EXTRACCIÓN DE ADN POR EL MÉTODO DE SALTING OUT Y
ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
SHARON RODRÍGUEZ RUÍZ
[email protected] CAROLINA MENDOZA
[email protected] VANESSA ATENCIO CHAVES
[email protected] (DICENTE)
ANDERSON RAMÍREZ
(DOCENTE)
GENÉTICA 2
UNIVERSIDAD DE LA GUAJIRA
CIENCIAS BÁSICAS Y APLICADAS
PROGRAMA DE BIOLOGÍA
2023
INTRODUCCIÓN
En la práctica de laboratorio se realizó una extracción de ADN por el método
Salting
out es un procedimiento en el cual ocurre una precipitación inducida por altas
concentraciones de sal, es una técnica de purificación que utiliza la solubilidad
reducida de ciertas moléculas en una solución de muy alta fuerza iónica. El
ahogamiento se utiliza normalmente para precipitar grandes biomoléculas, como
las
proteínas o el ADN. (Quimica facil, 2022).
Seguido de esto se realizó una electroforesis en gel de agarosa en una solución, a
un pH fisiológico, en el cual los grupos fosfatos del DNA confieren una carga
negativa a la molécula. Cuando esta molécula es colocada en un campo eléctrico
migrará hacia el electrodo positivo (ánodo). Si la molécula de DNA se hace migrar
a través de una sustancia inerte la velocidad de su movimiento hacia el ánodo
será inversamente proporcional a su coeficiente friccional. El porcentaje de
agarosa usado en el gel determina el grado entrecruzamiento entre las moléculas
de ADN y el material del cual está fabricado el gel. El tamaño del poro del gel tiene
dos consecuencias: 1. Una molécula de DNA pequeña puede correr más rápido a
través de los poros del gel que una molécula grande. 2. Una molécula de DNA de
cualquier tamaño migrará a diferentes velocidades a través de los geles de
agarosa de diferentes concentraciones. Los geles de agarosa son sumergidos en
un buffer de corrido, las muestras de ADN líquido son colocadas dentro de los
pozos de agarosa y la corriente es pasada a través de ella. El corrido de los
fragmentos de DNA sobre un gel de agarosa es visualizado por tinción con el
colorante bromuro de etidio y exponiendo el gel a rayos ultravioleta. Este colorante
contiene un grupo planar que se intercala entre las bases de DNA de doble
cadena emitiendo una fluorescencia. Uno de los usos primarios de la electroforesis
en gel de agarosa es determinar el tamaño de los fragmentos de DNA de una
muestra desconocida. Para hacer esta determinación se necesita un “estándar”
(fragmentos de DNA de longitud conocida o marcadores de peso molecular) que
se hacen correr simultáneamente con la muestra en una línea adyacente.
El objetivo fue extraer ADN de muestras de sangre total, a través del método de
Salting out y la realización de una electroforesis en gel de agarosa.
MARCO TEÓRICO
BUFFER DE LISIS I
Es una solución tampón que se utiliza con el fin de romper células abiertas para su
uso en experimentos de biología molecular que analizan las macromoléculas
lábiles de las células, y mejora la extracción y estabilidad de las proteínas.
(Quimica facil, 2022).
NaCl 6M
Ayuda a separar algunas de las proteínas que están unidas al ADN. También
mantiene las proteínas disueltas en la capa acuosa de forma a impedir que estas
precipitan también con el alcohol, junto con el ADN. Los iones sodio y cloruro
neutralizan las cargas negativas del ADN. (Fernandes, 2022).
ISOPROPANOL
Es utilizado con frecuencia en el laboratorio para la purificación de la muestra y
ayuda a la precipitación del ADN.
ETANOL 75%
El DNA es el único componente de la solución que no es soluble en el etanol, y se
hace visible porque las diferentes cadenas se van aglutinando entre sí al precipitar
debido a la acción de fuerzas físicas (Abyntek, 2017).
SDS 20%
El dodecilsulfato sódico (Sodium Dodecyl Sulphate, SDS, laurilsulfato sódico) es
un
detergente aniónico que se une a las proteínas, desnaturalizándolas en una
conformación extendida recubierta de moléculas de SDS. Como consecuencia, el
tamaño de la molécula de proteína es directamente proporcional a su longitud en
aminoácidos y su carga queda enmascarada por la mayor carga del SDS que la
recubre, que es también proporcional a la longitud. Por lo tanto, la movilidad
electroforética de la proteína depende exclusivamente de su masa molecular.
(Biomodel, s.f.).
EDTA
Acrónimo de Ethylene Diamine TetraAcetic acid, ácido etilendiamino tetraacético
(a
veces AEDT en español). En sus formas desp
rotonadas (2− y 4− ), es un conocido
agente quelante de cationes divalentes, en especial Ca 2+ y Mg 2+.
Dado que el Mg 2+ es un cofactor requerido por la mayoría de nucleasas, su
secuestro por el EDTA evita la degradación del DNA durante la preparación y la
electroforesis (Biomodel, s.f.)
BUFFER TBE
Tris (Tris-(hidroximetil)-aminometano): Molécula responsable del taponamiento y
regulación del pH (Gómez, 2012).
BROMURO DE ETIDIO
Se trata de un compuesto intercalaste, es decir, que tiene afinidad para unirse al
DNA, pues se introduce entre sus bases apiladas. Esto se debe a su geometría
plana y su estructura aromática, que interacciona favorablemente con el interior
hidrófobo de la doble hélice. En menor medida, interacciona también con el DNA
(Biomodel, s.f.).
MONOCATENARIO
Su utilidad deriva asimismo de su fluorescencia, exaltada al encontrarse en un
entorno hidrófobo, es decir, al estar unido al DNA. Se excita con luz ultravioleta de
onda corta, 254 nm, y emite su fluorescencia como luz visible, de color rosado
anaranjado (Biomodel, s.f.).
ESPECTROFOTOMETRÍA:
Mediante espectrofotometría se puede determinar la concentración y la pureza de
una muestra de ADN basándose en la capacidad de absorbancia de un
compuesto presente en una solución a una longitud de onda determinada.
MATERIALES Y REACTIVOS
Extracción de DNA y electroforesis.
Muestra de sangre
Buffer de Lisis I
Buffer de lisis II
NaCl 6M
Isopropanol
Etanol 75%
Pipetas Pasteur
Centrifuga (3000RPM)
Tubos de polipropileno de 15 ml
SDS 20%
Gel de agarosa
Buffer TBE
EDTA
Solución stock
Buffer TAE
Bromuro de etidio
Centrifugadora
Vortex
Proteinasa K
Tubo de polipropileno
Ácido bórico
METODOLOGÍA.
Procedimiento A: Protocolo de extracción de ADN de sangre periférica
empleando el método de SALTING OUT.
1. En un tubo de 15 ml se agregó 13ml de BUFFER DE LISIS I frío (glóbulos rojos)
y 1ml de sangre total que se encontraba en tubo con anticoagulante EDTA.
2. Se mezcló lentamente por inversión aproximadamente 30 veces.
3. Se incubó 10 minutos a temperatura ambiente.
4. Luego se centrifugó a 3400 rpm por 8 minutos.
5. Se descartó directamente el sobrenadante, volteando en un ángulo de 45
grados, el tubo en el lavamanos o lugar apropiado (se debe observar un
precipitado de color blanco que corresponde el botón de glóbulos blancos).
6. Se agitó en el vortex por 20 segundos para desprender las células del fondo del
tubo.
7. Al botón de blancos resuspendidos se le adicionaron 3ml de BUFFER DE
LISIS II, 500ul de proteinasa K (0,5mg/ml), y 100ul se SDS (20%).
8. Se agitó en el vortex por 20 segundos.
9. Después se adicionó 1.5 ml de NaCl (6M).
10. Se agitó en el vortex 20.
11. Seguidamente se centrifugó a 3000 rpm durante 8 minutos. En este paso se
debe observó un precipitado, el cual corresponde a las proteínas precipitadas, por
lo tanto, el ADN se encontraba en el sobrenadante.
12. Luego se transfirió directamente el sobrenadante (ADN) a un tubo falcon de
15ml rotulado que contenía 3ml de isopropanol frío.
13. Seguido se mezcló suavemente por inversión del tubo unas cincuenta veces,
hasta observar la formación de malla de ADN (se observa una estructura similar a
una telaraña de color blanco).
14. Nuevamente se centrifugó a 4500 rpm durante 5 minutos.
15. Se descartó directamente el sobrenadante. Se invertió el tubo en un ángulo de
90 grados sin sacudir el tubo.
16. Se adicionó 2ml de ETANOL al 70%.
17. Luego se centrifugó a 4500 rpm durante 5 minutos.
18. Se descartó directamente el sobrenadante y se dejó secar para tratar de
eliminar la mayor cantidad posible de etanol.
19. Después de esto se incubó a 45 C° durante 2 horas para evaporar el etanol.
20. Finalmente se adicionó 100ul de BUFFER DE REHIDRATACIÒN.
Procedimiento B: Electroforesis en gel de agarosa.
Preparación del gel de agarosa al 1%:
1. Se midió la cantidad de agarosa apropiada teniendo en cuenta la capacidad de
la cubeta de la cámara de electroforesis.
2. Luego se adicionó el volumen apropiado de buffer TBE (solución stock 5X de
concentración por litro: 54 grs de trisma base, 27,5 grs. de ácido bórico, 20 ml. De
EDTA 0,5 M pH 8).
3. Se fundió la agarosa por calentamiento a ebullición o en horno microondas o
plancha de calentamiento.
4. Seguido se mezcló bien la solución.
5. Se agregó 5 ul de bromuro de etidio por cada 100 ml de buffer.
6. Se dejó reposar algunos minutos hasta soportar el grado de calor en la palma
de la mano.
7. Luego se transfirió a una cámara de gelificación el volumen apropiado de gel.
8. Después se colocó los peines o peinillas con el número de pocillos apropiados.
9. Se dejó enfriar hasta que la agarosa gelificó (no debía moverse durante este
lapso de tiempo).
10. Después de esto se adicionó la cantidad apropiada de buffer en la cámara de
electroforesis.
11. Se añadió 5 ul de bromuro de etidio por cada 100 ml de buffer a la cámara de
electroforesis.
12. Una vez gelificada, se colocó el gel en la cámara de electroforesis.
13. Para facilitar la visualización de los pocillos se colocó un papel oscuro debajo
de la cámara.
15. Una vez hecho esto el gel estaba listo para recibir las muestras de ADN.
Preparación de las muestras.
1. Se preparó un ml. de buffer de carga 2X a partir de uno de 6X.
2. Posteriormente se centrifugó durante 1 minuto los tubos ependorf a 10.000 rpm.
3. Se mezcló en una placa de 96 pozos, 5 ul de ADN y 5 ul de buffer de carga 2X.
4. Luego se colocó los 10 ul de la mezcla en los pozos del gel, evitando que las
muestras de un pocillo se mezclen con las del otro, siempre se debe dejar un
pocillo libre para colocar el marcador de peso molecular, que se escoge de
acuerdo al tamaño de las bandas que nos interesa.
5. Se cubrió la cámara de electroforesis sin moverla.
6. Se corrió a un voltaje constante (100 voltios), hasta que el primer colorante
avanzó aproximadamente unos 2 cm en el gel.
7. Después se bajó el voltaje y se apagó la cámara.
8. Utilizando guantes se retiró el gel de la cámara y se llevó al transiluminador de
luz ultravioleta, con las luces apagadas del recinto donde se encuentra el equipo.
9. Fotografiamos el gel.
RESULTADOS
Imagen 1. Buffer de lisis I: se logra observar la precipitación del ADN fuera de las
células
Imagen 2. Centrifugado: se puede observar el precipitado en el fondo, esto
corresponde a las proteínas.
Imagen 3. Mezclado por inversión: se tenía que observar un tipo de malla blanca
que corresponde al ADN, pero en estas muestras no se logró identificar con
claridad.
Imagen 4. Electroforesis: en los resultados de la electroforesis no se puedo
observar material genético en ninguna de las muestras, solo se identificó el
marcador de peso molecular.
Imagen 4. Se observo que la muestra tenía una concentración de 275.58 ng/µl de
ADN
DISCUSIÓN.
Al realizar la práctica de extracción de ADN de sangre periférica y electroforesis en
gel Agarosa se observó que en la primera parte de la experimentación se logró
precipitar el ADN fuera de las células, esto debido al Buffer de Lisis y por otro lado
se observó un precipitado que corresponde a las proteínas. Para extracción de
ADN se requiere una serie de etapas básicas, en donde se tiene que romper la
membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula, y posteriormente
romperse también la membrana nuclear dejando libre el ADN, la lisis de las células
se consigue mediante la adición de tampones con concentraciones elevadas de
iones que favorecen al rompimiento de la estructura tridimensional de
macromoléculas como las proteínas y que forman parte de su estructura celular.
(Tuya, Curbelo, & Montero, 2016)
Después de esto se notó con dificultad una malla blanca que corresponde al ADN,
el cual se compone de dos cadenas, cada una está formada por nucleótidos, aquí
cada nucleótido, a su vez, está compuesto por un azúcar (desoxirribosa), un grupo
fosfato y una base nitrogenada, las bases nitrogenadas son cuatro: adenina (A),
timina (T), citosina (C), y guanina (G), y siempre una A se enfrenta a una T y una
C se enfrenta a una G en la doble cadena. Las bases enfrentadas se dice que son
complementarias. El ADN adopta una forma de doble hélice, como una escalera
caracol donde los lados son cadenas de azúcares y fosfatos conectadas por
escalones, que son las bases nitrogenadas, esto es lo que le da la forma de una
malla. La molécula de ADN se asocia a proteínas, llamadas histonas, y se
encuentra muy enrollada y compactada para formar el cromosoma. (ChileBIO,
2018)
En los resultados de la electroforesis no se pudo observar material genético en
ninguna de las muestras, solo se identificó el marcador de peso molecular, esto se
debe a que hubo problemas en los procedimientos, donde las soluciones utilizadas
no fueron realizadas correctamente, por tanto, los resultados de la electroforesis
no fueron los esperados. Para esto se colocaron cada una de las muestras de
ADN que se quisieron analizar se transfirieron cuidadosamente a los pozos. Los
grupos fosfato de su esqueleto de azúcares-fosfato les otorgan una carga negativa
a las moléculas de ADN, por lo que comienzan a moverse a través de la matriz de
gel hacia el polo positivo. A medida que corre el gel, los fragmentos más cortos de
ADN viajarán más rápido a través de los poros de la matriz del gel que los
fragmentos más grandes. Después de un rato que ha corrido el gel, los fragmentos
más cortos de ADN estarán más cerca del extremo positivo del gel y los más
largos se mantendrán cerca de los pozos. Una vez que los fragmentos se han
separado, se puede saber el tamaño de las bandas que se encuentran en él.
(Khan Academy, 2023) Estas serían las bandas que se tenían que observar en la
electroforesis.
CUESTIONARIO DE EXTRACCIÓN DE DNA.
1. Cuál es el fundamento del método de salting out?
A partir de un lisado celular se pueden separar las moléculas de proteínas y otros
contaminantes del ADN mediante la adición de altas concentraciones de sal que
hacen que disminuya la solubilidad de las moléculas orgánicas en la fase acuosa.
En este método se utiliza frecuentemente la proteinasa K, el TRIS-HCl para
regular el pH y otros reactivos químicos que aseguren la total inactivación de las
enzimas que pueden actuar sobre las moléculas de ADN. Para la extracción se
utilizan sales inorgánicas como el perclorato de sodio y el cloruro de sodio en
concentraciones muy altas que hacen precipitar a las moléculas orgánicas. El
precipitado formado se separa por centrifugación y luego se puede extraer el ADN
de la disolución acuosa mediante la adición de alcohol, por precipitación.
(FUJIFILM Wako Chemicals USA, 2014)
2. En qué consiste el método de extracción fenol cloroformo?
Esta técnica se fundamenta en la lisis total de las células y sus estructuras
subcelulares mediante el empleo de detergentes con la posterior eliminación de
las proteínas mediante su extracción y la de componentes lipídicos con solventes
orgánicos. ( Sandoval Rodríguez, Martínez Rizo, & López de la Mora, 2013)
3. Consulte cinco enfermedades genéticas en diferentes animales que se
puedan diagnosticar en el ADN extraído.
Animal: Perro; Enfermedad: polineuropatía; Raza Alaskan Malamute.
Animal: Vaca; Enfermedad: Mioclonía congénita hereditaria.
Animal: Caballo; Enfermedad: Lavender Foal Syndrome (LFS); Raza Arabe.
Animal: Gato; Enfermedad: Atrofia muscular espinal (SMA); Raza Maine Coon.
Animal: Gallina; Enfermedad: Coriza infecciosa.
4. Elabore un cuadro con el nombre y la función de cada uno de los reactivos
empleados en este procedimiento.
Nombre del Función
reactivo
Buffer de lisis I
Contiene una solución de detergente y sales que rompen las
membranas celulares y las proteínas, liberando el ADN de las
células.
EDTA Actúa secuestrando los iones metálicos necesarios para la
actividad de las nucleasas, lo que las inactiva y evita que
degradan el ADN.
Buffer de lisis Se utiliza para lisar los núcleos celulares y liberar el ADN
II nuclear. El buffer de lisis II suele contener un agente reductor,
como el ditiotrietol (DTT), que rompe los disulfuros en la
cromatina nuclear y permite la liberación del ADN. El DTT
también ayuda a desnaturalizar las proteínas nucleares y a
exponer el ADN para su posterior procesamiento y purificación.
Proteinasa K Actúa descomponiendo las proteínas y liberando el ADN de
ellas, lo que facilita la purificación y amplificación del ADN.
NaCl Actúa neutralizando las cargas negativas de los grupos fosfatos
del ADN y las cargas negativas de las proteínas y otros
componentes celulares. Esto permite que el ADN se condense
y forme un precipitado en la solución.
Etanol Se utiliza para lavar y purificar el ADN, porque el ADN es
menos soluble en etanol que en agua, lo que hace que el ADN
se precipite de la solución. Además, el etanol deshidrata el ADN
y hace que las moléculas se junten y formen un precipitado
visible.
Buffer de Sirve para volver a hidratar y disolver el ADN liofilizado o
rehidratación desecado, ya que contiene sales y tampones que ayudan a
solubilizar el ADN liofilizado o desecado. Además, el buffer de
rehidratación puede contener agentes reductores para ayudar a
reducir los enlaces disulfuro que pueden dañar el ADN.
5. Cuáles son los cuidados que deben tener en cuenta para la realización
de la práctica.
Protocolos de seguridad.
No contaminar la muestra.
Preparar de manera correcta los buffers.
Pipetear de manera correcta las muestras.
Al añadir la muestra de DNA con dos manos.
El gel de agarosa debe estar solidificada.
Control del pH.
CUESTIONARIO DE ELECTROFORESIS
1. Mencione otros dos tipos de electroforesis empleados en procedimientos
de Biología molecular.
Electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida
Es uno de los métodos más utilizados para la purificación, análisis y
caracterización de proteínas. La técnica permite separar moléculas cargadas y
explota diferencias en movilidad cuando se les somete a la acción de un campo
eléctrico. La electroforesis se lleva a cabo sobre un soporte inerte, generalmente
sobre geles de poliacrilamida (PAGE).
Electroforesis horizontal.
La electroforesis horizontal en gel utiliza la teoría básica para la separación de
moléculas de ADN, ARN o proteínas según su respectivo tamaño molecular y
carga. En esta técnica, el gel está presente en una orientación horizontal y se
sumerge en un tampón que es continuo.
3. Cuál es la estructura química y el nombre de los componentes de la
agarosa y de la poliacrilamida.
Estructura química.
Fórmula.
(C3H5NO).
Componentes de la agarosa.
La agarosa una vez separada de la agaropectina, estructuralmente es una cadena
lineal formada por uniones β-D-galactopiranosa con 3,6-anhidro-α-L-
galactopiranosa mediante enlaces 1-4. Esta unidad se repite a lo largo de la
cadena y se llama agarobiosa. En esta cadena puede haber grupos cargados, que
son los responsables de muchas de las propiedades de la agarosa.
La estructura del gel que forma la agarosa es una macroretícula estabilizada
mediante la formación de puentes de hidrógeno entre las diferentes cadenas de
agarosa, que le confieren una alta fuerza, incluso a bajas concentraciones.
(HISPANAGAR, 2021)
Componentes de la poliacrilamida
En la electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE), como su propio nombre indica,
se utilizan agentes desnaturalizantes de proteínas, como pueden ser: detergentes
(p.e. SDS), caótropos (p.e. urea) y agentes reductores (2- mercaptoetanol, DTT).
Para la visualización de las proteínas se utilizan diferentes métodos de tinción,
siendo el más habitual el azul de coomassie.
CONCLUSION
El método salting out es sencillo y es muy eficiente al realizar extracciones de
DNA, asimismo, es necesario que el DNA sea purificado varias veces antes de ser
usado, además la ventaja de este método es que se evita el uso de disolventes
orgánicos, la extracción realizada en el laboratorio fue exitosa porque se observó
la malla blanca corresponde al DNA, por otro lado, la electroforesis es importante
para la comprensión de la función de genes y proteínas al momento de realizar
diagnóstico clínico y forenses. Con respecto a los resultados obtenidos en la
electroforesis no fueron los esperados, ya que no se pudo observar material
genético en ninguna de las muestras, solo se identificó el marcador de peso
molecular, esto se puede asociar a posibles errores en el momento de realización
de los buffers. Muchos factores asociados a la práctica pudieron afectar los
resultados: contaminación de la muestra, problemas en el gel, etc. Sin embargo,
se pudo demostrar cuál era el peso molecular de la muestra. Para próximos
procedimientos de electroforesis y de extracción de ADN se recomienda utilizar
todos los materiales necesarios para una extracción de ADN limpia y seguir los
pasos adecuadamente en el momento en que se realizan los buffers.
REFERENCIAS
Sandoval Rodríguez, A. S., Martínez Rizo, A. B., & López de la Mora, D. A. (2013).
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