Control de Esterilidad de Los Productos Farmacéuticos y de Terapia Celular Preparados en Salas de Ambiente Controlado
Control de Esterilidad de Los Productos Farmacéuticos y de Terapia Celular Preparados en Salas de Ambiente Controlado
Emilia Cercenado Mansilla María Pía Roiz Mesones Pilar Egea Miranda
Rafael Cantón Moreno Virginia Rodríguez Garrido
Patricia Ruiz Garbajosa
María Pía Roiz Mesones
ISBN: 978-84-09-44228-7
EDITORES:
Emilia Cercenado Mansilla. Servicio de Microbiología. Hospital General Universitario Gregorio Marañón. Madrid.
Rafael Cantón Moreno, Servicio de Microbiología. Hospital Universitario Ramón y Cajal e Instituto Ramón y Cajal de
SUGERENCIA DE CITACIÓN:
Egea Miranda P, Rodríguez Garrido V, Ruiz Garbajosa P, Roiz Mesones MP. Control de esterilidad de los productos
farmacéuticos y de terapia celular preparados en salas de ambiente controlado. 2022. 77. Roiz Mesones MP (coor-
dinadora). Procedimientos en Microbiología Clínica. Cercenado Mansilla E, Cantón Moreno R (editores). Sociedad
AVISO:
Reservados todos los derechos. Los documentos SEIMC o cualquiera de sus partes no podrán ser reproducidos,
almacenados, trasmitidos, distribuidos, comunicados públicamente o transformados mediante ningún medio o sis-
tema sin la previa autorización de sus responsables, salvo excepción prevista por la ley. Cualquier publicación se-
cundaria debe referenciarse incluyendo “Este documento ha sido elaborado por la SEIMC (Sociedad Española de
Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica) y su contenido puede encontrase en la página web www.seimc.org”
Procedimientos en Microbiología Clínica
Editores:
Emilia Cercenado Mansilla
Rafael Cantón Moreno
1.
1. Introducción.............................................................................................................................................5
2.
2. Normativa Vigente....................................................................................................................................6
7. Bibliografía.................................................................................................................................................24
7.1 Documentos de consulta..................................................................................................................24
7.2 Referencias.......................................................................................................................................24
7.
DOCUMENTOS TÉCNICOS
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DOCUMENTO CIENTÍFICO
1. INTRODUCCIÓN
En el Procedimiento de la SEIMC nº 74, CONTROL MICROBIOLÓGICO AMBIENTAL DE SALAS BLAN-
CAS (CÉLULAS HUMANAS, PRODUCTOS FARMACÉUTICOS, REPRODUCCIÓN ASISTIDA), recien-
temente publicado, se realiza una descripción de las salas blancas, o salas de ambiente controlado,
así como de los requisitos que deben reunir para limitar y controlar la concentración de partículas de
diferentes tamaños en suspensión en el aire, los niveles de contaminación microbiana y mantener las
condiciones ambientales controladas con el propósito de conseguir, en unos casos la protección y segu-
ridad de las personas y en el caso que nos ocupa, para proteger los productos fabricados de una posible
contaminación.
La expansión de las salas blancas a los Servicios de Farmacia (preparación de citostáticos, formulaciones
parenterales), Unidades de Reproducción Asistida (preparación de embriones), Servicios de Medicina
Nuclear (radiofármacos y gammatecas) y Bancos de Sangre y Tejidos (preparados celulares) es hoy una
realidad en la rutina asistencial de nuestro Sistema de Salud. Este documento hará referencia al control
de esterilidad de todos aquellos medicamentos y productos sanitarios elaborados en estas instalaciones
hospitalarias y que están destinados a la terapia de los pacientes. Se aplica a los medicamentos conside-
rados estériles los cuales se deben elaborar en condiciones asépticas. El objetivo del ensayo de esterili-
dad, es proporcionar un control independiente para comprobar que un producto cumple con las exigencias
de la normativa existente (Real Farmacopea Española 5ª edición https://extranet.boe.es/farmacopea/ y
López Hernández, S. https://docplayer.es/21698102-Control-de-esterilidad-para-medicamentos-de-tera-
pias-avanzadas-susana-lopez-hernandez-division-de-productos-biologicos-y-biotecnologia-aemps.html).
No obstante, hay que tener en cuenta que la esterilidad de un producto se debe asegurar con la aplicación
de un proceso de producción adecuadamente validado para no correr el riesgo de obtener un producto no
estéril o deteriorado. De ahí la importancia de cumplir los principios de la Guía Europea de Buenas Prác-
ticas de Preparación de Medicamentos donde se recalca la importancia de trabajar con personal cualifica-
do, locales y equipos de producción adecuados, trabajar cumpliendo procedimientos validados y realizar
controles ambientales y su análisis durante la fabricación (ver procedimiento 74).
Algunos de los preparados que nos ocupan, son los conocidos como medicamentos de terapias avanza-
das (MTA) los cuales se han ido desarrollando de una forma exponencial en los últimos años. Los MTA son
medicamentos de uso humano basados en genes (terapia génica), células (terapia celular somática) y te-
jidos (ingeniería tisular) e incluyen productos de origen autólogo, alogénico o xenogénico. Los MTA fueron
regulados en la Unión Europea dentro del ámbito de los medicamentos con la publicación del Reglamento
Europeo y del Consejo sobre Medicamentos de Terapia Avanzada. Esta normativa trata a los MTA como al
resto de los medicamentos en lo que a autorización previa a la comercialización, necesidad de demostrar
calidad, seguridad, eficacia y vigilancia postautorización se refiere¹. El Real Decreto 477/2014, por el que
se regula la autorización de medicamentos de terapia avanzada de fabricación no industrial, posibilita la
fabricación de los MTA en los hospitales.
Los productos sanitarios más frecuentemente elaborados en los hospitales de nuestro sistema de salud,
y que requieren de un control de esterilidad, están descritos en los siguientes apartados de este docu-
mento y básicamente se aplica a todos aquellos preparados farmacéuticos considerados estériles y a los
hemoderivados y, en relación a los MTA, fundamentalmente aquellos basados en la terapia celular y que
se componen de preparados celulares a partir de la médula ósea, sangre periférica y cordón umbilical.
No siempre está claramente diferenciado el límite entre los MTA y otros tipos de tratamientos con células
o tejidos. En estos casos, es la Agencia Europea del Medicamento (EMA, European Medicines Agency)
quien, a través del Comité de Terapias Avanzadas (CAT), establece que productos se consideran MTA.
Desde que en noviembre de 2018 se hizo la presentación de las Terapias Avanzadas en el Sistema Na-
cional de Salud, las terapias CAR-T (Chimeric Antigen Receptor-T) ya son una realidad en algunos de
nuestros hospitales realizándose en alguno de ellos el proceso de producción de estos linfocitos T.
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DOCUMENTO CIENTÍFICO
Aunque este documento hace referencia exclusivamente a aquellos medicamentos o productos consider-
ados como estériles, existen también normas para el control microbiológico de productos no estériles. Es-
tán basados en el recuento microbiano de bacterias mesófilas, hongos y levaduras para determinar si una
sustancia o preparación satisface una especificación establecida de calidad microbiológica. Todas las espe-
cificaciones necesarias para su realización se encuentran disponibles para su consulta en los documentos
2.6.12 (CONTROL MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTOS NO ESTÉRILES: ENSAYOS DE RECUENTO
MICROBIANO) y 2.6.13 (CONTROL MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTOS NO ESTÉRILES: ENSAYO DE
MICROORGANISMOS ESPECIFICADOS) de la Real Farmacopea Española.
Como conclusión, podemos resumir que la fabricación de cualquier medicamento tiene que cumplir con las
normas de correcta fabricación para asegurar, en el caso que nos ocupa, la obtención de un producto estéril
y no deteriorado y que para comprobar que el producto final cumple con las exigencias de la normativa ex-
istente, se debe realizar un control de esterilidad.
2. NORMATIVA VIGENTE
En el Procedimiento 74, se detallan todas las normativas relacionadas con las salas de ambiente controlado.
Sin embargo, el control de esterilidad de todos aquellos medicamentos preparados o fabricados para uso hu-
mano y que se consideren estériles, debe complementarse con otro tipo de normativa específica la cual está
basada en la Farmacopea Europea. En este apartado, se hace mención a la normativa relacionada con todo
el proceso de fabricación y control de esterilidad de los productos sanitarios que se indica a continuación.
• Real Farmacopea Española 5ª edición. https://extranet.boe.es/farmacopea/
• Guide to Good Manufacturing Practice for Medical Products. Part I and Part II. Pharmaceutical
Inspection Convention. Mayo 2021. https://picscheme.org/docview/4588
• Boletín Oficial del Estado. Real Decreto 477/2014, de 13 de junio, por el que se regula la au-
torización de medicamentos de terapia avanzada de fabricación no industrial. BOE núm. 144 de
14/06/2014.
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DOCUMENTO CIENTÍFICO
• Note for Guidance on the Warning on Transmissible Agents in Summary of Product Char-
acteristics (Spcs) and Package Leaflets for Plasma-Derived Medicinal Products (CPMP/BPWG/
BWP/561703).https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/note-guidance-warn-
ing-transmissible-agents-summary-product-characteristics-spcs-package-leaflets/bpwg/bwp/561/03_
en.pdf
La calidad farmacoterapéutica incluye diferentes dimensiones, como la efectividad y la seguridad, que hacen
difícil alcanzar la calidad total; uno de los mejores sistemas para asegurar la calidad está recogido en la ISO
9001 y que en el caso que nos ocupa se fundamenta en 3 pilares:
1. Documentación escrita de los procedimientos que se realizan que incluye: el manual de la calidad,
los procedimientos generales, los procedimientos normalizados de trabajo, las instrucciones de trabajo
y los registros.
Es importante la realización de Test de Media Fill, única herramienta que permite calificar al personal au-
torizado para realizar técnicas asépticas para operaciones en área estéril; para demostrar el conocimiento
de trabajo mediante técnica aséptica en la elaboración de medicamentos estériles, la Guía de Buenas
Prácticas de Preparación de Medicamentos en Servicios de Farmacia Hospitalaria recomienda aplicar la
validación aséptica con medio de cultivo como se especifica en la sección USP 797 de la Farmacopea
Americana (https://www.sefh.es/fichadjuntos/USP797GC.pdf) en el apartado Media Fill test. Este método
consiste en la simulación de todo el proceso de fabricación, pero utilizando un medio de cultivo estéril (cal-
do o agar triptona soja) en lugar del producto. Los viales obtenidos, serán incubados a una temperatura
de 20º-25ºC ó 30º-35ºC por un mínimo de 14 días. Si las dos temperaturas van a ser utilizadas para la
incubación, se mantendrán los viales al menos 7 días para cada temperatura. El test de Media Fill se debe
realizar al menos 1 vez al año.
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DOCUMENTO CIENTÍFICO
En los capítulos de la USP 797 dedicados a la elaboración de preparaciones, tanto estériles como no es-
tériles, en el aparatado dedicado a la formación del personal y evaluación, indican que todo el personal
implicado en los procesos de elaboración de preparados no estériles y estériles debe estar previamente
formado y debe demostrar su competencia y cualificación (estériles), y debe someterse a una actualización
y reevaluación cada 12 meses. El entrenamiento y evaluación del personal debe quedar documentado.
El ensayo de esterilidad se aplicará a aquellas sustancias, preparaciones o artículos que según la farma-
copea deben ser estériles. El objetivo del ensayo de esterilidad es proporcionar un control independiente
para comprobar que un producto cumple con las exigencias de la Real Farmacopea Española (sección
2.6.1 ESTERILIDAD). Para llevarlo a cabo es necesario realizar un control de los medios de cultivo para
comprobar su esterilidad y propiedades nutritivas, además de un ensayo de idoneidad del método, que nos
permitirá demostrar que el método microbiológico elegido para cada producto es adecuado, permitiendo
el crecimiento de microorganismos patrón en nuestro producto y usando los medios de cultivo indicados.
Para llevar a cabo el ensayo de esterilidad se necesitan medios de cultivo adecuados que cumplan las es-
pecificaciones de la Farmacopea. Estos medios son:
1. Medio líquido con tioglicolato para cultivo de bacterias anaerobias; aunque también per-
mite detectar bacterias aerobias. El medio líquido con tioglicolato debe incubarse a 30-35°C.
2. Medio con hidrolizado de caseína y soja (TSB), adecuado para el cultivo tanto de hongos como
de bacterias aerobias. El medio con hidrolizado de caseína y soja debe incubarse a 20-25°C.
En los medios de cultivo utilizados, debe comprobarse que satisfacen unos requisitos mediante la
realización de los siguientes ensayos que pueden aplicarse antes del análisis del producto o bien en paralelo:
3.1.1. Esterilidad
Hay que incubar muestras de los medios de cultivo (comerciales y fabricados “in house”), a
las temperaturas indicadas previamente, durante 14 días. Transcurrido este periodo de incu-
bación, los medios satisfacen el ensayo si no se observa proliferación de microorganismos.
Se debe realizar un ensayo de fertilidad del medio para bacterias aerobias, anaerobias y hon-
gos, y hay que analizar cada lote de medio, ya sea comercial y listo para usar, o bien prepara-
do a partir de un medio deshidratado o de los componentes. Las cepas de microorganismos ade-
cuadas se indican en la tabla 1, tomada de la sección 2.6.1 de la Real Farmacopea Española.
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DOCUMENTO CIENTÍFICO
BACTERIAS AEROBIAS
Staphylococcus aureus ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10788, NCIMB 9518, NBRC 13276
Bacillus subtilis ATCC 6633, CIP 52.62, NCIMB 8054, NBRC 3134
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275
BACTERIA ANAEROBIA
Clostridium sporogenes ATCC 19404, CIP 79.3, NCTC 532, ATCC 11437, NBRC 14293
HONGOS
Candida albicans ATCC 10231, IP 48.72, NCPF 3179, NBRC 1594
Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, IP 1431.83, IMI 149007, NBRC 9455
Las muestras de medio líquido se inoculan con un pequeño número (como máximo 100 UFC) de los mi-
croorganismos indicados y posteriormente se incuban los medios sembrados con bacterias durante 3 días
y los medios sembrados con hongos durante 5 días. Los medios se consideran adecuados si se observa
crecimiento de los microorganismos.
Existen comercializadas cepas de referencia calibradas que consisten en bolas hidrosolubles que contie-
nen el número preciso de microorganismos.
La esterilidad de cada lote del medio se lleva a cabo incubando a 35-37ºC un frasco aerobio y otro anaero-
bio durante al menos 7 días en el incubador automatizado.
El ensayo de promoción de crecimiento se realiza sembrando en 2 frascos de cada medio entre 10-100
UFC de cada una de las cepas de referencia (ver tabla 2) e incubando a 35-37ºC durante 7 días en incuba-
dor automatizado. El ensayo será satisfactorio si se obtiene crecimiento en todos los frascos sembrados.
Este ensayo debe realizarse por duplicado.
Medio aerobio
Staphylococcus aureus ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10788, NCIMB 9518
Bacillus subtilis ATCC 6633, CIP 52.62, NCIMB 8054
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118
Candida albicans ATCC 10231, IP 48.72, NCPF 3179
Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, IP 1431.83, IMI 149007
Medio anaerobio
Clostridium sporogenes ATCC 19404, CIP 79.3, NCTC 532 o ATCC 11437
Bacteroides fragilis ATCC 25285, CIP 77.16, NCTC 9343
El objetivo es comprobar que el producto es capaz de soportar el crecimiento de las cepas patrón o de re-
ferencia. El test de idoneidad, consiste en realizar la misma metodología del ensayo de esterilidad del pro-
ducto (ver punto 4.5 de este documento) con las siguientes modificaciones según la metodología utilizada:
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DOCUMENTO CIENTÍFICO
a.Filtración a través de una membrana. Transferir el contenido a analizar a una membrana filtrante;
después añadir un inóculo que contenga como máximo 100 UFC a la porción final del diluyente estéril
utilizado para enjuagar el filtro.
b. Inoculación directa. Después de transferir el contenido de uno o varios envases del producto a
estudiar al medio de cultivo, añadir un inóculo que contenga como máximo 100 UFC.
En ambos métodos, deben utilizarse los microorganismos descritos anteriormente en el ensayo de fertilidad
del medio para bacterias aerobias y anaerobias y hongos (ver tabla 1 del punto 3.1.2 de este documento).
Se deben incubar los recipientes un máximo de 5 días. De forma paralela se puede realizar el ensayo de
fertilidad que serviría como control positivo.
Si en presencia del producto que desea analizarse no se observa crecimiento evidente, se considera que
el producto tiene actividad antimicrobiana que no se ha eliminado satisfactoriamente en las condiciones del
ensayo y se deberán modificar las condiciones para eliminar la actividad antimicrobiana y repetir el ensayo
de idoneidad del método.
Este método está indicado para los productos hematopoyéticos y de terapia celular. Consiste en realizar
una validación del método en presencia del tipo de preparación a examinar. Se valida la especificidad
(ausencia de resultados falsos positivos), sensibilidad (límite de detección) y reproducibilidad. El límite de
detección del ensayo se determina utilizando como inóculo el producto contaminado en diferentes grados,
con los siguientes microorganismos indicados en la Real Farmacopea Española (sección 2.6.27 Control
microbiológico de productos celulares), elegidos por su probabilidad de contaminación y sus requisitos de
crecimiento:
Clostridium sporogenes ATCC 19404, CIP 79.3, NCTC 532 o ATCC 11437
Staphylococcus aureus ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10788, NCIMB 9518
En función del origen de las células y de otros factores, como los resultados de cultivos anteriores positivos,
puede ser necesario modificar el listado de microorganismos patrón a ensayar. Por ejemplo, en la Farma-
copea Europea (2.6.27. Microbiological examination of cell-based preparations) la cepa control de Yersinia
enterocolitica es sustituida por una cepa control de Micrococcus spp. (ATCC 700405).
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DOCUMENTO CIENTÍFICO
De cada uno de estos microorganismos, se deben inocular como máximo 100 UFC en la botella de hemo-
cultivos en presencia del producto a examinar. De forma paralela, se debe realizar un control de inóculo para
garantizar un recuento inferior a 100 UFC. El ensayo de idoneidad debe realizarse por triplicado
Si después de la incubación se observa una proliferación de los microorganismos inoculados (cepas patrón
o de referencia) evidente y comparable a la observada en el recipiente de control sin producto, se considera
que el producto no tiene actividad antimicrobiana en las condiciones del ensayo o que dicha actividad se
ha eliminado satisfactoriamente. El ensayo de esterilidad puede realizarse entonces sin otra modificación.
Por el contrario, si en presencia del producto a examinar no se observa una proliferación evidente y visual-
mente comparable a la observada en el recipiente de control sin producto, se considera que el producto
tiene una actividad antimicrobiana que no se ha eliminado satisfactoriamente en las condiciones del ensayo
y se deben modificar las condiciones para eliminar la actividad antimicrobiana y repetir el ensayo de idonei-
dad del método.
El ensayo de esterilidad se aplica a todos aquellos preparados farmacéuticos considerados estériles. Con-
cretamente, en los servicios de farmacia hospitalaria, el control de esterilidad se aplicará a los productos
estériles preparados en lotes uniformes. El ensayo de esterilidad de estos productos se realizará siguiendo
las especificaciones de la sección 2.6.1 ESTERILIDAD de la Real Farmacopea Española descritas en el
punto 4.5 de este documento.
Se define como “lote” al conjunto homogéneo de envases sellados preparados de tal manera que el riesgo
de contaminación sea el mismo para cada una de las unidades que lo constituyen. La definición de lote apli-
cada a las preparaciones en los servicios de farmacia hace referencia a un número determinado de prepa-
raciones normalizadas o serie de preparaciones, para responder a las necesidades futuras de los pacientes.
Para realizar el control de esterilidad, el número mínimo de unidades a examinar depende del tamaño del
lote. Como es evidente es imposible realizar un análisis de cada uno de los envases que forman parte de
un lote, por lo que es necesario diseñar un plan de muestreo apropiado. Por este motivo se seleccionará un
número determinado de unidades basándonos en la hipótesis de que en el análisis del contenido de todos
los envases del lote se obtendrá el mismo resultado. En el caso de producción en condiciones asépticas,
se recomienda examinar muestras introducidas en los envases al principio y al final del lote y después de
cualquier intervención significativa.
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DOCUMENTO CIENTÍFICO
Tabla 3.- Número mínimo de unidades a examinar según el tamaño del lote:
Nº de unidades en el Nº mínimo de unidades a
Tipo de preparación
lote examinar para cada medio
El 10% de los envases, pero como
≤100 envases
mínimo 4
100-500 envases 10 envases
El 2% de los envases, pero como
Parenteral
máximo 20 (en el caso de las
>500 envases preparaciones parenterales de
gran volumen, como máximo 10
envases)
El 5% de los envases, pero como
≤200 envases
mínimo 2
Oftálmicas y otras
>200 envases 10 envases
preparaciones no
Si el producto se presenta en envases unidosis, aplicar el
inyectables
esquema descrito anteriormente para las preparaciones de
administración parenteral
Por otra parte, según las recomendaciones de la Guía de Buenas Prácticas de Preparación de Medicamen-
tos en Servicios de Farmacia Hospitalaria (https://www.sefh.es/sefhpdfs/GuiaBPP_JUNIO_2014_VF.pdf),
se debe realizar un control microbiológico en todas aquellas preparaciones estériles compuestas por más
de 25 unidades por lote. Este control se realizará una vez finalizada la preparación, pero antes de la libera-
ción del lote.
El control microbiológico de esterilidad se realizará siempre tras la producción de un nuevo lote siguiendo las
recomendaciones de muestreo recogidas en el punto 4.2.
En general, las muestras se deben recibir en el laboratorio dentro de las 2 horas siguientes tras su recogi-
da. Si no se pueden lograr estos tiempos para el transporte, las muestras pueden mantenerse a tempera-
tura ambiente no más de 24 horas. Es importante enviar las muestras lo antes posible para su inmediata
incubación, ya que no pueden conservarse en refrigeración.
Los contenedores con medio líquido se sellarán con film de plástico para evitar contaminaciones durante
su traslado. Las muestras se enviarán al laboratorio de Microbiología perfectamente identificadas y se re-
gistrarán en el SIL (sistema informático de laboratorio) para garantizar la trazabilidad dentro del laboratorio.
Puede utilizarse la técnica de filtración a través de membrana o siembra directa del producto en medio de
cultivo. (sección 2.6.1 ESTERILIDAD, de la Real Farmacopea Española) En ambos casos deben incluirse
controles negativos apropiados. La técnica de filtración a través de una membrana se utiliza siempre que la
naturaleza del producto lo permita, es decir, para preparaciones acuosas filtrables, preparaciones alcohólicas
u oleosas y preparaciones miscibles o solubles en disolventes acuosos u oleosos, siempre que estos disol-
ventes no tengan un efecto antimicrobiano en las condiciones del ensayo. En este apartado, realizaremos
un resumen de los métodos a realizar pudiendo consultar la documentación especificada para detalles más
concretos.
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DOCUMENTO CIENTÍFICO
a.Filtración a través de una membrana. Para la filtración por membrana, el producto (ya sea puro o
en diluyente, según corresponda) se pasa a través de un filtro con un tamaño nominal de poro de como
máximo 0,45 μm y cuya eficacia para retener microorganismos se haya demostrado. Es necesario filtrar
inmediatamente. Si el producto tiene propiedades antimicrobianas, el filtro se puede lavar al menos tres
veces (pero no más de cinco veces por filtro) con 100 ml de un diluyente estéril seleccionado para ser
utilizado en el ensayo de idoneidad del método (por ejemplo, una disolución neutra de 1 g/L de peptona
de carne o de caseína).
El contenido a examinar puede ser transferido a una o varias membranas, pero utilizando siempre
como mínimo las cantidades de producto a examinar prescritas en la tabla 4.
Cuando el contenido de un solo envase no sea suficiente para realizar estos ensayos, se puede utilizar
el contenido de ≥2 envases para sembrar los distintos medios.
El filtro de membrana es entonces transferido a TSB a 20º a 25°C y caldo de tioglicolato a 30º a 35°C
durante al menos 14 días. Si se ha utilizado una sola membrana, ésta puede ser cortada asépticamente
en dos partes iguales y transferirlos a los medios de cultivo.
Ventajas del uso de este método: posee alta sensibilidad y menor incidencia de falsos negativos, además
de permitir evaluar todo el volumen de producto si fuera necesario. Principal desventaja: mayor probabi-
lidad de contaminación.
b.Siembra directa del medio de cultivo. En este caso se transfiere la cantidad de la preparación a
examinar, indicada en la tabla 4, directamente al medio de cultivo; el volumen del producto utilizado no
será superior al 10% del volumen del medio.
Si el producto a examinar tiene actividad antimicrobiana, hay que efectuar el ensayo después de ha-
berla neutralizado con una sustancia neutralizante adecuada o bien por dilución con una cantidad su-
ficiente de medio de cultivo. Cuando sea necesario examinar un volumen importante del producto, es
preferible utilizar un medio de cultivo concentrado, preparado teniendo en cuenta la dilución posterior.
Líquidos oleosos: en este caso hay que emplear medios suplementados con un emulsionante apropiado
en concentración adecuada, determinada en el ensayo de idoneidad del método (por ejemplo, polisor-
bato 80).
Pomadas y cremas: preparar una dilución de aproximadamente 1/10 emulsionando con el emulsionante
seleccionado en un diluyente estéril adecuado, por ejemplo, una disolución neutra de 1 g/L de peptona
de carne o de caseína. Transferir el producto diluido a un medio que no contenga emulsionante.
13
DOCUMENTO CIENTÍFICO
Los medios sembrados se deben incubar durante como mínimo 14 días y observar los cultivos varias
veces durante el periodo de incubación. Cada día hay que agitar suavemente los medios que conten-
gan productos oleosos. No obstante, si se utiliza el medio líquido con tioglicolato para la detección de
microorganismos anaerobios, hay que reducir la agitación todo lo posible con el fin de mantener las
condiciones anaeróbicas.
Los medios de cultivo recomendados por la Farmacopea son el caldo tioglicolato, que permite el crecimiento
de bacterias aerobias y anaerobias y el caldo caseína y soja (TSB), que permite la recuperación de bacterias
aerobias y hongos.
Las condiciones de incubación recomendadas por la Farmacopea son las siguientes:
-Caldo tioglicolato: 30º-35ºC durante 14 días
-Caldo caseína y soja: 20º-25ºC durante 14 días
Si a los 14 días no se observa turbidez en el medio, el producto analizado satisface el ensayo de esterilidad.
Por el contrario, si en este periodo se detecta turbidez en el medio se realizará un subcultivo en medios sólidos
generales (por ejemplo, agar sangre o agar chocolate) y diferenciales que se incubarán durante 48-72 horas.
Las colonias de bacterias y/o hongos recuperadas de estos medios se identificarán a nivel de especie median-
te las técnicas microbiológicas rutinarias (por ejemplo, MALDI-TOF). En este caso, el producto no satisface el
ensayo de esterilidad y el cultivo se debe informar como positivo indicando la especie o especies identificadas.
No es necesaria la realización rutinaria de antibiogramas de las especies recuperadas de estos cultivos.
Ante un ensayo de esterilidad en el que se observa proliferación microbiana, habría que considerar revisar
los siguientes puntos:
a) Los resultados del control microbiológico de las instalaciones donde se realizan los ensayos de
esterilidad no son satisfactorios
b) La evaluación del procedimiento experimental utilizado para efectuar el ensayo en cuestión pone
de manifiesto algún problema
c) Se observa proliferación microbiana en los controles negativos
d) Después de la identificación de los microorganismos aislados en el ensayo, el crecimiento de esta
o estas especies puede atribuirse inequívocamente a problemas relacionados con los materiales y/o
las técnicas utilizados en el ensayo de esterilidad
Cuando el ensayo se declara inválido, se debe repetir con el mismo número de unidades que se utilizaron
en el ensayo inicial. Si en este caso en el ensayo de esterilidad no se detecta crecimiento bacteriano, se
considera que el producto satisface el ensayo de esterilidad. Por el contrario, si en la repetición del ensayo
se vuelve a detectar crecimiento microbiano, el producto a examinar no satisface el ensayo de esterilidad.
4.8 REGISTROS
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DOCUMENTO CIENTÍFICO
al menos un año tras la fecha de caducidad del producto terminado. Los procedimientos y las instrucciones de
trabajo (incluidas las prescripciones) deben conservarse al menos durante cinco años tras su empleo.
Los documentos en que se detalle el trabajo realizado (cuadernos, hojas de cálculo), informes parciales, finales
y la información que se genere a partir de los datos brutos, debe quedar igualmente archivada y accesible.
Todo el personal que participe en alguna fase del proceso, debe quedar debidamente identificado y regis-
trado, respetando en todo caso la ley de protección de datos mediante el sistema de codificación que se
acuerde (firmas, iniciales).
A) Introducción
En este apartado se hará referencia al control microbiológico de los productos celulares los cuales englo-
ban en líneas generales, a los derivados hematopoyéticos y los preparados de terapia celular.
La terapia celular, junto a la terapia génica y la ingeniería de tejidos, constituyen los 3 grandes grupos de
tratamientos incluidos en lo que se denomina medicamentos de terapia avanzada (MTA) que, tal y como se
ha comentado anteriormente, incluyen productos de origen autólogo (del mismo paciente), alogénico (de
un donante) o xenogénico (de un animal). Los medicamentos de terapia celular somática se utilizan princi-
palmente para el tratamiento de enfermedades que carecían, hasta ahora, de un tratamiento eficaz como
el cáncer, diabetes, infarto de miocardio, Parkinson, etc., y que se benefician de la capacidad regenerativa,
inmunomoduladora y de cicatrización, que presentan las células madre.
Las células madre son células no especializadas que tienen la capacidad de auto-renovarse y de diferen-
ciarse a varios linajes celulares con funciones específicas. Según su capacidad de diferenciación, se clasi-
fican en totipotentes, pluripotentes, multipotentes y unipotentes. Las más utilizadas son 1) las células madre
pluripotentes, embrionarias o inducidas (pueden diferenciarse en cualquier tipo celular del organismo) y 2)
multipotentes, adultas, somáticas o específicas de tejido (su potencial de especialización se limita a uno o
varios linajes celulares). Las células madre adultas y, dentro de este grupo, las células madre mesenqui-
males (CMM), son las más utilizadas y las que más aplicaciones tienen en terapia celular, por su mayor
facilidad de obtención, alta capacidad de expansión y diferenciación in vitro y menor riesgo de formación
de teratomas. Además, son células con una alta capacidad para producir factores de crecimiento, migrar a
otras regiones del cuerpo y ejercer funciones regenerativas e inmunomoduladoras.
La International Society of Cellular Therapy (ISCT, «Sociedad Internacional de Terapia Celular») estableció
en 2006 las características mínimas que deben cumplir las CMM:
Según la normativa vigente, un medicamento de terapia celular somática es un medicamento biológico con
las características siguientes:
1.- Contiene células o tejidos, o está constituido por ellos, que han sido objeto de manipulación sustancial
de modo que se hayan alterado sus características biológicas, funciones fisiológicas o propiedades es-
tructurales pertinentes para el uso clínico previsto, o por células o tejidos que no se pretende destinar a la
misma función esencial en el receptor y en el donante.
2.- Presenta propiedades para ser usado por seres humanos, o administrado a los mismos, con objeto de
tratar, prevenir o diagnosticar una enfermedad mediante la acción farmacológica, inmunológica o metabó-
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DOCUMENTO CIENTÍFICO
De entre los múltiples procedimientos de control llevados a cabo sobre los MTA, nos centraremos en este
documento en el control de bacterias, hongos y micoplasmas. Otros ensayos se llevan a cabo generalmen-
te fuera del ámbito del laboratorio de microbiología: análisis de endotoxinas, análisis de fenotipo mediante
citometría de flujo, de viabilidad, citogenético, entre otros.
El uso de los sistemas automatizados de hemocultivo, como un método alternativo para la prueba de es-
terilidad del producto, ha sido abrumadoramente favorable en los últimos 20 años, con la mayoría de los
estudios centrados en el rendimiento de los sistemas Bactec (Becton Dickinson) y BacT/Alert (bioMèrieux)2.
Estas plataformas son ventajosas en comparación con el método manual descrito en USP 71, ya que
proporcionan un monitoreo contínuo automatizado y detección objetiva del crecimiento microbiano, que a
menudo puede confundirse con la naturaleza turbia de los productos de terapia celular, lo que genera difi-
cultades en la interpretación del cultivo a través del método USP 71.
Actualmente, la Farmacopea Europea (sección 2.6.27) reconoce formalmente el uso de medios enrique-
cidos aerobios y anaerobios con una incubación mínima de 7 días a 35º- 37°C como método de prueba
alternativo (en el caso de Cutibacterium acnes, el tiempo de detección puede ser mayor). Este acortamiento
en el tiempo es de suma importancia debido al estado crítico del paciente y la corta vida útil del producto.
Un estudio publicado por la FDA en 2011 demostró que la detección de crecimiento por tecnología de bio-
luminiscencia ATP (Rapid Milliflex sistema de detección) o sistemas de monitoreo de CO2 (Bactec y BacT/
Alert) eran alternativas adecuadas a la detección de turbidez². A día de hoy, el sistema automatizado de
hemocultivos BACT/ALERT®3D (utilizado en la práctica clínica) y BACT/ALERT®3D DUAL-T (utilizado en
la industria), son los equipos que mejor han demostrado cumplir con las especificaciones definidas en la
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DOCUMENTO CIENTÍFICO
En referencia al sistema automatizado BACTEC, hay publicaciones con resultados dispares ²,³,⁴ . No obstan-
te, no debe olvidarse la necesidad de validar cualquiera de los métodos elegidos para realizar el ensayo en
todos los tipos de productos a estudiar.
El control microbiológico de productos celulares debe llevarse a cabo en condiciones de asepsia, siguiendo
las disposiciones vigentes para materiales potencialmente infecciosos, pero sin aplicar ningún procedimien-
to que pueda limitar la detección de microorganismos presentes en los mismos. El ensayo debe realizarse
en condiciones vigiladas regularmente por toma de muestras adecuadas en la zona de trabajo y por con-
troles apropiados.
Se procesará una muestra representativa de los derivados terapéuticos fabricados (células madre u otros).
Cuando la naturaleza del producto no permita realizar el ensayo directamente sobre la muestra, este puede
realizarse sobre soluciones de cultivo, lavado o transporte. Los ensayos de esterilidad se pueden realizar
en diferentes fases del proceso de producción:
• Ensayo de esterilidad durante la producción: se inocularán los medios de cultivo con una muestra
representativa del cultivo o cultivos celulares según se defina en el análisis de riesgos y puntos críti-
cos de cada producto. La finalidad de este ensayo es conocer el resultado antes de la liberación del
producto.
• Ensayo de esterilidad en el producto terminado: para controlar una posible contaminación al final del
procedimiento, es aceptable realizar un cribado con técnicas rápidas (tinciones) dirigidas a detectar
la presencia de hongos y bacterias. Puesto que los productos de terapia celular son de vida media
corta, el resultado no se obtendrá antes de la liberación del producto. La certificación y liberación
del medicamento puede hacerse en 2 fases, antes y después de obtener los resultados de todos los
ensayos.
El personal de producción de las salas será el responsable de tomar las muestras y entregarlas al responsa-
ble de control de calidad para la realización del ensayo. Utilizando material estéril, se inocularán medios de
cultivo adecuados para la detección de bacterias y hongos.
En la actualidad, se recomienda el uso de dos frascos de hemocultivo, uno anaerobio y otro aerobio, que se
procesarán en incubadores de lectura automatizada. En caso de que el volumen de muestra disponible no
sea suficiente para inocular adecuadamente ambos frascos de hemocultivo, se inoculará primero el frasco
aerobio con la cantidad necesaria y el resto se utilizará para el cultivo en frasco de anaerobiosis. La utiliza-
ción de frascos pediátricos es preferible para el cultivo de volúmenes de muestra inferiores a 5 ml, por lo que
se recomienda utilizarlos en lugar de los frascos aerobios estándar.
Para los productos hematopoyéticos, la cantidad mínima de producto a analizar en función del volumen final
del producto es la que sigue:
Volumen total del producto (mililitros) Volumen del inóculo
V ≥ 10 1 por ciento del volumen total
1 ≤ V <10 100 microlitros
V <1 No aplicable
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DOCUMENTO CIENTÍFICO
En caso de que requiera dilución antes de la congelación, debe aumentarse el volumen del inóculo según el
factor de dilución. Para otros productos celulares, las cantidades mínimas adecuadas se definen en térmi-
nos de volumen o de número de dosis con un volumen mínimo aconsejable de 1 ml por frasco. Volúmenes
inferiores deben justificarse y validarse previamente.
Adicionalmente se entregará una muestra de producto final en recipiente estéril para realizar tinciones di-
rectas de bacterias y hongos. Este procedimiento permite una liberación temprana del lote en los productos
de vida media corta. El responsable del procedimiento debe asegurarse de la correcta identificación de los
frascos y recipientes con muestras.
Todos los lotes de producto fabricado en las salas de producción deben someterse a los controles de calidad,
pudiendo llevarse a cabo en el mismo centro o en laboratorios de referencia. En cualquier caso, se seguirá el
plan de calidad establecido en el centro de producción.
Las muestras inoculadas en frascos de hemocultivo o recipiente estéril, serán transportadas al laboratorio
de Microbiología a la mayor brevedad posible. Si se va a retrasar la inoculación de la muestra en los medios
de cultivo, ésta debe conservarse a 5º ± 3ºC, para evitar que los microorganismos que pudiera haber en la
muestra sean fagocitados por células presentes en algunos productos celulares, por ejemplo, neutrófilos. En
caso de que los frascos de hemocultivo, una vez inoculados, no puedan introducirse en el incubador, deben
mantenerse a una temperatura de entre 15º-20ºC, por un tiempo no superior a 12 horas. Si se supera este
límite de tiempo, se deben realizar subcultivos de salida.
La normativa vigente indica que deben usarse al menos 2 medios de cultivo adecuados para hongos y bac-
terias aerobias y anaerobias. En la actualidad, como se ha comentado, se aconseja utilizar frascos de hemo-
cultivo para sistemas de monitorización continua que pueden disminuir el tiempo de detección a ≥7 días en
lugar de los 14 necesarios utilizando medios sin lectura automatizada (USP 1071https://doi.usp.org/USPNF/
USPNF_M12457_02_01.html ). Estos contienen caldo digerido de soja y caseína enriquecido. Una vez en
el laboratorio de Microbiología, se introducen los frascos en el incubador a 35º-37ºC, con un protocolo no
inferior a 7 días. Si se realiza el test utilizando medios de cultivo sin lectura automatizada, hay que efectuar
la inspección visual de turbidez del medio diariamente, durante el tiempo de incubación, que debe alargarse
en este caso hasta los 14 días. Los cultivos no automatizados deben examinarse como mínimo una vez al
día hasta la finalización del periodo de incubación. Para el subcultivo de frascos marcados como positivos o
medios líquidos donde se observe turbidez, se utilizarán medios sólidos adecuados, enriquecidos y/o dife-
renciales (agar sangre, agar chocolate, MacConkey). Las muestras para tinciones de hongos y bacterias se
procesarán según el protocolo general de las tinciones elegidas. Se recomienda realizar la tinción de Gram
para el despistaje de bacterias y la tinción de calcoflúor para hongos.
Los resultados de las tinciones se informarán cuando estén disponibles indicando si se observan formas
compatibles con la presencia microorganismos. En medios líquidos, si no se observa turbidez al finalizar
el periodo de incubación, se informará como cultivo negativo. En el caso de la utilización de frascos de he-
mocultivos, debe realizarse una inspección visual de los mismos al final de la incubación para descartar la
presencia de hongos filamentosos no detectados por el instrumento.
Si se obtiene crecimiento, se informará como cultivo positivo, realizando identificación a nivel de especie y
antibiograma mediante la metodología de rutina del laboratorio de microbiología. En función de la especie de
microorganismo aislado, los responsables de la Unidad de Terapia Celular decidirán, según los protocolos es-
tablecidos, si es posible continuar el tratamiento del paciente o por el contrario debe descartarse el producto⁵.
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DOCUMENTO CIENTÍFICO
5.7. REGISTROS
Los centros están obligados a mantener un sistema de trazabilidad de todos los productos, incluidas las
materias primas que se han utilizado y cualquier material que haya estado en contacto con los productos
celulares. El centro hospitalario debe conservar los datos durante un periodo de tiempo de 30 años tras la
fecha de caducidad del producto. La farmacovigilancia también será responsabilidad del hospital que tiene la
autorización de uso y deberán hacer informes periódicos de seguridad a la AEMPS.
Todo el personal que participe en alguna fase del proceso, debe quedar debidamente identificado y regis-
trado, respetando en todo caso la ley de protección de datos mediante el sistema de codificación que se
acuerde (firmas, iniciales).
La contaminación de los cultivos celulares con micoplasmas es un problema relativamente frecuente y sub-
estimado por la dificultad que conlleva su detección. El origen puede estar en las células de partida, sueros
no tratados de origen humano o animal o en el personal que trabaja los cultivos celulares. Los micoplasmas
pueden atravesar los filtros con tamaño de poro menor de 0,2 micras que se utilizan para la esterilización con
membrana. Además, son resistentes a los antibióticos que actúan a nivel de la pared celular, pues carecen de
ella, y no son completamente eliminados por muchos otros antibióticos de amplio espectro que simplemente
inhiben su proliferación. Los signos visibles de contaminación, como la turbidez o las variaciones de pH, son
infrecuentes, pero se pueden producir cambios como desaceleración de la tasa de crecimiento celular, pro-
piedades inmunológicas alteradas y cambios metabólicos y de la expresión génica que afectan a la calidad
y funcionalidad de las células. La sección 2.6.7 MICOPLASMAS, de la Real Farmacopea Española, indica
que puede llevarse a cabo el control de micoplasmas mediante diferentes técnicas: 1) método por cultivo, 2)
método por cultivo de células indicadoras o bien por 3) técnicas de amplificación de ácidos nucleicos (TAAN),
como alternativa a alguno de los dos primeros métodos, tras realizar la validación de las mismas.
a) Tipos de preparados
Todos los productos de terapia celular en fase final, previamente a su liberación, deben ser sometidos al
ensayo de detección de micoplasmas.
b) Recogida de muestras
Se realizará siguiendo el mismo procedimiento indicado para el control bacteriano y fúngico descrito
previamente, utilizando un recipiente estéril.
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DOCUMENTO CIENTÍFICO
técnicas de TAAN. No obstante, en el capítulo 2.6.7 de la Real Farmacopea Española, pueden consultarse
de forma específica los requisitos detallados para la realización del cultivo.
Puede utilizarse cualquier medio de cultivo indicado para el crecimiento de micoplasmas, siempre que se
haya evaluado, en cada lote, la capacidad del mismo para permitir el crecimiento de los micoplasmas, tanto
en presencia como en ausencia del producto a ensayar. Los medios de cultivo recomendados en la Farma-
copea Europea son: medio Hayflick (recomendado para la detección de micoplasmas en general), medio
Frey (recomendado para la detección de Mycoplasma synoviae) y medio Friis (micoplasmas no aviares).
Debe incluirse un control positivo de al menos una de las siguientes cepas de referencia:
En cada lote de medio de cultivo que se vaya a utilizar, habrá que llevar a cabo el ensayo para determinar
las propiedades nutritivas del medio, según la metodología descrita a continuación.
a) Propiedades nutritivas
Se realizará el ensayo para determinar las propiedades nutritivas en cada nuevo lote de medio. Para ello,
hay que sembrar en los medios elegidos las cepas patrón adecuadas, utilizando como máximo 100 UFC
por placa de 60 mm de diámetro que contenga 9 mL de medio sólido y por envase de 100 mL de medio
líquido. Para cada especie de microorganismo, se utilizará una placa y envase distinto. Posteriormente
se incuban los medios y se realizan subcultivos de 0,2 mL de medio líquido al medio sólido a intervalos
específicos según se describe en el siguiente punto “ensayo de detección de micoplasmas en el producto
a examinar”. El medio sólido satisface el ensayo si se observa crecimiento adecuado para cada microor-
ganismo de ensayo (el crecimiento obtenido no difiere en un factor superior a 5 del valor calculado para
el inóculo). El medio líquido satisface el ensayo si se observa crecimiento sobre placas de agar subculti-
vadas en el caldo en al menos 1 subcultivo de cada microorganismo de ensayo.
Se debe realizar además un ensayo de sustancias inhibitorias una sola vez por cada tipo de producto y sólo
se repetirá si se produce algún cambio en la metodología de producción que pueda afectar a la detección
de micoplasmas. Este se lleva a cabo mediante la realización de un ensayo de propiedades nutritivas en
presencia y ausencia del producto a examinar (sección 2.6.7 de la Real Farmacopea Española).
b) Ensayo para la detección de micoplasmas en el producto a analizar
Se sembrarán las muestras a examinar en medios de cultivo líquidos y sólidos. Sembrar 10 mL del pro-
ducto a examinar en 100 mL del medio de cultivo líquido. Si el pH del medio cambia significativamente,
se restablece por adición de una disolución de hidróxido de sodio o de ácido clorhídrico. Sembrar 0,2 mL
del producto a examinar en las placas de medio sólido. Como controles negativos se utilizarán placas
de medio sólido y un volumen de 100 mL del medio líquido y sin inocular. Incubar los medios líquidos en
envases herméticos a 35º-38°C y los medios sólidos en microaerofilia a 35º-38°C. Los medios líquidos
se incuban durante 21 días. Entre los días 2-4 después de la siembra, hay que realizar un subcultivo de
cada medio líquido sembrando 0,2 mL en al menos 1 placa de cada medio sólido con el fin de tener más
de un subcultivo por si se produjera contaminación por otros microrganismos. Hay que repetir el proce-
dimiento entre los días 6º y 8º, entre los días 13º y 15º y, finalmente, entre los días 19º y 21º del ensayo.
Todos los medios sólidos se incuban durante 14 días, excepto los del último subcultivo (días 19-21), que
se incubarán 7 días.
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DOCUMENTO CIENTÍFICO
Es necesario incluir en el ensayo controles positivos sembrando como máximo 100 UFC de al menos 1
microorganismo de ensayo en medio sólido o medio líquido. Se recomienda usar los microorganismos de
ensayo en rotaciones regulares.
Este método requiere realizar cultivos celulares de micoplasmas por lo que queda restringido a laboratorios
especializados. Brevemente, consiste en teñir los cultivos celulares con un colorante fluorescente que se
une al ADN. Los micoplasmas se detectan por el aspecto característico en partículas o en filamentos, de la
fluorescencia observada en la superficie de las células. Se utilizan células Vero u otras con capacidad simi-
lar para el cultivo de micoplasmas. Los procedimientos específicos están disponibles para su consulta en la
sección 2.6.7 de la Real Farmacopea Española.
Las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos pueden aplicarse en lugar del método por cultivo y el mé-
todo por cultivo de células indicadoras y cuando así lo indique la monografía. Cuando son positivas, indican
la presencia de una secuencia nucleotídica particular y no necesariamente la presencia de micoplasmas
viables. La PCR en tiempo real es un método sensible y específico para detectar la presencia de ADN de mi-
coplasmas en el sobrenadante de los cultivos celulares. Es necesario, como en otros casos, llevar a cabo la
validación del método antes de ponerlo en marcha o bien adquirir un kit comercial validado según Farmaco-
pea Europea (punto 2.6.7). Cuando se utilice un kit comercial, ciertas partes de la validación pueden haberse
llevado a cabo por la casa comercial, pero debe tenerse en cuenta que es posible que la información a este
respecto no sea accesible en su totalidad.
Como ejemplo de kit comercial validado por Farmacopea Europea expondremos brevemente la tecnología de
los productos de Minerva Biolabs (Berlín, Alemania), Venor®GeM. Se trata de kits de PCR que amplifican la
región codificante del ARNr 16S del genoma del micoplasma. La detección puede llevarse a cabo, bien me-
diante electroforesis en gel (kit de PCR convencional a punto final) o a tiempo real mediante sondas fluores-
centes (PCR a tiempo real). Incluyen, además, un control de amplificación interno y control positivo. Puesto
que detecta la presencia de ARN, no requiere la presencia de microorganismos viables. El kit contiene dUTP
en lugar de dTTP, para facilitar la degradación de los amplicones mediante el uso de uracil-ADN glicosilasas
(UNG), reduciendo la posibilidad de contaminación y falsos positivos. Las muestras deben recogerse cuando
los cultivos celulares alcancen una confluencia del 80-90%. El sobrenadante del cultivo es una muestra ade-
cuada que no requiere ninguna manipulación adicional. En caso de que se inhiba el proceso de amplificación
por presencia de sustancias indeseadas en el medio, puede llevarse a cabo una extracción de ADN previa.
Será necesaria una extracción de ADN cuando se utilicen muestras como vacunas, pellets celulares, suero
fetal bovino o muestras en parafina. De igual manera, para cumplir con los estándares de farmacopea, se
llevará a cabo previamente la extracción de ADN de la muestra. Los títulos de micoplasma en el medio de
cultivo suelen estar en torno a 10⁶ partículas por ml, con un máximo de 10⁸ partículas, lo que ofrece suficiente
cantidad de ADN en el sobrenadante para los límites de detección del método.
Los protocolos detallados de trabajo de los diferentes kits disponibles pueden consultarse en la página web
del fabricante (https://minerva-biolabs.com/en/mycoplasma-detection-kits).
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DOCUMENTO CIENTÍFICO
Por otro lado, también será necesario que el laboratorio compruebe la idoneidad del ensayo en los productos
a analizar, cada vez que se modifique el protocolo del ensayo y cuando se introduzcan productos nuevos en
el análisis. Las consideraciones generales para la validación de métodos alternativos, ventajas, inconvenien-
tes de cada técnica y usos potenciales de las mismas, se describen con detalle en la citada sección 5.1.6.
Como se ha mencionado anteriormente, hay otros ensayos que generalmente son llevados a cabo fuera del
ámbito del laboratorio de microbiología: análisis de endotoxinas, análisis de fenotipo mediante citometría de
flujo, de viabilidad, citogenético. En los apartados anteriores se ha descrito de forma minuciosa los métodos
más comúnmente utilizados para el control de esterilidad de los diferentes productos. En este apartado, se
hará mención a algunos procedimientos que, si bien no están al alcance de todos los laboratorios de mi-
crobiología, son en muchos casos necesarios para un correcto control de aquellos productos destinados a
terapias de más impacto clínico.
Entre los ensayos de identificación, destacan en la actualidad las técnicas basadas en la amplificación de
ácidos nucleicos (TAAN). Las técnicas de TAAN se basan en el uso de la reacción en cadena de la polimera-
sa (PCR), que conduce a un aumento exponencial de un fragmento del ácido nucleico, seleccionado previa-
mente, mediante el uso de iniciadores específicos. Se puede amplificar ADN o bien ARN, previa transcripción
del mismo a ADNc utilizando transcriptasa inversa (RT-PCR). Otras técnicas específicas para amplificar ARN
son NASBA (amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos) y TMA (amplificación mediada por
transcripción). La detección del producto amplificado puede realizarse por diferentes metodologías, como
hibridación por sondas fluorescentes, análisis del tamaño de fragmentos, de las secuencias, etc. Las TAAN
pueden ser técnicas cualitativas (indican presencia o ausencia), semicuantitativa o cuantitativa (estiman la
cantidad inicial de molécula diana). Para identificación/caracterización también puede analizarse la secuen-
cia de regiones específicas del genoma (ARNr 16S o 23S).
Algunas de las ventajas adicionales que presentan estos métodos son: escaso volumen de muestra nece-
sario para realizar el ensayo y una elevada sensibilidad y especificidad. Por otro lado, los procedimientos
son sensibles a la contaminación cruzada, por lo que habrá de extremar las condiciones de limpieza para
llevarlas a cabo, asegurando la completa eliminación de la presencia de fragmentos de ácidos nucleicos.
El papel de la biología molecular en el procedimiento que nos ocupa, también es extensible para demostrar
que un microorganismo aislado del producto examinado es idéntico a un microorganismo aislado del material o
del medio ambiente relacionado con el ensayo mediante tipado molecular basado en la homología ARN/ADN.
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DOCUMENTO CIENTÍFICO
6.2. ENDOTOXINAS
Las endotoxinas de bacterias Gram-negativas son la causa más frecuente de reacciones tóxicas debidas a
la contaminación de productos farmacéuticos con pirógenos. Su actividad pirógena es mucho mayor que la
de la mayoría de otras sustancias pirógenas. El ensayo de endotoxinas bacterianas (EEB) se utiliza para de-
tectar o cuantificar endotoxinas procedentes de bacterias Gram-negativas utilizando el lisado de amebocitos
del cangrejo de herradura (Limulus polyphemus o Tachypleus tridentatus). La presencia de endotoxinas en
un producto puede estar enmascarada por factores que interfieren con la reacción entre éstas y el lisado de
amebocitos por lo que se debe demostrar que el EEB es válido el producto considerado. Por lo tanto, esto
puede implicar la detección y eliminación de factores de interferencia por un procedimiento adecuado. El
EEB puede realizarse por tres técnicas: gelificación, turbidimetría y colorimetría. Un dato importante para la
realización de esta técnica, es el tipo de agua que se debe utilizar para preparar la composición de los reac-
tivos. Debe aplicarse la que se utiliza para realizar las preparaciones inyectables o, en su defecto, aquella
producida por otro procedimiento que no reaccione con el lisado utilizado en el límite de detección de la téc-
nica. La información necesaria se debe solicitar a los fabricantes que deben proporcionar todos los datos de
validación que se refieren a la aplicabilidad del EEB a las sustancias y formulaciones de interés. Estos datos
incluyen detalles de la preparación de la muestra y de cualquier procedimiento necesario para eliminar los
factores de interferencia. En las secciones 2.6.14 (ENDOTOXINAS BACTERIANAS) Y 5.1.10 (INDICACIO-
NES PARA LA APLICACIÓN DEL ENSAYO DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS) de la Real Farmacopea
Española, vienen desarrollados todos los aspectos relacionados con el EEB.
Actualmente existe en el mercado un método colorimétrico tipo point of care. Se trata de un sistema de ci-
nética cromogénica que mide la intensidad de color que está relacionada directamente con la concentración
de endotoxina en la muestra y es capaz de proporcionar resultados cuantitativos en 15 minutos. Emplea
reactivos LAL (lisado de amebocitos de Limulus) contenidos en cartuchos que contienen niveles exactos de
reactivo, sustrato cromogénico y control estándar de endotoxina; los cartuchos están aprobados por la FDA;
este equipo funciona con un software propio de la marca Charles River que permite la medición de la endo-
toxina. Existen cartuchos con diferentes niveles de sensibilidad (https://www.criver.com/products-services/
qc-microbial-solutions/endotoxin-testing/endotoxin-testing-systems/endosafe-nexgen-pts?region=3661).
Este apartado proporciona las indicaciones generales referentes a la seguridad viral de los medicamentos
cuya fabricación ha implicado el uso de materiales de origen humano o animal (Consultar sección 5.1.7 SE-
GURIDAD VIRAL de la Real Farmacopea Española).
El principio de la evaluación del riesgo, es considerar diversos factores que puedan influir en el nivel poten-
cial de partículas infecciosas en el medicamento y los factores relacionados con el uso del medicamento que
determinen o influyan en el riesgo viral para los pacientes.
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DOCUMENTO CIENTÍFICO
En el caso concreto de los MTA y para los productos derivados del plasma humano en la terapia alogénica, es
imperativo realizar la PCR frente a VIH, VHB y VHC, para el control de materia de partida. Así mismo, son de
aplicación ensayos para detectar contaminación viral general como técnicas de hemaglutinación y hemoad-
sorción.(https://ec.europa.eu/health/documents/community-register/2003/200312016445/anx_6445_es.pdf y
https://www.aemps.gob.es/laAEMPS/eventos/medicamentos-uso-humano/2010/docs/terapias-Avanzadas_
marzo-2010/ponencias/Estructura_Calidad_S.Rojo_M.Timon.pdf?x72238).
7. BIBLIOGRAFÍA
7.1.DOCUMENTOS DE CONSULTA
1. Boletín Oficial del Estado. Real Decreto 477/2014, de 13 de junio, por el que se regula la autorización de medicamen-
tos de terapia avanzada de fabricación no industrial. BOE núm. 144 de 14/06/2014
2. Directrices sobre normas de correcta fabricación específicas para Medicamentos de Terapia Avanzada. Ministerio de
Sanidad, Consumo y Bienestar Social. Agencia española de medicamentos y productos sanitarios. https://www.aemps.
gob.es/industria/inspeccionNCF/guiaNCF/docs/normas-co-rrecta-fabricacion/nueva-guia-NCF-ATMPs.pdf
3. Directriz Q5A de la Conferencia Internacional sobre Armonización (ICH): Evaluación de la Seguridad Viral de los
Productos Obtenidos por Biotecnología y Procedentes de Líneas Celulares de Origen Humano o Animal https://ec.europa.
eu/health/documents/community-register/2003/200312016445/anx_6445_es.pdf
4. Guía de Buenas Prácticas de Preparación de medicamentos en Servicios de Farmacia Hospitalaria. Dirección Gene-
ral de Cartera Básica del Servicios del SNS y Farmacia. Ministerio de Sanidad, Consumo y Bienestar Social.
5. Guía de Normas de Correcta Fabricación de Medicamentos de Uso Humano y Veterinario. Anexo I: Fabricación de
Medicamentos Estériles. Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios (AEMPS). Ministerio de Sanidad,
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6. Guías PIC/S Guide to Good Manufacturing Practice for Medicinal Products. https://picscheme.org/en/publications
7. Guide to Good Manufacturing Practice for Medical Products. Part I and Part II. Pharmaceutical Inspection Convention.
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8. Guide to the Quality and Safety of Tissues and Cells for Human Application. 4thedition.
9. Note for Guidance on the Warning on Transmissible Agents in Summary of Product Characteristics (Spcs) and Pac-
kage Leaflets for Plasma-Derived Medicinal Products (CPMP/BPWG/BWP/561703). https://www.ema.europa.eu/en/docu-
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leaflets/bpwg/bwp/561/03_en.pdf
10. Real Farmacopea Española 5ª edición. https://extranet.boe.es/index.php?referer=/farmacopea/index.php.Reglamen-
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pia Avanzada y por el que se modifican La Directiva 2001/83/CE y El Reglamento (CE) no 726/2004 https://www.boe.es/
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7.2. REFERENCIAS
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DOCUMENTO TÉCNICO
PNT-CE-01
Servicio / Unidad de Microbiología
Control de esterilidad de productos farmacéuticos
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PNT-CE-01
Control de esterilidad de productos farmacéuticos
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DOCUMENTO TÉCNICO
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1. PROPÓSITO Y ALCANCE
El objetivo del presente documento es describir el procesamiento para el control de la esterilidad de pro-
ductos farmacéuticos elaborados en los Servicios de Farmacia Hospitalaria. Este ensayo se aplica a las
sustancias, preparaciones o artículos que, según la farmacopea, deben ser estériles. Incluye el estudio de
esterilidad de los medios de cultivo, el ensayo de fertilidad de dichos medios y el ensayo de idoneidad del
método, que deben realizarse previamente al ensayo de esterilidad del producto farmacéutico a examinar.
2. FUNDAMENTO
El ensayo de esterilidad se aplicará a aquellas sustancias, preparaciones o artículos que según la farma-
copea deben ser estériles. El objetivo del ensayo de esterilidad es proporcionar un control independiente
para comprobar que un producto cumple con las exigencias de la Real Farmacopea Española (sección
2.6.1 ESTERILIDAD). Para llevarlo a cabo es necesario realizar previamente un control de los medios de
cultivo para comprobar su esterilidad y propiedades nutritivas, además de un ensayo de idoneidad del mé-
todo, que nos permitirá demostrar que el método microbiológico elegido para cada producto es adecuado,
permitiendo el crecimiento de microorganismos patrón en nuestro producto y usando los medios de cultivo
indicados.
3. DOCUMENTOS DE CONSULTA
- Guías PIC/S Guide to Good Manufacturing Practice for Medicinal Products
4. MUESTRAS
El volante de petición, o la petición electrónica que acompaña a cada muestra, debe ser correctamente
cumplimentado y en él deberán constar claramente:
- Datos demográficos y de la muestra (fecha de obtención de la muestra, tipo de producto, fecha de
preparación, número de lote y similares), servicio de procedencia y datos del farmacéutico que realiza
la petición.
- Es recomendable aportar información sobre la matriz de riesgo (elaborada por el Servicio de Farmacia
al realizar la evaluación de los riesgos de las preparaciones).
- Determinaciones microbiológicas solicitadas
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- Las muestras se recogerán en el lugar de preparación de los diferentes productos farmacéuticos (salas blan-
cas o de ambiente controlado). Las Farmacias Hospitalarias enviarán el producto a estudio inoculado en los
medios de cultivo proporcionados por los laboratorios de Microbiología.
- Para realizar el control de esterilidad, el número mínimo de unidades a examinar depende del tamaño del lote.
Como es evidente, es imposible realizar un análisis de cada uno de los envases que forman parte de un lote, por
lo que es necesario diseñar un plan de muestreo apropiado. Por este motivo se seleccionará un número deter-
minado de unidades basándonos en la hipótesis de que el análisis del contenido de todos los envases del lote
darán el mismo resultado. En el caso de producción en condiciones asépticas, se recomienda examinar mues-
tras introducidas en los envases al principio y al final del lote y después de cualquier intervención significativa.
En la Tabla 1 se resumen el número mínimo de unidades a examinar según el tamaño del lote, atendiendo a las
recomendaciones de la Real Farmacopea Española.
Tabla 1.- Número mínimo de unidades a examinar según el tamaño del lote
Por otra parte, según las recomendaciones de la Guía de Buenas Prácticas de Preparación de Medicamentos
en Servicios de Farmacia Hospitalaria (https://www.sefh.es/sefhpdfs/GuiaBPP_JUNIO_2014_VF.pdf), se debe
realizar un control microbiológico en todas aquellas preparaciones estériles compuestas por más de 25 unida-
des por lote. Este control se realizará una vez finalizada la preparación, pero antes de la liberación del lote.
El control microbiológico de esterilidad se realizará siempre tras la producción de un nuevo lote siguiendo las
recomendaciones de muestro descritas anteriormente.
El transporte de los medios de cultivo ya inoculados se realizará de forma inmediata en contenedores de trans-
porte adecuado y a temperatura ambiente.
En general, las muestras se deben recibir en el laboratorio dentro de las 2 horas siguientes tras su recogida. Si
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no se pueden lograr estos tiempos para el transporte, las muestras pueden mantenerse a temperatura ambiente
no más de 24 horas. Es importante enviar las muestras lo antes posible para su inmediata incubación, ya que
no pueden conservarse en refrigeración.
Los contenedores con medio líquido se sellarán con film de plástico para evitar contaminaciones durante su
traslado. Las muestras se enviarán al laboratorio de Microbiología perfectamente identificadas y se registrarán
en el SIL para garantizar la trazabilidad dentro del laboratorio.
Cepas patrón necesarias para el ensayo de fertilidad del medio y el ensayo de idoneidad del método
- Bacterias aerobias
Staphylococcus aureus ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10788, NCIMB 9518, NBRC 13276
Bacillus subtilis ATCC 6633, CIP 52.62, NCIMB 8054, NBRC 3134
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275
- Bacterias anaerobias
Clostridium sporogenes ATCC 19404, CIP 79.3, NCTC 532, ATCC 11437, NBRC 14293
- Hongos
Candida albicans ATCC 10231, IP 48.72, NCPF 3179, NBRC 1594
Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, IP 1431.83, IMI 149007, NBRC 9455
Existen comercializadas cepas de referencia calibradas que consisten en bolas hidrosolubles que contie-
nen el número preciso de microorganismos necesarios para llevar a cabo los ensayos.
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6. APARATOS Y MATERIALES
7. PROCESAMIENTO
Los medios de cultivo utilizados deben satisfacer los siguientes ensayos, efectuados antes del análisis del
producto a examinar o en paralelo.
7.1. ESTERILIDAD
- Incubar muestras de los medios de cultivo durante 14 días. No se debe observar proliferación de microor-
ganismos.
- Deberá efectuarse en ambos medios (caldo tioglicolato a 30-35ºC y caldo de hidrolizado de caseína y soja
a 20-25ºC).
- Analizar cada lote de medio, ya sea adquirido listo para usar o preparado a partir de un medio deshidratado
o de sus componentes. Las cepas de microorganismos adecuadas se indican en el punto 5.2 de este docu-
mento.
- Inocular muestras del caldo tioglicolato con un pequeño número (como máximo 100 UFC) de los siguientes
microorganismos, utilizando una muestra diferente para cada una de las siguientes bacterias: Clostridium
sporogenes, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus. Incubar en aerobiosis a 30-35ºC.
- Inocular muestras del medio con hidrolizado de caseína y de soja con un pequeño número (como máximo
100 UFC) de los siguientes microorganismos, utilizando una muestra diferente para cada uno de los siguien-
tes microorganismos: Aspergillus brasiliensis, Bacillus subtilis, Candida albicans. Incubar los medios sembra-
dos con bacterias durante como máximo 3 días y los medios sembrados con hongos durante como máximo
5 días. Incubar en aerobiosis a 20-25ºC.
El objetivo es comprobar que el producto es capaz de soportar el crecimiento de las cepas patrón. El test
de idoneidad, consiste en realizar la misma metodología del ensayo de esterilidad del producto (ver punto
7.4 de este documento) con las siguientes modificaciones según la metodología utilizada:
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a.Filtración a través de una membrana. Transferir el contenido a analizar a una membrana filtrante; des-
pués añadir un inóculo que contenga como máximo 100 UFC a la porción final del diluyente estéril utilizado
para enjuagar el filtro.
b.Siembra directa. Después de transferir el contenido de uno o varios envases del producto a estudiar al
medio de cultivo, añadir un inóculo que contenga como máximo 100 UFC.
En ambos casos, utilizar los microorganismos descritos anteriormente en el ensayo de fertilidad del medio
(apartado 7.2) para bacterias aerobias, anaerobias, y hongos. Realizar un ensayo de fertilidad que sirva de
control positivo. Incubar los recipientes con los medios durante como máximo 5 días.
Si después de la incubación se observa una proliferación de los microorganismos inoculados (cepas pa-
trón) evidente y comparable a la observada en el recipiente de control sin producto, se considera que el pro-
ducto no tiene actividad antimicrobiana en las condiciones del ensayo o que dicha actividad se ha eliminado
satisfactoriamente. El ensayo de esterilidad puede realizarse entonces sin otra modificación.
Por el contrario, si en presencia del producto a examinar no se observa una proliferación evidente y visual-
mente comparable a la observada en el recipiente de control sin producto, se considera que el producto
tiene una actividad antimicrobiana que no se ha eliminado satisfactoriamente en las condiciones del ensa-
yo. Modificar las condiciones para eliminar la actividad antimicrobiana y repetir el ensayo de idoneidad del
método.
Puede utilizarse la técnica de filtración a través de una membrana o de siembra directa del producto a exa-
minar en el medio de cultivo. En ambos casos se incluyen controles negativos apropiados. La técnica de
filtración a través de una membrana se utiliza siempre que la naturaleza del producto lo permita, es decir,
para preparaciones acuosas filtrables, preparaciones alcohólicas u oleosas y preparaciones miscibles o so-
lubles en disolventes acuosos u oleosos, siempre que estos disolventes no tengan un efecto antimicrobiano
en las condiciones del ensayo.
El contenido a examinar puede ser transferido a una o varias membranas, pero utilizando siempre como
mínimo las cantidades de producto a examinar prescritas en la Tabla 2:
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Tabla 2.- Cantidades de producto a utilizar para cada medio en el ensayo de esterilidad
Cantidad por envase Cantidad mínima que se ha de utilizar para
cada medio, salvo excepción justificada y
autorizada
LÍQUIDOS
Menos de 1 mL El contenido total de cada envase
1-40 mL La mitad del contenido de cada envase, pero como
mínimo 1 mL
Más de 40 mL pero no más de 100 mL 20 mL
Más de 100 mL El 10% del contenido del envase, pero como mínimo
20 mL
Líquidos antibióticos 1 mL
Preparaciones insolubles, cremas y pomadas que Utilizar el contenido de cada envase de modo que
deben ponerse en suspensión o emulsionarse se obtengan como mínimo 200 mg
SÓLIDOS
Menos de 50 mg El contenido total de cada envase
50 mg o más pero menos de 300 mg La mitad del contenido de cada envase, pero como
mínimo 50 mg
De 300 mg a 5 g 150 mg
Más de 5 g 500 mg
Catgut y otros hilos de sutura para uso veterinario 3 segmentos de hilo (cada uno de 30 cm de largo)
Cuando el contenido de un solo envase no sea suficiente para realizar estos ensayos, se puede utilizar el
contenido de ≥2 envases para sembrar los distintos medios.
El filtro de membrana es entonces transferido a TSB a 20 a 25°C y caldo de tioglicolato a 30 a 35°C durante
al menos 14 días. Si se ha utilizado una sola membrana, ésta puede ser cortada asépticamente en dos
partes iguales y transferirlos a los medios de cultivo.
Líquidos oleosos: emplear medios suplementados con un emulsionante apropiado en concentración ade-
cuada, determinada en el ensayo de idoneidad del método (ejemplo polisorbato 80).
Pomadas y cremas: preparar dilución de aproximadamente 1/10 emulsionando con el emulsionante selec-
cionado en un diluyente estéril adecuado, por ejemplo, una disolución neutra de 1 g/L de peptona de carne
o de caseína. Transferir el producto diluido a un medio que no contenga emulsionante.
Incubar los medios sembrados durante como mínimo 14 días. Observar los cultivos varias veces durante el
periodo de incubación. Agitar suavemente cada día los medios que contengan productos oleosos. No obs-
tante, si se utiliza el medio líquido con tioglicolato para la detección de microorganismos anaerobios, reducir
la agitación todo lo posible con el fin de mantener las condiciones anaeróbicas.
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Los cultivos se examinarán diariamente hasta completar los 14 días de incubación. Si el producto a exami-
nar enturbia el medio de modo que la presencia o ausencia de proliferación microbiana no puede evaluarse
visualmente, 14 días después del comienzo de la incubación, transferir muestras del medio (cada una como
mínimo de 1 mL) a otros recipientes que contengan el mismo medio fresco e incubar a continuación los
recipientes iniciales y los nuevos durante como mínimo 4 días.
Si a los 14 días no se observa turbidez en el medio el producto analizado satisface el ensayo de esterilidad.
Por el contrario, si en este periodo se detecta turbidez en el medio se realizará un subcultivo en medios
sólidos generales (por ejemplo, agar sangre o agar chocolate) y diferenciales que se incubarán durante
48-72 horas. Las colonias de bacterias y/o hongos recuperadas de estos medios se identificarán a nivel
de especie mediante las técnicas microbiológicas rutinarias (por ejemplo, MALDI-TOF). En este caso el
producto no satisface el ensayo de esterilidad y el cultivo se debe informar como positivo indicando la es-
pecie o especies identificadas. No es necesaria la realización rutinaria de antibiogramas de las especies
recuperadas de estos cultivos.
Ante un ensayo de esterilidad en el que se observa proliferación microbiana, habría que considerar revisar
los siguientes puntos:
a) Los resultados del control microbiológico de las instalaciones donde se realizan los ensayos de esterili-
dad no son satisfactorios
b) La evaluación del procedimiento experimental utilizado para efectuar el ensayo en cuestión pone de
manifiesto algún problema.
c) Se observa proliferación microbiana en los controles negativos
d) Después de la identificación de los microorganismos aislados en el ensayo, el crecimiento de esta o
estas especies puede atribuirse inequívocamente a problemas relacionados con los materiales y/o las téc-
nicas utilizados en el ensayo de esterilidad.
Cuando el ensayo se declara inválido, se debe repetir con el mismo número de unidades que se utilizaron
en el ensayo inicial. Si en este caso en el ensayo de esterilidad no se detecta crecimiento bacteriano se
considera que el producto satisface el ensayo de esterilidad. Por el contrario, si en la repetición del ensayo
se vuelve a detectar crecimiento microbiano, el producto a examinar no satisface el ensayo de esterilidad.
Los resultados obtenidos para cada muestra se introducirán en el programa informático y serán validados
por el facultativo responsable.
9. RESPONSABILIDADES
Deben estar descritas en el manual general de organización del laboratorio de Microbiología y en las fichas
de descripción de los puestos de trabajo.
- El personal técnico es responsable de la realización de los procedimientos microbiológicos de identifica-
ción, así como del registro de resultados.
- El personal facultativo es responsable de la supervisión de la técnica, supervisión de la lectura de los cul-
tivos y determinación de los microorganismos a valorar, así como de la supervisión del trabajo del personal
técnico, comunicación de los resultados preliminares, validación de los resultados preliminares y definitivos
y firma de los informes.
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En las preparaciones estériles todo crecimiento microbiano debe ser investigado y documentado en un
informe de desviaciones por escrito. Los registros de trabajo han de conservarse un periodo de tiempo su-
ficiente que satisfaga los requisitos legales. En cualquier caso, los registros se deben conservar al menos
un año tras la fecha de caducidad del producto terminado. Los procedimientos y las instrucciones de trabajo
(incluidas las prescripciones) deben conservarse al menos durante cinco años tras su empleo.
Los documentos en que se detalle el trabajo realizado (cuadernos, hojas de cálculo), informes parciales,
finales y la información que se genere a partir de los datos brutos, debe quedar igualmente archivada y
accesible.
Todo el personal que participe en alguna fase del proceso, debe quedar debidamente identificado y regis-
trado, respetando en todo caso la ley de protección de datos mediante el sistema de codificación que se
acuerde (firmas, iniciales).
12. BIBLIOGRAFÍA
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terapia celular y derivados hematopoyéticos
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terapia celular y derivados hematopoyéticos
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1. PROPÓSITO Y ALCANCE
Describir el procedimiento para llevar a cabo el control microbiológico (bacterias y hongos) de los productos
celulares que se procesan en salas blancas hospitalarias (productos de terapia celular y derivados hema-
topoyéticos).
2. FUNDAMENTO
Los derivados hematopoyéticos y los medicamentos de terapia celular son productos habitualmente procesa-
dos en las salas blancas de los recintos hospitalarios, y que requieren de un estricto control de esterilidad antes
de administrarlos a los pacientes. Los productos de terapia celular son preparados celulares obtenidos me-
diante cultivo y modificación de células de médula ósea, sangre periférica y cordón umbilical, principalmente.
Durante estos procedimientos puede producirse la contaminación bacteriana y fúngica de los preparados ce-
lulares, por lo que resulta imprescindible llevar a cabo un control de la esterilidad de los mismos antes de su libe-
ración para administrarlos a pacientes. En este documento se describen las técnicas para realizar los ensayos
englobados en el llamado "control microbiológico de productos celulares" (sección 2.6.27 de la Farmacopea).
3. DOCUMENTOS DE CONSULTA
- Capítulo 2.6.27 CONTROL MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTOS CELULARES de la Real Farmaco-
pea Española . https://extranet.boe.es/farmacopea/
4. MUESTRAS
El volante de petición, o la petición electrónica que acompaña a cada muestra, debe ser correctamente
cumplimentado y en él deberán constar claramente:
- Datos demográficos y de la muestra (fecha de obtención de la muestra, tipo de producto, fecha de prepa-
ración, número de lote y similares), servicio de procedencia y datos del facultativo que realiza la petición.
- Determinaciones microbiológicas solicitadas.
Las muestras deben ser representativas de los derivados terapéuticos fabricados (células madre u otros).
Se acepta el cultivo de soluciones de cultivo, lavado o transporte, cuando esté indicado. Los ensayos se
realizan en diferentes fases del proceso de producción:
- Ensayo de esterilidad durante la producción: se inocularán los medios de cultivo con una muestra
representativa del cultivo o cultivos celulares según se defina en el análisis de riesgos y puntos críti-
cos de cada producto. La finalidad de este ensayo es conocer el resultado antes de la liberación del
producto.
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- Ensayo de esterilidad en el producto terminado: para controlar una posible contaminación al final
del procedimiento, es aceptable realizar un cribado con técnicas rápidas (tinciones) dirigidas a de-
tectar la presencia de hongos y bacterias. Puesto que los productos de terapia celular son de vida
media corta, el resultado no se obtendrá antes de la liberación del producto. La certificación y libe-
ración del medicamento puede hacerse en 2 fases, antes y después de obtener los resultados de
todos los ensayos.
El personal de producción de las salas será el responsable de tomar las muestras y entregarlas al res-
ponsable de control de calidad para la realización del ensayo. Utilizando material estéril, se inocularán los
medios de cultivo adecuados para la detección de bacterias y hongos. En la actualidad, se recomienda el
uso de dos frascos de hemocultivo, uno anaerobio y otro aerobio, que se procesarán en incubadores de
lectura automatizada. Si el volumen de muestra disponible no es suficiente para inocular adecuadamente
ambos frascos de hemocultivo, se inoculará primero el frasco aerobio con la cantidad necesaria y el resto
se utilizará para el cultivo en frasco de anaerobiosis. La utilización de frascos pediátricos es preferible para
el cultivo de volúmenes de muestra inferiores a 5 ml, por lo que se recomienda utilizarlos en lugar de los
frascos aerobios estándar.
Para los productos hematopoyéticos la cantidad mínima de producto a analizar en función del volumen
final del producto es la que sigue:
En caso de que requieran dilución antes de la congelación, debe aumentarse el volumen del inóculo se-
gún el factor de dilución. Para otros productos celulares, las cantidades mínimas adecuadas se definen
en términos de volumen o de número de dosis con un volumen mínimo aconsejable de 1 ml por frasco.
Volúmenes inferiores deben justificarse y validarse previamente.
Adicionalmente se entregará una muestra de producto final en recipiente estéril para realizar tinciones de
bacterias y hongos directas. Este procedimiento permite una liberación temprana del lote en los productos
de vida media corta. El responsable del procedimiento debe asegurarse de la correcta identificación de los
frascos y recipientes con muestras.
Todos los lotes de producto fabricado en las salas de producción deben someterse a los controles de ca-
lidad, pudiendo llevarse a cabo en el mismo centro o en laboratorios de referencia. En cualquier caso, se
seguirá el plan de calidad establecido en el centro de producción.
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Cepas patrón necesarias para el ensayo de promoción del crecimiento y el ensayo de idoneidad del méto-
do: ver tablas en los puntos 7. 2 y 7. 3.
Existen comercializadas cepas de referencia calibradas que consisten en bolas hidrosolubles que contie-
nen el número preciso de microorganismos necesarios para llevar a cabo los ensayos.
6. APARATOS Y MATERIALES
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7. PROCESAMIENTO
Los medios de cultivo utilizados deben satisfacer los siguientes ensayos, efectuados antes del análisis del
producto a examinar o en paralelo.
La esterilidad de cada lote del medio se lleva a cabo incubando a 35-37ºC un frasco aerobio y otro anaerobio
durante al menos 7 días en el incubador automatizado. En el caso de usar otros medios líquidos hay que
incubar muestras de los mismos durante 14 días. No se debe observar proliferación de microorganismos.
Deberá efectuarse con ambos medios (caldo tioglicolato a 30-35ºC y caldo de hidrolizado de caseína y soja
a 20-25ºC).
Utilizar un mínimo de 2 medios de cultivo enriquecidos adecuados para la detección de bacterias aerobias,
anaerobias y hongos. Son adecuados los medios para hemocultivo. Sembrar entre 10-100 microorganismos
de cada una de las cepas de referencia (ver tabla 1) e incubar a 35-37ºC durante 7 días en incubador automati-
zado (medios de hemocultivo) o durante 14 días (caldo tioglicolato a 30-35ºC y caldo de hidrolizado de caseína
y soja a 20-25ºC), si se realiza inspección visual de los medios. El ensayo será satisfactorio si se obtiene cre-
cimiento en todos los frascos o medios sembrados.
Tabla 1.- Cepas patrón utilizadas para realizar el ensayo de promoción del crecimiento
Medio aerobio
Staphylococcus aureus ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10788, NCIMB 9518
Bacillus subtilis ATCC 6633, CIP 52.62, NCIMB 8054
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118
Candida albicans ATCC 10231, IP 48.72, NCPF 3179
Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, IP 1431.83, IMI 149007
Medio anaerobio
Clostridium sporogenes ATCC 19404, CIP 79.3, NCTC 532 o ATCC 11437
Bacteroides fragilis ATCC 25285, CIP 77.16, NCTC 9343
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terapia celular y derivados hematopoyéticos
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Tabla 2.- Cepas patrón para realizar el ensayo de idoneidad del método
Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, IP 1431.83, IMI 149007
Clostridium sporogenes ATCC 19404, CIP 79.3, NCTC 532 o ATCC 11437
Staphylococcus aureus ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10788, NCIMB 9518
En función del origen de las células y de otros factores, como unos resultados de cultivos anteriores positi-
vos, puede ser necesario modificar el listado de microorganismos patrón a ensayar.
Se aconseja el uso de frascos de hemocultivo para sistemas de monitorización continua, frente a medios
líquidos de inspección visual, ya que los primeros pueden disminuir el tiempo de detección a<=7 días en
lugar de los 14 necesarios utilizando medios sin lectura automatizada (USP 1071https://doi.usp.org/USP-
NF/USPNF_M12457_02_01.html). Los frascos contienen caldo digerido de soja y caseína enriquecido. Los
protocolos de incubación son los siguientes, en función del medio utilizado:
Si se realiza el test utilizando medios de cultivo sin lectura automatizada, efectuar la inspección visual de
turbidez del medio diariamente. Para el subcultivo de frascos marcados como positivos o medios líquidos
donde se observe turbidez, se utilizarán medios sólidos adecuados, enriquecidos y/o diferenciales (agar
sangre, agar chocolate, MacConkey). Las muestras para tinciones de hongos y bacterias (liberación urgen-
te de productos de terapia celular) se procesarán según el protocolo general de las tinciones elegidas. Se
recomienda la tinción de Gram para el despistaje de bacterias y la tinción de calcoflúor para hongos.
Los resultados de las tinciones se informarán cuando estén disponibles indicando si se observan formas
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9. RESPONSABILIDADES
- Deben estar descritas en el manual general de organización del laboratorio de Microbiología y en las fi-
chas de descripción de los puestos de trabajo.
- El personal técnico es responsable de la realización de los procedimientos microbiológicos de identifica-
ción, así como del registro de resultados.
- El personal facultativo es responsable de la supervisión de la técnica, supervisión de la lectura de los cul-
tivos y determinación de los microorganismos a valorar, así como de la supervisión del trabajo del personal
técnico, comunicación de los resultados preliminares, validación de los resultados preliminares y definitivos
y firma de los informes.
- El proceso de recogida de la muestra es responsabilidad del servicio solicitante.
- Es responsabilidad del laboratorio de Microbiología poner a disposición de las áreas clínicas, donde habi-
tualmente se recogen las muestras, los medios de cultivo y otros materiales para su inoculación y transpor-
te, así como informar del modo de conservación de los medios de cultivo.
Un resultado satisfactorio en el ensayo de esterilidad de un producto celular solo significa que no se han
encontrado microorganismos en la muestra examinada en las condiciones del ensayo.
11.ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO
Los centros están obligados a mantener un sistema de trazabilidad de todos los productos, incluidas las
materias primas que se han utilizado y cualquier material que haya estado en contacto con los productos
celulares. El centro hospitalario debe conservar los datos durante un periodo de tiempo de 30 años tras la
fecha de caducidad del producto. La farmacovigilancia también será responsabilidad del hospital que tiene
la autorización de uso y deberán hacer informes periódicos de seguridad a la AEMPS (Agencia Española
de Medicamentos y Productos Sanitarios).
Todo el personal que participe en alguna fase del proceso, debe quedar debidamente identificado y registrado,
respetando en todo caso la ley de protección de datos mediante el sistema de codificación que se acuerde
(firmas, iniciales).
12. BIBLIOGRAFÍA
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Servicio / Unidad de Microbiología Control de Mycoplasma spp. en los
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Control de Mycoplasma spp. en los
preparados de terapia celular
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preparados de terapia celular
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1. PROPÓSITO Y ALCANCE
Describir el procedimiento para llevar a cabo el control de la contaminación con Mycoplasma spp. de los pre-
parados para terapia celular que se producen en salas blancas hospitalarias.
2. FUNDAMENTO
La contaminación por micoplasmas de los cultivos celulares es un problema relativamente frecuente y sub-
estimado debido a la dificultad de su detección. Las propiedades de las células se ven afectadas por estos
microorganismos, por lo que resulta imprescindible llevar a cabo procedimientos para detectar su presencia
en los cultivos antes de liberar los productos para su uso en terapia celular.
3. DOCUMENTOS DE CONSULTA
4. MUESTRAS
El volante de petición, o la petición electrónica que acompaña a cada muestra, debe ser correctamente
cumplimentado y en él deberán constar claramente:
- Datos demográficos y de la muestra (fecha de obtención de la muestra, tipo de producto, fecha de prepa-
ración, número de lote y similares), servicio de procedencia y datos del facultativo que realiza la petición.
- Determinaciones microbiológicas solicitadas.
Las muestras deben ser representativas de los derivados terapéuticos fabricados (células madre u otros).
Todos los productos de terapia celular en fase final, previamente a su liberación, deben ser sometidos al
ensayo de detección de micoplasmas. El personal de producción de las salas será el responsable de tomar
las muestras, introducirlas en un recipiente estéril y entregarlas al responsable de control de calidad para
la realización del ensayo.
Todos los lotes de productos celulares fabricados en las salas de producción deben someterse a los con-
troles de detección de Mycoplasma spp. antes de su liberación.
Las muestras serán transportadas al laboratorio de Microbiología en recipiente estéril a temperatura am-
biente a la mayor brevedad posible. Es recomendable avisar al responsable del laboratorio de Microbiología
de la hora prevista de entrega de las muestras para evitar la demora del procedimiento.
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Las muestras serán transportadas al laboratorio de Microbiología en recipiente estéril a temperatura am-
biente a la mayor brevedad posible. Es recomendable avisar al responsable del laboratorio de Microbiología
de la hora prevista de entrega de las muestras para evitar la demora del procedimiento.
- Medios para cultivo de micoplasmas: medio Hyflick, medio Friis, medio Frey.
Cepas patrón necesarias para el ensayo de promoción del crecimiento y el ensayo de idoneidad del méto-
do: ver tabla en el punto 7.
6. APARATOS Y MATERIALES
- Termocicladores
- Cubetas de electroforesis
7. PROCESAMIENTO
El ensayo para la detección de micoplasmas puede realizarse por diferentes técnicas basadas en el cultivo
o en la amplificación de ácidos nucleicos.
Tabla 1.- Cepas patrón utilizadas en el método mediante cultivo para detección de Mycoplasma spp.
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A) Propiedades nutritivas
Se realizará el ensayo para determinar las propiedades nutritivas en cada nuevo lote de medio. Para ello,
hay que sembrar en los medios elegidos las cepas patrón, utilizando como máximo 100 UFC por placa de
60 mm de diámetro que contenga 9 mL de medio sólido y por envase de 100 mL de medio líquido. Para
cada especie de microorganismos se utilizará una placa y envase distinto. Incubar los medios y realizar
subcultivos desde 0,2 mL de medio líquido hasta el medio sólido a intervalos específicos según se describe
en el siguiente apartado B) “ensayo para la detección de micoplasmas en el producto a examinar”. El medio
sólido satisface el ensayo si se observa crecimiento adecuado para cada microorganismo de ensayo (el
crecimiento obtenido no difiere en un factor superior a 5 del valor calculado para el inóculo). El medio líqui-
do satisface el ensayo si se observa crecimiento sobre placas de agar-agar subcultivadas en el caldo en al
menos 1 subcultivo de cada microorganismo de ensayo.
Los medios de cultivo recomendados en la Farmacopea Europea son: medio Hayflick (recomendado para
la detección de micoplasmas en general), medio Frey (recomendado para la detección de M. synoviae) y
medio Friis (micoplasmas no aviares). Se sembrarán las muestras a examinar en medios de cultivo líquidos
y sólidos. Sembrar 10 mL del producto a examinar en 100 mL del medio de cultivo líquido. Si el pH del medio
cambia significativamente, se restablece por adición de una solución de hidróxido de sodio o de ácido clor-
hídrico. Sembrar 0,2 mL del producto a examinar en las placas de medio sólido. Como controles negativos
se utilizarán placas de medio sólido y un volumen de 100 mL del medio líquido y sin inocular. Incubar los
medios líquidos en envases herméticos a 35-38°C y los medios sólidos en microaerofilia a 35-38°C. Incubar
los medios líquidos durante 21 días. Entre los días 2-4 después de la siembra, realizar un subcultivo de
cada medio líquido sembrando 0,2 mL en al menos 1 placa de cada medio sólido con el fin de tener más
de un pase por si se produjera contaminación por otros microrganismos. Repetir el procedimiento entre los
días 6º y 8º, entre los días 13º y 15º y, finalmente, entre los días 19º y 21º del ensayo. Todos los medios
sólidos se incuban durante 14 días, excepto los del último subcultivo (días 19-21), que se incubarán 7 días.
Incluir en el ensayo controles positivos sembrando como máximo 100 UFC de al menos 1 microorganismo
de ensayo en medio sólido o medio líquido. Se recomienda usar los microorganismos de ensayo en rota-
ciones regulares.
Este método requiere realizar cultivos celulares de micoplasmas, por lo que queda restringido a laboratorios
especializados. Brevemente, consiste en teñir los cultivos celulares con un colorante fluorescente que se
une al ADN. Los micoplasmas se detectan por el aspecto característico en partículas o en filamentos, de
la fluorescencia observada en la superficie de las células. Se utilizan células Vero u otras con capacidad
similar para el cultivo de micoplasmas. Los procedimientos específicos están disponibles para su consulta
en la sección 2.6.7 de la Real Farmacopea Española.
Las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos pueden aplicarse en lugar del método por cultivo y el
método por cultivo de células indicadoras y cuando así lo indique la monografía. La PCR es un método
sensible y específico para detectar la presencia de ADN de micoplasmas (no necesariamente micoplas-
mas viables) en el sobrenadante de los cultivos celulares. Es necesario, como en otros casos, llevar a
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cabo la validación del método antes de ponerlo en marcha o bien adquirir un kit comercial validado según
Farmacopea Europea (los detalles de la metodología pueden consultarse en la sección 2.6.7 MICOPLAS-
MAS de la Real Farmacopea Española). Cuando se utilice un kit comercial, ciertas partes de la validación
pueden haberse llevado a cabo por la casa comercial, pero debe tenerse en cuenta que es posible que la
información a este respecto no sea accesible en su totalidad. En la actualidad, es frecuente el uso de kits
comerciales que detectan la región codificante del ARNr 16S del genoma de los micoplasmas. Existen en el
mercado variantes de PCR a tiempo real o PCR convencional, validadas según farmacopea para muestras
de cultivos celulares, siempre que se realice previamente una extracción del ADN. Como ejemplo de kits
validados pueden consultarse los detalles en la página web del fabricante (https://minerva-biolabs.com/en/
mycoplasma-detection-kits).
En el método mediante cultivo, observar los medios líquidos cada 2-3 días y si se advierte un cambio de co-
lor realizar un subcultivo a medio sólido. El ensayo es válido si se puede leer al menos 1 placa por medio y
por día de siembra. Examinar al microscopio los medios sólidos una vez concluido el periodo de incubación.
El producto satisface el ensayo si no se observa crecimiento de colonias compatibles con micoplasmas.
Si un medio líquido presenta contaminación bacteriana o fúngica, el ensayo no es válido. Tampoco es váli-
do si uno o más de los controles positivos no presentan crecimiento de micoplasmas en al menos una placa
de subcultivo. El ensayo no es válido si uno o más de los controles negativos presentan crecimiento de
micoplasmas. Si se observan colonias sospechosas, se debe realizar la identificación por una metodología
previamente validada.
9. RESPONSABILIDADES
- Deben estar descritas en el manual general de organización del laboratorio de Microbiología y en las fi-
chas de descripción de los puestos de trabajo.
- El personal técnico es responsable de la realización de los procedimientos microbiológicos de identifica-
ción, así como del registro de resultados.
- El personal facultativo es responsable de la supervisión de la técnica, supervisión de la lectura de los cul-
tivos y determinación de los microorganismos a valorar, así como de la supervisión del trabajo del personal
técnico, comunicación de los resultados preliminares, validación de los resultados preliminares y definitivos
y firma de los informes.
- El proceso de recogida de la muestra es responsabilidad del servicio solicitante.
- Es responsabilidad del laboratorio de Microbiología poner a disposición de las áreas clínicas, donde habi-
tualmente se recogen las muestras, los medios de cultivo y otros materiales para su inoculación y transpor-
te, así como informar del modo de conservación de los medios de cultivo.
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Los centros están obligados a mantener un sistema de trazabilidad de todos los productos, incluidas las
materias primas que se han utilizado y cualquier material que haya estado en contacto con los productos
celulares. El centro hospitalario debe conservar los datos durante un periodo de tiempo de 30 años tras la
fecha de caducidad del producto. La farmacovigilancia también será responsabilidad del hospital que tiene
la autorización de uso y deberán hacer informes periódicos de seguridad a la AEMPS (Agencia Española
de Medicamentos y Productos Sanitarios).
Todo el personal que participe en alguna fase del proceso, debe quedar debidamente identificado y regis-
trado, respetando en todo caso la ley de protección de datos mediante el sistema de codificación que se
acuerde (firmas, iniciales).
12. BIBLIOGRAFÍA
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