2019

Microbiología Manual de prácticas

Universidad de Cuenca
Universidad de Cuenca
5-2-2019
Manual de Prácticas Microbiología

Introducción

La siguiente guía de prácticas de Microbiología, está dirigida a los estudiantes de tercer

ciclo de la carrera de Medicina de la Universidad de Cuenca, como una herramienta o
guía de consulta de gran utilidad para quienes estén encaminándose al diagnóstico
microbiológico. Tiene como función principal orientar al alumno en la realización de sus
actividades de prácticas en el laboratorio de Microbiología.

La Microbiología es una ciencia en progreso que va de la mano con el avance de la

tecnología. Durante décadas, hemos menospreciado el conocimiento del mundo
microbiano que nos rodea. Felizmente hoy, nos damos cuenta que los microorganismos
son de vital importancia en el ciclo de vida planetario y en los seres que lo habitan; así
que vale la pena estudiar a fondo los agentes biológicos y los mecanismos que emplea
nuestro organismo para relacionarse con ellos.

Se debe mencionar que dentro de los criterios de evaluación, para la aprobación de la

materia, es necesario que los estudiantes demuestren ciertas aptitudes como la
capacidad investigativa y creativa, en donde cada par de alumnos (son dos generalmente)
deben exponer la práctica asignada. “La nota obtenida en prácticas toma en cuenta el
manejo de material, informes, dominio del tema durante la exposición, iniciativa,
investigación, habilidades y pericias demostradas” 1 . El informe debe contener una
revisión bibliográfica adecuada al tema. El ayudante de prácticas de la asignatura es el
responsable de organizar y coordinar con los alumnos sobre cada uno de los temas
sugeridos en el sílabo de Microbiología. Sin embargo, tiene plena apertura a realizar
cualquier cambio que crea pertinente, para el beneficio de los estudiantes, informando
con antelación a los docentes de la cátedra.

Esperamos que este texto le sea de utilidad en el proceso de aprendizaje, no solo para
alcanzar buenos resultados docentes, sino más bien, como una herramienta que le
proporcione una capacitación perdurable, sobre el que se sustente su desempeño
profesional, que es, en definitiva, el objetivo esencial de su formación; por lo que
ponemos a consideración de los docentes y estudiantes de las prácticas de Microbiología
la siguiente guía.

Dra. Hidaleisy Quintana Hernández

Dra. Alicia Bustos Cabrera
Prof. Cátedra Microbiología

1
Índice
Temas Pág

Introducción………………………………………………………………………………………………………………… 1

Tema 1: Normas de Bioseguridad en el laboratorio de Microbiología…………………………… 3

Tema 2: Materiales y Equipos en el laboratorio de Microbiología………………………………… 6

Tema 3: Desinfección y Esterilización…………………………………………………………………………. 13

Tema 4: Toma de muestras I y II. Normas básicas generales……………………………………… 17

Tema 5: Tinciones……………………………………………………………………………………………………… 26

Tema 6: Medios de cultivo y cultivo ………………………………………………………………………….. 32

Tema 7: Cultivos………………………………………………………………………………………………………… 37

Tema 8: Pruebas de identificación de cocos gram (+) y gram (-)………………………………… 42

Tema 9: Pruebas bioquímicas para bacilos gram negativos (enterobacterias)…………… 46

Tema 10: Protocolos (técnicas, aplicación e interpretación) para Urocultivos

Hemocultivos, Coprocultivos…………………………………………………………… 55

Tema 11: Antibiograma……………………………………………………………………………………………. 63

Tema 12: Métodos diagnósticos de infecciones virales y micóticas…………………………… 67

2
Tema1: Normas de bioseguridad en el laboratorio de microbiología.

Objetivo General:
Describir la organización de un laboratorio de microbiología y las normas de
bioseguridad que se establecen en el mismo.

Objetivos específicos:
1. Describir la estructura general de un laboratorio de microbiología clínica
2. Aplicar las normas de bioseguridad que deben establecerse en el
laboratorio para evitar la trasmisión de infecciones
3. Reconocer la importancia de estas normas para la protección personal y
de la comunidad.
4. Conocer los materiales y equipos de uso frecuente.

Justificación.-

Los estudiantes deben conocer y aplicar las normas de bioseguridad para evitar cualquier
accidente en el laboratorio, las destrezas que se adquieran en el trascurso de las prácticas
depende directamente de este tema fundamental.

Marco teórico.-

La organización de un laboratorio depende de microbiología depende de las

características y el tamaño del mismo, disponibilidad del personal y del espacio físico. 2

Estructura de un laboratorio de microbiología.-

Dependiendo de las características de cada laboratorio, el mismo cuenta con las

siguientes secciones o áreas básicas, a más de áreas especializadas:

1) Sección de la toma de muestras

2) Sección de recepción y registro de muestras
3) Sección de siembra de muestras
4) Sección de medios de cultivo
5) Sección de lavado y esterilización
6) Área de almacén o depósito
7) Sección de bacteriología
8) Áreas especializadas: sección de micobacterias, sección de micología, sección de
antibióticos, sección de serología, sección de virología sección de biología
molecular.

Normas de bioseguridad:

Conjunto de medidas preventivas destinadas a evitar el riesgo de infección del personal

que trabaja en él, así como su extensión a la comunidad. El propósito básico es obtener
un ambiente de trabajo seguro y ordenado.
Elementos de contención:

Equipos de seguridad
Diseño del laboratorio

2
Manual práctico de bacteriología general. Ramírez Ana. Et al. Universidad de los Andes. 2010

3
Prácticas de trabajo

Equipos de seguridad.- (contención primaria)

Permiten al operador la preparación y trasferencia del material potencialmente
infeccioso sin romper la barrera. Estos incluyen: guantes, bata, mascarilla, tubos de
centrífuga con tapón, etc.

Diseño del laboratorio.- (contención secundaria)

Debe estar pensado para proteger al personal del laboratorio, a las personas que trabajan
en otras áreas de la institución y a la comunidad. Debe ser de acceso restringido, los
materiales que contiene debe ser de fácil limpieza.

Prácticas de trabajo.-
Corresponde a la utilización estricta de los procedimientos y técnicas, especialmente
diseñadas para disminuir el riesgo. Es el elemento de contención más importante en
cuanto a la prevención de infección en el laboratorio.

Niveles de seguridad biológica.-

Existen cuatro niveles, según las técnicas utilizadas, los equipos de seguridad, y la
estructura del laboratorio 3.

Nivel 1.-
Válido para los laboratorios de enseñanza para los que se trabaja con microorganismos
no patógenos bien conocidos y patógenos oportunistas.
Nivel 2.-
Permite el trabajo con microorganismos potencial moderada. Es el caso de laboratorios
de hospitales o centros de salud a nivel primario.

Nivel 3.-
Adecuado para trabajar con microorganismos de alto riesgo.

3
Riesgos Específicos Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. 01- Principios generales.

4
Nivel 4.-
Solo se establece en laboratorios de experimentación, se manejan microorganismos de
altísimo riesgo.

Actividad a realizarse:
Los responsables de la práctica deben ampliar los conocimientos investigando:
- los microorganismos que se estudian según el nivel de seguridad biológico
- normas a cumplirse en cada uno de los niveles
- materiales a usarse en cada uno de los niveles de contención.
- elaborar actividades didácticas para la comprensión y aplicación del tema de
bioseguridad.
- Ejemplo 1: realizar un plano del laboratorio de microbiología y colocar las áreas
o secciones correspondientes.
- Ejemplo 2 : Nombrar los significados de estos símbolos

5
Tema 2: Equipos y materiales en el laboratorio de Microbiología.

Objetivo General:
Conocer y manejar adecuadamente los equipos y materiales que se encuentran
en el laboratorio de microbiología.

Objetivos específicos:
1. Identificar y conocer el manejo adecuado de los materiales que se
encuentran en el laboratorio de microbiología.
2. Identificar y manejar apropiadamente los equipos empleados en los
laboratorios de Microbiología.
3. Conocer los elementos que componen un microscopio óptico: Sistema
mecánico y sistema óptico.
4. Exponer los cuidados de los materiales de uso frecuente en el laboratorio
de microbiología.

Justificación.- luego de conocer el espacio en donde se realizarán las prácticas, los

estudiantes deben familiarizarse con los materiales de uso frecuente en un laboratorio
microbiológico, así como el manejo y funcionamiento de algunos de los equipos con los
que contamos.

Marco teórico.-

Los laboratorios deberán disponer de los instrumentos, materiales y equipos necesarios

para el correcto desarrollo de las actividades prácticas. Acompañado a esto debe existir
un sistema de control de calidad en el laboratorio de Microbiología que implique la
monitorización de los medios e instrumentos, con el fin de asegurar la adecuada
realización de los aislamientos, identificación y caracterización de los microorganismos
patógenos así como la realización de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos
como referencia terapéutica. El sistema de la calidad deberá contemplar la existencia de
registros de formación del personal.

Es necesario contar con un protocolo sobre el uso de las normas de protección personal
en el manejo de equipos evitando de esta manera riesgos innecesarios.

Los equipos del laboratorio deben funcionar de forma que se asegure la reproducibilidad
de los resultados de las pruebas diagnósticas.

El personal técnico y/o auxiliar del laboratorio deberá disponer la titulación adecuada
para las funciones que desarrolla de conformidad con la legislación vigente.

Elementos y materiales más frecuentes de un laboratorio de Microbiología clínica

2.1. Mesas de laboratorio, fregadero, vitrinas, armarios.

6
 2.2. Mecheros

Son instrumentos de laboratorio diseñados para obtener una llama calorífica a partir de la
combustión del alcohol o del gas.

Mechero de alcohol Mecheros de gas

Advertencia!!!

- El empleo del mechero entraña un peligro potencial de quemaduras en la piel o en la

ropa, por lo que se debe tener sumo cuidado con su manejo, por las mismas razones
debe mantenerse el pelo recogido y concentrarse totalmente en la actividad que se esté
realizando.
- Los instrumentos de siembra (asas o agujas de platino o nicrón) que contengan restos
de muestra o de cultivos, deben ser introducidos gradualmente en la llama del mechero
de la siguiente manera: de inicio se expondrá el extremo del instrumento a la zona azul
de la llama y tan pronto se ponga al rojo, se introduce gradualmente el resto del alambre
hasta que también se ponga al rojo vivo. La introducción total del instrumento en la
llama tiende a aumentar la intensidad de la formación de aerosoles, potencialmente
peligrosos para el manipulador. Lo idóneo cuando se trabaja con muestras o cultivos, es
disponer de un recipiente con arena humedecida en fenol, para introducir previamente
el asa, con los restos de inoculo, antes de flamearla a la llama del mechero.
- Todas las manipulaciones deben realizarse en un radio de 10-15cm de la llama del
mechero (zona aséptica).
- En caso de utilizar mechero nunca se debe coger material por encima de la llama
- Antes de comenzar a trabajar se procurará disponer de todo el material necesario para
el procesamiento de la muestra
- Tomar las medidas necesarias para evitar la contaminación de las muestras o/ y cultivo
por microorganismos ambientales4

2.3. Gradillas: Su principal función es facilitar el soporte y el manejo de los tubos de

ensayo. Las gradillas se fabrican en madera, plástico o metal; las más comunes son
las de plástico.

4
Microbiología General y Bucal. Prácticas. El laboratorio de Microbiología. Universidad de Salamanca

7
2.4. Estufa de incubación o Incubadora
Es una cámara de temperatura controlada para cultivo de microorganismos. Se utiliza
para facilitar el desarrollo de los microorganismos a su temperatura óptima de
crecimiento (generalmente 35-37º).

2.5. Frigorífico o cámaras refrigeradas

Se utilizan para conservar tanto materiales (medios de cultivo, reactivos) como
microorganismos. Generalmente están a una temperatura fija de 4ºC.

2.6. Congeladores
Se utilizan para la conservación de reactivos y microorganismos a temperaturas inferiores
a 0ºC, llegando a -80ºC (los más frecuentes son -20º, -40º y -80º). Pueden ser
horizontales o verticales.

2.7. Microscopio óptico: componentes del mismo: Sistema mecánico y sistema óptico.

8
2.8. Centrífuga
Aparato que aplica sobre los tubos una fuerza centrífuga lo que permite la separación de
los distintos componentes de la muestra, mediante la precipitación en el fondo del tubo
de las partículas en suspensión.

2.9. Cabinas de seguridad biológica (CBS): Definición, tipos, clases y aplicación de cada
una.

2.10. Desionizador de agua.

La mayor parte de los trabajos que se realizan en un laboratorio de Microbiología Clínica
necesitan la utilización de agua pura con el fin de evitar cualquier tipo de interferencia.
Entre otras características debe: estar exenta de materiales en suspensión o un pH
comprendido entre 5,0 y 7,5. Durante años se ha utilizado agua destilada, en la actualidad
los destiladores se han ido abandonando para dar paso a desionizadores que funcionan
con resinas de intercambio iónico. También se pueden utilizar otras técnicas como la
ósmosis inversa5.

5
Microbiología General y Bucal. Práctica 1: El laboratorio de Microbiología. Universidad de Salamanca

9
2.11. Contador de colonias: Es un aparato que, mediante la iluminación de la placa y una
lupa, nos permite observar con mayor nitidez las colonias y por tanto facilita su
recuento.

2.12. Balanzas

2.13. Baños termostáticos: son recipientes que contienen agua y un sistema de

regulación de la temperatura. Se utilizan para atemperar medios de cultivo o incluso
para incubar cultivos de microorganismos.

2.14. Agitador/ mezclador

Vórtex Agitador horizontal

2.15. Jarras de anaerobios:

Recipientes que se usan para conseguir una atmósfera libre de oxígeno para el cultivo de
microorganismos anaerobios.

10
2.16. Asas de siembra:
Se utilizan para sembrar. Pueden ser metálicas o de plástico, curvas o rectas (para la
siembra por picadura), calibradas o no.

2.17. Estereoscopio:
Se utiliza en Microbiología para observar preparaciones que no necesitan tantos
aumentos como el microscopio electrónico y además tienen mucho volumen, por lo que
no se pueden introducir en un microscopio óptico.

2.18. Material fungible

Placas de Petri: recipientes para la preparación de medios de cultivo sólidos

Placas de Petri con medio sólido

Tubos de ensayo con medio líquido

11
Tubos con medio sólido

¡Recuerda!: los tubos con medio sólido se dejan enfriar en una gradilla, para que
solidifique y forme el bisel que se mira en el gráfico superior. O se deja enfriar a
temperatura ambiente de forma horizontal
En el caso de las placas de petri, una vez solidificadas las placas se conservan en posición
invertida

Pipetas de vidrio, de plástico y pipeteadores

Pipeteador automático Pipeteador manual

Pipetas automáticas (micropipetas) y puntas de pipeta:

Se utilizan para pipetear pequeñas cantidades de líquidos.
Se utilizan con puntas desechables de distinto tamaño y color según la micropipeta.
Existen cuatro tamaños: de 0,5-2µm; de 2-20 µm; de 20-200 µm y de 200-1000 µm.

Asas acodadas o Asas de Digralsky:

Se utilizan para la extensión de microorganismos sobre la superficie de un medio de
cultivo en placa Petri.

12
Portas y cubres
Para realizar las observaciones al microscopio.

Vasos de precipitados y matraces

Cucharas y espátulas:
Se utilizan para pesar muestras o medios de cultivo.

Autoclave
Es el equipo más utilizado.
Es un procedimiento de esterilización mediante calor húmedo. Se realiza en al autoclave
durante 15 o 20 min, según el volumen, a 115°C o 121°C, según la naturaleza del material
que se desee esterilizar.

Auto clavado: es un procedimiento en el que se emplea vapor a presión (a 1 atmósfera).

Como tiene gran poder de penetración la temperatura y el tiempo utilizado es menor que
los que se emplean con el horno Pasteur (121º C, 15-20 minutos). Se utiliza para
esterilizar: Medios de cultivo, ropa, material de plástico resistente al calor húmedo,
objetos de metal que no se alteren con la humedad y sobre todo material de vidrio.

Horno de Pasteur: Emplea calor seco, a altas temperaturas (160-180º C) durante un

tiempo prolongado (1.5 a 3 horas). Debido a su poca capacidad de penetración se usa
para esterilizar vidrio y metales. Actúa principalmente desnaturalizando las proteínas y
secundariamente oxidando los compuestos celulares.

13
Actividad a realizarse: Esta práctica se puede sumar con la primera, dependiendo del
número de sesiones, la organización de los grupos y la factibilidad del ayudante de
prácticas.
Al finalizar la práctica se aconseja realizar una autoevaluación a los estudiantes
identificando cada una de las partes del microscopio y sus funciones; así como los
cuidados de los materiales y equipos una vez utilizados, en especial con el lente de
inmersión del microscopio óptico.
Se debe recordar las partes del microscopio
óptico. Por ejemplo:

Imagen tomada del manual práctico de bacteriología general.

Ramírez Ana. Universidad de los Andes

Tema 3: Desinfección y Esterilización

Objetivo General:
Comprender la importancia de la desinfección y la esterilización del laboratorio
de microbiología

14
 Objetivos específicos:
1. Mencionar las principales definiciones relacionados con la Desinfección
y la Esterilización
2. Conocer y diferenciar los conceptos de: Agentes esterilizantes,
desinfectantes y antisépticos
3. Aplicar un adecuado manejo de residuos/desechos biológicos y
químicos.

Justificación.- una vez terminadas las prácticas los estudiantes deben saber con qué
solución se debe limpiar los mesones de trabajo y cual se debe usar en caso de derrames.
Esto es importante pues se debe mantener en orden el área de trabajo.

Marco teórico.-

Se debe recordar las normas de bioseguridad en el momento de deshacerse del material

contaminado pues se deben utilizar recipientes adecuados que deben ser esterilizados
posteriormente.

Tener presente que nunca se puede tirar nada contaminado por el fregadero o al cubo
de la basura común sin haber sido esterilizado previamente. Existe riesgo potencial de
contaminación y “pinchazos” accidentales con material corto punzante por parte del
personal de laboratorio como aquellos que recogen la basura, por ello se recomienda
aplicar ciertas normas de precaución para evitar accidentes.

En el laboratorio deben existir unas recomendaciones generales de limpieza y en caso de

vertidos:

✓ Procedimientos de limpieza de superficies externas mediante papel humedecido

con solución desinfectante (alcohol 70%, desinfectante fenólico diluido, etc.).
Aclarar con agua los restos de desinfectante.
✓ En caso de usar soluciones de hipoclorito en zonas metálicas, limpiar
posteriormente para evitar el efecto corrosivo.
✓ En caso de derramamientos de material peligroso o formación de aerosoles:
evitar inspiraciones de esos aerosoles, esperar 30 minutos hasta que las
partículas se hayan depositado y limpiar con mascarilla, guantes y otros útiles
protectores.
✓ En caso de vertido de materiales, cubrir la superficie con desinfectante y
posteriormente cubrir con papel humedecido con desinfectante. Dejar durante
15 minutos y limpiar. En caso necesario aclarar con agua.
✓ En caso de derramamientos menores limpiar el material vertido mediante papel
humedecido y posteriormente aclarar, cuando sea necesario.

Métodos Físicos y Químicos Generalidades

15
Imagen tomada del tema teórico: “Agentes antimicrobianos y quimioterapia”. Silabo
Bacteriología. 2014.

Definición de términos:

Desinfección: Es el conjunto de operaciones que tiene como objetivo la reducción

temporal del número total de microorganismos vivos y la destrucción de los patógenos y
alterantes; sin embargo, la esterilización busca la obtención definitiva de un medio
completamente exento de gérmenes
Desinfectante: Cualquier agente que limite la infección inhibiendo la germinación y
proliferación de esporas de los microorganismos. (Esporostáticos)
Antiséptico: Biocida o producto que destruye o inhibe el desarrollo de los
microorganismos en un tejido vivo. Por ejemplo la piel. 6
Detergente: Material tenso activo diseñado para remover y eliminar la contaminación
indeseada de alguna superficie de algún material
Esterilización: Es la destrucción o eliminación de todas formas de vida. Puede llevarse a
cabo por procesos físicos o químicos.
Higiene: Todas las medidas necesarias para garantizar la sanidad e inocuidad
Limpieza: Es el conjunto de operaciones que permiten eliminar la suciedad visible o
microscópica. Estas operaciones se realizan mediante productos detergentes elegidos en
función del tipo de suciedad y las superficies donde se deposita
Solución: Combinación de un sólido o de un producto concentrado con agua, para
obtener una distribución homogénea de cada uno de los componentes.

Agentes esterilizantes, desinfectantes y antisépticos

La acción antimicrobiana de los desinfectantes depende de su concentración, el tiempo

y la temperatura y la valoración de su efecto es compleja.

6
Microbiología médica. Jawetz. 25º edición

16
 Desinfección del ambiente Desinfección de la piel o
inanimado heridas

Formaldehido Hexaclorofeno Clorhexidina

Amonio cuaternario

Hipoclorito de sodio Alcohol

Propilenglicol Peróxido de hidrógeno

Óxido de etileno Yodo povidona

Imagen tomada del tema teórico: “Agentes antimicrobianos y quimioterapia”. Silabo
Bacteriología. 2014.

Preparación de desinfectantes
Para la preparación de los agentes desinfectantes a las concentraciones deseadas se
emplea la siguiente formula7:

V1C1=V2C2

DONDE:
V1= V2*C2/ C1
V1= Volumen deseado
C1= Concentración conocida
V2= Volumen conocido
C2= Concentración deseada

Ejemplo: Hipoclorito comercial al 13% y se desea preparar al 6% un volumen de 50

mililitros = 50cc de hipoclorito al 6%.
V1C1=V2C2
V1 (13%) = (50ml) (6%)
V1= (50ml) (6%)
(13)%
V1= 24 ml

Respuesta: Se debe agregar 24 ml. de hipoclorito de sodio a 26 ml. de agua destilada para
tener 50 ml. de una solución al 6%

Manejo de desechos.
En los laboratorios tanto la descontaminación como la eliminación de desechos son
procedimientos íntimamente relacionados. En el trabajo cotidiano hay que eliminar parte
del material que se utiliza y el resto se aprovecha para volver a utilizarlo, como ocurre
con la cristalería, el instrumental y la ropa de laboratorio.

Descontaminación.- el material destinado a la descontaminación y eliminación debe

introducirse en recipientes, por ejemplo: bolsas de plástico susceptibles de tratamiento

7
Universidad de Pamplona. Centro de Preparación de Medios. Manual de Limpieza y
Desinfección

17
con autoclave que tengan un código de color que indique si el contenido ha de pasar al
autoclave o la incineración.
El tratamiento con autoclave constituye el método de elección para todos los procesos
de descontaminación.

Eliminación de desechos.- hay que establecer un sistema de identificación y separación

de material contaminado (y sus recipientes). Puede hacerse la siguiente división:
a) Desechos no contaminados que pueden eliminarse con la basura
b) Objetos cortantes: agujas hipodérmicas, bisturís, vidrios rotos, etc.
c) Material contaminado para el tratamiento en autoclave y reutilización
d) Material contaminado para eliminación
e) Desechos anatómicos: tejidos humanos y animales8

Actividad a realizar: Al finalizar la práctica los estudiantes deben conocer los colores de
identificación para la eliminación correcta de los desechos, se recomienda realizar
actividades que fomenten el buen uso de los basureros, así como la realización de
ejercicios para la preparación de desinfectantes.

8
Manual práctico de bacteriología general. Ramírez Ana. Et al. Universidad de los Andes. 2010

18
Tema 4.- Toma de Muestras. Normas básicas generales

Objetivo General:
Comprender la importancia de la toma de muestras como un paso previo
indispensable dentro de la fase pre analítica de un examen microbiológico.

Objetivos específicos:
1. Conocer las normas básicas generales en el momento de tomar una
muestra, para conocer el agente responsable de un cuadro clínico
infeccioso.
2. Distinguir las diversas formas de rechazo de una muestra, para evitar
resultados erróneos.
3. Recordar las características anatómicas de cada sistema para la toma de
muestras de manera específica.

Justificación.- A pesar que el estudiante de medicina promedio no se dedicará en su vida

profesional al laboratorio clínico, sí manejará las muestras que serán enviadas al mismo
para su análisis y deberá brindarle al paciente las orientaciones precisas para una
correcta toma de muestras en caso necesario; paso fundamental conocido como la “fase
pre analítica” la que es de vital importancia para la interpretación y el diagnóstico de las
enfermedades infecciosas, como se verá a continuación.

Marco teórico.-

La actividad que desarrolla el laboratorio de microbiología está orientada esencialmente

al diagnóstico microbiológico de las enfermedades infecciosas. Una parte importante de
esa actividad consiste en el aislamiento, la identificación y la determinación de la
sensibilidad a los antimicrobianos de los microorganismos causales de estas
enfermedades.

El diagnóstico clínico es, en muchos casos, orientador luego de evaluar los datos que
ofrecen la historia clínica y la exploración, pero la confirmación de un diagnóstico clínico
requiere en enfermedades infecciosas del diagnóstico etiológico que confiere el
Laboratorio de Microbiología Clínica.

El trabajo a realizarse en el laboratorio de Microbiología debe llevarse a cabo de acuerdo

con los estándares técnicos y de seguridad propios. Las muestras que analicemos para
determinar los microorganismos presentes deben ser manejadas con extrema
precaución para evitar contaminaciones que den lugar a resultados equívocos a más de
evitar infecciones por su potencial patogenicidad.

Toda la información diagnóstica que el laboratorio de microbiología puede proporcionar,

depende de la calidad de la muestra recibida. Por ello, una toma mal realizada,
pobremente recogida o mal conservada o transportada determinará un posible fallo en
la recuperación de los agentes patógenos, que puede inducir a errores diagnósticos, e
incluso a un tratamiento inadecuado del enfermo. Este hecho es bien conocido por los
microbiólogos, no obstante, la mayoría de las muestras son obtenidas por otros
profesionales de la salud en diversos servicios clínicos, por lo que es necesaria la
educación continua de dicho personal sanitario, al que hay que advertir del gasto inútil y
el error de los datos obtenidos a partir de un estudio realizado de forma inadecuada.

19
Normas o reglas generales. -

IDENTIFICACION

TRANSPORTE Y
ASEPSIA
CONSERVACION

OBTENCION O
TOMA DE LA
MUESTRA

1. Obtención de muestras: Reglas generales

• Antes de recoger la muestra, considerar el riesgo/beneficio de la recogida de la
muestra para el paciente.
• Deben realizarse en condiciones de máxima asepsia, evitando contaminaciones
ambientales, del personal médico y del propio enfermo.
• La muestra debe etiquetarse con el nombre del paciente, el servicio solicitante,
el tipo de muestra y la fecha de recogida.
• Se debe recoger una cantidad de muestra adecuada a la petición.
• No debe estar en contacto con sustancias desinfectantes o anestésicas siempre
que sea posible.
• La muestra debe transportarse en envases adecuados con cierres a prueba de
fugas.
• La muestra se debe recoger, siempre que sea posible, antes de iniciar cualquier
terapia antimicrobiana.
• Se debe evitar, siempre que sea posible, el contacto de la muestra con microbiota
normal del paciente, con el objeto de asegurar que la muestra refleje lo mejor
posible el lugar de la infección.
• Se prefieran siempre los productos purulentos frescos líquidos (recogidos por
aspiración directa con jeringa) o tejidos sospechosos, a las muestras tomadas con
hisopos o torundas con algodón.
• El envío al laboratorio de microbiología debe ser lo más rápido posible con objeto
de asegurar la supervivencia de microorganismos de difícil crecimiento y de
evitar el sobrecrecimiento del microbiota normal, acortar el tiempo de contacto
con anestésicos locales o con otras sustancias con acción antimicrobiana
utilizadas en la recogida de la muestra.

2. La Orden de solicitud de examen.

Precisa:
• Identificación del paciente.
• Identificación del médico.
• Datos de la muestra (hora de recogida, tipo de muestra, Diagnóstico, localización
anatómica, procedimiento de obtención de la muestra). Determinaciones
solicitadas.

3. Identificación de la muestra:
Cada muestra debe estar acompañada siempre de una orden. El paciente debe
identificarse con nombre y apellidos, tipo de muestra, fecha, y hora de extracción.

20
 4. Conservación de las muestras:
• Muestras para virus: en refrigerador, salvo sangre, médula ósea, y Ag CMV
(citomegalovirus).
• Muestras para hongos: en refrigerador, salvo LCR, piel, pelo, uñas, vaginal y
balano prepucial.
• Muestras para anaerobios: a Temperatura ambiente.
• Muestras para micobacterias: en refrigerador, salvo contenido gástrico.

Muestras para Bacteriología:

▫ A temperatura ambiente: médula ósea, líquidos estériles (pleural, peritoneal,
articular,...), muestras oculares, muestras de cavidad oral, heridas, abscesos,
fístulas, adenopatías, del tracto genital, y biopsias.
▫ En refrigerador: orinas, heces, catéteres, esputo.
▫ En ESTUFA: hemocultivos, LCR, placas de petri y tubos inoculados.

Criterios de rechazo de una muestra

• Muestras sin orden o con órdenes incompletas y/o fallo de identificación de la
muestra.
• Muestras derramadas, o rotas, con recipiente fuera del periodo que indica la
fecha de caducidad.
• Muestra no adecuada para la prueba solicitada.
• Muestras sin medio de transporte adecuado o incorrectamente conservadas.
• Muestras duplicadas en el trascurso de 24 horas.
• Muestras con agujas o cualquier otro material corto punzante 9

Se deben exponer las principales muestras a estudiar en el laboratorio de Microbiología, en esta

práctica profundizaremos en las siguientes: Tracto respiratorio superior (nasal, faríngea,
nasofaríngea, ótica), Tracto respiratorio inferior (Esputo, LBA, LB, Cepillado bronquial, etc), Orina,
Heces fecales, Secreciones genitales (vaginales, Sec. Endocervicales, uretrales), Sangre para
hemocultivos, Sec. de piel y partes blandas, LCR, entre otras.

TRACTO RESPIRATORIO SUPERIOR. - (nasal, faríngea, nasofaríngea, ótica)

El tracto respiratorio superior (TRS) se inicia con las fosas nasales y la boca y se continúa
con la nasofaringe y orofaringe. Junto a éstas se encuentran los senos paranasales y el
oído medio. Las infecciones del TRS constituyen una de las consultas médicas más
frecuentes, a pesar de que tienen un curso benigno y autolimitado, producen
inconvenientes laborales o escolares por ausentismo e incluso pueden originar
complicaciones supurativas y no supurativas de variada gravedad. En este grupo se
encuentran la faringitis, otitis y sinusitis.

Nariz: Toma de muestra.-

Muestra: frotis de fosas nasales.
Volumen: 1ml aproximadamente
Recipiente: medio de transporte Stuart.

9
Recolección y trasporte de muestras en microbiología Clínica. Zurita Jeannete. OPS. 2004

21
 Faringe: (es la que llevaremos a cabo en la práctica)
Muestra: frotis de amígdalas y faringe posterior, de úlceras, o lesiones purulentas.
Volumen: 1ml
Recipiente: medio de transporte Stuart (figura 1).

Figura 1: Medio de transporte comercial con medio de cultivo Stuart.

Toma de muestra de secreción faríngea: Procedimiento.-

Para la toma de muestra de los exudados faringo-amigdalinos se necesita una buena

fuente de luz, un hisopo de Dacron o que contenga alginato de calcio y un baja lenguas.
Se coloca el cuello del paciente en hiperextensión y se ilumina la faringe deslizando y
rodando el hisopo por ambas amígdalas (o los pilares en caso de no haber amígdalas)
procurando que en ningún momento toque la lengua o el paladar. Si hay exudado o
membranas se deben tomar éstas. En caso de niños pequeños la madre debe sentar al
niño en su regazo y cruzar sus brazos sobre los del niño de tal forma que sujete al niño.
Una vez tomada la muestra se coloca el hisopo en el medio de transporte y se envía al
laboratorio dentro de las 4 horas siguientes, si va a tardar más se debe utilizar medios de
transporte adecuados, pues estos mantienen viables los microorganismos y evitan el
sobre crecimiento de los contaminantes como las bacterias de la saliva, lengua o paladar
que pueden proliferar mejor o competir.
¿Qué orientaciones damos al paciente antes de acudir a la toma de muestras: Ayunas?,
cepillado bucal?
¿Qué microorganismos buscamos en este tipo de muestras como responsable de
Faringoamigdalitis?

Toma y transporte de la muestra nasofaríngea.

La toma de muestra nasofaríngea es una toma muy útil para VSR, otros virus
respiratorios, y para las bacterias como Chlamydia spp. y Bordetella pertussis. El
espécimen debe ser tomado de tal manera que evite la contaminación con la flora nasal
y oral y es realizada por el médico especialista. La nasofaringe es alcanzada insertando
un pequeño y delgado hisopo a través ya sea de la nariz o de la garganta. Si es por vía
nasal se recomienda el uso del espéculo nasal; esta toma puede ser realizada mediante:
1. Hisopo o escobillón delgado flexible (menor rendimiento). Debe introducirse con
cuidado a través del orificio nasal hasta alcanzar la nasofaringe, en donde se deja unos
30 a 60 segundos para que los microorganismos se absorban.

22
2. Una alternativa es tomar la muestra a través de una sonda tratando de llegar hasta
la parte posterior de las fosas nasales
3. El lavado nasofaríngeo es la técnica que ofrece una mayor capacidad de
recuperación del microorganismo.
Remueva las secreciones nasales o exudados que se encuentren en las fosas anteriores,
inserte el espéculo nasal (opcional). Suavemente pase a través de la nariz y llegue hasta
la nasofaringe. Rote el hisopo sobre la membrana nasofaríngea y déjelo por 10 a 15
segundos para que absorba los microorganismos. Retire suavemente el hisopo y
colóquelo en un medio de transporte de acuerdo al microorganismo que desee se
investigue (bacterias o virus)10.

Secreciones óticas
Oído externo: Limpieza del oído externo con un antiséptico suave. Se tomará la muestra
mediante frotis con torunda, raspado o aspiración del fluido en caso de abscesos. Se
obtendrá la muestra del borde activo y el exudado o las secreciones de las zonas
profundas.
Oído medio: Timpanocentesis: Debe obtener la muestra un especialista en O.R.L. o
personal entrenado para ello. Se limpiará el canal auditivo externo con una torunda
impregnada en Povidona yodada. Se puncionará el tímpano a través de un otoscopio
estéril. La muestra se enviará en un contenedor estéril. Cuando no sea suficiente se
tomará con torunda.
Muestras con tímpano roto: Tras la limpieza del canal externo se tomará la muestra con
torunda a través de un otoscopio estéril. El fluido suele colonizarse con flora de CAE, con
lo que la interpretación de los resultados es siempre complicada.

INFECCIONES DEL TRACTO RESPIRATORIO INFERIOR. –

Esputo: requisitos para la toma de muestra, desventajas de esta muestra, criterios de Murray
Washington para establecer como esputo de calidad aceptable para el cultivo.
Aspirado endotraqueal o AT: Se toma en los pacientes intubados y con ventilación mecánica para
la detección de los agentes causales de la infección, desventajas de esta muestra.
Aspirado bronquial, LBA, LB, Cepillado bronquial: mencionar estas muestras tomadas por
Fibrobroncoscopía sin profundizar en el procedimiento invasivo.

ESPUTO
Si bien el esputo es la muestra respiratoria que se obtiene por metodología menos
agresiva, es también una muestra que inevitablemente se encuentra contaminada por
flora de la orofaringe por lo que su valoración e interpretación de los hallazgos debe ser
siempre cuidadosa; a pesar de ello, en muchos casos el esputo sigue siendo una ayuda

10
Recolección y trasporte de muestras en microbiología Clínica. Zurita Jeannete. OPS. 2004

23
para el diagnóstico. Para que sea útil el sembrar una muestra de esputo se debe cumplir
con los algunos requisitos, según la OPS:
• La muestra de esputo debe ser enviada al laboratorio para su procesamiento
dentro de las 2 horas de recolectada, en un recipiente estéril de boca ancha y
tapa rosca.
• Si esto no es posible refrigerarlo (4 a 8°C) pero no más de 24 horas, para evitar la
proliferación de flora comensal y evitar la pérdida de viabilidad de
microorganismos como S. pneumoniae y H. influenzae.
• Una muestra adecuada para cultivo en un paciente inmunocompetente es la que
tiene en la tinción Gram o Giemsa, más de 25 polimorfonucleares y menos de 10
células epiteliales de descamación por campo (bajo aumento 100X), Criterios de
Murray Washington
• Para estudios bacterianos envíe una muestra de más de 1 ml de esputo.
• Para investigación de Mycobacterium realice un seriado de 3 días consecutivos.
Estas pueden almacenarse hasta 5 días en refrigeración sin perder la viabilidad.
Enviar aproximadamente 5 a 10 ml
• No envíe la muestra de esputo para cultivos de anaerobios.
• No recolecte el esputo en 12 o 24 horas para cultivo, ni para ninguna otra prueba,
debido al crecimiento bacteriano excesivo y a la pérdida consecuente de su valor
diagnóstico.

Para la obtención de la muestra de esputo se necesita que el paciente esté alerta y

colabore con la recolección. Es importante indicar al paciente que la muestra debe ser
obtenida por expectoración o tos profunda y no recoger saliva (escupir). El esputo se
obtiene luego de una expectoración profunda después de haberse enjuagado la boca con
agua, e incluso puede haber un cepillado previo de los dientes. Después de esta sencilla
higiene oral, la muestra debe ser recolectada en un frasco estéril de boca ancha y tapa
de rosca. Los recipientes para la recolección de orina son apropiados; se deben rechazar
las muestras que vienen en cajas para heces u otro tipo de cajas, envases caseros, etc.

Muestra: esputo no saliva (ver imagen superior).

Volumen: 2 ml aproximadamente.
Recipiente: envase estéril de boca ancha.

24
ORINA. -

Entre todas las infecciones humanas, las del aparato urinario son una de las más
frecuentes. En cualquier comunidad social suelen ocupar el segundo lugar después de las
respiratorias. Hay un patrón característico y definido relacionado con las distintas etapas
de la vida de los seres humanos. Son frecuentes en la infancia en ambos sexos, en la edad
preescolar y en la escolar para las niñas; en los adultos su incidencia es muy bajas en el
varón, y más alta en la mujer, sobre todo si es activa sexualmente, lleva dispositivos
intrauterinos o está embarazada; en el varón, a partir de los 50-60 años, aumenta la
incidencia, por la obstrucción causada por la próstata y posible instrumentación
urológica; en el anciano, tanto varón como mujer, las alteraciones anatómicas y
funcionales aumentan el porcentaje.

El diagnóstico de ITU (infección del tracto urinario) se basa en la demostración del agente
causal mediante urocultivo.
Tomando en cuenta una recogida adecuada de orina y su remisión inmediata al
laboratorio. Si la muestra de orina no puede ser procesada y cultivada en la media hora
siguiente a su obtención debe ser refrigerada para evitar la multiplicación de los
microorganismos contaminantes. La orina, al igual que la mayoría de muestras
destinadas al estudio bacteriológico, debe recogerse antes de la instauración del
tratamiento antibiótico. Es preferible obtener la muestra de la primera micción de la
mañana. En este momento los recuentos bacterianos serán más elevados debido a la
posibilidad que tienen las bacterias de multiplicarse durante la incubación nocturna (cada
20 minutos). En caso contrario se esperarán 4 horas después de la última micción antes
de recoger la muestra. No se debe forzar la micción con líquidos y si esto sucede debe
constar en la hoja del pedido. La uretra está fisiológicamente habitada por una flora
bacteriana saprófita y la orina vesical estéril del individuo sano puede contaminarse al
pasar por la uretra o al entrar en contacto con secreciones vaginales o del prepucio. Por
lo tanto, la orina recogida sin precaución de limpieza previa de los genitales puede
suministrar resultados falsamente positivos11.
Argumentar la etiología más frecuente de las infecciones del tracto urinario (ITU).

TOMA DE MUESTRA
El objetivo es recolectar una muestra que refleje lo mejor posible las características de la orina
presente en la vejiga urinaria. Se ha comentado en repetidas ocasiones que el reservorio natural
de los uropatógenos es el intestino y que el área perineovaginal de la mujer y el surco balano-
prepucial del hombre, sobre todo fimótico es, a menudo, un reservorio secundario. Además, la
orina debido a sus componentes químicos es un medio de cultivo adecuado para el crecimiento,
por lo que la toma de muestras de la orina debe tomarse con sumo cuidado para que la
colonización accidental sea restringida al máximo.

Métodos de obtención de la muestra: (Explicarlos brevemente, mencionar ventajas y desventajas

de cada uno)
1- Micción espontánea
2- Recolección de la orina en bolsa adhesiva. (Desventajas)
3- Obtención de orina por sondaje vesical transuretral
4- Obtención de orina por punción suprapúbica
5- Recolección de orina en pacientes cateterizados con sonda permanente
6- Recolección de orina en situaciones especiales

11
Manual Micro diagnóstica. Tercera parte. Toma de muestras. LABORATORIO LINSAN S.A.

25
MICCION ESPONTÁNEA
Es una técnica fácil, barata, no invasora y de rápida ejecución que tiene una alta fiabilidad
en la mayoría de los casos si se realiza bajo unas estrictas condiciones. Es la usada entre
nosotros en el 80 % de las ocasiones
Este método de recolección de orina es posible en adultos y en los niños que ya pueden
controlar esfínteres. En el caso de las mujeres adultas el método idóneo de recogida es
el siguiente:
1. Lavado de las manos
2. Lavado de los genitales externos suavemente empleando compresas o gasas
humedecidas con agua y jabón; no utilizar antisépticos pues pueden mezclarse con la
orina y dar resultados falsos negativos.
3. Después del lavado hay que aclarar con agua y secar con una toalla
4. Con los labios aún separados se iniciará la micción desechando el primer chorro de
orina, que por arrastre mecánico limpia el canal uretral. Se recogerá la segunda parte
de la micción (chorro medio) en un recipiente estéril de boca ancha, que
inmediatamente se cerrará y se entregará al laboratorio para su procesamiento.

En el varón la recogida de la orina es más sencilla. Hay que dar instrucciones a los varones
no circuncidados para que retraigan la piel del prepucio. Una vez que se ha realizado la
limpieza del glande y posteriormente a su secado con la gasa o compresa, se recogerá
igualmente la orina a mitad de la micción descartando la primera parte de la misma.

Resumen:
Envase estéril de boca ancha adultos, recolector para muestras pediátricas
• Muestra: micción media.
• Volumen: 0,5 ml mínimo
• Recipiente: envase estéril de boca ancha.
• Consideraciones: primera micción de la mañana., segundo chorro o mitad del chorro.

HECES.-

A nivel mundial, las infecciones gastrointestinales siguen siendo una de las causas más
importantes de morbilidad y mortalidad entre los lactantes y los niños. Se ha estimado que, en
Asia, África y Latinoamérica, dependiendo de factores socioeconómicos y nutricionales, la
probabilidad de que un niño muera antes de los 5 años por estas causas puede llegar al 50%. Las
epidemias de diarrea en lactantes, niños y adultos son generalmente causadas por
microorganismos presentes en el agua o en los alimentos contaminados habitualmente por heces
que presentan microorganismos patógenos. Las infecciones también se pueden transmitir de
persona a persona por contacto directo o a través de fómites.

Etiología de los síndromes gastrointestinales infecciosos más frecuentes

26
En líneas generales, las muestras de heces deben recogerse durante la fase aguda de la infección,
preferentemente durante los 3-5 primeros días de la enfermedad.
Es necesario un mínimo de un gramo de heces, que deben transportarse en un recipiente limpio
y seco de boca ancha preferiblemente de plástico, bien cerrado. Si el transporte y cultivo se van
a demorar más de 4 horas, que suele ser lo habitual, las muestras deben enviarse en medio de
transporte de Cary-Blair, excepto en el caso de sospecha de diarrea por Clostridium difficile, en el
que se deben enviar en un frasco limpio y seco.
• Si no se van a procesar inmediatamente, deben conservarse refrigeradas a 4ºC.
• Deben desecharse las muestras de heces mezcladas con orina, nunca se debe
tomar la muestra del agua del inodoro.
• Tampoco son adecuadas para cultivo o detección de antígeno las heces
conservadas en formol al 10%, en SAF o en PVA.
• Las muestras de heces no deben recogerse en recipientes que contengan suero
animal, iones metálicos, agentes oxidantes o detergentes.
• Los escobillones rectales pueden utilizarse para cultivo pero son inapropiados
para la detección de antígenos.
El análisis de dos o tres muestras de distintos días puede incrementar la probabilidad de identificar
el agente causal. Una vez emitidas, las heces frescas pueden conservarse hasta dos horas a
temperatura ambiente, durante dos días refrigeradas a 4ºC y pasado este tiempo deben
congelarse a -20º C o preferentemente a -70º C. Una muestra descongelada no debe volver a
congelarse, por lo que es recomendable preparar alícuotas.
Es de particular valor el examen físico de una muestra de heces, esta valoración de las
heces permite la:
1. Determinación objetiva de las quejas subjetivas del paciente.
2. Observación de la calidad de las heces; acuosa, mucosa, sanguinolenta, espumosa,
grasosa, etc., que ayuda al diagnóstico.

No se deben procesar las muestras si éstas:

1. No vienen en el recipiente apropiado (limpio, boca ancha, tapa rosca)
2. Están mezcladas con orina
3. Vienen en pañales.
4. Han sido recolectadas de los inodoros o retretes
5. Están contaminadas con agua
6. Contengan purgantes de aceite, bario o sustancias radiopacas, o con carbón o supositorios
de glicerina, etc.
7. No están en medio de transporte (Cary Blair), en el caso de solicitarse coprocultivo.

Todas las muestras deben ir acompañadas de la siguiente información: Nombre del

paciente, nombre del médico, fecha y hora de la recolección de la muestra, diagnóstico
presuntivo, historia de viajes relevantes.

¡Recuerda!:
Las heces destinadas a cultivarse para la búsqueda de bacterias enteropatógenas deben
ser diarreicas, caso contrario no se justifica la realización de un coprocultivo, (una
excepción, es la búsqueda de Salmonella typhi). La diarrea es un síntoma común que
puede variar de intensidad de una molestia aguda autolimitada a una enfermedad grave
que pone en peligro la vida del paciente. La diarrea puede ser aguda o crónica, la primera
es de inicio agudo y persiste menos de dos semanas, mientras que la crónica es mayor a
este período. La diarrea aguda es causada comúnmente por agentes infecciosos, en su
mayoría por toxinas bacterianas (ya sea preformadas ingeridas, en alimentos o
producidas en el intestino). La información epidemiológica puede proporcionar indicios

27
sobre el agente etiológico, así, el consumo de mariscos en el caso de Vibrio
parahemolyticus, tratamiento antimicrobiano en el caso de Clostridium difficile.
81
SECRECIONES GENITALES: (Incluiremos las sec. uretrales, vaginales y endocervicales).

Mencionar brevemente la etiología más frecuente de Uretritis masculina, infecciones vaginales

y cervicitis.

Para la toma de la secreción uretral masculina.-

Para obtener un mejor rendimiento, el paciente no debe haber orinado en las 2 horas previas a la
realización de la toma de la muestra. Se deben usar torundas finas con varilla de alambre, de
alginato cálcico o dacrón y con medio de transporte tipo Stuart-Amies.
Si existe secreción abundante, puede recogerse con hisopo, incluso exprimiendo la uretra desde
atrás hacia delante para evacuar el exudado..
Si no fuese el caso, se debe introducir la torunda suavemente por la uretra unos 2 cm realizando
un movimiento de rotación suavemente, para posteriormente extraerla e introducirla en el medio
de transporte.

Toma de muestras de secreciones vaginales

Se precisa un espéculo que se introducirá sin la utilización de lubricante.
Utilizando una torunda de alginato cálcico o de dacrón se recomienda recoger el exudado de la
zona donde éste sea más abundante en las paredes, o del fondo de saco vaginal posterior.
Estas muestras son óptimas para el diagnóstico de Cándida spp, Trichomonas vaginalis, y Vaginosis
bacteriana.
se debe realizar la toma de exudado endocervical (excepto en mujeres histerectomizadas en las
que se realiza la toma en el fornix posterior). Se deben enviar dos muestras, vaginal y
endocervical, debidamente rotuladas para que el laboratorio emplee cada una en la recuperaciÛn
de los patÛgenos que con mayor probabilidad se encontrar·n en cada caso. En niÒas est· indicado
el cultivo de Haemophilus spp. y estreptococos beta-hemolÌticos aunque se pueden producir
casos de vulvovaginitis por estos microorganismos tambiÈn en mujeres adultas por lo que su
presencia puede indicar patologÌa o bien estado

Para la toma de muestra del endocérvix. –

Para la búsqueda de: Gonococo y Chlamydia trachomatis.
Se debe proceder inicialmente de forma similar a la utilizada para la toma del exudado vaginal, y
visualizar el cuello uterino, antes de obtener la muestra es necesario limpiar el moco cervical con
una torunda seca o con una gasa estéril sujeta con pinzas y descartarla.
Posteriormente, se debe comprimir suavemente el cérvix con el espéculo para introducir la
torunda en el canal hasta 2 cm en el interior del conducto cervical y girar suavemente, retirar y
colocar inmediatamente en el medio de transporte.
La toma de secreción vaginal para la investigación de N. gonorrhoeae está indicada únicamente
en mujeres que han sido sometidas a una histerectomía y en las prepúberes. En las primeras se

28
 deberá utilizar un espéculo vaginal para tomar la muestra del fondo de saco posterior y en el caso
de las prepúberes es suficiente la toma del exudado sin el uso de espéculo.

Imagen tomada en internet: Universidad de Michigan. Caren Stalburg, M.D. 2009

Resumen:
• Muestra: secreciones vaginales o uretrales, torundas de cérvix.
• Volumen: 1 o 0,5 ml.
• Recipiente: medio de transporte Stuart (en muestras líquidas usa el tubo estéril, o
Frasco Transporte PE-Lin).
• Consideraciones: para estudio de Chlamydias utilizar medio de transporte específico.

SANGRE

La detección de la bacteriemia y la fungemia constituye una de las prioridades del Servicio de

Microbiología Clínica, dada su importancia diagnóstica y pronóstica. Estos procesos se asocian a
una mortalidad elevada, que puede oscilar entre el 10% y el 30% según las series y según el tipo
de paciente, el origen y el manejo inicial. La gravedad de esta entidad clínica requiere de la
administración rápida de tratamiento antibiótico empírico en función de los datos clínicos y de la
epidemiología local de la resistencia antibiótica.
Por tanto, el hemocultivo sigue siendo actualmente el principal método de diagnóstico para
determinar la etiología de una bacteriemia. Su fácil realización lo hace asequible a cualquier
centro y es el único método que hasta el momento permite el aislamiento del microorganismo
viable, necesario para determinar su sensibilidad antibiótica.
La muestra de sangre para hemocultivo debe extraerse de una vena, utilizándose generalmente
las del antebrazo. La utilización de sangre arterial no ha demostrado ventajas sobre la venosa. La
extracción no debe realizarse a través de catéteres intravenosos o intaarteriales, tal y como lo
recomienda la American College of Physicians, salvo en los casos de sospecha de bacteriemia
asociada a catéter.
Cada muestra de sangre se obtendrá de lugares de venopunción diferentes.

ASEPSIA DE LA PIEL.
El principal problema para la interpretación correcta de los hemocultivos es su contaminación con
la microbiota cutánea durante la extracción. Para evitarla debe prepararse antes
meticulosamente la piel de la zona de extracción:
➢ Después de la palpación de la vena elegida para la punción se limpiará la zona con alcohol
isopropílico o etílico de 70º durante 30 segundos.
➢ Se aplicará a continuación una solución yodada (tintura de yodo al 1-2% durante 30
segundos o povidona yodada al 10% durante 1 minuto) cubriendo un área circular de 2-4
cm de diámetro. Es importante dejar secar el compuesto yodado para que ejerza su acción

29
 oxidante y evitar tocar con los dedos el lugar de la venopunción, así como hablar o toser
mientras se realiza la extracción. En pacientes alérgicos a los compuestos yodados se deben
realizar dos limpiezas con alcohol isopropílico.
➢ Con una técnica aséptica correcta, el número de hemocultivos contaminados no debe
exceder del 3%
➢ El uso de la clorhexidina, que es lo que recomienda actualmente la Sociedad Española de
Microbiología e Infectología clínica, se puede sustituir por otros antisépticos mencionados
anteriormente como el alcohol o povidona yodada.

EXTRACCIÓN DE LA MUESTRA DE SANGRE.

❖ Antes de proceder a la extracción se limpiarán los tapones de los frascos de hemocultivo
con un antiséptico que se dejará secar para evitar su entrada en el interior del frasco al
inocular la sangre. Se ha demostrado que la introducción de pequeñas cantidades de
antiséptico en el frasco puede inhibir el crecimiento bacteriano.
❖ A continuación, se insertará la aguja en la vena elegida y se extraerá el volumen de sangre
sin utilizar anticoagulante.
❖ No debe ponerse algodón u otro material no estéril sobre la aguja en el momento de
sacarla de la vena.
❖ Los frascos de hemocultivo deben inocularse rápidamente para evitar la coagulación de
la sangre en la jeringa, atravesándolos con la aguja en posición vertical.
❖ Diferentes estudios demuestran que el cambio de agujas no disminuye la tasa de
contaminación y aumenta el riesgo de pinchazo accidental y otros sugieren lo contrario.
❖ Se inoculará en primer lugar el frasco anaerobio, evitando la entrada de aire, seguido del
aerobio, invirtiéndolos varias veces para mezclar la sangre y el medio de cultivo.

NÚMERO E INTERVALO DE LAS EXTRACCIONES:

Se considera una extracción para hemocultivo a la sangre extraída de una única venopunción,
independientemente de los frascos en los que sea inoculada, habitualmente dos (aerobio y
anaerobio).
• El número de extracciones considerado óptimo para la documentación de un episodio de
bacteriemia es de 2 a 3, utilizando siempre lugares diferentes de venopunción. De este
manera logran detectarse más del 95% de las bacteriemias. Un mayor número de
extracciones es desaconsejable desde el punto de vista coste/beneficio e incrementa
innecesariamente el trabajo del laboratorio. (Hay excepciones)
• De todas las variables que influyen en el aislamiento de una bacteria u hongo en un
hemocultivo, el volumen de sangre cultivada es la más importante debido al bajo número
de microorganismos presentes en la mayoría de las bacteriemias.
VOLUMEN:
• La mayor parte de los escasos recuentos realizados muestran cifras próximas a 10 UFC/ml
de sangre o inferiores y muy rara vez se superan 100 UFC/ml. En niños las cifras son muy
variables. El volumen recomendado por cada venopunción en adultos es de 10 ml, ya que
con volúmenes menores se ha demostrado una disminución del índice de positividad.
• Se considera que el índice de positividad aumenta entre el 3-5% por cada mililitro
adicional de sangre cultivada. Sin embargo, la recomendación de elevar el volumen de
sangre por extracción no se aplica, en cierta medida por la anemia que se puede provocar
al paciente y para mantener la proporción de volumen sangre/medio de cultivo.
• La dilución final recomendada es de 1/5 a 1/10 (volumen/volumen) ya que diluciones <
1/5 reducen la positividad.

30
LCR.-
El paciente se acuesta de lado con las rodillas encogidas hacia el abdomen y la barbilla
pegada al tórax. Algunas veces, este procedimiento se realiza con la persona sentada,
pero doblada hacia adelante. Después de limpiar la espalda, el médico inyectará
anestésico local en la región lumbar. Se introduce una aguja espinal, generalmente en el
área lumbar. Una vez que se ha ubicado la aguja adecuadamente, se mide la presión del
líquido cefalorraquídeo y se recoge la muestra. Luego, se retira la aguja, se limpia el área
y se aplica un vendaje sobre el sitio. Con frecuencia, se le pide a la persona permanecer
acostada por un corto período de tiempo después del examen.
Contraindicaciones:
• Pacientes con presión intracraneal elevada
• Pacientes con enfermedad articular vertebral degenerativa (Artrosis Intensa)
• Pacientes con focos infecciosos cercanos al sitio de punción
• Pacientes con problemas en la coagulación

http://raulcalasanz.wordpress.com/

Resumen:
• Muestra: líquido cefalorraquídeo.

31
• Volumen: 1 ml habitualmente, ≥ 5 ml para micobacterias.
• Recipiente: tuvo estéril.
• Consideraciones: el primer tubo puede verse hemático como en la imagen, se debe
diferenciar entre hemorragia y trauma.

SECRECIONES DE PIEL Y PARTES BLANDAS

Las infecciones de piel y tejidos blandos incluyen a todas las que afectan a piel y anejos cutáneos,
tejido celular subcutáneo, fascias y músculo estriado y son, junto con las infecciones de las vías
respiratorias, las infecciones más frecuentes en clínica humana.

Tipos de infecciones:
1) Infección de la herida quirúrgica (IHQ)
2) Infecciones agudas de tejidos blandos
3) Infecciones de mordeduras
4) Infecciones de quemaduras
5) Infecciones de úlceras por presión y de otras heridas crónicas (úlceras vasculares venosas)
Infección del pie diabético

La muestra debe tomarse de una zona representativa de la infección y en cantidad adecuada y

evitando, en lo posible, la contaminación con la microbiota normal.

Consideraciones generales
- Se recomienda obtener la muestra únicamente de aquellas lesiones que presenten signos
clínicos de infección, que se estén deteriorando o que no cicatricen después de un periodo
de tiempo largo.
- La toma de muestras debe precederse de la limpieza y desinfección del área de la toma.
• En biopsias y heridas cerradas, se recomienda desinfectar la piel con clorhexidina
al 2% o etanol de 70%, seguidamente pintar con povidona iodada al 10%, dejar
secar y eliminar el iodo con etanol antes de tomar la muestra.
• En heridas abiertas, se recomienda eliminar el material necrótico y los tejidos
desvitalizados y lavar a chorro con suero salino estéril.
- Se recomienda tomar muestra de tejido viable infectado y no de restos superficiales.
- La muestra de tejido o la obtenida por aspiración son las mejores desde el punto de vista
microbiológico.
- Aunque, en general, no se recomienda tomar muestras superficiales mediante torunda, es
un método sencillo, barato, no invasivo y conveniente para la mayoría de las heridas
abiertas. Se ha cuestionado en base a que la microbiología de la superficie de la herida
puede no reflejar exactamente lo que ocurre en profundidad, y que pueden aislarse
microorganismos de la microbiota comensal del individuo e incluso microorganismos
patógenos que no participan en la infección. Sin embargo, dado que la mayoría de las
heridas están colonizadas con microorganismos de origen endógeno, cualquier
microorganismo presente en la profundidad de la herida es muy probable que también esté
en la superficie.
- Las muestras de trayectos fistulosos no representan la verdadera etiología en casos de
osteomielitis subyacente y no se recomienda tomarlas.
- Se deben utilizar contenedores apropiados para cada tipo de muestra.

Obtención de la muestra tras la limpieza y desinfección:

❖ Abscesos cerrados: se recomienda aspirar el pus con jeringa y aguja, preferiblemente a

través de una zona de piel sana. Si así no se obtuviera una muestra, se puede inyectar

32
 suero salino estéril subcutáneo, y volver a aspirar. Una vez realizada la aspiración se debe
expulsar el aire, tapando la aguja con una gasa estéril impregnada en alcohol para eliminar
el riesgo de aerosoles. Se puede tapar el cono de la jeringa con un tapón, asegurarlo bien
y enviar así la muestra al laboratorio.

❖ Heridas abiertas: con una torunda se debe muestrear un área de aproximadamente 1 cm2
del tejido celular subcutáneo de los bordes de la herida o de la base de la lesión. No se
debe frotar con fuerza para evitar el sangrado. En el caso de heridas muy secas, se
recomienda impregnar la torunda con suero salino estéril antes de realizar la toma. Se
recomienda que la torunda sea de alginato. Se enviar· en un medio de transporte
específico (por ejemplo, Amies/Stuart/medio de transporte para anaerobios). –
❖ Pus: se recomienda aspirar el pus de la zona más profunda de la herida con jeringa y aguja.
La muestra se inocular· en un vial de transporte para anaerobios, como en el caso de los
abscesos cerrados.
❖ Tejidos obtenidos mediante curetaje y biopsias: se recomienda obtener suficiente
muestra, evitando las zonas necróticas. Estas muestras pueden obtenerse mediante
punción-aspiración con aguja fina o con cualquier dispositivo al efecto.

Actividades a realizar:
La práctica puede dividirse en dos partes dado el contenido del tema, para facilitar el
entendimiento de los estudiantes.

Al finalizar la práctica el par responsable debe ahondar más sobre las diferentes tomas
de muestras, mostrando de ser posible videos sobre los procedimientos más comunes,
haciendo hincapié en la técnica como en los materiales a usarse.

Se debe investigar sobre los microorganismos que se encuentran normalmente en las

diferentes zonas anatómicas, para no confundir la “microbiota” de un agente patógeno.

Se procederá a sacar muestras de los propios compañeros recordando las medidas de

bioseguridad y obteniendo un consentimiento informado previo.

Generalmente por la factibilidad y sencillez se procede a tomar muestras de exudado

faríngeo entre los estudiantes y se puede llevar a cabo igualmente la toma de muestras
de sangre venosa con las medidas de bioseguridad requeridas.

Tema 5: Tinciones

Objetivo General:
Conocer el fundamento y aplicar las tinciones que se usan con más frecuencia en
el laboratorio de microbiología. (Gram y Zielh Neelsen)

Objetivos específicos:
1. Diferenciar las características de las tinciones según el número de
colorantes a usarse.
2. Recordar los componentes de la pared bacteriana para el fundamento
científico de las tinciones de Gram y Zielh Neelsen
3. Aplicar las tinciones y reportar los resultados obtenidos.

33
Justificación.- dado que la mayoría de las veces que se mencionen a las bacterias serán
como “gram positivas” y “gram negativas” es necesario que los estudiantes sepan el
origen de estos términos para que lo manejen con soltura a lo largo de su carrera.

Marco teórico.-

Tinción:
Es el proceso por el cual las moléculas de un colorante se adsorben a una superficie. El
uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los microorganismos y poder
realizar la observación en microscopio óptico. Dado que las bacterias son casi incoloras,
no presentan contraste con el medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden
observarse claramente sin algún tratamiento previo.
De acuerdo a la reacción que ocurre, existen diferentes tipos de tinción:

a) Tinción simple:
El colorante utilizado sirve solo para denotar la morfología celular.

b) Tinción negativa:
Es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir, pero se
colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las
células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene
afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como
la tinta china (que es una suspensión de partículas de carbono coloidal) o la nigrosina (un
colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de
aumentar el contraste de las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad
está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas. Ejemplo:
Criptococo neoformans12.

c) Tinción compuesta:
El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre células bacterianas o entre
partes de una misma célula. Estas técnicas utilizan más de un colorante o bien ciertos
reactivos complementarios para la tinción. Ejemplos: Tinción de Gram, Tinción de Ziehl-
Neelsen, etc.

Colorantes
Los colorantes más utilizados: azul de metileno, cristal violeta, safranina, son catiónicos
y se combinan fuertemente con componentes celulares cargados negativamente, como
los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos (las envueltas externas de los
microorganismos están por lo general cargadas negativamente).

12
Microbiología General y Bucal. Práctica 4: Diagnóstico Microbiológico Directo. Universidad de
Salamanca

34
Materiales y reactivos:
· Portaobjetos
· Cubreobjetos
· Microscopio óptico
· Solución de cristal violeta al 1 %
· Solución de azul de metileno al 1 %
· Solución de safranina al 1 %
· Solución decolorante (alcohol etílico y
acetona 1:1) · Solución de I2 / I- (yodo /
yoduro al 0.1 %) · Cultivo (caldo o agar) a
teñir.
· Asa de punta y asa redonda.
· Mecheros
· Alcohol etílico
· Gasa

Tinción de Gram.-
Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la
desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias
pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los
términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrica, sino simplemente
designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias).

Proceso:
Preparación de la extensión en la placa
Fijación con calor o metanol
El Frotis fijado con calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con
solución Yodada durante 1 - 2 min y se lava de nuevo con agua (chorro fino), Se decolora
con una mezcla de alcohol etílico/acetona por 30 segundos máximo.
Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 1 – 2 min. Lavar, secar al
ambiente y observar en el microscopio.

Fundamento:
Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las
diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula
bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis
osmótica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el
peptidoglicano. La pared de la célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas
interconectadas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-
90% de la pared de la célula gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la célula gram-
negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de
peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos,
lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula gram-negativa
es peptidoglicano13.

13
Microbiología médica. Jawetz. 25º edición

35
Reporte de resultados:
La tinción de Gram es usada para clasificar bacterias sobre la base de sus formas,
tamaños, morfologías celulares y reacción Gram (color). A nivel del laboratorio es útil
como test para un rápido diagnóstico presuntivo de agentes infecciosos, tanto en
muestras como en cultivos en crecimiento, y adicionalmente sirve para valorar la calidad
de la muestra clínica. Las bacterias se tiñen gram positivas (+), gram negativas (–) o no se
tiñen debido a sus diferencias en la composición de su pared y arquitectura celular.

Existen una serie de puntos con respecto a un buen control de calidad de las tinciones de
Gram, y que deben ser tenidas en cuenta antes de su realización, a saber:
✓ Diariamente se debe comprobar que no existen precipitados ni cristales en la
solución de cristal violeta. Si los hay, filtrar antes de su uso.
✓ La estabilidad de la solución de cristal violeta, alcohol y/o acetona, safranina o
fucsina básica es de 1 año y la de la solución de lugol de 6 meses, todas ellas
conservadas en frascos cerrados (la evaporación puede alterar su efectividad) a
temperatura ambiente.
✓ Ciertos procedimientos de laboratorio pueden dificultar la interpretación
microscópica de la tinción, como son la preparación de extensiones demasiado
gruesas, uso de portas que no han sido prelavados o desengrasados,
sobrecalentamiento en la fijación y excesivos lavados durante la tinción. Todos
los anteriores son causas comunes de pobres resultados en la tinción de Gram.
✓ Debe tenerse en cuenta que no todos los microorganismos observados en una
tinción pueden ser cultivados, y al contrario, algunos no observados pero
presentes consiguen ser recuperados en el cultivo.
✓ Supervisión diaria de unas cuantas tinciones elegidas al azar por personal
especializado, para confirmación de coincidencias y posibles discrepancias 14.

Ejemplos:

14
Dr. Adrián Navarro Domínguez. Especialista en microbiología

36
 Bacillus antrhacis (gram positivo) Pseudomona auruginosa (gram negativo)

Tinción de Zielh Neelsen.-

Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos
(ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren
la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción
con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes (BAAR).

PROCEDIMIENTO:
Preparación del extendido
1. Ordenar las muestras
2. Marcar los portaobjetos
3. Partir el aplicador
4. Seleccionar la partícula más purulenta
5. Depositar en el portaobjetos
6. Extender la muestra uniformemente, en forma de óvalo sin tocar los
bordes del portaobjetos
7. Fijar el extendido cuando esté totalmente seco

Tinción de Ziehl Neelsen15

1. Cubrir con fucsina filtrada
2. Calentar hasta emisión de vapores tres veces durante 5 Minutos
3. Lavar con agua
4. Cubrir con decolorante durante 3 minutos (alcohol etílico 95% con un 3%
de ClH concentrado)
5. Lavar con agua
6. Cubrir con azul de metileno durante 1 minuto
7. Lavar con agua
8. Secar al aire
9. Observar al microscopio con lente de inmersión Ejemplos:

REPORTE DE RESULTADOS16

15
MANUAL PARA EL DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO DE LA TUBERCULOSIS. NORMAS Y GUÍA
TÉCNICA PARTE I. Baciloscopia. 2008. OPS
16
MANUAL PARA EL DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO DE LA TUBERCULOSIS. NORMAS Y GUÍA
TÉCNICA PARTE I. Baciloscopia. 2008. OPS

37
Resultado del examen microscópico Informe

No se encuentran BAAR en los 100 No se observan bacilos ácido alcohol

campos observados resistentes
Se observan de 1 a 9 BAAR Nº exacto de bacilos en 100
en 100 campos observados campos
Se observa entre 10 y 99 BAAR Positivo (+)
en 100 campos observados
Se observan de 1 a 10 BAAR por Positivo (++)
campo en 50 campos observados
Se observan más de 10 BAAR por Positivo (+++)
campo en 20 campos observados

¡Recuerda!:
- Si observa BAAR que se mueven en forma anormal, pueden ser bacilos
provenientes de otra baciloscopia que fueron arrastrados por el aceite
de inmersión y es necesario reemplazarlo y repetir la baciloscopia.
- Si se observan cuerpos extraños (artefactos) que se mueven cuando se
desplaza el portaobjetos, pueden ser restos de alimentos, precipitados o
cristales. Si sólo se mueven cuando se gira el ocular, se trata de suciedad
que está en el ocular y hay que proceder a limpiarlo.
- Si no se mueven, la suciedad o bacilos contaminantes puede estar en los
objetivos, el condensador, el espejo o la fuente de iluminación; proceder
a limpiarlos.
Se debe contar el número de campos que se ha leído y el número de BAAR que
se ha identificado. Se puede utilizar una cuadrícula de 10 cuadrados por 10
cuadrados, que representan los 100 campos microscópicos, como ayuda para
registrar la cuenta. En cada cuadrado anotar el número de BAAR que se observa.
Si no observa BAAR consignar 0.

DERIVACIÓN DE MUESTRAS PARA CULTIVO

El cultivo incrementa la posibilidad de detectar el bacilo de la tuberculosis en las
muestras de casos que están afectados por un bajo número de bacilos, como los
niños (tuberculosis primaria) o pacientes con tuberculosis extrapulmonar.
Además, permite diferenciar el bacilo de la tuberculosis de otras micobacterias
en muestras donde se pueden encontrar ambos, como en orina, contenido
gástrico, o las de pacientes que viven con VIH. Por último, permite conocer la
sensibilidad de bacilos a drogas antituberculosas e identificar los casos que
pueden no responder al esquema de tratamiento de primera línea.

Actividades a realizar: la tinción de Gram, la baciloscopia y la tinción de Zielh

Neelsen son de mucha importancia para el diagnóstico de enfermedades
infecciosas, estos dos últimos en especial para la tuberculosis. Es necesario que
los estudiantes realicen una investigación previa de los datos estadísticos sobre
este tema tanto a nivel nacional como mundial, para concientizarse sobre la
problemática de esta patología y se familiaricen con el esquema de tratamiento
de primera línea.

Se realizará la práctica sobre tinciones y se procederá a graficar en los siguientes

cuadros el reporte de lo que se observe para presentar al finalizar la misma:

38
 Tinción de: Placa 1 Placa 2
Esquema de campo
microscópico representativo

Descripción:

Muestra:

Forma:

Agrupamiento de células:

Bacteria encontrada:

Observaciones:

Tinción de: Placa 3 Placa 4

Esquema de campo
microscópico representativo

Descripción:

Muestra:

Forma:

Agrupamiento de células:

Bacteria encontrada:

Observaciones:

39
Tema 6: Medios de Cultivo

Objetivo General:
Identificar los medios de cultivo más utilizados en el laboratorio de microbiología

Objetivos específicos:
1. Conocer los tipos básicos de medios de cultivos según su naturaleza,
estado físico y funciones.
2. Conceptualizar los medios de cultivo
3. Definir la importancia de su uso en un laboratorio microbiológico.
4. Conocer su composición básica y específica de los medios de mayor uso.
5. Conocer su preparación y conservación.

Justificación.- La mayoría de las enfermedades infecciosas a través de la clínica llegan a

un diagnóstico presuntivo, y para alcanzar al diagnóstico etiológico es necesario el aporte
del laboratorio microbiológico donde se realizan diversas pruebas diagnósticas directas
e indirectas, entre las primeras están los cultivos.

Marco teórico.-

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es

observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de
Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de
10.000 medios de cultivo diferentes.

Condiciones generales para el cultivo de microorganismos:

✓ Disponibilidad de nutrientes adecuados

✓ Consistencia adecuada del medio
✓ Presencia o ausencia de oxígeno y otros gases
✓ Condiciones adecuadas de humedad
✓ Luz ambiental
✓ pH
✓ temperatura
✓ esterilidad del medio

Para crecer, un microorganismo necesita nutrientes que le aporten energía y elementos

químicos para la síntesis de sus constituyentes celulares. La mayoría de las bacterias
patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos
orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una
infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes
indispensables para la vida como: Oxígeno, Nitrógeno, Hidrógeno, Carbono, Fe, S, Na, K,
etc.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de
cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al

40
enfriarse a 40°. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las
bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él 17.

En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de

enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los
hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el
valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los
microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden
para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

También se añaden colorantes que actúan como indicadores de pH para detectar, por
ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y
no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo
en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento
de la mayoría de las bacterias Gram-positivas).

De acuerdo con lo antes mencionado los medios de cultivo se pueden clasificar:

Según su estado físico:

❖ Líquidos
❖ Solidos
❖ Semisólidos

Según su condición:
❖ Animados (huevos de gallinas, líneas celulares “HELA”, animales: cobayos, ratas,
etc.) En estos medios crecen los virus y bacterias muy pequeñas como las
Rickettsias y las Clamidias
❖ Inanimados (origen vegetal, mineral o animal (sangre, leche, suero, etc.))
❖ Sintéticos o construidos en el laboratorio de fórmula conocida como por ejemplo
un caldo nutritivo puede tener: agua 1000 ml, CL Na 9 gr, peptona 15 gr, glucosa
50 gr.

Según sus funciones:

❖ Medios básicos.- Contienen los nutrientes indispensables para el crecimiento del
microorganismo. Utilidad: transporte (Medios que garantizan que los
microorganismos permanecen viables desde el momento de la toma de la
muestra hasta su procesamiento en el laboratorio.) y conservación de una
muestra, realizar antibiogramas y usarlos como base para construir medios
específicos o complejos.
❖ Medios específicos.- A más de su contenido nutricional básico se los agrega otras
sustancias que cumplirán funciones determinadas, obteniendo tres clases de
medios específicos:
Enriquecidos,
Selectivos,
Diferenciales.

Enriquecidos.- Suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal,

potenciando el cultivo y crecimiento deseado. Ejemplo. Agar base sangre +
sangre de oveja = Agar sangre. Estos medios nos sirven para favorecer el
crecimiento de bacterias exigentes como los Estreptococos y Haemophilus.

17
Manual Micro diagnóstica III parte. TOMA DE MUESTRAS, MEDIOS DE TRANSPORTE, MEDIOS DE
CULTIVO, y PRUEBAS DIFERENCIALES. LABORATORIO LINSAN S.A. M. Loreto Gardeweg M.

41
 Selectivos.- Se agrega sustancias que favorecen el desarrollo de unos
microorganismos e inhiben el crecimiento de otros. Ejemplo: Mc Conkey a más
de los nutrientes básicos contiene cristal violeta y sales biliares que inhiben a
bacterias Gram-positivas y favorecen el desarrollo de Bacilos Gramnegativos
especialmente los miembros de la familia Enterobacteriaceae (Escherichia coli).
Diferenciales.- Útil para el estudio de peculiaridades fisiológicas específicas para
cada especie pues contiene sustancias que permiten la diferenciación de unas
bacterias con otras. Ejemplo: Mc Conkey también es diferencial y contiene
lactosa como sustrato y rojo neutro como indicador y así los diferencia a las
fermentadoras de lactosa que forman colonias rosadas de las no fermentadoras
como los Proteus y Salmonellas que forman colonias no rosadas blanca, grises
o negras.

Según su utilidad práctica:

Para aislamientos especializados.- formulaciones nutritivas especiales que satisfacen

requerimientos de grupos específicos de bacterias, ayudando a su identificación (medio
de Lowestein)
Principales medios utilizados en microbiología18

18
Diagnóstico microbiológico. Bailey & Scott. 12º edición.

42
 Desarrollo de la práctica.-

Materiales necesarios
. Medios liofilizados en frascos
. Medios preparados en cajas, frascos y en tubos.
. Probetas, Pipetas, Frascos de Erlenmeyer, Balanza, Agua destilada, Sangre fresca
desfibrinada de oveja, Cocina, Autoclave y refrigeradora.

Técnicas y procedimientos:

El docente, ayudante o estudiante asignado realizará una presentación demostrativa de

los diferentes medios de mayor utilidad en el laboratorio. Presentará ejemplos de medios
animados e inanimados sea en forma gráfica o en forma directa. Además de medios
sólidos (agar nutritivo), semisólidos (SIM), líquidos (caldo nutritivo).

Actividades a realizar:

El estudiante de medicina no necesariamente debe realizar la preparación de los medios

sin embargo es importante conocer los diferentes medios preparados y los usos que se
los dará de acuerdo a sus requerimientos para un cultivo como método diagnostico
directo.
Cuestionario de Evaluación de la práctica.

.Defina que es un medio de cultivo, su importancia y usos.

.Que es un medio básico y los usos se los da en un laboratorio.

.Clasifique los medios de cultivo según sus funciones.

¿De qué medio de cultivo se tratan los siguientes gráficos y que bacterias pueden crecer
en cada uno de estos medios?

Grafico 1: Grafico 2: Grafico 3:

43
Nombre: Nombre: Nombre:

Bacterias a crecer: Bacterias a crecer: Bacterias a crecer:

Tema 7: Cultivos

Objetivo general:
Entender la importancia de un cultivo bacteriano como método diagnóstico directo.

Objetivos específicos:
1. Conocer las etapas de un cultivo.
2. Ejecutar las técnicas y procedimientos de un cultivo.
3. Leer e interpretar un crecimiento primario.
4. Entender los aislamientos y resiembras.
5. Conocer las pruebas de identificación aplicadas.
6. Relacionar los resultados con el estado clínico del paciente.

Justificación.- El cultivo como método diagnóstico directo en las infecciones bacterianas

es de gran importancia por su mayor especificidad y sensibilidad en relación con la
microscopia, a través del cultivo se identifican a las bacterias por géneros y hasta por
especies, además con el aislamiento del agente nos permite determinar la sensibilidad o
resistencia del microorganismo con los antibióticos de elección.

Marco teórico.-

44
En el ámbito médico el cultivo bacteriano es un importante método diagnóstico directo
que nos permite el aislamiento e identificación de los microorganismos causantes de un
proceso infeccioso. El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza,
en la mayoría de los casos, mediante la producción de colonias aisladas en cultivos
sólidos. El crecimiento de las bacterias produce un gran número a partir de una única
célula inicial de forma que, tras un periodo de tiempo de incubación en las condiciones
ambientales adecuadas, se produce una colonia de individuos iguales.

Los cultivos como procedimiento técnico para la identificación bacteriana, tiene

diferentes etapas, realizadas específicamente en medios sólidos de amplia superficie o
en medios preparados en cajas de Petri.

Etapas de un cultivo19

1. Siembra: es colocar una parte de la muestra en el medio de cultivo. A la vez tiene

dos sub-etapas.
1.1. Inoculación: es el acto de tomar una porción representativa de la muestra con un
aplicador o asa estéril y depositar en un área delimitada del medio.
1.2. Diseminación: Con asa bacteriológica estéril se dispersara la muestra en toda la
superficie del medio con el afán de permitir el crecimiento aislado de las colonias
o cepas bacterianas, esto facilitara la lectura e interpretación del crecimiento así
como el aislamiento para las resiembras.
2. Incubación: a más de los nutrientes en los medios es la provisión de los factores
ambientales requeridos para el crecimiento bacteriano: Temperatura ideal: 37 oC,
Aireación según los requerimientos: O2 aeróbicos, No O2 anaeróbicos, CO2
capnófilos, poco O2 micro-aerobios.
Humedad, según el microorganismo a cultivar.
Tiempo: 18 a 24 horas (la mayoría de bacterias patógenas, existen excepciones).
3. Lectura e interpretación primaria: Se basa en el crecimiento o la presencia de
microrganismos que se pueden detectar mediante visualización directa. Cambios
bioquímicos, crecimiento en medios selectivos, turbidez en medios líquidos o
sólidos, cambios citopáticos en cultivos celulares. Transcurrido el tiempo
necesario se procede a realizar la lectura del crecimiento primario y su
interpretación; esto variará según el tipo de muestra cultivada, muestra
biológicas con flora normal (exudado faríngeo), muestras normalmente estériles
(sangre o LCR), Muestras patológicas etc.
4. Aislamiento y resiembra para cultivo puro: luego de interpretar un crecimiento
bacteriano y considerarlo válido o como una contaminación se procederá a
realizar el aislamiento de las colonias presuntivas o sospechosas de pertenecer a
un agente relacionado con el proceso infeccioso, el mismo se ejecuta tomando
una o parte de la colonia con una aguja bacteriológica estéril y se traslada/
resiembra en otro medio sólido o liquido estéril así se obtiene un cultivo puro.

Pasos de una Resiembra:

19
Manual de Micro diagnóstica. III parte: TOMA DE MUESTRAS, MEDIOS DE TRANSPORTE, MEDIOS DE
CULTIVO, y PRUEBAS DIFERENCIALES. LABORATORIO LINSAN S.A.

45
5. Pruebas de identificación: Son reacciones bioquímicas y fisiológicas que sirven
para diferenciar con otras bacterias y caracterizarlas como género o especie.

Métodos técnicas y procedimientos.-

La selección de un medio de cultivo se basa en los microorganismos con mayores
probabilidades de participación en el proceso patológico. En el caso de muestras
contaminadas, como en el caso de una fístula anal, se debe usar un medio
selectivo como el de CNA (agar Columbia con Colistina y ácido nalidíxico). Este
inhibe las bacterias gram negativas y permite el aislamiento de gram positivos y
levaduras.

Tipos de Siembras:

Siembra por Dilución.- Se toma el tubo de ensayo con medio líquido, como el
caldo simple. Se toma el material a diluir y se siembra en el tubo con el uso del
asa cargada con el material bacteriológico, se agita, con movimientos
moderados. Esta técnica no se utiliza al menos que sea imposible el cultivo en
placa.

Medio de cultivo: líquido

Instrumento: asa
Finalidad: poner la bacteria en suspensión.

Siembra por estrías de superficie.- Se siembra el material en la superficie del

agar inclinado en un tubo de ensayo, allí se extiende por toda la superficie con
el asa bacteriológica, previamente esterilizada y cargada con el material a
sembrar, haciendo estrías. Se inicia por la parte más profunda de la superficie
inclinada y se termina la estría en la parte más cerca de la boca del tubo.

Medio de cultivo: agar base inclinado

Instrumento: asa o aguja bacteriológica
Finalidad: obtener masa bacteriana

Siembra por estría por agotamiento.- Se puede separar las colonias y aislarlas
fácilmente. Con el asa esterilizada se toma material de un cultivo heterogéneo y
se descarga sobre la superficie del medio formando estrías.

46
 Medio de cultivo: solido en placa de Petri
Instrumento: Asa
Finalidad: Obtener colonias aisladas

Siembra por picadura o punción.- Con una aguja se toma el material que se
quiere sembrar y se lo introduce en el tubo, con medio semisólido.
Introducir la aguja hasta el fondo, formando un canal de punción, trayecto por el
cual la retiraremos luego.

Medio de cultivo: semisólido

Instrumento: asa recta
Finalidad: estudiar la movilidad de las bacterias

En el aislamiento y resiembra para cultivo puro.-

Se puede aplicar el estriado de las placas inoculadas con una cantidad determinada
de muestra, al utilizar un asa calibrada para cuantificar las unidades formadoras de
colonias (UFC). Esto se aplica en los cultivos de orina, mediante la diseminación del
inóculo sobre la superficie completa del agar. Facilita el recuento de las colonias
porque asegura que cada célula bacteriana se disperse sobre la superficie del agar 20.

Imagen tomada del Centro de Bachillerato Tecnológico Industrial y de Servicios No. 134.
Especialidad Laboratorista clínico

Características de la colonia:
Es importante para la identificación bacteriana, la tasa de éxito posterior dependen
de estas observaciones:
▫ Tamaño de la colonia (en mm o con términos como cabeza de alfiler,
pequeño, mediano, grande)

20
Diagnóstico microbiológico. Bailey & Scott. 12º edición.

47
 ▫ Pigmentación de la colonia
▫ Forma de la colonia (elevación y bordes)
▫ Aspecto de la superficie de la colonia (brillante, opaca, mate trasparente)
▫ Cambios en los medios, como resultado del crecimiento (hemolisis, cambios
de color, etc.)
▫ Olor (característico en algunas de ellas)

Desarrollo de la práctica

Materiales necesarios:
• Muestras biológicas y patológicas adecuadamente obtenidas (secreciones, orina,
heces fecales.
• Medios de cultivo estériles preparados en cajas de Petri. (Agar sangre, Mc
Conkey, SS agar.)
• Aplicadores estériles de algodón, asas y agujas bacteriológica, mecheros de
alcohol, frascos de anaerobiosis, de capnofilia, incubadora calibrada a 37 oC,
guantes, mascarillas, etc.

Técnicas y Procedimientos.- Se ejecutará un prototipo de cultivo, siguiendo las normas

adecuadas; el docente, ayudante o estudiante disertador realizará un acto demostrativo
primero y participativo después en la práctica, escogiendo algunas de los tipos de siembra
antes expuestos
Ejemplo: Coprocultivo.

1. Siembra: con aplicador estéril se tomará una porción de la muestra e inoculará

en una pequeña área del medio y con asa estéril se diseminara por zic zac en
todo el campo de los medios Mc Conkey/ EMB agar o SS agar, o TCBS agar según
el tipo de bacteria a ser identificada. (las características de las heces determinará
el procedimiento a seguir)
2. Incubación: Los medios sembrados, se colocarán en la incubadora a 37 oC en
aerobiosis, anaerobiosis, microaerofilia según el tipo de bacteria a ser
identificada, durante 18 a 24 horas.
3. Lectura e interpretación primaria: transcurrido el tiempo necesario se dará
lectura al crecimiento bacteriano, al tratarse de heces fecales, exista o no
infección hay crecimiento por la abundante flora que contiene. En MacConkey
las colonias son bacilos Gram negativos: las colonias rosadas son de bacterias
fermentadoras lactosa y pueden ser Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, etc. y
las no rosadas son de bacterias no fermentadoras y pueden ser Salmonellas,
Shigellas, Proteus, etc.
4. Aislamiento y resiembra: las colonias presuntivas se aislarán y resembrarán en
otro medio sea sólido o caldo.
5. Pruebas de Identificación: A fin de caracterizar determinada bacteria en
coprocultivo se ejecutara una batería de pruebas bioquímicas que nos permitirá
identificar un género y hasta una especie.

Actividades a realizar:

La práctica puede ser vista junto a los medios de cultivo para su mejor entendimiento,
según como lo considere el ayudante. Se recomienda completar el siguiente cuestionario:

• Definir un cultivo

48
 • Describir las fases del cultivo.
• Interpretar un crecimiento primario.
• Mencionar bacterias de valor clínico en un coprocultivo.

En base al ejemplo descrito anteriormente se presenta esta imagen, mencione que es lo

que usted ve en este agar:

http://faculty.lacitycollege.edu/hicksdr/emb.htm

Tema 8: Pruebas de identificación de cocos Gram positivos y Gram negativos.

Objetivo General:
Conocer las pruebas básicas de identificación para bacterias cocos gram positivos
y cocos gram negativos de importancia médica.

Objetivos específicos:
1. Entender el fundamento metabólico de las pruebas.
2. Ejecutar las técnicas y procedimientos de cada prueba.
3. Interpretar las reacciones bioquímicas de las pruebas a usar.
4. Relacionar el resultado con el estado clínico del paciente.

Justificación.- Las pruebas de identificación básicas de cocos Gram positivos y negativos

de importancia clínica como los Staphylococcus aureus, S. saprophyticus, y S. epidermidis,
Streptococcus pyogenes, S. agalactiae, Enterococcus, Streptococcus viridans,
Neumococos y Neisserias. Es de suma importancia para asociar a estas bacterias con los
procesos infecciosos en el hombre.

Marco teórico.-

LAS PRUEBAS BÁSICAS DE IDENTIFICACIÓN PARA COCOS GRAM POSITIVOS:

Prueba de la catalasa.- Diferencia los Staphylococcus (prueba positiva) de los

Estreptococos (prueba negativa); los Staphylococcus producen la catalasa que
descompone al peróxido de hidrógeno (agua oxigenada) en agua y oxígeno volátil; se
manifiesta con un burbujeo si la reacción es positiva.

Prueba de la coagulasa.- Diferencia al Staphylococcus aureus (único positivo), del resto

de estafilococos como pueden ser S. epidermidis, S saprophyticcus, etc; S. aureus coagula
el plasma y los S. saprophyticus, S. epidermidis entre otros no coagulan el plasma.

49
Prueba sensibilidad a la novobiocina.- Diferencia al Staphylococcus saprophyticus del
resto de estafilococos coagulasas negativos, siendo resistente el Staphylococcus
saprophyticus y sensibles los demás.

Prueba de sensibilidad a la Bacitracina.- De no contar con antisueros específicos, esta

prueba es importante para diferenciar e identificar al Estreptococo beta hemolítico del
grupo A de los otros grupos. El Streptococo pyogenes es sensible a la Bacitracina, los otros
grupos son resistentes, esta prueba es rápida y económica tiene una especificidad del
97%.

Prueba de la Optoquina (clorhidrato d hidrocupreina), Sales biliares 10% y Desoxicolato

Na 2%.- Es útil para diferenciar al Streptococcus pneumoniae (Neumococo) de los
Estreptococos viridans o Estreptococos alfa hemolíticos, debido que estos grupos
bacterianos son similares en las características culturales. A la microscopía se presentan
como cocos Grampositivos agrupados en pares y en cadenas y ambos forman colonias
pequeñas alfa hemolíticas. Los Neumococos son sensibles a la optoquina y lisados por
las sales biliares y el desoxicolato de sodio, en contraposición los Estreptococos viridans
o alfa hemolíticos son resistentes a la optoquina y no son lisados por las sales biliares y
el desoxicolato de sodio.

Prueba de CAMP:

LAS PRUEBAS BÁSICAS DE IDENTIFICACIÓN PARA COCOS GRAM NEGATIVOS21:

Prueba de la Oxidasa y fermentación de los azúcares. - Es importante para caracterizar

al género Neisseria; un grupo bacteriano que a más de presentarse como diplococos
Gramnegativos producen la enzima indofeniloxidasa, al no ser visible, se determina su
presencia con el reactivo indicador llamado tetrametilparafenilendiamina o
simplemente reactivo de la oxidasa, el mismo que al unirse con la enzima manifiesta un
color desde violeta hasta negro.

Fermentación de los azúcares. - Todas las especies de Neisserias fermentan la glucosa

produciendo ácido, la identificación de las distintas especies se determinará por la
capacidad de fermentar además otros carbohidratos, por ejemplo: N. gonorrhoeae
únicamente fermenta la glucosa, la Neisseria meningitidis fermenta la glucosa y maltosa.
etc.

21
Manual de Micro diagnóstica. III parte: TOMA DE MUESTRAS, MEDIOS DE TRANSPORTE, MEDIOS DE
CULTIVO, y PRUEBAS DIFERENCIALES. LABORATORIO LINSAN S.A.

50
Desarrollo de la práctica.

Materiales necesarios

▫ Cultivos primarios en agar sangre con colonias presuntivas de Staphylococcus,

Estreptococos alfa y beta hemolíticas.
▫ Colonias presuntivas de Neisserias en agar chocolate.
▫ Materiales de protección guantes y mascarillas.
▫ Agujas y asas bacteriológicas, mechero de alcohol.
▫ Portaobjetos, tubos estériles con tapa rosca.
▫ Peróxido de hidrógeno 10 vol., plasma humano fresco, discos de Novobiocina,
Bacitracina, Optoquina, Oxidasa y azúcares con indicadores preparados en tubos
pequeños, Incubadora.

Técnicas; procedimientos e interpretación.-

Prueba de la catalasa:
En un portaobjeto limpio sin melladuras se
coloca una gota peróxido de hidrógeno Sobre
la gota se suspende una colonia.
Sí de inmediato presenta burbujeo; indica
reacción positiva (ESTAFILOCOCOS), la
reacción negativa a ESTREPTOCOCOS.
¡Recuerda!: Para atribuir estas reacciones a Estafilococos o Estreptococos, se debe
cerciorar previamente de que se trata de cocos Gram positivos ya que existen otras
bacterias como bacilos gran negativos que pueden ser catalasa positivas. El aislamiento
de la colonia debe ser cuidadoso, no tocar la sangre que también tiene catalasa de los
hematíes y puede dar falsos positivos.

Prueba de la coagulasa: Diferencia al Staphylococcus aureus (único positivo), del resto de

estafilococos.

En un portaobjeto limpio se coloca una gota

de plasma, se suspende una colonia encima
y en pocos minutos se forma un grumo, si la
reacción es positiva y significa presencia de
Staphylococcus aureus. Como alternativa se
realiza la prueba en tubo; en el mismo se
coloca de 0,25 a 0,5 ml de plasma fresco y se
siembra 2 a 3 colonias, se incuba a 37oC
durante 1 a 4 horas, en cada hora se lee
inclinando el tubo y en caso de observar
coagulo la reacción es positiva y si es negativa
se espera hasta 24 horas, que define una
reacción tardía.

Prueba de la Novobiocina:
Una cepa pura de Staphylococcus ya conocido como coagulasa negativo, se siembra en
plateado sobre la superficie de un medio de cultivo de Agar sangre de cordero para

51
 realizar antibiograma por difusión, se coloca un disco de Novobiocina, se incuba a 37 oC
durante 24 horas, transcurrido este tiempo, si presenta un halo de inhibición <=12 mm
se define como resistente y se corresponde con el diagnóstico de Staphylococcus
saprophyticcus, de lo contrario si el halo es mayor a esta cifra se trata de cualquier otro
estafilococo coagulasa negativo, posiblemente S. epidermidis que es el que se aísla con
mayor frecuencia.

Prueba de la Optoquina y solubilidad en sales biliares:

A partir de colonias pequeñas alfa hemolíticas se prepara un inóculo en caldo de cultivo
y se siembra en agar Mueller Hinton con sangre, colocándose un disco de Optoquina,
se incuba a 37 oC durante 24 horas, luego del este tiempo, si presenta un halo de
inhibición igual o mayor de 14 mm de diámetro se trata de un Neumococo, si no forma
halo de inhibición hay resistencia que le caracteriza a un Estreptococo viridans o alfa
hemolítico y en caso de formar un halo de inhibición menor a 14 mm de diámetro, el
diagnóstico se define con la prueba de lisis en sales biliares. Para este procedimiento se
utiliza un inóculo bacteriano en caldo, donde la turbidez indica presencia de la bacteria,
a este inóculo se agrega uno a 2 ml de sales biliares al 10%, se incuba unas 4 a 6 horas,
transcurrido este tiempo se observa el tubo y en caso de manifestar transparencia indica
lisis bacteriana que confirma un Neumococo, y si se mantiene la turbidez indica
resistencia que confirma a un Estreptococo viridans.

Prueba de sensibilidad a la bacitracina: Antibiótico que inhibe la síntesis de la pared celular a la

concentración de 0,04 U, inhibe el crecimiento de los estreptococos beta hemolíticos del grupo A.
Procedimiento

Siembra - Realizar una suspensión del microorganismo en estudio mediante la técnica de hisopado
en superficie, inocular el microorganismo en estudio en una placa de Agar Sangre de cordero.

Colocar un disco de Bacitracina de 0,04 U sobre la superficie del agar.

En atmósfera 5-10% de CO2, a 35-37 ºC durante 24 horas.

52
Resultados: Si se produce un halo de inhibición se considera sensible y corresponde con S.
pyogenes, si no hay halo, se considera resistente y puede corresponder con cualquier otro
estreptococo Beta hemolítico.

Prueba de CAMP: Se utiliza para la identificación presuntiva de estreptococos Beta- hemolítico del
grupo B (Streptococcus agalactiae).

El factor CAMP actúa sinérgicamente con la beta hemolisina producida por S. aureus para inducir
una mayor hemólisis de los glóbulos rojos.

Una cepa hemolítica conocida de S. aureus se estría en una línea recta a través del centro de la
placa de agar sangre de carnero y se inocula perpendicular a la misma varias líneas rectas (2-3 cm
de longitud) de la cepa en estudio, a una separación de 3-4 mm.

Resultado: CAMP positiva: se forma una punta de flecha si la cepa corresponde con S. agalactiae.

Prueba de la Oxidasa para Neisserias: El reactivo de la oxidasa viene liofilizado en papel filtro el
mismo que se humedece con agua estéril y después se toma una a dos colonias friccionado
cuidadosamente el papel humedecido; si dentro de 60 segundos presenta un color violeta a
negro corresponde a una reacción positiva a la oxidasa, en caso contrario es una reacción
negativa.
¡Recuerda!: Para definir como Neisseria previamente se demostrará la presencia de
diplococos Gram-negativos al microscopio como mínimo fermente la glucosa.

Test de oxidasa

- +

53
Fermentación de los azúcares
Se utiliza una batería de azúcares en caldo de cultivo con un indicador (rojo de fenol), una
batería base: glucosa, maltosa, lactosa, etc. En cada tubo se siembra 0,5 ml de un inóculo
de Neisserias, se incuba a 37°C durante 24 horas. Transcurrido este tiempo se da lectura
a la batería de azúcares, si observamos un color amarillo indica acidez y significa
fermentación del azúcar, si se observa el color original naranja o rojo la fermentación es
negativa. Si fermenta únicamente la glucosa se define Neisseria gonorrhoeae, si fermenta
solo glucosa y maltosa se define Neisseria meningitidis, si fermenta glucosa y lactosa se
define Neisseria lactamica, si no fermenta ninguno posiblemente se trata de M.
catarrhalis

Actividad a realizar:

Se llevará a cabo en prácticas por parte de los estudiantes las pruebas de

catalasa, coagulasa, oxidasa, y se les mostrará a los mismos, pruebas positivas
correspondientes a optoquina (S), Bacitracina (S), Prueba de CAMP (+),
Novobiocina (R), y otras en dependencia de la disponibilidad de las cepas.

Investigar otras pruebas de utilidad para la identificación bacteriana como, por

ejemplo, las pruebas serológicas: A.S.T.O. sin profundizar en el procedimiento,
pues corresponde a medicina de laboratorio.

Tema 9: Pruebas bioquímicas para bacilos gram negativos (enterobacterias)

Objetivo general:
Conocer la importancia de las diferentes pruebas bioquímicas para la familia
Enterobacteriaceae.

Objetivos específicos:
1. Conocer el procedimiento y el fundamento de las pruebas a usarse.
2. Leer e interpretar los cambios bioquímicos en los medios diferenciales de uso
frecuente.
3. Relacionar los resultados con el estado clínico del paciente.

Justificación.- Una vez obtenidas las colonias de un medio artificial, la tinción de Gram
puede poner en evidencia células de bacilos, cocos o cocobacilos gramnegativos o
grampositivos, grandes o pequeños. Sin embargo no es posible diferenciar las especies
sólo sobre la base de la morfología en la tinción de Gram. Es por ello que el conocimiento
de las pruebas bioquímicas es de importancia para la identificación de un
microorganismo.

Marco teórico.-

54
 La diferenciación de las bacterias se basa principalmente en la presencia o ausencia de
diferentes enzimas codificadas por el material genético del cromosoma bacteriano. Estas
enzimas dirigen el metabolismo bacteriano a lo largo de una de varias vías que puede
detectarse mediante medios especiales utilizados en técnicas de cultivo en vitro. Se
incorporan al medio de cultivo sustratos sobre los cuales pueden reaccionar estas
enzimas, junto con un indicador que puede detectar la utilización del sustrato o la
presencia de productos metabólicos específicos. Mediante la selección de una serie de
medios que miden diferentes características metabólicas de los microorganismos por
evaluar es posible determinar un perfil bioquímico para la diferenciación de la especie 22.

MEDIO UREA DE CHRISTENSEN

Medio utilizado para la identificación de microorganismos, en base a la actividad ureásica.

Es particularmente útil para diferenciar Proteus spp. de otros miembros de la familia
Enterobacteriaceae.

Fundamento

Este medio de cultivo, formulado por Rustigian y Stuart, presenta bajo contenido de
nutrientes y alta capacidad buffer. El extracto de levadura es la única fuente de carbono,
nitrógeno, vitaminas y cofactores, y aporta los nutrientes esenciales para el desarrollo
bacteriano.

Las sales de fosfatos constituyen el sistema buffer, el rojo de fenol es el indicador de pH

y la urea es el sustrato de la enzima ureasa. Aquellas bacterias que poseen la enzima
ureasa, pueden utilizar el nitrógeno proveniente de la urea, la hidrolizan, liberando
amoníaco y dióxido de carbono. Estos productos metabólicos alcalinizan el medio,
haciendo virar el indicador rojo fenol del amarillo al rojo. Esta prueba puede ser usada
como parte de la identificación de Enterobacteriaceae, incluyendo Proteus, Klebsiella y
algunas especies de Yersinia y Citrobacter Procedimiento y materiales:
Permita que el medio con urea se atempere.
Use un asa estéril, seleccione una colonia e inocule el agar en el bisel.
Incube con la tapa ligeramente cerrada en atmósfera aerobia a 35-37°C.
Para no fermentadores incube a 30°C.
Examine cambio de coloración.
Control de calidad:
Proteus mirabilis ATCC 12453 Positivo.
Escherichia coli ATCC 25922 Negativo.
Interpretación
Positivo: Desarrollo de un color intenso magenta o rosa brillante en 24 horas de
incubación. Negativo: No hay cambio de coloración.

22
Manual de Micro diagnóstica. III parte: TOMA DE MUESTRAS, MEDIOS DE TRANSPORTE, MEDIOS DE
CULTIVO, y PRUEBAS DIFERENCIALES. LABORATORIO LINSAN S.A.

55
Imagen tomada de: http://aprendeenlinea.udea.edu.co/

MEDIO TSI (Agar hierro triple azúcar)

Medio universalmente empleado para la diferenciación de enterobacterias, en
base a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido
sulfhídrico (SH2).

Fundamento
Se basa en la fermentación de los azucares del medio, después de 18-24h de
incubación.
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los
nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y
glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el
sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y
amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el ácido
sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro.
El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance
osmótico. Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan
por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio
ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona
luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color
negro.

¡Recuerda!: La fórmula del agar Kliger (KIA) es idéntica al TSI, excepto porque la
segunda contiene sacarosa además de glucosa y lactosa. El agregado de sacarosa
al TSI ayuda a investigar especies de Salmonella y Shigella ya que ninguna
metaboliza ni lactosa ni sacarosa; también sirve para eliminar bacterias no
fermentadoras de lactosa pero fermentadoras de sacarosa; por ejemplo:
especies de Proteus y de Citrobacter, asi como también Yersinia enterocolitica23.

Procedimientos y materiales:
Tomar una colonia bien aislada de una caja de agar, con un asa recta.
Inocular el medio de TSI picando la capa profunda hasta unos 3-5mm de fondo del tubo
y se retirar el asa delicadamente y se estría la superficie inclinada con un movimiento de
ida y vuelta.
Incubar a 35°C por 18-24horas

Resultados:

23
Módulo de Bacteriología. Universidad de Guayaquil. Programa de microbiología avanzada 2010.

56
 Para leer las reacciones en el tubo, se anota primero la del “pico de flauta” o “bisel”
(aerobia) y en segundo lugar la del “fondo” o “botón” (anaerobia). El fondo y pico de
flauta del tubo es de aproximadamente 3cm cada uno. Las diversas maneras de
interpretar son:

1. Tendido alcalino/fondo ácido (K/A) (Tendido rojo/fondo amarillo): el

microorganismo solamente fermenta la glucosa.
2. Tendido ácido/fondo ácido (A/A) (Tendido amarillo/fondo amarillo): el
microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.
3. Tendido alcalino/fondo alcalino (K/K) (Tendido rojo/fondo rojo): el
microorganismo es no fermentador de azúcares.
4. La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el
microorganismo produce gas. (g)
5. El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido
sulfhídrico. (SH2)

Ejemplos:

Microorganismo Pico/Fondo Producción de gas Producción de ácido

sulfhídrico
E. coli ATCC 25922 A/A + -
K. pneumoniae ATCC A/A + -
700603
P. mirabilis ATCC K/A + +
43071
S. typhimurium ATCC K/A - +
14028
S. enteritidis ATCC K/A + +
13076
S. flexneri ATCC 12022 K/A - -
P. aeruginosa ATCC K/K - -
27853

Gráfico:

Imagen tomada de: http://web.clark.edu/tkibota/240/Unknowns/TSI.htm

MEDIO LIA (Lisine Iron Agar)

57
Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella
spp., basado en la descarboxilación / desaminación de la lisina y en la producción de ácido
sulfhídrico.

Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para
el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el
sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas descarboxilasa y deaminasa.
El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción
de ácido sulfhídrico.
El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o
menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.
Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio
y esto produce el viraje del indicador al color violeta.
La decarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio ácido, por lo que es necesario que la
glucosa sea previamente fermentada.

Procedimiento y materiales:
Tomar con un asa recta, un colonia aislada y estriar la superficie inclinada y luego picar la
capa profunda a unos 3-5mm del fondo del tubo, se retira el asa delicadamente siguiendo
el mismo camino de entrada.

Resultados
Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores
de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a
las 24hs de incubación se observa el tendido de color violeta debido al consumo de las
peptonas, y el fondo amarillo.
La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio
debido a la formación de sulfuro de hierro.
Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan
la lisina, esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la
influencia del oxígeno forma un color rojizo ladrillo en la superficie del medio.
1- Decarboxilación de la lisina:
-Prueba Positiva: Tendido violeta/fondo violeta.
-Prueba Negativa: Tendido violeta/fondo amarillo.
2-Desaminación de la lisina:
Tendido rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del género Proteus, Providencia y
cepas de Morganella spp.
3-Producción de ácido sulfhídrico:
-Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el límite del Tendido y
fondo)

Control de calidad:
Positivo: Escherichia coli ATCC 25922
Negativo: Citrobacter freundii

Grafico

58
 Ejemplos:

Microorganismos Color del tendido Color en el fondo Ennegrecimiento del

medio
Proteus mirabilis ATCCRojo Amarillo Negativo
43071
Salmonella typhimurium Púrpura Púrpura Positivo
ATCC 14028

Salmonella enteritidisPúrpura Púrpura Positivo

ATCC 13076
Providencia spp. Rojo Amarillo Negativo
Citrobacter freundii Púrpura Amarillo Positivo
Morganella spp.* Rojo Amarillo Negativo
Edwardsiella spp. Púrpura Púrpura Positivo
Klebsiella pneumoniaePúrpura Púrpura Negativo
ATCC 700603
Escherichia coli ATCC Púrpura Púrpura Negativo
25922

CITRATO SIMMONS
Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la capacidad de usar
citrato como única fuente de carbono y energía.

Fundamento
La utilización del citrato por la bacteria, se detecta en el medio por la producción de
subproductos alcalinos por la acción de le enzima citratasa o citrato permeasa.
El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador
de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El metabolismo del citrato se realiza, en
aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo del ácido
tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato.
Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser
utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El
medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de citrato permeasa.

Procedimiento y materiales:
Tomar una colonia aislada de una caja de petri con un asa recta e inocular estriando en
el pico de flauta del agar citrato (color verde).
Incubar a 35°C durante 24-48 horas.

59
¡Recuerda!: no depositar un inóculo muy cargado en el tubo porque los compuestos
orgánicos preformados de las bacterias, pueden liberar suficiente carbono y nitrógeno y
dar un resultado falso positivo24.

Resultados
-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.
-Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano
y no hay cambio de color.

Gráfico:

Ejemplos:

Microorganismo Citrato permeasa Color del medio

Klebsiella pneumoniae ATCCPositivo Azul
700603
S. typhimurium ATCC 14028 Positivo Azul

E. coli ATCC 25922 Negativo Verde

S. flexneri ATCC 12022 Negativo Verde

MEDIO MIO (Movilidad Indol Ornitina)

Medio usado para la identificación de Enterobacterias en base a su movilidad, actividad
de ornitina decarboxilasa y producción de indol.

Fundamento
Medio de cultivo semisólido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de
levadura, peptona y tripteína. Además, la tripteína aporta grandes cantidades de
triptófano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la realización de la prueba del indol.
La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la
detección de la enzima ornitina decarboxilasa, el púrpura de bromocresol es el indicador
de pH, que en medio alcalino es de color púrpura y en medio ácido es amarillo.
Por su composición, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad,
presencia de ornitina decarboxilasa e indol.
La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que
difunde más allá de la línea de inoculación.
La reacción positiva a la ornitina está dada por un color púrpura del medio.
Debido a la fermentación de la glucosa se reduce el pH produciendo una condición ácida
y originando que el indicador de pH púrpura de bromocresol vire al amarillo. La presencia

24
Módulo de Bacteriología. Universidad de Guayaquil. Programa de microbiología avanzada 2010.

60
de acidez, otorga condiciones óptimas para la actividad de la enzima ornitina
decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente. Por decarboxilación, se alcaliniza
el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el color púrpura.
El indol, es producido a partir del triptófano por los microorganismos que contienen la
enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de
reactivo de Kovac´s o de Erlich, indica un resultado positivo.

Procedimiento y materiales:
Tomar una colonia con un asa recta y realizar una siembra en “picadura” en el agar, hasta
5mm del fondo del tubo y retirar el asa suavemente, siguiendo la línea inicial de
inoculación sin perforar el fondo
Incubar a 35°C por 18-24 horas.

Resultados.- 1-
Movilidad:
-Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento más allá de la línea de siembra.
-Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra.
2-Ornitina decarboxilasa:
-Resultado positivo: color púrpura.
-Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violáceo en la
superficie del medio.
3-Prueba del indol:
La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y la prueba de
ornitina.
-Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador.
-Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro o amarillento.

Características del medio

Medio preparado: púrpura transparente a ligeramente opalescente
Gráfico:

INDOL
La prueba del indol es una prueba bioquímica realizada en especies bacterianas para
determinar la habilidad del organismo de romper el indol del aminoácido triptófano. Esta
división molecular es lograda por una serie de enzimas intracelulares diferentes, un
sistema que en conjunto se le llama con frecuencia triptofanasa. Los productos finales de
la reacción son el indol, ácido pirúvico, amoníaco (NH3) y energía. Como coenzima de la
reacción se requiere al fosfato de piridoxal.
Tal como ocurre con muchas pruebas bioquímicas, los resultados de una prueba de indol
se indican con el cambio de color que sigue a la reacción. El cultivo bacteriano puro debe
ser sembrado en un medio con triptófano o peptona estériles o ambos por 24 a 48 horas
antes de realizar la prueba. Luego de la incubación, se añaden cinco gotas de reactivo
Kovac’s al medio de cultivo. Una variante de la prueba se realiza usando el reactivo de

61
 Ehrlich's (usando alcohol etílico en lugar del alcohol isoamilo, desarrollado por Paul
Erlich), en especial si se tiene un organismo que no sea fermentador y en organismos
anaeróbicos.
Los resultados positivos se muestran por la presencia de un color rojo o rojo-violeta en la
superficie de la capa de alcohol en el cultivo. Un resultado negativo se muestra amarillo.
Un resultado variable puede ocurrir cuando se muestra un color anaranjado. Ello es
debido a la presencia de escatol, también conocido como metil-indol o indol metilado,
otro posible producto de la degradación del triptófano.

Gráfico:

Control de calidad:
Positivo: Escherichia coli ATCC 25922
Negativo: Klebsiella pneumoniae ATCC 700603

Actividades a realizar:
Investigar las bacterias indol positivas, asi como las negativas, comparar realizando un
cuadro resumen como los ejemplos vistos.

Investigar el procedimiento Voges Proskauer, Rojo de metilo, SIM. Y otros de importancia

microbiológica.

Haciendo
hincapié
en: -
Fundam
ento
- Materiales
- Interpretación de resultados
Dibujar los siguientes resultados según el TSI:

A/A K/A, SH2 K/A (g) K/K

62
Dibujar los siguientes medios con ejemplos de bacterias con resultado positivo:

Citrato Urea Motilidad Lisina

63
Tema 10: Protocolos (Técnica, aplicación, interpretación) para Urocultivos, Hemocultivos y
Coprocultivos.

Objetivo general:
Aplicar los métodos convencionales para el diagnóstico microbiológico de infecciones del
tracto urinario (ITU), en aparato circulatorio, y en enfermedad diarreica aguda.

Objetivos específicos:
1. Recordar las condiciones adecuadas para la toma de muestras de
orina, sangre y heces fecales para cultivo
2. Argumentar sobre el procesamiento microbiológico de las muestras
anteriores.
4. Interpretar correctamente el informe del laboratorio de microbiología de cada
uno de estos procedimientos.
5. Dominar aspectos importantes sobre la bacteriemia asociada a catéteres
intravasculares.
6. Relacionar los resultados con el estado clínico del paciente.

Justificación.- Para interpretar correctamente el resultado de los Urocultivos,

hemocultivos, y coprocultivos es importante conocer la epidemiología, condiciones
generales y la clínica del paciente. En estos casos una buena relación entre el médico y el
microbiólogo es determinante para un diagnóstico preciso.

Marco teórico.-

UROCULTIVO

Las infecciones del tracto urinario (ITU) son unas de las más frecuentes, puede ocurrir a
toda edad desde neonatos hasta ancianos, en personas sanas o inmunocomprometidos.
En general un limitado número de especies bacterianas son responsables de la mayoría
de estas infecciones. La presencia de microorganismos en orina se denomina bacteriuria,
sean o no, causantes de infección.

Fase pre analítica: recordar la toma adecuada de la muestra en el sexo masculino y

femenino, así como en procedimientos especiales como la toma supra púbica, por
catéter, etc. Además, es importante recordar las normas generales o básicas para un
adecuado traslado de la muestra y los criterios de rechazo. (Así en todos los protocolos)

Fase analítica:
Examen directo
1. Examen macroscópico: olor, color, aspecto, pH, densidad.
2. Examen microscópico (examen realizado por el laboratorio clínico): estudio del
sedimento (en fresco): se centrifuga entre 10 - 15 ml de orina a 3000 rpm durante 10
min, el sedimento obtenido se coloca entre lámina y laminilla y se observa al
microscopio con objetivo de 40X.

Cultivo y recuento de colonias:

Cultivo cuantitativo: Permite diferenciar la verdadera infección de una contaminación. Se
conocen varios métodos para determinar la cantidad de microorganismos. Como
ejemplo:
• Método del asa calibrada: Es un método práctico, sencillo y económico, que consiste
en sembrar la orina sin centrifugar con un asa calibrada por ej: 0.001 ml (3mm de
diámetro), 0,01 ml (4mm de diámetro).

64
 En la elección de los medios de cultivo debe considerarse la recuperación de la mayoría
de los patógenos, con el menor costo posible. Generalmente se recomienda la utilización
de un agar sangre (AS) y un agar CLED o un medio selectivo diferencial como MK o EMB.
En niños incluir un agar chocolate suplementado para la recuperación de Haemophilus25.

Procedimiento
1. Mezclar cuidadosamente la orina restante.
2. Insertar el asa estéril verticalmente en la muestra y luego diseminarla sobre la
superficie de la placa desde el centro, formando una línea y posteriormente hacer
estrías sobre la placa cruzando la línea del inóculo varias veces.
3. Incubar las placas durante 18–24 horas a 37°C en aerobiosis y el AS (Agar sangre) en
microaerofilia y en anaerobiosis si la muestra así lo exigiera. En caso de tener cultivos
negativos a las 24 horas, se deben incubar hasta completar 48 horas.

Gráfico:

Imagen tomada del manual Práctico de Bacteriología Clínica. Universidad de los Andes. 2008

Análisis cualitativo
La identificación de los agentes se hace mediante el estudio de las características
microscópicas de las colonias y la utilización de los sustratos del medio, ejemplo: lactosa,
hemólisis y la identificación final a través de pruebas fisiológicas diferenciales, como la
prueba de la oxidasa, acción sobre azúcares.
Análisis cuantitativo
Contar el número de colonias y multiplicar por el factor 1000 o 100, de acuerdo a la
capacidad del asa utilizada, para determinar las unidades formadoras de colonia por
mililitro de orina (UFC/ml).

DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICO26
La estrategia primordial para el éxito de un protocolo de urocultivo es aislar al patógeno
más probable y diferenciarlo de los organismos contaminantes.

25
Manual Práctico de Bacteriología Clínica. Universidad de los Andes. 2008
26
Manual Micro diagnóstica. LABORATORIO LINSAN S.A. Primera parte Diagnóstico de Infecciones
Bacterianas. tercera edición. 2012

65
1.- ORGANISMOS QUE SON UROPATÓGENOS RECONOCIDOS Y CRECEN BIEN EN MEDIOS
DE RUTINA EN 24 HRS. Estos incluyen E. coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, y
Pseudomona aeruginosa. Estos patógenos constituyen la causa del 80% de los bacilos
gram negativos aislados. Enterobacter y Citrobacter son también comúnmente aislados.
Enterococcus, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus y Streptococcus
agalactiae son los gram positivos más frecuente-mente aislados.

2.-ORGANISMOS QUE SON UROPATOGENOS RECONOCIDOS Y NO CRECEN EN MEDIOS DE

RUTINA: Mycobacterium tuberculosis, es un uropatógeno infrecuente que se asocia a
altos recuentos de leucocitos. Chlamydia trachomatis se desarrolla solamente en cultivos
celulares y se asocia a uretritis y salpingitis pudiendo provocar ITU. Ureaplasma
urealyticum, se asocia a otros uropatógenos. Neisseria gonorrhoeae se desarrolla en
Medio Thayer Martin.

3.-ORGANISMOS QUE PUEDEN SER UROPATOGENOS, PUEDEN REQUERIR MEDIOS

ESPECIALES Y MÁS DE 24 HRS. Hay microorganismos pertenecientes a la flora normal y
que aislados en recuentos altos se han asociado a ITU entre ellos se encuentran:
Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium seminale éstos se desarrollan en A.
Sangre CNA.; Haemophilus influenzae, H. parainfluenza, estos de desarrollan en A.
chocolate Gardenella vaginalis en altos recuentos se ha asociado a ITU éste se desarrolla
en Human Blood Agar. Todos estos medios especiales deben incubarse por 48 hrs. En
CO2.

4.-ORGANISMOS QUE NO SON UROPATOGENOS PERO PUEDEN AISLARSE DE URETRA Y

ORINA: Gran variedad de gérmenes colonizan la uretra y el área genitourinaria, estos
incluyen anaerobios, Actinomyces spp, Lactobacillus, Streptococcus alfa-hemolíticos,
Staphylococcus coagulasa negativa, y pequeños números de gram negativos.

Fase post analítica:

INTERPRETACION DEL RECUENTO

El recuento bacteriano de la muestra es la parte más importante del urocultivo, porque
indica la presencia de bacteriuria clínicamente significativa. La muestra se siembra con
asa calibrada de 0,01 ml y/o 0,001 ml. Un recuento mayor de 100.000 UFC/ml es
indicativo de ITU. Recuentos menores de 10.000 UFC/ml son indicativos de
contaminación uretral o vaginal. Recuentos entre 10.000 y 100.000 UFC/ml deben ser
evaluados basados en la información clínica, el tipo de muestra enviada, tiempo de
obtención de la muestra.
Si se aíslan 2 o más morfotipos bacterianos diferentes, generalmente, salvo algunas
excepciones, corresponde con contaminación al tomar la muestra, en este caso se
recomienda solicitar nueva muestra para estudio.
La gran mayoría de los casos de cistitis y pielonefritis pueden ser correctamente
interpretados usando estos parámetros.
Gráfico:

66
Imagen tomada del Manual Práctico de Bacteriología Clínica. Universidad de los Andes. 2008

HEMOCULTIVO

Se define como bacteriemia la presencia de bacterias en la sangre que se pone de manifiesto por
el aislamiento de éstas en los hemocultivos. El origen de la bacteriemia puede ser diverso en
función de las características clínicas del paciente. El término fungemia se utiliza para designar la
presencia de hongos en la sangre, generalmente levaduras del género Candida spp.
Ambas se producen cuando los microorganismos invaden el torrente sanguíneo y se multiplican
a un ritmo que supera la capacidad del sistema reticuloendotelial para eliminarlos. Esta invasión
puede producirse desde un foco infeccioso extravascular (a través de los capilares sanguíneos o
de los vasos linfáticos) o desde un foco intravascular (endocarditis, infección de catéteres
intravenosos o arteriales.
Por tanto, el hemocultivo sigue siendo actualmente el principal método de diagnóstico
para determinar la etiología de una bacteriemia. Su fácil realización lo hace asequible a
cualquier centro y es el único método que hasta el momento permite el aislamiento del
microorganismo viable, necesario para determinar su sensibilidad antibiótica.

67
Indicaciones:
No existe una recomendación universal sobre cuáles son las indicaciones de la toma de
hemocultivos, aunque generalmente se recomienda su extracción ante la presencia de:
▪ Escalofríos, fiebre (temperatura corporal ≥38ºC) o hipotermia en neonatos y pacientes
ancianos.
▪ Ante leucopenia, leucocitosis o trombopenia no relacionada con procesos
hematológicos.
▪ Otros signos de infección focal o sepsis
▪ Sospecha de endocarditis.
▪ Cuando se envía a cultivar un catéter por sospecha de bacteriemia originada en el mismo.
▪ En pacientes susceptibles de padecer meningitis, osteomielitis, pielonefritis, infección
intraabdominal, artritis, infecciones graves de la piel y tejidos blandos, neumonía,
endocarditis.
▪ Fiebre de origen desconocido FOD
▪ En niños pequeños o ancianos con un decaimiento súbito, ya que en estas poblaciones
pueden no presentarse los signos y síntomas típicos de la bacteriemia.
▪ El cultivo de la sangre debe complementarse con el de muestras de otras localizaciones
para tratar de determinar el foco del proceso.

OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
(Revisar el acápite de correcta obtención de la muestra para hemocultivos)
AVISO!!! RECORDAR QUE ES MUY IMPORTANTE IDENTIFICAR CORRECTAMENTE EL
FRASCO DE HEMOCULTIVO PARA EVITAR DIAGNÓSTICOS ERRÓNEOS Y TRATAMIENTOS
INADECUADOS.
La aplicación de una buena metodología para la extracción y procesamiento de los
hemocultivos debe perseguir
• El aislamiento de todos los microorganismos productores de bacteriemia deben tenerse
en cuenta sus diferentes requerimientos nutricionales, temperatura y atmósfera de
óptimo crecimiento y período de incubación.
• La detección precoz de la presencia de bacterias en sangre, su identificación precisa y
la información sobre su perfil de sensibilidad antibiótica de forma que las modificaciones
del tratamiento puedan realizarse con la mayor rapidez posible.
• La diferenciación, en la medida de lo posible, de los casos de verdadera bacteriemia de
aquellos en los que la positividad se deba a un inadecuado procedimiento de extracción
y procesamiento de la muestra.

Sitio de extracción: Las muestras de sangre para hemocultivo deben extraerse mediante
venopunción (extracción periférica), evitándose la extracción a partir de dispositivos
intravasculares tal y como lo recomienda la American College of Physicians, cambiando
de equipo y localización anatómica en la extracción de cada hemocultivo.
Sólo se realizarán extracciones a través del catéter si se pretende diagnosticar una
infección del mismo y ésta debe ir acompañada de otra extracción por vía periférica.

Momento de la extracción: Debería coincidir, en el caso de infección aguda, con aquel

en el que existe un mayor número de bacterias viables en sangre, que se sabe que es el
momento que precede a la aparición de la fiebre. Así se recomienda la extracción
coincidiendo con la aparición de escalofríos (se cree que estos suelen preceder
inmediatamente al pico febril y que aparecen aproximadamente al cabo de 1h de entrar
el microorganismo en el torrente sanguíneo).

68
La extracción de sangre debe hacerse antes de iniciar la administración del tratamiento
antibiótico y en el caso de que esto no fuera posible, cuando el antibiótico esté en su
concentración valle (justo antes de la siguiente dosis).

Número de muestras: El número de muestras y el tiempo en que se obtienen dependen

de la fisiopatología de la bacteriemia. Múltiples botellas inoculadas de una punción
deben considerarse como un solo hemocultivo. Dos o tres hemocultivos son suficientes
para detectar la gran mayoría de los episodios de bacteriemia. Se recomienda la
extracción simultánea de 20 a 30 ml de sangre para la evaluación inicial.

Volumen:
• La mayor parte de los escasos recuentos realizados muestran cifras próximas a 10 UFC/ml
de sangre o inferiores y muy rara vez se superan 100 UFC/ml. En niños las cifras son muy
variables. El volumen recomendado por cada venopunción en adultos es de 10 ml, ya que
con volúmenes menores se ha demostrado una disminución del índice de positividad.
• Se considera que el índice de positividad aumenta entre el 3-5% por cada mililitro
adicional de sangre cultivada. Sin embargo, la recomendación de elevar el volumen de
sangre por extracción no se aplica, en cierta medida por la anemia que se puede provocar
al paciente y para mantener la proporción de volumen sangre/medio de cultivo.
• La dilución final recomendada es de 1/5 a 1/10 (volumen/volumen) ya que diluciones <
1/5 reducen la positividad.

La dificultad en la interpretación del hemocultivo es la contaminación con flora normal

de la piel. Debido a que la endocarditis infecciosa puede ser causada por
microorganismos habitualmente encontrados en la piel como Staphylococcus
epidermidis o Corynebacterium spp, la contaminación de la muestra debe ser reducida a
un mínimo. Las muestras para hemocultivo nunca deben ser obtenidas a través de
catéteres intravenosos o intra arteriales como ya mencionó en el acápite de toma de
muestras.
Procedimiento:
1. Luego de obtener la muestra con las medidas de bioseguridad señaladas en
temas anteriores.
2. Se procede a limpiar el tapón de goma de la botella de hemocultivo con alcohol
o solución yodada, esperar que seque e inocular las botellas.
3. Mezclar suavemente la sangre en el medio de cultivo.
4. Mandar las botellas inmediatamente al Laboratorio, sin refrigerar.

¡Recuerda!
El volumen óptimo de sangre por muestra corresponde a 20 a 30 ml para adultos y 10 ml
para niños menores. Un número significativo de bacteriemias pueden ser no
diagnosticadas con muestras menores de 10 ml en adultos.
Las botellas de hemocultivo no deben llenarse, ya que siempre debe existir atmósfera y
espacio para la producción de gases.

Recepción: A su llegada al laboratorio es fundamental verificar que los frascos están

correctamente identificados en cuanto al paciente y la extracción de la que proceden (Si

69
son periféricos o tomados por vía central). Se recomienda, una vez registrada la entrada,
la introducción inmediata de los mismos en incubadores específicos.

PROCESAMIENTO DEL HEMOCULTIVO EN EQUIPOS AUTOMATIZADOS

Incubación: El 85-90% de los hemocultivos son positivos en menos de 48 horas salvo en el caso
de que se trate de una fungemia o de una bacteriemia causada por una bacteria de crecimiento
lento.
En general, los frascos se incuban 5 días antes de informarse como negativos. Este tiempo es
generalmente suficiente para la recuperación de la mayoría de los microorganismos, incluidas las
bacterias exigentes del grupo HACEK y Brucella spp., y se debe prolongar en aquellas patologías
como la endocarditis que pueden estar causadas por bacterias de crecimiento lento o cuando se
sospeche la presencia de hongos, micobacterias, u otras.

Los hemocultivos positivos se deben procesar en cuanto el sistema comunique su positividad.

Cada laboratorio debe establecer los protocolos de trabajo para que dentro del horario del mismo
se procesen de forma continuada y se informen de forma precoz los resultados disponibles.
Cuando se detecta un hemocultivo positivo se debe realizar lo antes posible un subcultivo en
diferentes medios de cultivo.

Medios de cultivo: Siempre se debe inocular en agar sangre y/o agar chocolate y en función de la
tinción de Gram se debe valorar la adición de otros medios.
Las placas se incubarán a 37ºC y las que contienen sangre en atmósfera con 5-10% de CO2. Se
deben revisar a las 24 h, manteniéndolas más tiempo si son negativas.

Interpretación de resultados La interpretación óptima de los resultados de los hemocultivos

positivos requiere del conocimiento de la situación clínica del paciente, su enfermedad de base,
los factores predisponentes a la infección y, a poder ser, de los tratamientos antimicrobianos que
le han sido administrados.
Un tema capital a la hora de establecer la importancia clínica de los hallazgos microbiológicos es
lograr diferenciar entre contaminación e infección. El National Healthcare Safety Network (NHSN)
de Estados Unidos define hemocultivo contaminado (falso positivo) como aquel en el que se aíslan
especies propias de la microbiota comensal de la piel o propios del medio ambiente: estafilococos
coagulasa negativa, otros microorganismos de baja o nula virulencia como Aerococcus spp.,
Micrococcus spp., P. acnes, la mayoría de las especies de los géneros Bacillus y Corynebacterium
y algunos estreptococos del grupo viridans.

Sin embargo, antes de considerar un aislamiento de estos microorganismos como contaminante,

hay que analizar detenidamente las características clínicas del paciente y el número de
hemocultivos en los que se aíslan ya que, en algunos casos, estos microorganismos pueden estar
implicados en bacteriemias; en caso de niños, esta diferenciación es particularmente difícil porque
habitualmente sólo tienen una extracción y por tanto deben extremarse las medidas para evitar
la contaminación de los frascos y en caso de duda, se podría volver a extraer otra muestra.

70
S. aureus, S. pneumoniae, enterobacterias, P. aeruginosa y C. albicans están casi siempre
implicados en bacteriemias verdaderas; por el contrario, Corynebacterium spp. y
Propionibacterium spp. suelen ser contaminantes. La recuperación de Streptococcus del grupo
viridans, estafilococos coagulasa negativa y Enterococcus spp. tiene más difícil interpretación
porque se ha comunicado que se asocian a verdadera bacteriemia en el 38 %, 15 % y 78 % de los
casos, respectivamente.

Existen varios parámetros que pueden ayudar a identificar con precisión el significado de un
hemocultivo positivo cuando la sintomatología clínica no es definitoria:
1. El número de extracciones positivas con respecto al total de extracciones efectuadas
2. El sitio de toma de la muestra: catéter versus punción venosa.
3. El tiempo hasta la positividad, incluyendo el tiempo de diferencia de positividad entre
pares recogidos en diferentes sitios. En lo que respecta a los estafilococos coagulasa
negativa, un tiempo de ≤15 h generalmente indica que el microorganismo tiene valor
clínico y si es de ≥22 h sugiere contaminación; para analizar este parámetro con exactitud,
debe asegurarse un transporte rápido de los hemocultivos al Servicio de Microbiología.
4. La identidad del microorganismo, ya que la presencia de algunos microorganismos como
P. acnes en el cultivo de sangre tiene pocas posibilidades de indicar bacteriemia
verdadera, a menos que el paciente esté expuesto a un riesgo particular.

PROCESAMIENTO DEL HEMOCULTIVO DE MANERA CONVENCIONAL O MANUAL:

Luego de la recepción en el laboratorio se incubarán en estufa de incubación, de 35-37 oc, durante

5-7 días.
Las botellas deben observarse macroscópicamente a diario en busca de evidencia de
desarrollo bacteriano por un total de 7 días.

Hemocultivos positivos
El desarrollo bacteriano se detecta por por turbidez del medio de cultivo; colonias visibles
en la capa sedimentada de sangre, o sobre ésta. Hemólisis de la sangre, producción de
gas. Cuando se obtiene un cultivo positivo se debe efectuar una tinción de Gram, que es
particularmente útil para distinguir Streptococcus de Staphylococcus. Los medios de
cultivo selectivos de traspaso deben estar basados en el resultado de la tinción de Gram,
según la morfología encontrada es el medio selectivo para subcultivo.

El resto del procesamiento y la interpretación es similar al método automatizado.

Gráfico:

71
Imagen tomada del Manual Práctico de Bacteriología Clínica. Universidad de los Andes. 2008

INFECCIONES ASOCIADAS A CATÉTERES INTRAVASCULARES 27

La utilización de catéteres intravasculares con fines diagnósticos o terapéuticos es cada vez más
frecuente, especialmente en pacientes en situación crítica o con patologías agudas o crónicas
graves. Las infecciones asociadas a catéteres constituyen la principal causa de bacteriemia
nosocomial y están relacionadas con una alta morbilidad y mortalidad.

Etiología de las infecciones asociadas a CVC:

Los microorganismos más frecuentes son aquellos cuyo hábitat natural es la piel.
- El 60% de los casos están producidos por especies de estafilococos (ECN y S.
aureus) aunque Enterococcus spp. está aumentando en los últimos años.
- BGN de la familia Enterobacteriaceae
- Género Candida
- BGN no fermentadores

I. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE LAS INFECCIONES RELACIONADAS CON CATÉTERES

(IRC)
Procedimientos microbiológicos de diagnóstico realizado sobre catéteres retirados:
Cultivo cualitativo, semicuantitaivo y cuantitativo de la punta del catéter.

II. PROCEDIMIENTOS DE DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO MANTENIENDO EL CATÉTER

Técnicas basadas en la velocidad de crecimiento de hemocultivos cualitativos. (El más
empleado)

27
Manual Práctico de Bacteriología Clínica. Universidad de los Andes. 2008. Diagnóstico microbiológico de las
infecciones del aparato circulatorio. Hemocultivo

72
Cultivo de la punta de catéter (retirado). -
Técnica de Maki: Método semicuantitativo

El método consiste en los siguientes pasos:

1. Realizar una antisepsia cuidadosa del sitio de inserción y retirar el catéter.
2. Cortar con técnica estéril a 4 o 5 cm del extremo del catéter.
3. Colocar la punta en un tubo estéril para ser enviada al laboratorio.
4. Una vez en el laboratorio se procede a inocular mediante rodamiento en una
placa de agar sangre la punta del catéter.
5. La placa de agar sangre debe ser incubada a una temperatura de 36°C durante
un máximo de 72 horas con lecturas intermedias cada 24 horas en aerobiosis.
6. Después de la incubación, realizar contaje del número de colonias bacterianas y
si el número de colonias en la placa es igual o mayor de 15, la posibilidad de
septicemia con este punto de origen es alta.
7. Identificación de los microorganismos aislados mediante la realización de la
coloración de Gram y pruebas bioquímicas diferenciales.
8. Realizar las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana de acuerdo al
microorganismo identificado.

 Revisar criterios de bacteriemia relacionada con infección del CVC, con retirada
del catéter y sin la retirada del mismo.
Revisar el link:
https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologi
a/seimc-procedimientomicrobiologia15.pdf

COPROCULTIVO

A nivel mundial, las infecciones gastrointestinales siguen siendo una de las causas más
importantes de morbilidad y mortalidad entre los lactantes y los niños. Se ha estimado que, en
Asia, África y Latinoamérica, dependiendo de factores socioeconómicos y nutricionales, la
probabilidad de que un niño muera antes de los 5 años por estas causas puede llegar al 50%. Las
epidemias de diarrea en lactantes, niños y adultos son generalmente causadas por
microorganismos presentes en el agua o en los alimentos contaminados habitualmente por heces
que presentan microorganismos patógenos. Las infecciones también se pueden transmitir de
persona a persona por contacto directo o a través de fómites.

El coprocultivo es el método de elección para el diagnóstico de las infecciones bacterianas

intestinales.

73
Recolección y transporte de muestras

La muestra de preferencia para el coprocultivo y el aislamiento de agentes bacterianos

es la muestra de heces recolectada durante el período agudo de la enfermedad.
La muestra debe ser enviada inmediatamente al laboratorio después de obtenida.
Si la demora entre la toma de muestra y el procesamiento de ésta es mayor a dos horas,
se debe enviar la muestra en Medio de transporte (Cary Blair).
Hasta tres muestras es el número óptimo de coprocultivos para obtener un buen
resultado en el aislamiento del agente infeccioso, especialmente cuando los síntomas no
son claros y definitivos.
Si las heces son de consistencia líquida o se han enviado en medio de transporte, la muestra se
siembra directamente con ayuda del asa o pipeta Pasteur.
Si las heces son formes se selecciona una porción adecuada, del tamaño aproximado de un
guisante, y se emulsiona en solución salina estéril para homogeneizar el inóculo y facilitar su
siembra. Los medios sólidos se siembran por agotamiento. Los medios líquidos se siembran
abundantemente (1 ml de heces líquidas o 1 gr de heces formes).

Examen directo
Examen macroscópico: consistencia, color, olor, presencia o ausencia de moco y/o sangre;
permite seleccionar para el inóculo aquella porción de la muestra de aspecto patológico por la
eventual presencia de sangre, moco o pus.

Examen microscópico: para determinar rápidamente la naturaleza de una enfermedad

diarreica es de gran ayuda y tiene un alto grado de confiabilidad la Investigación de
leucocitos fecales, que consiste en determinar el tipo de células inflamatorias presentes
en las heces; esta información orienta sobre la naturaleza del proceso infeccioso,
ejemplo, en la Shigelosis hay abundancia de neutrófilos polimorfonucleares.

La detección de leucocitos fecales se enfocará en la materia de Medicina de laboratorio.

Interpretación del examen microscópico
La presencia de 5 o más leucocitos por campo microscópico sugiere la presencia de un
agente entero invasor. La ausencia de células inflamatorias sugiere la presencia de un
agente toxigénico.

74
 Cultivo:
Los medios de cultivo se seleccionarán en función de los microorganismos que deseemos
investigar (sospecha clínica, circunstancias epidemiológicas, viajes, controles de
tratamiento, portadores,…).

Entre ellos figuran los medios sólidos de aislamiento, que en función de su selectividad
para las enterobacterias enteropatógenas se clasifican en tres categorías:

• Escasamente selectivos: inhiben el desarrollo de los microorganismos Gram-positivos,

pero permiten el desarrollo de enterobacterias y otros bacilos Gram-negativos. Incluyen
agar MacConkey y agar EMB (Levine).
• Moderadamente selectivos: inhiben el desarrollo de los Gram-positivos y también de
numerosos "coliformes" lo que facilita la recuperación fundamentalmente de Salmonella
y Shigella, si bien de forma menos constante pueden permitir la recuperación de otros
bacilos Gram-negativos enteropatógenos. Los más usados son el agar entérico de
Hektoen, agar Xilosa-LisinaDesoxicolato (XLD), agar Salmonella-Shigella (SS) y agar de
Rambach.
• Altamente selectivos: diseñados específicamente para el aislamiento de salmonelas
gastroenteríticas tienen un uso más restringido en los laboratorios de Microbiología
Clínica. Pertenecen a este grupo el agar sulfito de bismuto (Wilson-Blair) y el, agar verde
brillante.

Gráfico:

Imagen tomada del Manual Práctico de Bacteriología Clínica. Universidad de los Andes. 2008

Aislamiento bacteriano
En las muestras de heces, las bacterias entéricas patógenas se encuentran siempre
asociadas a una gran variedad de bacterias comensales, es por ello que, para facilitar el

75
aislamiento y posterior identificación de estas bacterias, se emplean diferentes medios
de enriquecimiento, selectivos y selectivos diferenciales.

Interpretación y expresión de resultados En general, se debe informar sobre el patógeno

o los patógenos bacterianos encontrados en las muestras remitidas al laboratorio de
microbiología, pero antes
Si no se encuentra ninguno de los buscados rutinariamente se informará como: “no se aislan
enteropatógenos”.

Actividades a realizar:
1. Mencionar en orden de frecuencia las especies bacterianas productoras de ITU.
2. Definir los siguientes términos: disuria, poliaquiuria, piuria, cistitis, pielonefritis.
3. Establecer criterios de positividad de un urocultivo.
4. Describir los pasos a seguir en la toma de muestra para un hemocultivo.
5. Definir cuándo se trata de una bacteriemia verdadera.
6. Conocer los términos de bacteriemia relacionada con catéter.
7. Mencionar los microorganismos productores de EDA.

Tema 11: Antibiograma.

Objetivo general:
Definir la importancia clínica, microbiológica y epidemiológica de las pruebas de
susceptibilidad antimicrobiana.

Objetivos específicos:
1. Conocer qué es un antibiograma y los tipos que existen.
2. Determinar la importancia de las pruebas de susceptibilidad a los
antimicrobianos.
3. Interpretación del informe final.
4. Conocer la lectura interpretada de un antibiograma: incluir el conocimiento de la
resistencia natural de algunos microorganismos.
5. Realizar correctamente un antibiograma de acuerdo al método de difusión del
disco o Kirby- Bauer.
6. Interpretar y elaborar correctamente el reporte de un antibiograma.
7. Detallar y analizar pruebas especiales para detección de algunos mecanismos de
resistencia: BLEE, Carbapenemasas, MRSA, Resistencia inducible a clindamicina.

Justificación.- El panorama actual de las resistencias de los microorganismos a los

antimicrobianos hace ineludible su determinación, incluso en aquellos casos en los que
la sensibilidad se considera universal y no se han descrito, por el momento, mecanismos
de resistencia. Cada laboratorio de microbiología establecerá según su estructura,
demanda asistencial y Política de Antibióticos un esquema de organización y técnicas de
trabajo que aseguren la realización e información posterior de los antibiogramas.

Marco teórico.-

Importancia: El estudio de la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos

es una de las funciones más importantes de los laboratorios de microbiología clínica. Su

76
realización se desarrolla mediante las pruebas de sensibilidad o antibiograma, cuyo
principal objetivo es evaluar en el laboratorio la respuesta de un microorganismo a uno
o varios antimicrobianos, traduciendo, en una primera aproximación, su resultado como
factor predictivo de la eficacia clínica, además permite determinar diferentes
mecanismos de resistencia, así como realizar investigaciones epidemiológicas sobre
resistencia bacteriana ante estudios de brotes, etc.

Por el momento no existe un método universal que reproduzca las condiciones en las que
se encuentra un microorganismo produciendo una infección y, por tanto, la situación
ideal en las que deben desarrollarse las pruebas de sensibilidad.

En el presente mencionaremos los métodos básicos más utilizados y aceptados para el

estudio de la sensibilidad, así como los criterios para su interpretación y control.

1. Método de difusión del disco en agar (prueba de Kirby-Bauer).

2. Métodos de dilución: (CMI)
✓ En caldo (Macro y microdilución)
✓ En Agar
3. Método de la cinta o Epsilon test, (E test.) 28
4. Antibiograma ATB Rapid (bioMérieux).
5. Otros: Métodos automatizados: Microscan, Phoenix, Vitek 2 compact.

Método de difusión del disco en agar (prueba de Kirby-Bauer)

Fundamento

El método utilizado con mayor frecuencia para evaluar la sensibilidad de las bacterias a
los agentes antimicrobianos es la denominada prueba de difusión del disco. Esta técnica
fue estandarizada por Kirby y Bauer en 1966, de allí que dicho método también se le
conozca con el nombre de “prueba de Kirby-Bauer”. Es un método sencillo y fácil de
realizar en los laboratorios de rutina que sólo brinda información cualitativa sobre la
sensibilidad de un microorganismo a un antibiótico determinado. Sin embargo, los
resultados obtenidos son de gran valor clínico para iniciar, mantener o modificar una
Antibioticoterapia.

Este método consiste en depositar en la superficie de agar de una caja de petri

previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel filtro impregnados con
los diferentes antibióticos. Cuando el antibiótico se pone en contacto con la superficie
húmeda del agar (Mueller-Hinton), el papel filtro absorbe el agua y el antibiótico se
difunde. Trascurridas 18-24 horas de incubación los discos aparecen rodeados por una
zona de inhibición.

Materiales:

✓ Tubos con solución salina (0,85 g NaCl en 100ml agua destilada estéril)
✓ Torundas de algodón estériles
✓ Placas con Agar Mueller Hinton (pH 7,2-7,4)
✓ Discos de antibióticos (temperatura ambiente 1 hora antes de su uso)
✓ Tubo 0,5 de la escala de McFarland
✓ Pinzas
✓ Regla milimetrada
✓ Tablas de los criterios estandarizados del CLSI.

28
Manual Práctico de Bacteriología Clínica. Universidad de los Andes. 2008. Dr. María del Carmen Araque.

77
 Procedimiento:

Tomar varias colonias con un asa y colocar en un tubo con 3ml de solución salina, ajustar
el inóculo a una turbidez equivalente al 0,5 de la escala de McFarland (medio de
estandarización, representa una concentración aproximada de 1-2 x 10⁸ UFC/ml). Agitar
por 15-20 segundos en el vórtex.

Introducir la torunda dentro del tubo y eliminar el exceso del inóculo rotando varias veces
contra la pared del tubo. Luego inocular las placas de Mueller Hinton sin dejar zonas
libres, deslizando la torunda por la superficie del agar en tres direcciones para conseguir
una siembra uniforme y rotando la placa unos 60° cada vez. Dejar secar de 3-5 minutos
antes de depositar los discos.

Colocar los discos con la ayuda de pinzas estériles, presionando ligeramente el disco en
el agar; flameando la pinza con cada uno. Los discos han de colocarse de manera que no
se produzca superposición de los halos de inhibición. Placas de 150mm 10 discos y de
100mm no más de 5.

Incubar las placas invertidas a 35°C en atmósfera aeróbica (antes de que trascurran 15
minutos) por 18-24 horas.

Leer el diámetro de las zonas de completa inhibición con una regla milimetrada.

¡Recuerda! Las zonas de los medios transparentes se miden sobre el reverso de la placa
y los medios que contienen sangre sobre la superficie del agar 29.

Imagen tomada de la guía de prácticas de microbiología. Universidad Complutense de

Madrid. 2008

Interpretación:

Medir la zona clara alrededor del disco. Para la interpretación de resultados se seguirán
las normas establecidas por el CLSI (antes NCCLS) y sus respectivas tablas.

Las tres categorías según los halos de inhibición son: Sensible (S) Intermedia (I) y
Resistente (R)

Sensible: Indica que puede usarse para el tratamiento empleando dosis habituales de
antimicrobiano, según su halo de inhibición. El médico debe tomar en cuenta la
fisiopatología del cuadro, la edad del paciente, etc.

Intermedio: Indica que puede esperarse eficacia al usarse en localizaciones en las que se
alcanzan altas concentraciones del antimicrobiano o cuando se emplean dosis más
elevadas. El médico debe evitar usar estos antibióticos en la medida de lo posible.

29
Módulo de Bacteriología. Programa de Microbiología Avanzada. Universidad de Guayaquil. 2010

78
Resistente: Indica que los microorganismos poseen mecanismos de resistencia para ese
antimicrobiano y/o que no se inhiben por las concentraciones habituales en sangre y
tejidos, sea cual sea el tipo de tratamiento. Se aconseja realizar otras pruebas de
susceptibilidad adicional ante el aislamiento de un microorganismo multirresistente.

¡Recuerda! El antibiograma es un instrumento de gran utilidad para la elaboración de un

plan terapéutico eficaz contra el patógeno, seleccionando el antibiótico menos tóxico
para el paciente, y con las características farmacocinéticas más apropiadas según la
naturaleza y gravedad de la infección.

Fuentes de error más comunes en la realización de un antibiograma

1. Falta del control de calidad de los medios de cultivo a utilizar, patrón de

McFarland y los discos de antibióticos.
2. Trabajar con cepas bacterianas que no están puras.
3. Inadecuada estandarización de la concentración del inóculo.
4. Utilización de un número excesivo de discos de antibióticos por placa.
5. Utilización de medios de cultivo no aptos para las pruebas de susceptibilidad.
6. Lectura prematura o extemporánea de las pruebas de susceptibilidad.
7. Medición incorrecta de los halos de inhibición por una iluminación deficiente o
reglilla inadecuada.
8. Incubación en atmósfera inadecuada.
9. Error en la transcripción de los resultados en la hoja de reporte.

Qué es la lectura interpretada del antibiograma:

1. Revisar el siguiente documento y precisar además la resistencia natural o íntrinseca
de las enterobacterias: Lectura interpretada del antibiograma de
enterobacterias: http://www.elsevier.es/es-revista-enfermedades-infecciosas-
microbiologia-clinica-28-articulo-lectura-interpretada-del-antibiograma-
enterobacterias-S0213005X10002193
2. Revisar sobre la resistencia natural o íntrinseca de Pseudomonas aeruginosa y
Enterococcus.
Revisar en: http://file.qums.ac.ir/repository/mmrc/clsi%202017.pdf

Conteste:

1. ¿Qué es un antibiograma?
2. ¿Cuáles son los método más empleados y los ideales?
3. ¿Cuál es la finalidad de las pruebas de susceptibilidad?
4. ¿Qué significa sensible, Intermedio y resistente cuando se interpreta un
antibiograma?
5. ¿A qué se refiere con lectura interpretada del antibiograma?
6. Las imágenes siguientes muestran fenómenos especiales de resistencia,
investigue de cuáles se trata:

I.- Test D
Revisar ¨RESISTENCIA A LOS MACRÓLIDOS Y A LA CLINDAMICINA¨ en el sgte
link:
https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicr
obiologia/seimc-procedimientomicrobiologia39.pdf

79
 II.- Técnica de difusión con disco: efecto sinérgico producido entre las cefalosporinas de
espectro extendido o los monobactámicos y el ácido clavulánico.

Imagen tomada de:

https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-
procedimientomicrobiologia38.pdf

III.- Método de inactivación a los carbapenémicos:

Imagen tomada de: http://www.scielo.org.co/pdf/inf/v21n4/0123-9392-inf-21-04-00251.pdf

Elabore un cuadro clínico donde esté implicado algunos de los mecanismos de resistencia
anteriores y diga las implicaciones terapéuticas que trae como consecuencia.

CRITERIOS PARA ESTABLECER CATEGORÍAS EN ANTIBIOGRAMAS

Ejemplos tomados de M100 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing,
27th Edition, se puede revisar en el siguiente link:
http://file.qums.ac.ir/repository/mmrc/clsi%202017.pdf

80
81
Tema 12: Métodos diagnósticos de infecciones virales y micóticas

Objetivo general:
Conocimiento de las técnicas básicas utilizadas en el laboratorio para la investigación de
hongos y virus de importancia médica.

Objetivos específicos:
1. Reconocimiento de las distintas estructuras que tienen los hongos cuando se
desarrollan sobre medios de cultivo.
2. Conocer las características morfológicas (macro y microscópicas) de los distintos
grupos taxonómicos.
3. Observar la técnica de PCR en el laboratorio molecular de la facultad 4. Identificar
mohos por la técnica de “microcultivo”.
5. Analizar casos clínicos para relacionar la parte teórica con la práctica.

Justificación.- Es causa habitual de consulta las molestias descritas como prurito y

eritema, característica de una micosis superficial, que pueden ser difíciles de distinguir
de otras lesiones cutáneas y derivar a un mal tratamiento por el uso de corticoides que
generarán cuadros clínicos atípicos difíciles de diagnosticar y tratar posteriormente. Asi
mismo estan en auge las micosis oportunistas que afectan a individuos
inmunocomprometidos, tal es el caso de los pacientes VIH, causando cuadros clínicos
inespecíficos que requieren de un diagnóstico precoz para aumentar la tasa de éxito en
la adición al tratamiento.

Marco Teórico.-
VIROLOGIA
El estudio de los virus siempre requiere el uso de células vivas. Afortunadamente, en la
actualidad se dispone de líneas celulares continuas: células que se multiplican en un
medio adecuado en frascos de cultivo en el laboratorio. Las células así mantenidas son
muy susceptibles a contaminaciones, variaciones de temperatura, de pH, de presión de
oxígeno, etc. Han de ser cultivadas en unos ambientes muy restringidos, manteniendo
las condiciones lo más constantes posible. Por este motivo, el acceso a la “sala de
cultivos” debe ser restringido y no es aconsejable incluir en las prácticas el manejo de las
células, bien infectadas o bien sin infectar por virus.
Los virus son demasiado pequeños para ser observados con el microscopio óptico 30. Sin
embargo, al desarrollar su ciclo de replicación utilizan productos celulares y alteran la
vida de la célula, y en muchas ocasiones esto sí que se puede observar con el microscopio
óptico, éste es el llamado “efecto citopático”. Los posibles efectos citopáticos son
numerosos. Entre ellos se cuentan la aparición de sincitios, la lisis celular, el desarrollo
de cordones, la vacuolización, la aparición de células gigantes, etc.
NOTA: Nuestro laboratorio no cuenta con lo mencionado líneas arriba, asi que los casos
clínicos y el material que puedan adicionar los estudiantes a la práctica es de mucha
ayuda para la comprensión de este tema.

Micología
EXAMEN DIRECTO
La microscopía sigue siendo una de las herramientas más antiguas y útiles del micólogo
clínico. Con frecuencia los hongos tardan en desarrollar las estructuras conidiógenas

30
IDENTIFICACIÓN DE HONGOS-CLAVES DICOTOMICAS. Universidad Complutense de Madrid. Guión de
prácticas 2008

82
 características para su identificación definitiva. Por lo tanto, es de gran utilidad que a la
vez que se inoculan los medios de cultivo, se realicen las técnicas microscópicas que, en
tiempo real (menos de 10 min), puedan orientar de forma preliminar la etiología del
proceso.

El examen microscópico directo proporciona un diagnóstico definitivo si se observan

elementos fúngicos patognomónicos: cápsula de Cryptococcus neoformans, células
fumagoides en cromo blastomicosis, levaduras pequeñas intracelulares de Histoplasma
capsulatum, quistes/ascas típicos de P. jiroveci, levaduras con brotes de base ancha de
Blastomyces dermatitidis, levaduras con gemación multipolar en rueda de timón de
Paracoccidioides brasiliensis o las esférulas de Coccidiodes immitis. En algunos casos, el
diagnóstico microscópico puede ser la única evidencia de infección fúngica y, en otros, su
negatividad puede sustentar la interpretación de aislamientos como contaminantes. La
escasez de la muestra es, en la práctica, la única razón para no efectuar la observación
microscópica en beneficio del cultivo. El examen microscópico puede también orientar la
técnica de cultivo (medios, temperatura, tiempo de incubación, precauciones especiales
de bioseguridad) e, incluso, su inutilidad por tratarse de patógenos enigmáticos no
cultivables como Rhinosporidium seeberi o Pneumocystis jiroveci.
La observación microscópica se realiza con bajo aumento, seguida de alto aumento en
seco y, si es necesario, con aceite de inmersión. Las dos formas observadas
habitualmente son levaduras y/o elementos miceliares. La mayoría de los hongos se
pueden detectar sin tinción, en la mayor parte de las muestras clínicas como esputos,
orinas, exudados y LCR, usando siempre que sea posible microscopia de contraste de
fases. No obstante, se han desarrollado una serie de tinciones (tinta china, Giemsa,
argénticas, agentes quimio fluorescentes, etc.) para mejorar la sensibilidad de la técnica.
Las técnicas microscópicas directas son de gran utilidad en el estudio de muestras clínicas
de pacientes con micosis que afectan a la piel y mucosas, pero también son muy útiles en
el diagnóstico de micosis subcutáneas y profundas.

Son múltiples las técnicas de observación microscópica para el diagnóstico de las micosis.
Se utilizan montajes húmedos, tinciones fijas y diversas técnicas histológicas para las
muestras de tejidos. En los montajes húmedos, la adición de KOH y dimetil-sulfóxido
(DMSO) permiten la clarificación de la muestra, mientras que la adición de glicerol,
mejora la conservación de las estructuras fúngicas.

Tabla tomada del manual Micro diagnóstica. II parte. Diagnóstico de hongos y levaduras.

Limitaciones del examen microscópico

• Un examen directo negativo nunca descarta una infección fúngica. La sensibilidad

de la técnica puede estar entre 103-105 elementos fúngicos por ml y puede
depender del lugar anatómico, tipo de paciente, tinción y experiencia del
observador.
• El examen microscópico puede originar falsos positivos al confundirse ciertas
estructuras con elementos fúngicos (linfocitos lisados que se confunden con C.
neoformans en la tinción con tinta china, fibras de colágeno o del hisopo que se
confunden con elementos fúngicos, gotas de grasa con levaduras en gemación,
etc.)

83
 • El examen microscópico debe realizarse, al menos, en todas las muestras con alta
sospecha de micosis; aunque lo ideal sería realizarlo siempre que fuese posible.
• Posee una relativamente baja sensibilidad diagnóstica.
• En la mayoría de los casos, no es posible identificar la especie fúngica.
• No permite la realización de estudios de sensibilidad a los Antifúngicos.

Medios de cultivo.- Agar Sabouraud + Glucosa modificado por Emmons: es el medio

estándar para el aislamiento, esporulación y conservación de muchos hongos. Su pH y la
concentración de glucosa favorecen la esporulación.

Incubación.- La temperatura óptima de crecimiento de la mayoría de los hongos

patógenos es 30°C. La temperatura de 37°C debe reservarse para hongos dimórficos o
algún hongo que se desarrolle mejor a esta temperatura. Los cultivos de hongos deben
incubarse durante 3-4 semanas antes de ser desechados, y no deben desecharse cuando
se aísla un hongo, sino que debe completarse el periodo de incubación. Sin embargo, hay
muestras que se pueden eliminar antes (por ejemplo, exudado vaginal), a los 7 días,
cuando se realizan cultivos habituales.

IDENTIFICACIÓN

HONGOS FILAMENTOSOS

Cuando el crecimiento detectado corresponda a un hongo filamentoso, la identificación

se debe hacer por el examen macroscópico de la colonia: forma, color, textura, velocidad
de crecimiento y reverso. Si el hongo tiene abundantes formas de reproducción se
emplea la técnica del scotch o papel de celofán, que consiste en tocar la superficie de la
colonia con la cinta adhesiva y colocarla sobre un porta, en el que se ha depositado una
gota de azul de lactofenol y observar al microscopio.

Cuando no se puede conseguir una buena observación de las formas de reproducción por
las técnicas anteriores, es necesario hacer un microcultivo. Esta técnica consiste en
depositar sobre un porta un trozo de agar de Sabouraud, o del medio recomendado
según el género de hongo filamentoso que se presume, de 1 cm² de superficie
aproximadamente, en cuyos extremos se inocula el hongo problema (en profundidad).
Posteriormente se le coloca un cubre encima y se incuba en cámara húmeda a 25ºC hasta
observar crecimiento; entonces se toma el cubre, que es donde se han depositado las
formas de reproducción, y se coloca sobre un porta que lleva una gota de azul de
lactofenol y se observa al microscopio.

Gráficos:

Imágenes tomadas de http://www.biblioteca.upibi.ipn.mx/

Los criterios de identificación son fundamentalmente morfológicos basados en la

presencia de estructuras de reproducción sexual, estructuras de reproducción asexual y
características especiales de las hifas, cuya descripción pueden ser consultados en atlas

84
micológicos. En ocasiones, la identificación se complementa con pruebas bioquímicas,
como la investigación de la ureasa, que diferencia T. mentagrophytes (positivo) de T.
rubrum (negativo).
LEVADURAS

La mayoría de los organismos levaduriformes crecen fácilmente en un gran número de

medios de cultivo usados rutinariamente en el laboratorio de microbiología (agar sangre,
agar chocolate, agar Cled, etc.). Sin embargo, el AGS (agar glucosado de Sabouraud), con
o sin antibióticos añadidos, es el medio de aislamiento por excelencia para la
identificación de levaduras. En el medio AGS las colonias de levaduras suelen ser
completas, ligeramente abombadas o planas, de consistencia mantecosa, lisa o rugosa,
con olor dulzón agradable, volviéndose más pastosas a medida que la colonia envejece.
Por lo general, las colonias de levaduras no desarrollan micelio aéreo, aunque en
ocasiones pueden aparecer prolongaciones aracneiformes en la periferia de las colonias.

Identificación convencional.- Si se visualiza crecimiento en cualquier medio que sugiera

posibilidad de levaduras, se realiza una extensión en fresco. Si en la misma se observan
levaduras, se procede a la identificación mediante subcultivo.
Si se observa un micelio aéreo definido, debe considerarse la posibilidad de que se trate
de un hongo dimórfico. Una colonia de aspecto y consistencia mucoide sugiere la
formación de cápsulas y puede ser el paso inicial para la identificación de C. neoformans.

Otros medios diagnósticos complementarios31

- Prueba del tubo germinal o filamentación precoz: el tubo germinal es una extensión
filamentosa de la levadura, sin estrechamiento en su origen, cuyo ancho suele ser la
mitad de la célula progenitora y su longitud tres o cuatro veces mayor que la célula
madre.
Falsos negativos: aproximadamente un 5% de cepas de C. albicans dan negativa la prueba
de los tubos germinales. Si se utiliza un inóculo demasiado abundante de levaduras,
también pueden obtenerse falsos resultados negativos.
Metodología: 1) emulsionar una porción de la colonia aislada en 0,5 ml de suero humano,
de caballo o de conejo. 2) Incubar a 35°C durante 2 horas. 3) Depositar una gota de la
emulsión sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, colocar un cubreobjetos y
visualizar a 100 X, 400 X o 1000 X.
Interpretación: La prueba es positiva si se visualizan tubos germinales.

Gráficos:

Fotografía de pseudohifas en Candida spp. (Izquierda). Fotografía de tubo germinativo

positivo, es decir, presencia de C. albicans. Imagen tomada de la Universidad de concepción.
Carrera de Tecnología médica.

31
Micro diagnóstica. II parte. Diagnóstico de hongos y levaduras.

85
 - Detección de ureasa: una levadura con reacción positiva a la prueba de la ureasa
es sugestiva de pertenecer al género Cryptococcus
- Prueba de la enzima nitrato-reductasa: la capacidad de C. neoformans de reducir
nitratos a nitritos es una prueba de utilidad cuando se pretende identificar esta
levadura. Interpretación: el desarrollo inmediato de un color rojo indica una
reacción positiva.
- Prueba de la fenol-oxidasa: C. neoformans produce fenol-oxidasa, una enzima
necesaria para el metabolismo de la 3,4-dihidroxifenilanina (DOPA) y otros
compuestos fenólicos en la síntesis de la melanina.
Interpretación: el desarrollo de una pigmentación marrón oscura alrededor del
crecimiento es característico de C. neoformans.
-Detección de antígenos y Anticuerpos: Se han descrito numerosas técnicas para la
detección de antígenos fúngicos, algunas de ellas incluso disponibles comercialmente.
- Látex para Cryptococcus.
- Inmunofluorescencia para Pneumocystis jiroveci (ex carinii).
- Antigenemia para búsqueda de Aspergillus spp.
- Detección de antígenos de Candida spp.

-Biología molecular:
Entre las técnicas más difundidas está la amplificación por PCR, especialmente por su alta
sensibilidad y rapidez. Esta técnica se ha implementado en diferentes aproximaciones:
PCR con partidores especie o género-específicos, PCR y Southern blot, PCR y análisis con
enzimas de restricción, PCR anidada, PCR en tiempo real, PCR con análisis de fragmentos
y secuenciación. Esta técnica se pretende observar con los subgrupos de estudiantes
coordinando con el área de biología molecular e inmunología.

Actividades por realizar:

Complete:
Como se denominan a las colonias mucosas de color blanco, crema o rosas, que crecen
en agar glucosado de Sabouraud sin formación de
filamentos:……………………………………………………………… Crecimiento en medio Agar
Glucosado de Sabouraud formando colonias de apariencia
miceliar...........................................................................................

Según lo anterior observe los gráficos y mencione de qué se trata

Imágenes tomadas de: IDENTIFICACIÓN DE HONGOS-CLAVES DICOTOMICAS. Universidad

Complutense de Madrid.
Guión de prácticas 2008.
Responda:

86
 1. ¿Qué es un conidio?
2. ¿Qué es un esporangio?
3. ¿A qué familia pertenece el virus de la rubeola?
4. ¿Qué es el dengue, cuales son las estadísticas en el país actualmente?

Investigue
5. Esquema de vacunación
6. Tratamiento Antiretroviral

Referencias bibliográficas
1. Bailey y Scott. (2009). Diagnóstico Microbiológico. (12ª Ed.). Argentina: Editorial
Panamericana.
2. Harrison, T. et. al. (2012). Principios de Medicina Interna. (18ª Ed.). México:
Editorial Mc Graw Hill. Volumen 1.
3. Jawetz, E. (2010).Microbiología Médica. (25ª Ed.). México: Editorial. Mc Graw
Hill.
4. Koneman, E. (2008). Diagnóstico Microbiológico. (6ª Ed.). Argentina: Editorial
Panamericana.
5. Loreto M., Gardeweg M. (2012). Manual Microdiagnóstica parte 1-2-3. (3ª Ed.).
Chile: Laboratorio Linsan s.a.
6. Ministerio de Salud pública del Ecuador. (2010). Manual de normas y
procedimientos para el control de la tuberculosis en Ecuador. (2ª Ed.). (s.l.i.):
(s.e.).
7. Organización Panamericana de la Salud. (2008). Manual para el diagnóstico
bacteriológico de la tuberculosis. (Normas y guía técnica, Parte I). (s.l.i.):
“Baciloscopia”.
8. Perilla Mindy et.al. (2004). Manual de laboratorio para la identificación y prueba
de susceptibilidad a los antimicrobianos de patógenos bacterianos de
importancia para la salud pública en el mundo en desarrollo. (s.l.i.). Organización
Mundial de la Salud (OMS).
9. Pesantes, Carmen. (2010). Módulo de Microbiología. (1ª Ed.). Guayaquil:
Universidad de Guayaquil.
10. Ramírez, Ana et. al. (2010). Manual Práctico de Bacteriología general. (Texto
universitario). (1ª Ed. Digital). Mérida: Universidad de los Andes.
11. Santambrosio, Eduardo et. al. (2009). Tinción y Observación de Microorganismos.
(1ª Ed.). Argentina: Universidad Tecnológica Nacional.
12. Torres Carmen, Cercenado Emilia. (2010). Enfermedades Infecciosas y
Microbiología Clínica. (1ª Ed.). España: Editorial Elsevier.
13. Velasco Judith, Araque María del Carmen. (2011). Manual Práctico de
Bacteriología Clínica. (Texto universitario). (1ª Ed. digital), Mérida: Universidad
de los Andes.
14. Zurita, Jeannette. (2004). Recolección y Transporte de Muestras en Microbiología
Clínica. (1ª Ed.). Quito: OPS.

Paginas consultadas de internet:

- http://www.telmeds.org/atlas
- http://www.practicalscience.com/microscopy.html

87
- www.elsevier.es/eimc
- http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/bacteriologia/tuberculosis.html
- http://aprendeenlinea.udea.edu.co/lms/moodle/file.php/743/Bacteriologia/Pruebas_
de_laboratorio/Prueba_urea.html
- http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Microbiology/Dehydrated-
CultureMedia-Biochemical-Identification-Media-Animal-based-Media/MIO-Medium-
MotilityIndole-Ornithine-Medium-M378
- http://www.biblioteca.upibi.ipn.mx/Archivos/Material%20Didactico/T%C3%A9cnicas%
20microbiol%C3%B3gicas/T%C3%A9cnicas%20Microbiol%C3%B3gicas%20Parte%202.p
df
- http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioAntibioticos.htm -
http://procedimientosmicrobiologicos.wikispaces.com/

88