UNAM ENP 2

Erasmo Castellanos Quinto

BIOLOGA V
Prctica: Clculo de la velocidad de reaccin enzimtica de la catalasa. Integrantes: Franco Daz Brenda Margarita Merln Martnez Nadia Alejandra Quiones Gmez Cintya Rodrguez Cortes Beatriz Santos Lobaco Alejandra

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INTRODUCCIN: Para comenzar se les dar una pequea definicin y caractersticas de las enzimas; enzimas son protenas especializadas en la catlisis de las reacciones biolgica. encuentran entre las ms notables de las biomolculas conocidas debido a extraordinaria especificidad y a su poder cataltico, que es mucho mayor que la de catalizadores hechos por el hombre. (Lehninger, 2003) las Se su los

La funcin de una enzima es incrementar la velocidad o celeridad de una reaccin. Sin embargo, las enzimas poseen tres caractersticas sin paralelo. En primer lugar, son los catalizadores ms eficientes, que se conocen pues bastan cantidades muy pequeas de ellas para acelerar una reaccin en forma impresionante. En segundo lugar, la mayora de las enzimas se distingue como ya se mencion por una especificidad de reaccin, lo que significa que prcticamente cada conversin de un reactivo (llamado sustrato) en un producto es catalizada por determinada enzima. La tercera caracterstica es que las acciones de muchas enzimas son reguladoras; es decir, pueden cambiar alternativamente de un estado de baja actividad a otro de gran actividad. (Bohinski, 1998). *Enzima Catalasa: La catalasa en una enzima que la podemos encontrar en muchos organismos vivos, y cataliza la reaccin de descomposicin del perxido de hidrgeno en agua y oxgeno. (Gonzlez, 2010)

(Gonzlez, 2010) El perxido de hidrgeno es uno de los productos del metabolismo celular en diversos organismos, pero dada su potencial toxicidad, es transformado enseguida por la enzima catalasa. (Gonzlez, 2010).

Fig 1.1 Estructura de la enzima catalasa

*Velocidad de Reaccin (Cintica Enzimtica). Ecuacin de Michaelis-Menten. Los principios generales de la cintica de las reacciones qumicas son aplicables a las reacciones catalizadas por las enzimas, pero stas muestran tambin un rango caracterstico que no se observa en las reacciones no enzimticas: la saturacin con el sustrato. (Lehninger, 2003)

En la figura 1.2 vemos el efecto de la concentracin del sustrato sobre la velocidad de la reaccin catalizada por una enzima A P. A una concentracin de sustrato baja, la velocidad inicial de la reaccin es Vo es casi proporcional a la concentracin del sustrato y la reaccin, por tanto, es aproximadamente de primer orden con respecto al mismo. Sin embargo, a medida que la concentracin de sustrato aumenta, la velocidad inicial de la reaccin disminuye y deja de ser aproximadamente proporcional a la concentracin; en esta zona de reaccin el orden es mixto. Todas las enzimas muestran el efecto de saturacin pero varian ampliamente con respecto a la concentracin de sustrato que se necesita para que se manifieste.(Lehninger, 2003).

Fig. 1.2 Grfica representativa de la velocidad de la reaccin catalizada por una enzima(Lehninger, 2003)

La teora de Michaels-Menten supone que la enzima E se combina en primer lugar con el sustrato para formar el complejo enzima-sustrato ES; a continuacin este ltimo se escinde en una segunda etapa, para formar enzima libre y producto P: (Lehninger, 2003)
.. 1

2 La ecuacin de Michaelis-Menten es la ecuacin de la velocidad para las reacciones catalizadas por enzimas que slo actan sobre un sustrato. En la deduccin, debida a Briggs y Haldane, [E] representa la concentracin del complejo enzima-sustrato, y [ES] la concentracin del complejo anzima-sustrato, y [ ] la concentracin total de la enzima. La concentracin del sustrato se representa [S], la cual se supone que es mucho mayor que [E], de modo que la cantidad de S unida a E en cualquier instante, es despreciable si se compara con la concentracin total de S. (Lehninger, 2003)

La velocidad inicial es, por supuesto, igual a la velocidad de ruptura del complejo enzima-sustrato, ES, de acuerdo con la ecuacin 2: podemos escribir para ella la ecuacin de velocidad de primer orden. (Lehninger, 2003) 3

Sin embargo, ya que ni

, ni [ES}, pueden determinarse directamente, debemos encontrar

otra expresin para en funcin de otras variables que puedan medirse con mas facilidad, se muestra a continuacin la ecuacin para la formacin de ES a partir de E y S: (Lehninger, 2003) . 5

Cuando la velocidad de formacin de ES es igual a la velocidad de desaparicin, es decir, cuando el sistema ha alcanzado el estado estacionario, que se define como aqul en que la concentracin de ES permanece constante, entonces: (Lehninger, 2003)

6 La figura 1.3 se muestra la variacin a lo largo del tiempo de los diversos participantes. Reordenando la ecuacin anterior obtenemos: (Lehninger, 2003) 7

Fig.1.3 Variacin a lo largo del tiempo de los diversos participantes(Lehninger, 2003)

La constante global se llama la constante de Miachelis-Menten. Apartir de esta ecuacin puede obtenerse la concentracin del complejo ES en el estado estacionario, despejando dicho trmino: (Lehninger, 2003)

..8

Como ya se mencion anteriormente la velocidad inicial de reaccin enzimtica es: (Lehninger, 2003)

, de una reaccin

Se puede sustituir el termino [ES] que figura en la ecuacin anterior por su valor en la ecuacin 8: (Lehninger, 2003)

Cuando la concentracin del sustrato es tan elevada que prcticamente toda la enzima esta presente en forma de complejo ES, es decir, cuando la enzima se halla saturado, se alcanzar la velocidad inicial mxima, , dada por: (Lehninger, 2003)

Sustituyendo

por su valor deducido en la ecuacin anterior se obtiene:

(Lehninger, 2003)

sta es la ecuacin de Michaelis-Menten; es la ecuacin de la velocidad para una reaccin de un solo sustrato, catalizada enzimticamente. Relaciona la velocidad inicial, la velocidad mxima y la concentracin inicial del sustrato a travs de la constante de Michaelis-Menten. (Lehninger, 2003) De la ecuacin de Michaelis-Menten se deriva la relacin numrica importante en el caso especial en que la velocidad inicial de la reaccin sea exactamente la mitad de la velocidad mxima; es decir, cuando = (Lehninger, 2003)

Al dividir por

se obtiene:

Reordenando, se transforma en:

El comportamiento cintico de la mayor parte de las enzimas es ms complejo que el sencillo e idealizado de la reaccin de un solo sustrato que se mostr. En primer lugar, nuestra formulacin ha supuesto que en la reaccin con un solo sustrato, se forma nicamente un solo complejo enzima-sustrato, peor ahora parece probable que en muchas de las reacciones con un sustrato puedan intervenir dos o tres complejos intermedios, tal como se indica a continuacin:

En que la EZ es el complejo del estado de transicin, y EP un complejo enzima-producto. Adems, solamente una minora de las reacciones enzimticas son de un solo sustrato; en la mayor parte de ellas intervienen dos o ms sustratos, y pueden haber dos o ms productos. El anlisis cintico de las reacciones enzimticas en las que intervienen varias reacciones y productos es complejo; no obstante, la relacin de Michaelis-Menten contina siendo el punto de partida para el anlisis de la cintica de todas las reacciones enzimticas.

Objetivo: Los objetivos de la prctica son dos.

a) El diseo y construccin de un dispositivo que mida el volumen de O 2 producido en la

reaccin catalasa-agua oxigenada.

b) Medicin de la velocidad de reaccin de la catalasa con agua oxigenada.

Metodologa: Para elaborar el dispositivo se tuvo que: Elaboracin del dispositivo

Dispositiv o

Material

2 frascos de muestra reciclados. para evitar para A los cuales se aforar Se le harn orificios; a uno un orificio de 1cm de dimetro y otro para que entre la pequea manguera, se llenar de agua con colorante y cerrar. Y en el otro se har un pequeito hoyito del tamao de un Mediciones un piquete y orificio para que

Trozo de manguera transparente inservible con 1 cm de dimetro.

Un trocito de manguerita para tanque de oxgeno.

Una jeringa Plastiloca Cinta inservible sobrante. adhesiv de 5ml. a

para subcionar introducir Fuga alguna y Pegar los evitar la salida frascos a de oxgeno por El agua un base y oxigenadaotra no estar y parte que no sea agregar al frasco la sosteniend manguera donde se llevar o. a cabo la aforada. reaccin de liberacin de oxgeno.

Para medir el nivel de agua y se introducir en el orificio del frasco correspondiente. Suele venir doblada y la puedes alinear con un palo del mismo tamao.

En los orificios correspondient es, quedando as en conexin frasco con frasco.

ESQUEMA DEL DISPOSITIVO:

Imagen 1. Dispositivo creado para medir oxigeno. Elaborado en Paint, 29-11-2011 Mediciones: Pesar 8.5 g de hgado entero ( 4 muestras).

Introducir la primera muestra de hgado a la Parte B del dispositivo.

Succionar con la jeringa 5 ml de agua oxigenada

Inyectar el agua en la Parte B

Esperar la reaccin, sellando en donde se insert la jeringa

Registrar resultados y/o mediciones

Repetir en 4 Ensayos.

*Figura 1.4 Diagrama sobre la metodologa de la practica del hgado y el agua oxigenada.

Resultados: Estos fueron los resultados que se obtuvieron despus de hacer las mediciones y clculos pertinentes: Ensayo 1:

Tabla 1.a Registro de todos los datos

Tiempo (s) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 Volumen de O2 desprendi do 18 20 22 24 26 28 29.5 31 32.5 34 34.8 35.6 36.4 37.2 38 38.8 39.6 40.1 40.6 41.1 41.4 41.7 42 42 42 42 42 42

Tabla 1.b. Extraccin de los datos para graficar

Tiempo (s) 0 2 4 6 8 10 12 14 16

Volumen de O2 desprendi do 18 20 22 24 26 28 29.5 31 32.5

18 20 22 24 26 28 30 32 34 36

34 34.8 35.6 36.4 37.2 38 38.8 39.6 40.1 40.6

En las tablas 1.a y 1.b se pueden observar los valores obtenidos al cronometrar cada dos segundos la subida del agua desplazada por el oxigeno proveniente de la reaccin acelerada del agua oxigenada que entro en contacto con el hgado. En la tabla 1.b solo se muestran los datos que nos ayudaran a graficar. **Nota: los valores marcados con color verde no se tomaron en cuenta para la realizacin de su grfica correspondiente, ya que desde el punto marcado se considera que la reaccin qumica alcanz el equilibrio qumico.

Graficando estos datos en Excel se tiene:

Grafica 1.a Velocidad de reaccin sin regresin lineal. Utilizando la regresin lineal que ofrece Excel, la grfica se ve de esta manera:

Grafica 1.b Velocidad de reaccin con regresin lineal. Tabla 4.c Datos obtenidos a partir de la regresin lineal Obteniendo los siguientes datos: Datos Valor m(pendiente) 0.6186 R2(cociente de relacin) 0.9545 b 20.765

Ensayo 2: Tabla 2.a Registro total de Datos

Tiempo (s) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60

Volumen de O2 Volumen desprendi Tiempo de O2 do (s) desprendi 15 do 17 0 15 19 2 17 21 4 19 23 6 21 25 8 23 26 10 25 28 12 26 30 14 28 31.5 16 30 33.1 18 31.5 34.2 20 33.1 35 22 34.2 35.9 24 35 36.7 26 35.9 37.2 28 36.7 38 30 37.2 38.8 32 38 39.5 34 38.8 40 36 39.5 40.5 38 40 41 40 40.5 41.5 42 41 42 44 41.5 42.5 46 42 43 48 42.5 43.5 43.8 44.1 44.1 En las tablas 2.a y 2.b se pueden observar los valores obtenidos al 44.1 cronometrar cada dos segundos la subida del agua desplazada por

Tabla 2.b Donde usaran los sig. valores para graficar:

el oxigeno proveniente de la reaccin acelerada del agua oxigenada que entro en contacto con el hgado. En la tabla 1.b solo se muestran los datos que nos ayudaran a graficar. **Nota: los valores marcados con color morado no se tomaron en cuenta para la realizacin de su grfica correspondiente, ya que desde el punto marcado se considera que la reaccin qumica alcanz el equilibrio qumico.

Grafica 1.a Velocidad de reaccin sin regresin lineal. Usando la regresin lineal que ofrece Excel se obtiene la siguiente grfica:

Grafica 2.b Velocidad de reaccin con regresin lineal. Tabla 2.c Datos obtenidos a partir de la regresin lineal Datos Valor m(pendiente) 2 R (cociente de relacin) b

0.6613 0.9553 19.28

Ensayo 3 Tabla 3.a Registro de todos los datos

Tiempo (s) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 Volumen de O2 desprendi do 20 22.1 24.2 26.3 28.4 30.5 32.6 34.3 36 37.7 38.5 39.3 40.1 40.9 41.7 42.2 42.7 43.2 43.5 43.8 43.5 43.5 43.5 43.5 43.5 43.5

Tabla 3.b. Extraccin de los datos para graficar

Volumen de O2 desprendi do

Tiempo (s)

0 20 En las tablas 3.a y 2 22.1 3.b se pueden 4 24.2 observar los 6 26.3 valores obtenidos 8 28.4 al cronometrar 10 30.5 cada dos 12 32.6 segundos la 14 34.3 subida del agua 16 36 desplazada por el 18 37.7 oxigeno 20 38.5 proveniente de la 22 39.3 reaccin 24 40.1 acelerada del 26 40.9 agua oxigenada 28 41.7 que entro en 30 42.2 contacto con el 32 42.7 hgado. En la 34 43.2 tabla 3.b solo se 36 43.5 muestran los datos que nos ayudaran a graficar y en la 3.a es registro de todos los datos obtenidos.

**Nota: los valores marcados con color rojo no se tomaron en cuenta para la realizacin de su grfica correspondiente, ya que desde el punto marcado se considera que la reaccin qumica alcanz el equilibrio qumico.

Graficando los datos seleccionados, tenemos que:

Grafica 3.a Velocidad de reaccin sin regresin lineal. Aplicando la regresin lineal:

Grafica 3.b Velocidad de reaccin con regresin lineal. Tabla 3.c Datos obtenidos a partir de la regresin lineal Dicha regresin lineal proporciona los siguientes valores: Datos m(pendiente) R (cociente de relacin) b
2

Valor 0.6564 0.9364 23.143

Ensayo 4: Tabla 4.a Registro de todos los datos Tabla 4.b. Solo se consideraran los siguientes datos para la elaboracin de las grficas:
Tiempo (s) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 Volumen de O2 desprendi do 15 17.1 19.4 21.7 24 25.6 27.2 28.8 30.4 32 32.9 33.8 34.7 35.6 36 36.4 36.8 37.2 37.5 37.8 38.1 38.2 38.2 38.2 38.2 Tiempo (s) 0 2 4 6 8 10 12 Volumen de O2 desprendi do 15 17.1 19.4 21.7 24 25.6 27.2

14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36

28.8 30.4 32 32.9 33.8 34.7 35.6 36 36.4 36.8 37.2 37.5

En las tablas 4.a y 4.b se pueden observar los valores obtenidos al cronometrar cada dos segundos la subida del agua desplazada por el oxigeno proveniente de la reaccin acelerada del agua oxigenada que entro en contacto con el hgado. En la tabla 4.b solo se muestran los datos que nos ayudaran a graficar. **Nota: los valores marcados con color naranja no se tomaron en cuenta para la realizacin de su grfica correspondiente, ya que desde el punto marcado se considera que la reaccin qumica alcanz el equilibrio qumico.

Con los datos seleccionados, la grfica quedara as:

Grafica 4.a Velocidad de reaccin sin regresin lineal. Aplicndole la regresin lineal, la grafica se modificara de la siguiente manera:

Grafica 4.b Velocidad de reaccin con regresin lineal. Tabla 4.c Datos obtenidos a partir de la regresin lineal

Datos m(pendiente) R (cociente de relacin) b

2

Valor 0.6213 0.9306 18.401

Ahora bien, en base a la investigacin previa sobre regresin lineal tenemos que el valor de m es igual a la velocidad de reaccin; por lo que, recopilando los datos, obtenemos estos valores:
Variable ENSAYO 1 2 Velocidad de reaccin (pendiente) R2 Velocidad de reaccin (pendiente) R2 Valor

0.6186
0.9545

0.6613
0.9553

Velociadad de reaccion (pendiente) R2 Velociadad de reaccion (pendiente) R2

0.6564
0.9364

0.6213
0.9306

Para determinar la velocidad de reaccin nos apoyaremos en una herramienta de Office Excel. Excel ofrece la posibilidad de hacer un proceso llamado regresin lineal, con el cual ajusta el mayor nmero posible de puntos de la grfica a una line recta que la atraviesa. Los datos que proporciona son:

m: esta variable representa la pendiente de la recta, lo que se traduce en esta prctica, como la velocidad de reaccin.

R2:Esta variable me da informacin sobre la coincidencia que hubo entre a recta adicional que se traz y la lnea de la grafica inicial. En biologa se deben manejar valores mayores o iguales a 0.8 para que mi grafica sea confiable Entre ms disminuya el valor de R2 significa que mis datos no son confiables y que hubo muchos errores en su obtencin.

Se explicar ms ampliamente lo que es una regresin lineal.

REGRESION LINEAL SIMPLE Ahora asumiremos que si hay una relacin de causalidad de la variable X (causa) hacia la variable Y (efecto). Adems, se sabe que esa relacin es de tipo lineal, dentro del rango de los datos. Estableceremos un modelo para explicar la causa (Y) en trminos del efecto (X), del tipo siguiente: Y = a + bXi + ei para i = 1,2,..., n en que a y b son dos cantidades fijas (parmetros del modelo) y los e i son cantidades aleatorias que representan las diferencias entre lo que postula el modelo a + bx y lo que realmente se observa, y. Por esa razn a los e los llamaremos "errores" o "errores aleatorios". Se asume que tienen valor esperado 0 y desviacin estndar comn . El problema es estimar los parmetros a, b y 2 para poder identificar el modelo.

Para estimar a y b se utiliza el mtodo de Mnimos cuadrados, que consiste en encontrar aquellos valores de a y de b que hagan mnima la suma de los cuadrados de las desviaciones de las observaciones respecto de la recta que representa el modelo, en el sentido vertical. En la figura, son los cuadrados de los segmentos verticales cuya suma de cuadrados se debe minimizar, para determinar a y b. Estos segmentos representan los errores e del modelo. b se llama pendiente de la recta que representa los datos y a se llama intercepto sobre el eje vertical.

Fig. 1.4. Cuadrados de los segmentos verticales

Discusin: Con base en los valores de velocidad de reaccin, establecemos que el dispositivo funcion adecuadamente puesto que los valores de pendiente no fueron muy distantes entre si. Adems el valor de R2 nos indica una buena confiabilidad de los resultados. Esto se justifica con base en la investigacin previa realizada (introduccin).Analizando las tablas con los datos recabados se observa cierta generalidad en todas las graficas de esta manera. Segn lo expuesto por (Lehninger, 2003):

A una concentracin de sustrato baja, la velocidad inicial de la reaccin es Vo es casi proporcional a la concentracin del sustrato y la reaccin, por tanto, es aproximadamente de primer orden con respecto al mismo. Sin embargo, a medida que la concentracin de sustrato aumenta, la velocidad inicial de la reaccin disminuye y deja de ser aproximadamente proporcional a la concentracin; en esta zona de reaccin el orden es mixto. Asi pues la curva que se formo al transcurrir la reaccin fue ascendente positiva puesto que los reactivos se estaban convirtiendo rpidamente en producto (en este caso el Agua Oxigenada).

Conclusiones: La prctica se relaciona directamente con el tema de metabolismo pues la reaccin qumica que recreamos forma parte importante del proceso por el cual los seres se mantienen en un nivel ptimo de entropa. Pudimos comprobar que, efectivamente la funcin de una enzima es incrementar la velocidad o celeridad de una reaccin puesto que los intervalos de tiempo son muy breves, sin embargo esto no influye en la eficiencia qumica. Comprobamos que la enzima Catalasa (presentes en organismos vivos) cataliza la reaccin de descomposicin del perxido de hidrogeno en agua y oxigeno. Esto fue medible adecuadamente mediante el dispositivo que se realiz previamente pues notamos que el incremento en el nivel de produccin de oxigeno fue disminuyendo tras el paso del tiempo (el proceso se fue desacelerando). El equipo obtuvo una buena experiencia tras concluir la practica pues reafirmo los conocimientos adquiridos en el tema de cintica enzimtica; adems de que aprendi a disear un dispositivo con respecto a lo que se necesita evaluar y observar.

Bibliografa
Bohinski, R. C. (1998). Bioquimica. Mexico: Pearson Educacin. Gonzlez, M. (25 de Octubre de 2010). Quimica en la guia 2000. Recuperado el 29 de Noviembre de 2011, de Quimica en la guia 200: http://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/enzima-catalasa Lehninger, A. L. (2003). Bioquimica. Espaa: Ediciones Omega.

Trabajos citados
Bohinski, R. C. (1998). Bioquimica. Mexico: Pearson Educacin. Gonzlez, M. (25 de Octubre de 2010). Quimica en la guia 2000. Recuperado el 29 de Noviembre de 2011, de Quimica en la guia 200: http://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/enzima-catalasa Lehninger, A. L. (2003). Bioquimica. Espaa: Ediciones Omega.

AUTOEVALUACIN

* Franco Daz Brenda Margarita.10 * Merln Martnez Nadia Alejandra.10 * Quiones Gmez Cintya..10 * Rodrguez Cortes Beatriz.10 * Santos Lobaco Alejandra10