 2003; Vasudevan et al., 2003; Goksungur et al.,
Cd2+
2005;
Metal Tóxico Al-Saraj et al., 1999; Zhu et al., 2004
Hg2+
Al-Saraj et al. 1999
Co2+
Bakkaloglu et al., 1998; Özer, Özer, 2003
Ni2+
Ferraz et al., 2004; Özer, Özer, 2003; Rapoport, Muter, 1995;
Cr3+
Nguyên-nhu, Knoops, 2002
As3+
Liu et al., 2003a; Xie et al., 2003a
Metales Pd2+
Xie et al., 2003b
Preciosos Pt4+
Karamushka, Gadd, 1999; Lin et al., 2005
Au3+
Bustard, McHale, 1998; Simmons, Singleton, 1996
Ag+
Kedari et al., 2001
U2+
241Am Liu et al., 2003b
Avery, Tobin, 1992
Radionúclidos Sr
Nakajima, 2001; Popa et al., 2003; Riordan et al., 1997
U2+
Pérez-Corona et al.,1997
Se, Sb3+
Kapoor, Viraraghavan, 1997
U, Sr, Cs
Nota. Tomada de “Biosorption of heavy metals by Saccharomyces cerevisiae: A review”, por
Wang y Chen, 2006, Biotechnology Advances, 24(5).
23
Cuando la levadura S. cerevisiae es incubada en presencia de metal, la pared celular es
la primera estructura celular que entra en contacto con los iones metálicos. Inicialmente, la
captación de metal por la célula ocurre a través de la interacción con los grupos funcionales
presentes en la pared celular, incluyendo fosfato, carboxilo, amina y especies fosfodiester. (Liu
et al., 2002; Volesky, 1990a, b; Wang y Chen, 2006).
Entre las levaduras, S. cerevisiae es una de las más empleadas en estudios de biosorción
porque presenta características únicas en comparación con otros microorganismos para la
remoción de metal. Según Wang y Chen (2006), las ventajas que tornan esta levadura
interesante para procesos de biosorción son:
1) Se pueden cultivar en grande escala, pudiendo crecer fácilmente, utilizando técnicas
de fermentación no sofisticadas en medio de cultivo de bajo costo;
2) La biomasa de S. cerevisiae, como un subproducto, puede obtenerse fácilmente en
grandes cantidades, a partir de varias industrias de fermentación (cervecera, de alimentos,
producción de etanol combustible), en comparación con otros tipos de biomasa microbiana
residual. A diferencia de otras biomasas, las células de levadura obtenidas de industrias de
fermentación son estables y no son necesarios tratamientos drásticos asociados a procesos de
recuperación de productos primarios. Por ejemplo, la biomasa de hongos utilizada en la
industria farmacéutica necesita tratamientos con solventes, que pueden afectar el desempeño
de su capacidad de remoción de metal;
3) Como es un organismo GRAS, este hecho aumenta la viabilidad del uso de esta
biomasa en procesos de biorremediación.
4) La levadura S. cerevisiae fue utilizada como modelo eucariota para investigaciones
de biosorción de iones metálicos, incluyendo estudios de interacción microorganismos-iones;
5) La utilización de esta levadura como sistema modelo es particularmente atractiva
debido a la fácil manipulación genética y la disponibilidad de la secuencia genómica completa
24
(Perego y Howell, 1997). Los conocimientos acumulados sobre la biología molecular de esta
levadura son útiles para identificar los mecanismos moleculares de biosorción en la remoción
de iones metálicos;
6) La característica de floculación presentada por S. cerevisiae puede facilitar la
separación mecánica al final del proceso de biosorción. Esta propiedad intrínseca hace
innecesario el uso de técnicas de inmovilización celular o procesos de separación sólido-
líquido (Soares y Soares, 2012).
Todas estas ventajas hacen de la biomasa de levadura una herramienta promisoria en
procesos de biorremediación que apuntan a la descontaminación de aguas con metales pesados
tóxicos.
2.2.5.2 Sistema de anclaje en la superficie celular “cell surface display” de
S. cerevisiae. El uso de proteínas nativas de superficie celular como herramienta para anclar
proteínas heterólogas presenta varias aplicaciones en las diferentes áreas de la ciencia. Por
medio de esta estrategia, varios péptidos o proteínas fueron anclados en la superficie celular de
algunos microorganismos para aplicaciones biotecnológicas como producción de anticuerpos,
construcción de biocatalizadores, biosorbentes celulares, biosensores, entre otros (Wernerus y
Ståhl, 2004).
La utilización de esta estrategia permitió la construcción de cepas recombinantes de
S. cerevisiae que presentaron proteínas heterólogas, con actividad catalítica, ancladas en su
pared celular. Estas cepas fueron llamadas de células de levaduras armadas (“arming yeast
cells”) (Kondo y Ueda, 2004; Lee et al., 2003; Schreuder, 1996; Ueda y Tanaka, 2000b; Van
der Vaart et al., 1997).
25
La pared celular de S. cerevisiae es una estructura rígida de aproximadamente
200 ƞm de espesura, está formada por tres componentes principales: (1) glucano forma parte
da capa interna de la pared celular, es un polímero de β-1,3 y β-1,6 de glucosa, que le
proporciona rigidez y flexibilidad a la célula; el β-1,3 glucano forma una red fibrosa; y el
-1,6 glucano es ampliamente ramificado; (2) quitina es un polímero N-acetilglucosamina, y
está localizada en la capa interna formando un complejo con el -1,3 glucano;
(3) mananoproteínas altamente glucosiladas, están localizadas en la capa externa de la pared
celular, otorgándole porosidad (Lipke y Ovalle, 1998).
La pared celular de Saccharomyces sp. contiene más de 20 tipos de mananoproteínas
que desempeñan diferentes papeles en la construcción, preservación, modificación de la
estructura celular e interacción das células, como por ejemplo, las interacciones intercelulares
durante la aglutinación o floculación (Lipke y Ovalle, 1998; Mrsa y Tanner, 1999) (Figura 3).
Figura 3
Componentes estructurales de la pared celular S. cerevisiae
Nota. Adaptada de “Cell Wall Architecture in Yeast: New Structure and New Challenges”,
por Lipke y Ovalle, 1998, Journal of Bacteriology, 180(15).
26
Varias mananoproteínas de S. cerevisiae, como: Agα1, Aga1, Flo1, Sed1, Cwp1, Cwp2,
Tip1, Tir1 / Srp1, presentan en su estructura un dominio de unión a glucosilfosfatidilinositol
(GPI). La estructura GPI fue encontrada en varias proteínas de membrana plasmática de
eucariotas y es altamente conservada en los diferentes organismos (Ueda y Tanaka, 2000a).
La estructura GPI de levaduras está compuesta de: etanol-amino fosfato, manosa (α-1,2),
manosa (α-1,6), manosa (α-1,4), glucosamina (GlcN) e inositol -fosfolípido (Figura 4).
La parte glucofosfolípidica de GPI se une covalentemente a la región
C-terminal de las mananoproteínas y su función principal es permitir una asociación estable
entre la mananoproteína y la membrana plasmática.
Figura 4
Componentes estruturales de Glucosilfosfatidilinositol (GPI)
Nota. Man (manosa); GlcNH2, glucosamina. Tomada de “Genetic immobilization of protein
on the yeast cell surface”, por Ueda y Tanaka, 2000a, Biotechnology Advances, 18(2).
La proteína heteróloga es expresada en la superficie celular como una fusión con la
proteína de pared celular, utilizada como ancla para inmovilizar la proteína heteróloga.
27
En los sistemas descritos, el gen codificador de la proteína heteróloga es fusionado: (1)
en un extremo a una secuencia codificadora del péptido señal, que direcciona el transporte de
la proteína para la superficie celular; y, (2) en el otro extremo a una secuencia codificadora de
proteína de pared celular (mananoproteína - ancla), como por ejemplo proteína α-aglutinina,
Flo1p, Sed, Cwp2, entre otros (Murai et al., 1997; Nakamura et al., 2001; Ueda y Tanaka,
2000a; Van der Vaart et al., 1997). De esta forma, la proteína heteróloga es transportada y
anclada a la superficie celular externa da levadura S. cerevisiae (Kondo y Ueda, 2004)
(Figura 5).
Figura 5
Esquema del diseño para la expresión de proteína heteróloga sobre la superficie celular de
levaadura (“yeast cell surface display”)
Nota. Adaptada de “Yeast cell surface display – Application of molecular display”, por Kondo
y Ueda, 2004, Applied Microbiology and Biotechnology, 64(1).
28
2.3 Actividades desarrolladas sobre Ingeniería genética en levadura y su aplicación
biotecnológica para Biorremediación de Mercurio
2.3.1 Construcción de un sistema de anclaje de proteína heteróloga en la superficie celular
de S. cerevisiae
Entre los sistemas de anclaje de proteínas heterólogas en la superficie celular externa
de S. cerevisiae, se destaca la mananoproteina Flo1p (Murai et al., 1997; Sato et al., 2002)
responsable por la floculación (Teunissen et al.,1993). Este fenómeno consiste en la agregación
de células en grupos y su posterior extracción del medio de fermentación, por sedimentación.
La proteína Flo1p es codificada por el gen FLO1, rica en serina y treonina, y está
compuesta por 1536 aminoácidos. Debido al elevado número de posibles sitios de
O y N-glicosilación, Flo1p presenta una conformación extendida, rígida, tipo bastón,
atravesando la pared celular y exponiendo la región N-terminal en la superficie celular (Watari
et al., 1994). Esta proteína está compuesta por los siguientes dominios: secuencia señal de
excreción (presente en la región N-terminal); el dominio funcional de la floculación, que se
repite por 18 veces y el dominio de unión a GPI (presente en la región C-terminal), responsable
de la unión de esta proteína a la superficie celular (Teunissen et al., 1993, Watari et al., 1994;
Sato et al., 2002) (Figura 6).
29
Figura 6
Esquema de la proteína Flo1p de S. cerevisiae
SS DF GPI
Flo428
(ancla)
Nota. SS - secuencia señal; DF - dominio funcional de floculación; GPI - dominio de unión a
GPI. Tomada de “Long anchor using Flo1 protein enhances reactivity of cell surface-displayed
glucoamylase to polymer substrates”, por Sato et al., 2002, Applied Microbiology and
Biotechnology, 60(4).
En trabajos anteriores fue demostrado que el tamaño del ancla influye en la exposición
del péptido o proteína heteróloga anclada en la superficie celular de levadura (Sato et al., 2002).
Basado en esta información fue construido un sistema que permitió el anclaje de la
proteína glucoamilasa de Aspergillus awamori en la superficie de la pared celular de la levadura
Saccharomyces cerevisiae, utilizando como ancla el dominio C-terminal de 428 aminoácidos
de la proteína de pared celular Flo1p, denominado como Flo428 (Fuentes Rivera, 2008)
(Figura 6). La glucoamilasa representó un marcador directo de selección para S. cerevisiae que
no produce normalmente amilasas y no es capaz de hidrolizar el almidón directamente; además
de ser de gran valor para investigaciones biotecnológicas.
La glucoamilasa de A. awamori es una exohidrolasa (α 1,4-D-glucan-glucohidrolasa
E.C.3.2.1.3.) que ataca a los enlaces glucosídicos de los extremos no reductores de las cadenas
30
de almidón, liberando moléculas de glucosa. Por lo tanto, el anclaje de glucoamilasa en la pared
celular de S. cerevisiae puede facilitar la utilización del almidón por la levadura, asimilando la
glucosa liberada para proliferar y fermentar (Pavezzi et al., 2008).
Para la construcción del sistema de anclaje en S. cerevisiae fue necesario realizar la
fusión génica entre el ADNc codificador de la glucoamilasa de A. awamori (el cual contiene
su secuencia señal de secreción) y la secuencia de ADN codificadora de Flo428, utilizada como
ancla. Antes de realizar la fusión génica, fue retirado el codón de terminación de la secuencia
codificadora de glucoamilasa, pero se conservó el codón de terminación de la secuencia
codificadora de Flo428. De esta forma, la fusión génica “Glucoamilasa-Flo428” (G*-F) seria
traducida como una única proteína. La fusión génica fue expresada sobre la regulación del
promotor y terminador del gen codificador de la fosfoglicerato quinasa (PGK) de S. cerevisiae,
obteniéndose el casete de expresión y anclaje de glucoamilasa. El casete ladeado en los
extremos con el fragmento del gen CAN1 (codificador de L-canavanina) de S. cerevisiae, fue
denominado CG*FC y fue utilizado en la transformación genética de la cepa de
S. cerevisiae YPH252. Las colonias transformantes obtenidas fueron seleccionadas por la
adquisición de resistencia a L-canavanina, resultante de la integración del casete CG*FC en el
genoma de la levadura. Estas colonias transformante de S. cerevisiae fueron denominadas
YPH252/CG*FC y se utilizo como control negativo la cepa YPH252 no transformada con el
casete CG*FC.
La actividad amilolítica de las colonias transformantes fue detectada por la formación
de halos alrededor de estas colonias en medio agar YPDA (conteniendo 0.5% almidón), hecho
que no fue observado en la colonia del control negativo (Figura 7). (Fuentes Rivera, 2008).
31
Figura 7
Ensayo en placa para detección de actividad de la glucoamilasa en las colonias de
S. cerevisiae YPH252
3
2
4 5
Nota. Colonias da S. cerevisiae YPH252 cultivadas en medio agar YPDA (conteniendo 0.5%
de almidón) y expuestas a vapor de yodo. La colonia (1) corresponde al control negativo:
S. cerevisiae YPH252. Las colonias (2, 3, 4, 5 y 6) corresponden a los transformantes obtenidos
de S. cerevisiae YPH252, denominados YPH252/CG*FC.Tomada de Fuentes Rivera, 2008.
En la figuras 8-A y 8-B se pueden observar que la cepa recombinante YPH252/CG*FC
fue capaz de utilizar directamente el almidón como única fuente de carbono para el crecimiento
celular, mientras que la cepa original YPH252 (control negativo) presentó una velocidad de
crecimiento reducida, debido a la incapacidad de esta para degradar almidón. Estos resultados
indicaron que la cepa recombinante expresaba la enzima glucoamilasa, la cual hidrolizaba el
almidón presente en el medio de cultivo, por consiguiente disminuia la concentración de este
sustrato en el sobrenadante del cultivo, y finalmente se liberaba la glucosa para su crecimiento.
32
Figura 8-A
Curva de crecimiento de las cepa recombiante YPH252/CG*FC y control negativo YPH252
Nota. Las células de levadura fueron cultivadas en medio de cultivo YPA (conteniendo 1% de
almidón, sin glucosa) e incubadas a 28 ºC y con una agitación de 150 rpm. Tomada de
Fuentes Rivera, 2008.
Figura 8-B
Detección de almidón residual presente en el sobrenadante de los cultivos de las cepa
recombinante YPH252/CG*FC y control negativo YPH252
Nota. Las células de levadura fueron cultivadas en medio de cultivo YPA (conteniendo 1%
almidón) e incubadas a 28 ºC y con una agitación de 150 rpm. Tomada de Fuentes Rivera,
2008.
33
La actividad enzimática de la glucoamilasa fue detectada en la fracción celular de la
cepa recombinante YPH252/CG*FC pero no fue detectada en el medio de cultivo, indicando
que la enzima glucoamilasa estaba asociada a la superficie celular de la cepa recombinante y
no estaba siendo excretada al medio de cultivo (sobrenadante). Durante el ensayo, el cultivo
celular de la cepa recombinante fue centrifugada y separada en dos fracciones: sedimento
celular y sobrenadante. Ambas fracciones fueron incubadas, separadamente, con solución de
almidón (1%), para posteriormente dosar la glucosa liberada a partir del substrato de almidón,
el mismo procedimiento fue realizado en la cepa control negativo.
Figura 9
Detección de glucosa liberada a partir de la degradación de almidón en el sedimento y
sobrenadante
Nota. La cuantificación de la glucosa liberada, en los cultivos de la cepa recombinante
YPH252/CG*FC y el control negativo YPH252, fue determinada en la fracción del
sedimento celular y en su respectivo sobrenadante, previamente centrifugadas. Tomada de
Fuentes Rivera, 2018.
34
La localización de glucoamilasa en la superficie celular de levadura fue confirmada por
inmunofluorescencia. Esta técnica permitió observar fluorescencia en la superficie celular de
la cepa recombinante, demostrando que glucoamilasa fue expresada y anclada en su superficie
celular externa. En el caso del control negativo (cepa YPH252) no fue observado ningún tipo
de fluorescencia (Figura 10).
Figura 10
Micrografía de Inmunofluorescencia de cepa recombinante YPH252/CG*FC y su respectivo
control negativo
YPH252 / CG*FC YPH252 (control negativo)
Nota. Micrografías de inmunofluorescencia de células de levadura utilizando anticuerpo
primario anti-glucoamilasa y anticuerpo secundario marcado con FITC. Tomada de Fuentes
Rivera, 2009.
Los resultados obtenidos demostraron la funcionalidad del sistema de anclaje
construido que permite inmovilizar enzimas o proteínas de interés en la superficie celular de
levadura, dotando a las células con nuevas propiedades benéficas y convirtiéndolas en un
organismo atractivo capaz de actuar como biocatalizador celular.
35
2.3.2 Construcción de una cepa de levadura diseñada para la biorremediación
de mercurio
El desarrollo de biosorbentes ha ido creciendo nos últimos años debido a su potencial
en el tratamiento de aguas contaminadas con iones metálicos tóxicos.
El sistema de anclaje de péptidos o proteínas heterólogas que se unen a iones metálicos
en la superficie celular externa de S. cerevisiae posibilitó la construcción de biosorbentes para
la remoción de iones metálicos tóxicos (Kuroda y Ueda, 2011) (Tabla 3). La adsorción en la
superficie celular, utilizando técnicas de ingeniería genética, tiene ventajas en comparación a
la acumulación intracelular convencional (bioacumulación), por ejemplo los iones adsorbidos
en la superficie celular pueden ser fácilmente recuperados sin ruptura celular, siendo posible la
reutilización de los biosorbentes celulares para la adsorción de iones metálicos tóxicos.
Tabla 3
Sistema de anclaje de péptidos o proteínas que se unen a iones metálicos tóxico en la superficie
celular de la levadura S. cerevisiae.
Péptido/Proteína Eficiencia de
Proteína ancla Referencia
que se une a metal remoción del metal
Cu2+, Ni2+ e Zn2+ = Aumento de Kambe-Honjoh et
Hexa histidina -Takamilasa Cwp 1p
1,6-1,8 veces al., 2000
Hexa histidina α-aglutinina Cu2+ = Aumento de 3 - 8 veces Kuroda et al., 2001
Péptido rico en histidina
α-aglutinina Zn2+ = Aumento de 20% Vinopal et al., 2007
(HP3)
Péptido rico en cisteína Vinopal et al.,,
α-aglutinina Cd2+ = Aumento de 30%
(CP3) 2007
YTM - Hexa histidina
Kuroda; Ueda,
YTM = Metalotioneina de α-aglutinina Cd2+ = Aumento considerable
2003
levadura
YTM4 α-aglutinina Cd2+ = Aumento de 5,9 veces Kurod; Ueda, 2006
Kuroda; Ueda,
YTM8 α-aglutinina Cd2+ = Aumento de 8,7 veces
2006
Nota. Tomada de “Molecular design of the microbial cell surface toward the recovery of metal
ions”, por Kuroda y Ueda, 2011, Current Opinion in Biotechnology, 22(3).
36
Los tratamientos convencionales para retirar íones Hg2+ de aguas o efluentes
contaminados, como precipitación, filtración y adsorción por membrana (Environmental
Protection Agency [EPA], 2007), no son tan eficientes para reducir concentraciones Hg2+ a
niveles aceptables. Para la remoción eficiente de iones Hg2+, la tecnología se centra en el
desarrollo de biosorbentes para la remoción eficaz de mercurio (Byrnes-Brower et al., 1997).
En este sentido, tanto péptidos naturales, como metalotioneínas, y péptidos sintéticos, como
fitoquelatinas sintéticas (por ejemplo, EC20), que se unen a metal fueron expresados en la
superficie de las células bacterianas para mejorar la captación y biosorción de iones mercurio
(Bae et al., 2000, 2001, 2002). Sin embargo, el problema principal asociado con estos péptidos
ricos en cisteínas es su falta de especificidad, que puede causar dificultad en la recuperación
específica y el reciclaje de iones Hg2+.
Existen bacterias que desarrollan resistencia a metales pesados al expresar un conjunto
de proteínas de resistencia. En el caso específico de las bacterias que presentan resistencia a
iones Hg2+, varios autores verificaron que estas bacterias contienen operón mer y que las
proteínas codificadas por los genes del operón son responsables por la resistencia y
desintoxicación de Hg2+. Una proteína de particular interés es la proteína metalorreguladora
MerR, la cual controla su propia expresión y la expresión de los productos génicos del operón
mer.
La afinidad de unión de la proteína MerR a los iones Hg2+ es varias órdenes de magnitud
mayor que para otros metales pesados tóxicos (Bontidean et al., 1998); esta proteína presenta
un dominio de unión formado por un arreglo trigonal de tres cisteínas que forman un sitio de
unión altamente específico para Hg2+, promoviendo una fuerte interacción de los grupos
sulfhidrilos de las cisteínas con el ion Hg2+.
En base a lo que se conoce sobre la proteína MerR, proteína con mayor afinidad a iones
Hg2+; y la utilización de Flo428 como ancla para inmovilización de proteínas heterólogas en la
37
pared celular de levadura, fue realizada la construcción de una cepa recombinante de
S. cerevisiae, que expresa la proteína MerR anclada en su superficie celular, diseñada para la
biorremediación de mercurio (Fuentes Rivera, 2013).
Para ello fue realizado una fusión génica entre el gen codificador de la proteína MerR
de Cupriavidus metallidurans y la secuencia codificadora de Flo428. Previamente fue retirado
el codón de terminación de MerR, pero se conservó el codón de terminación de la secuencia
codificadora de Flo428 con la finalidad de que la fusión génica “MerR-Flo428” fuese traducida
como una única proteína. En esta construcción fue utilizada la secuencia señal del factor alfa
(SS) de S. cerevisiae como péptido señal. La fusión génica (SS-MerR-Flo428) fue insertada en
un vector de expresión, el cassette de anclaje de MerR fue expresado sobre la regulación del
promotor y terminador del gen codificador de la fosfoglicerato quinasa (PGK). El vector
obtenido conteniendo el cassete de expresión y anclaje de MerR fue utilizado en la
transformación genética de la cepa de S. cerevisiae YPH252, obteniéndose colonias
recombinantes de S. cerevisiae, denominadas YPH252/pMF (Fuentes Rivera, 2010, 2013). Por
otro lado, se utilizó como control negativo, la cepa de S. cerevisiae YPH252 transformada con
el vector sin el cassette de expresión y anclaje de MerR, denominado YPH252/p.
Las imágenes de la microscopia electrónica de transmisión (MET) demostraron
que las células de la cepa recombinante YPH252/pMF, incubadas en solución de HgCl2
(1,0 µM), presentaron nanoparticulas que recubrían su superficie celular externa, hecho que no
fue observado en las células del control negativo (YPH252/p) incubadas en las mismas
condiciones. Por lo tanto, los resultados indicaron, con clareza, la localización y unión de iones
Hg2+ a la proteína MerR anclada en la pared celular externa de YPH252/pMF (Figura 11).
38
Figura 11
Microscopia Eletrónica de Transmisión (MET) de cortes histológicos de células de la cepa
recombinante de S. cerevisiae YPH252/pMF y respectivo control negativo YPH252/p.
Nota. (A1) y (A2) - Células de S. cerevisiae YPH252/pMF incubadas en solución de HgCl2
(1,0 µM); (B) - Células de S. cerevisiae YPH252/pMF incubadas con agua Milli-Q;
(C1) y (C2) - Células de S. cerevisiae YPH252/p (control negativo) incubadas en solución de
HgCl2 (1 µM); (D) - Células S. cerevisiae YPH252/p incubadas con agua Milli-Q.
Aumento de 15 000 X. Las flechas ( ) indican la unión de iones Hg2+ a la proteína MerR
anclada en la pared celular de la cepa recombinante.Tomada de Fuentes Rivera, 2013.
39
La cepa recombinante de S. cerevisiae YPH252/pMF y su respectivo control negativo
YPH252/p fueron utilizados en ensayos de adsorción de iones Hg2+. La cuantificación de la
adsorción de iones Hg2+ en la biomasa celular de la cepa recombinante y en la biomasa celular
del control negativo fue realizado por Espectrometría de Absorción Atómica en fase de vapor
frio.
La figura 12 muestra que en ambas concentraciones de solución de HgCl2 (5,0 µM y
10 µM), la velocidad de adsorción de iones mercurio de la biomasa celular de la cepa
recombinante y del control negativo aumentó rápidamente en los primeros 10 minutos de
incubación y luego disminuyó en los siguientes intervalos de tiempo. También se observó que
en 5,0 µM de HgCl2, la cepa recombinante YPH252/pMF adsorbió 110 µg de Hg2+/g de peso
seco de células, después de 10 minutos de incubación, lo cual representó un aumento de 54%
en la capacidad de adsorción de íon mercurio en relación al control negativo (YPH252/p), el
cual adsorbió 70 µg de Hg2+/g de peso seco de células. Mientras que en la concentración de
10 µM de HgCl2, la cepa recombinante YPH252/pMF adsorbió 174 µg de Hg2+/g de peso seco
de células, después de 10 minutos de incubación, representando un aumento de 84% en la
capacidad de adsorción de íon mercurio en relación al control negativo, el cual adsorbió 94 µg
de Hg2+/g de peso seco de células (YPH252/p) (Fuentes Rivera 2013).
40
Figura 12
Adsorción de iones Hg2+ por la cepa recombinante de S. cerevisiae YPH252/pMF y su
respectivo control negativo YPH252/p
5,0 µM HgCl2
10,0 µM HgCl2
Nota. Las células de levadura fueron previamente cultivadas, luego lavadas con solución salina
(0,9%) e incubadas en solución de HgCl2 (5,0 µM y 10,0 µM), con una agitación de 150 rpm,
a 28 ºC, durante diferentes intervalos de tempo. Tomada de Fuentes Rivera, 2013.
41
La capacidad de adsorción de iones Hg2+ de la cepa recombinante YPH252/pM
aumentó con el incremento de la concentración de HgCl2 hasta alcanzar la saturação
en 15,0 µM de HgCl2, después de 120 minutos de incubación, siendo
el valor máximo adsorvido de 374,86 μg de Hg2+/g peso seco de célula (Figura 13).
En estudios realizados por Madrid et al. (1995), referente a la utilización de S. cerevisiae para
separar selectivamente metilmercurio y iones Hg2+, fue observado que la adsorción de iones
Hg2+ sigue una cinética de Michaelis-Menten basados en los sitios de uniones saturables
localizados en la pared celular de levadura.
Figura 13
Capacidad de adsorción de iones Hg2+ de la cepa recombinante YPH252/pMF y su respectivo
control negativo
Nota. Las células de levadura fueron incubadas en diferentes concentraciones de solución
HgCl2 durante 120 minutos, a 28 ºC y con una agitación de 150 rpm. Tomada de
Fuentes Rivera, 2013.
42
A partir de los resultados obtenidos inferimos que iones Hg2+ se unen al sitio activo de
la proteína MerR anclada en la superficie celular externa de la levadura recombinante
YPH252/pMF en tiempos cortos de incubación, seguidos de uniones no específicas del metal
a otros componentes de la pared celular. Bae et al. (2003) sugirió una unión instantánea del ion
Hg2+ al sitio activo de la proteína MerR anclada en la superficie celular de la cepa bacteriana
E. coli JM109.
Es importante resaltar que hay pocos trabajos en la literatura relacionados a sistemas de
biosorción de mercurio en S. cerevisiae. Los mecanismos de desintoxicación de Hg2+ en
S. cerevisiae están menos claros que los mecanismos de resistencia a otros metales
tóxicos como Cu2+ y Cd2+ (Gross et al. 2000; Lee et al., 1999; Vido et al., 2001).
Zhu et al. (2004) verificó que S. cerevisiae fue utilizada como biosorbente de Hg2+
consiguiendo remover hasta el 96% de los iones, después de 15 min de incubación
en 2,5 mM de Hg2+, en pH 3,0 y empleando una biomasa celular de 40 g/L.
Por otro lado, Mukherjee et el., (2009) aisló un mutante de S. cerevisiae, seleccionado en medio
mínimo conteniendo mercurio, denominado S. cerevisiae A100, para aumentar la biosorción
de mercurio. Se evaluó, también, el efecto de los elementos trazos del medio mínimo sobre la
biosorción de Hg2+ por la cepa S. cerevisiae A100, la adición de algunos iones metálicos como
Fe2+, Mn2+ y Mo6+ en el medio mínimo conteniendo 1,5 mM de HgCl2 aumentaron la eficiencia
de adsorción de Hg2+ de 90 al 96,6%, por las células de levadura, después de 48 horas de
incubación (Mukherjee y Banik, 2010).
Finalmente, los resultados obtenidos confirmaron la construcción de la cepa
recombinante YPH252/pMF y la funcionalidad del sistema de anclaje de MerR en la superficie
externa da levadura recombinante, aumentando su capacidad de biosorción de mercurio, con
potencial para ser utilizada como herramienta biotecnológica para la biorremediación de aguas
contaminadas con mercurio.
43
III. APORTES DESTACABLES A LA EMPRESA/INSTITUCIÓN
El laboratorio de Genética de Microorganismos y la compañía minera Vale firmaron un
convenio referente a un proyecto que tenía como objetivo el desarrollo de microorganismos
genéticamente modificados para la biorremediación de efluentes y aguas contaminadas por
metales pesados tóxicos. En ese sentido, el equipo de investigadores del laboratorio
desarrollamos proyectos de investigación para alcanzar el objetivo del proyecto principal.
Los aportes de este trabajo al laboratorio de Genética de Microorganismos son los
siguientes:
El desarrollo de un microrganismo genéticamente modificado con potencial para
biorremediación de aguas o efluentes contaminados con mercurio, comprometiéndose en la
búsqueda de procesos eficientes y amigables al medio ambiente para disminuir las
concentraciones tóxicas de este metal pesado y colaborando de esta forma en la preservación
del planeta.
Fueron seleccionados algunos de los resultados para ser presentados en congresos
internacionales, con previo aviso y permiso de la compañía VALE, financiadora del proyecto.
Elaboración de una patente depositada y otorgada por el Instituto Nacional de
Propiedad Industrial (INPI - Brasil), referente a la protección y derecho de uso de la cepa
recombinante y de las secuencias génicas construidas para biorremediación (Fuentes Rivera,
2014).
44
IV. CONCLUSIONES
Se comprobó la construcción del casete de expresión y anclaje de la proteína
MerR en vector de transformación de S. cerevisiae. El nuevo vector fue empleado exitosamente
en la transformación genética de la cepa de S. cerevisiae YPH252.
Se construyó con éxito la cepa recombinante de levadura que presenta la
proteína MerR anclada en su superficie celular externa.
Se comprobó la ligación del ion Hg2+ a la proteína MerR y su localización en la
superficie celular externa de la cepa recombinante a través de Microscopia Electrónica de
Transmidión (MET).
La cepa recombinante construida mostró tener una capacidad aumentada de
ligación de ion Hg2+ en relación a la cepa control negativo, con potencial para ser utilizada
como herramienta biotecnológica para la biorremediación de mercurio.
45
V. RECOMENDACIONES
A partir del presente trabajo se deberían realizar ensayos de biorremediación de
mercurio en condiciones ex situ, en biorreactor, con el objetivo de:
1) establecer la cinética de ligación a iones Hg2+; 2) evidenciar la ligación específica del ion
en cuestión (Hg2+), a través de ensayos en conjunto con otros metales en solución; y,
3) establecer la biomasa necesaria de células de levadura recombinante en los procesos de
biorremediación de ambientes contaminados con mercurio.
A diferencia de los iones metálicos acumulados en el interior de la célula, los
iones adsorbidos en la superficie celular pueden recuperarse fácilmente sin ruptura de las
células. Por lo tanto. es necesario evaluar los principales métodos para la desorción de iones
metálicos y de esta forma reutilizar la biomasa celular para próximos procesos de
biorremediación.
46
VI. REFERENCIAS
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