UNIVERSIDAD NACIONAL “JORGE BASADRE GROHMANN DE TACNA”

FACULTAD DE EDUCACIÓN, COMUNICACIÓN Y HUMANIDADES

JLP. LIC. NANCY BOLAÑOS CRUZ

PRACTICA DE LABORATORIO N°

ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO

PERTENECIENTE:…………………………………………………………………………………………..

CODIGO:……………………………………….

OBJETIVOS

 Conocer los principios generales de la preparación y técnicas de esterilización de diversos materiales y medios de cultivo de uso
común en Microbiología.
 Aprender aplicar diferentes técnicas de siembra y aislamiento de cultivos de bacterias y levaduras en medios sólidos.
 Conocer la utilidad que tienen los medios de cultivos de uso general, diferenciales y selectivos.

MARCO TEORICO:

La esterilización es un método de eliminación total de todo tipo de organismo que asegura la ausencia absoluta de cualquier forma
viviente. Una esterilización deficiente o manipulación incorrecta de materiales y medios de cultivo conlleva a contami- naciones, resultados
erróneos o pérdida del material biológico. Por ello, se requieren buenas prácticas de laboratorio para su adecuado manejo.

La esterilización por calor seco o húmedo son los métodos que se utilizan con mayor frecuencia en el Laboratorio de Micro- biología. El calor
seco destruye a los microorganismos por oxidación, por ejemplo, al exponerlos directamente a la flama de un mechero o en horno a 150-
180°C durante 2 horas. Estos métodos se aplican en la esterilización de asas de inoculación y para todo tipo de material de vidrio
y quirúrgico.

Los procesos con calor húmedo afectan la estabilidad de estructuras celulares y proteínas; se aplican para esterilizar medios de cultivo,
soluciones termoestables, materiales de vidrio y cultivos bacterianos que se desechan.

El equipo de uso común es la autoclave, que utiliza vapor de agua a presión (15 lb/in 2); con esta presión el material alcanza una temperatura
de 121 °C y si se mantiene durante 15 minutos se asegurará la inactivación de endosporas, que son las estruc- turas bacterianas más
resistentes al calor.

Como en los estudios de microbiología se requiere la esterilización de espacios, superficies y materiales de naturaleza di- versa (plástico,
vidrio, instrumentos, medios de cultivo, cultivos para desechar, etc.), hay diferentes métodos que se aplicarán de acuerdo con el tipo de
materiales requeridos, tal como se observa en la Tabla 2.
Tabla 2. Métodos de esterilización.

húmedo vapor a presión (autoclave)

aire caliente (horno)
calor
seco flameado
incineración
Métodos físicos discos de membranas o filtros absolutos
filtración
flujo laminar
rayos ultravioleta
no ionizantes
rayos infrarrojos
radiaciones rayos X
ionizantes rayos (cobalto-60)
radiación electrónica de alta energía
gases óxido de etileno
Métodos químicos formaldehído
líquidos
β-propiolactona

El cultivo de microorganismos. - Es una actividad que requiere del conocimiento de técnicas de siembra o inoculación y de ais- lamiento
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para transferirlos de un medio a otro, o mantener su crecimiento y actividad. Es indispensable para realizar diversos estudios morfológicos,
de identificación, bioquímicos, de patogenicidad y ecológicos, entre otros.

Existen diferentes técnicas de siembra: por suspensión de la muestra en medios líquidos; extensión de diluciones de un cultivo en superficie
de medios en caja de Petri; por estría en caja de Petri y tubos con medios solidificados en forma inclinada; por piquete o picadura en tubos
con medios sólidos o semisólidos. Con la aplicación de cada técnica se obtiene información de importancia para el estudio básico o aplicado
de los microorganismos de interés.

En la naturaleza, los microorganismos generalmente se encuentran en poblaciones, formando parte de comunidades de gran
complejidad, por lo que uno de los objetivos de estudio más importantes en microbiología es aislarlos. El aislamiento de bacterias a partir de
muestras naturales se realiza, en la mayoría de los casos, mediante la técnica de estría cruzada para producir colonias aisladas en cultivos
sólidos y así, obtener un cultivo puro o axénico, también conocido como cepa, que contiene un solo tipo de microorganismo con la
misma composición genética.

Cuando la técnica por estría se aplica para aislar un microorganismo de interés a partir de mezclas donde se encuentra en pequeñas
cantidades, generalmente se obtendrán las bacterias dominantes. En este caso, se utilizan medios selectivos o de enriquecimiento, los que
contienen nutrientes especiales, antibióticos, altas concentraciones de sales y/o condiciones de pH, luz o temperatura que incrementarán la
población del microorganismo de interés y se facilitará su aislamiento.

Si se agregan a los medios de cultivo otros componentes como: sangre, colorantes, indicadores, es posible distinguir entre especies
bacterianas por la forma en que metabolizan los sustratos y que se manifiesta por cambios en la apariencia del pH del medio de cultivo.
Estos medios se conocen como medios diferenciales y son de gran utilidad para la caracterización e identifica- ción de especies
bacterianas.

En medios de cultivo sólidos en placa de Petri las dos técnicas de siembra más utilizadas son:
-Agotamiento en estría. (Figura 8.4)
-Método de diseminación en superficie. (Figura 8.6)
AGOTAMIENTO EN ESTRÍA: Se practica para obtener cultivos puros de muestras que contienen flora
polimicrobiana. Es también útil para estudiar la morfología y propiedades hemolíticas de las colonias
aisladas. Los pasos a seguir son:
1. Realizar el inóculo primario: Tomar una porción de la muestra con el anillo del ansa, pipeta o hisopo y
depositar directamente sobre la superficie solidificada del medio en un extremo.
2. Una vez hecho el inóculo primario diseminar el material en la placa empleando un ansa ojal. Para ello,
se toma la base de la placa de Petri donde se encuentra el medio de cultivo sólido fresco, y se la
levanta hasta la altura de la llama del mechero, a unos 20 cm de la misma. Rápidamente para evitar la
contaminación realizar estrías muy juntas con el ansa, pero sin hacer presión para no dañar el agar, en
una parte de la placa equivalente a un cuarto (Figura 8.4 zona A).
3. Se flamea el ansa, se enfría y tocar 3 a 5 veces la siembra anterior. Se extiende de nuevo por otra
zona de la placa haciendo nuevas estrías. Este proceso se repite en los dos cuadrantes restantes y
finalmente se termina con un estriado en zig-zag.
4. Terminada la siembra, tapar las placas. Incubar.
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1 2y3 4

A A A
B B B

E
C C

D D

Inóculo
primario Mechero de Mechero de Bunsen
Bunsen
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Figura 8.4. Método de agotamiento en estría en placas de Petri. 1. Se coloca el inóculo primario en
la zona A y se disemina en zig-zag con estrías muy juntas, 2. Esterilizar el ansa, girar la placa 60°,
tocar tres a cinco veces la última estría de la zona A y estriar la zona B, 3. Reiterar el procedimiento
2 para la zona C y D, 4. Para terminar dibujar una estría en zig-zag en la zona E (el espacio que
queda entre los cuatro cuadrantes). (Esquemas desarrollados por Jerke, 2003).

El método descrito es el recomendado para el primocultivo de casi todas las muestras.

El propósito de esta técnica es diluir suficientemente el inóculo sobre la superficie del agar para
obtener colonias bacterianas bien aisladas a partir de unidades formadoras de colonias.
Las colonias aisladas obtenidas por el método de agotamiento en estría, se pueden luego subcultivar
individualmente transfiriéndolas a otros medios a fin de obtener cultivos puros que pueden ser
estudiados en medios diferenciales (Figura 8.5).
Existen otros métodos especiales de inoculación: Dilución y agotamiento, siembra en profundidad,
siembra por goteo, entre otros.

Figura 8.5. Obtención de un cultivo microbiano puro a partir de una muestra líquida. A: toma del
inóculo de la muestra mediante un ansa ojal, B. siembra de un medio sólido para aislamiento, que
puede realizarse por las técnicas C y D: en cinco estrías o en cuadrantes respectivamente E: tras la
incubación, recoger una colonias bien aislada para obtener un cultivo puro. F y G. inoculación en
medios sólidos (F) y líquidos (G) para obtener dicho cultivo puro. Fuente: Manual de Microbiología
Practica, Diaz, 2005.
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Preparación de medios de cultivo.

Esquema del ejemplo con base de caldo.

160 mL agua
+ X g de medio deshidratado

Disolver

pH 6.5 a 7.2

10 mL c/u 20 mL 90 mL

Medio Líquido
+ X g de agar + X g de agar

Fundir Fundir

7 mL 10 mL 20 mL

*Medio semisólido

*Medio sólido

 Preparación de medios de cultivo (ejemplo de preparación con base en caldo)

1. Leer cuidadosamente el membrete del medio de cultivo.
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2. Calcular la cantidad necesaria para preparar 160 mL de caldo.

3. Pesar la cantidad calculada del medio deshidratado. Esta operación debe ser rápida para evitar que la
humedad del ambiente no afecte el resto del contenido del frasco.
4. Disolver el medio en 100 mL de agua y una vez disuelto completar el volumen a 160 mL.
5. Ajustar el pH entre 6.8 y 7.2.
6. Colocar 10 mL en 5 tubos de 16x150.
7. Colocar 20 mL del caldo en el matraz de 50 mL y calcular la cantidad necesaria de agar-agar para obtener
un medio semisólido. (* a un litro de medio se agregan 2.0 g de agar-agar).
8. Tapar el matraz y calentar hasta disolver totalmente.
9. Colocar 10 mL en 2 tubos de 16x150.
10. A partir del volumen excedente, calcular la cantidad necesaria para obtener un medio sólido. (* a un litro
de medio se agregan de 15 g a 20 g de agar-agar).
11. Tapar el matraz y calentar hasta disolución total.
12. Distribuir: 20 mL en 2 tubos de 22x175, 10 mL en 2 tubos de 16x150 y 7 mL en 4 tubos de 16x150.
13. Tapar cada uno de los tubos con algodón y etiquetarlos.
14. Acomodar los tubos (incluyendo el que contiene el indicador biológico) de acuerdo a su estado físico en
tres cestos metálicos, (líquido, semisólido y sólido) y cubrir con papel kraft.
15. Esterilizar este material en autoclave a temperatura de 121°C, y 15 libras de presión durante 20 minutos.
16. Antes de abrir el autoclave, asegurarse que baje la temperatura y que la presión interior sea igual a la del
exterior.
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MATERIALES

Por equipo Por grupo

12 tubos de cultivo de 16 x 150 mm con rosca 2 autoclaves con base, canastilla y válvula
10 tubos de cultivo de 16 x 150 mm sin rosca 2 balanzas analíticas
40 cajas Petri de vidrio 1 horno (temperatura>150°C)
10 pipetas serológicas de 1.0 mL 1 incubadora
5 pipetas serológicas de 10 mL 1 refrigerador
2 pipetas Pasteur 2 pares de guantes de asbesto
4 matraces Erlenmeyer de 500 mL escobillones, fibra, detergente y toallas de papel
1 matraz Erlenmeyer de 1000 mL
Medios y
1 matraz volumétrico de 100 mL Reactivos
3 vasos de precipitados de 100 mL caldo nutritivo (CN)
1 probeta de 250 mL agar bacteriológico
2 parrillas de calentamiento con agitación 2 agar papa dextrosa (PDA)
agitadores magnéticos agar eosina azul de metileno (EMB)
1 gradilla Soluciones amortiguadoras pH 4 y 7
3 propipetas mecánicas (1.0, 5.0, 10 mL) HCl
3 espátulas NaOH
Gelatina sin sabor
2 mecheros Fisher
1 piceta con agua destilada
1 piceta con alcohol al 70%
1 potenciómetro
Tiras de papel Kraft de 2.5 cm de ancho
(para envolver pipetas) y de 20 cm de
ancho (para envolver cajas)
Algodón y gasa
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1-PROCEDIMIENTOS

El profesor hará la demostración para: envolver las cajas Petri y pipetas con papel CRAF, así como elaborar tapones y capucho- nes para
tubos.
 Preparación y esterilización de material de vidrio
1. Lavar material con detergente líquido, enjuagar con abundante agua de la llave y al final con agua destilada.
2. Secar el material de vidrio de preferencia en horno, si no es posible secar al aire.
3. En las pipetas poner un filtro de algodón en la boquilla y envolver con papel Kraft.
4. Envolver las cajas de Petri y pipetas de acuerdo a las indicaciones del profesor.
5. Introducir los hisopos en un tubo y tapar con algodón.
6. Identificar con nombre y marcar el volumen en el papel de las pipetas.
7. Introducir el material a un horno previamente calentado a 180°C, esperar a que la temperatura se estabilice
nuevamente y a partir de este momento dejar 1 hora.
8. De no ser posible emplear el horno, se puede esterilizar el material de vidrio en autoclave.

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Esterilización de materiales y medios de cultivo

1. Las cajas Petri y pipetas envueltas con papel estraza se colocarán en un horno a 150ºC durante 2 horas. Después de sacarlas,
dejar enfriar y abrir los paquetes únicamente en área aséptica (cerca del mechero).

2. Los medios de cultivo se esterilizarán en autoclave de acuerdo con las siguientes instrucciones:
a. Revisar que el agua en la autoclave esté limpia y el nivel coincida con la marca en el tubo indicador. En caso necesario
cambiar o añadir agua destilada.
b. Conectarla y poner la perilla de control en calentamiento máximo. Con el uso de guantes de asbesto, acomodar los
medios y materiales en la canasta de la autoclave y colocarla dentro.
c. Cerrar la tapa, apretar las manijas de dos en dos en posición encontrada y esperar a que salga el vapor por el orificio
de purga, después cerrarlo con la válvula.
d. Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121°C o 15 lbs /in2 de presión y mantener estas condiciones durante
15 minutos. Revisar continuamente el manómetro y regular el control de temperatura a valor medio o mínimo.
e. Apagar la autoclave y dejar que la presión baje al valor de cero. Quitar la válvula y con la ayuda de guantes de asbesto,
abrir cuidadosamente la tapa, desde la parte trasera para evitar que el vapor caliente cause quemaduras.

Vertido de los medios en cajas Petri y solidificación.

1. Cerrar los tubos con tapón de rosca, los que contienen agar se colocarán en una superficie inclinada para que el medio
solidifique a una distancia aproximada de 1-2 cm de la boca del tubo.

2. Enfriar los medios de cultivo de los matraces hasta una temperatura aproximada de 45-50°C, que coincide con la posibilidad
de sostener el matraz en la palma de la mano sin quemarse.

3. Limpiar la mesa con solución de alcohol al 70% (v/v), encender mecheros y colocarlos a una distancia de 50 cm. Verter
entre 20 y 25 mL de cada uno de los medios en tres cajas Petri en esta zona aséptica. Dejar que los medios solidifiquen.
Prueba de esterilidad de materiales

1. Abrir una caja Petri con la colonia, durante 1 minuto en zonas no asépticas (patio, aulas, comedor) y etiquetarlas.

2. Abrir una caja Petri con la colonia, 1 minuto en zona asépticas (cerca del mechero) y etiquetarlas.

3. Colocar los tubos y las cajas Petri en una incubadora ajustada a 30ºC durante 24-48 horas. Las cajas Petri se
colocarán con la tapa hacia abajo.

4. Revisar los tubos y cajas Petri para detectar la presencia de contaminantes, por la aparición de turbidez, nata
superficial y/o depósito de material en el fondo de los tubos con medio líquido, así como la formación de colonias
microbianas en la superficie de los medios sólidos.

Resultados

A. Describir la morfología de las colonias

B. Discutir los resultados con base en la efectividad de la esterilización y manejo de los materiales.

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4. PROCEDIMIENTO: TÉCNICA DE ESTRÍA CRUZADA

A. Dividir cada una de las cajas Petri por la parte de atrás en cuatro cuadrantes. Esterilizar el asa con calor en el mechero.

B. Dejar enfriar el asa y tomar la muestra de una colonia.

C. Inocular la muestra haciendo 4 o 5 estrías simples muy juntas de lado a lado sobre el primer cuadrante de la caja, cerrar la caja.
Flamear el asa de inoculación y hacer girar la caja Petri un cuarto de vuelta.

D. Abrir nuevamente la caja y con el asa de siembra esterilizada y fría, tocar la superficie del de estrías recién hechas en un punto
alejado del inicio. Hacer un segundo grupo de estrías como en el caso anterior. Realizar el mismo procedimiento en el tercer
cuadrante y en el último cuadrante, sin flamear el asa de siembra hará una estría más abierta (simple).

F. Las cajas con la base hacia arriba se incuban a 35°C durante 24-48 horas.

Figura 1.Técnica de siembra por estría en placas de Petri.

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15
 Discusión de resultados

Conclusión

Cuestionario

1. ¿Qué características de un material o sustancia se requieren conocer para elegir el método adecuado de
esterilización?

2. ¿Qué diferencias observó en los resultados obtenidos en tubos y en cajas de Petri? Explique.

3. Describa el tipo de contaminantes microbianos que se encuentran con mayor frecuencia en las cajas de Petri.
¿Cómo expli- can estos resultados?

4. ¿Cuáles son las tres principales recomendaciones de uso correcto de la autoclave?

5. ¿Qué es un medio de cultivo? Y ¿Para qué sirve?

6. ¿Cuáles son las características de los medios de cultivo natural o complejo, y de los
sintéticos?
7. ¿Qué es el agar? Menciona la forma de obtención, así como su uso. Define los medios
de cultivo de acuerdo a su estado.
8. Define los medios de cultivo de acuerdo a su utilidad: enriquecido, de
enriquecimiento, selectivo, diferencial, prueba bioquímica, de transporte y de
conservación. Menciona un ejemplo de cada uno de ellos.
9. ¿Qué es un factor de crecimiento? 15
 10. ¿Qué sustancias son utilizadas en los medios de cultivo como fuentes de: C, N, P y S?
11. ¿Qué factores físicos y químicos afectan los medios de cultivo?
12. Defina los siguientes términos: esterilidad, aséptico y desinfección.

Glosario de medios de cultivo

Investiga la formulación y preparación de los siguientes medios de cultivo:

 Agar BHI
 Agar Nutritivo
 Agar Sabouraud.
 Agar Soya Tripticase
 Caldo BHI
 Caldo Nutritivo
 Caseína soya Agar

Glosario de microorganismos

Geobacillus stearothermophylus
Bibliografía complementaria
 Cappuccino, J. & Sherman, N., Microbiology: A laboratory manual, California. Benjamin
Cummings, 2010.
 Leboffe Michael J. and Burton E. Pierce. 2006. Microbiology laboratory theory and
application. 2nd edition, Morton Publishing Co. USA.
 Madigan M.T, Martinko J.M., Bender K.S., Buckley D.H. and Stahl D.A., Brock Biology of
microorganisms, 14th edition, UK, Benjamin Cummings, 2014.
 Madigan M.T, Martinko J.M., Dunlap P.V. and Clark D.P., Brock Biología de los
microorganismos, 12a edición, UK, Pearson Education, 2009.
 Prescott Lansing M., Harley John P. and Klein Donald A. 2005. Microbiology. 6th edition.
McGraw-Hill. USA.
 Ramírez-Gama, R. M., Luna, M. B., Velásquez, M. O., Vierna, L., Mejía C. A., Tsuzuki, R.
G., Hernández G. L., Müggenburg, I., Camacho Cruz, A. y Urzúa H. M. del C., Manual de
Prácticas de Microbiología General, México, UNAM, Facultad de Química, 2011.
 Tortora G.J., Funke B.R. and Case C.L., Microbiology: An Introduction with Mastering
Microbiology, 11th edition, UK, Pearson Benjamin Cummings, 2012.

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