Justa Mara Poveda Colado

EFECTO DE LA UTILIZACIN DE DISTINTOS CULTIVOS INICIADORES EN LA PROTEOLISIS DEL QUESO MANCHEGO. OTROS ASPECTOS DE LA MADURACIN

I.S.B.N. Ediciones de la UCLM 978-84-8427-559-6

Cuenca, 2007

UNIVERSIDAD DE CASTILLA-LA MANCHA Facultad de Ciencias Qumicas Departamento de Qumica Analtica y Tecnologa de Alimentos

EFECTO DE LA UTILIZACIN DE DISTINTOS CULTIVOS INICIADORES EN LA PROTEOLISIS DEL QUESO MANCHEGO. OTROS ASPECTOS DE LA MADURACIN

JUSTA M POVEDA COLADO

TESIS DOCTORAL Ciudad Real, 2001

Departamento de Qumica Analtica y Tecnologa de Alimentos Facultad de Ciencias Qumicas

EFECTO DE LA UTILIZACIN DE DISTINTOS CULTIVOS INICIADORES EN LA PROTEOLISIS DEL QUESO MANCHEGO. OTROS ASPECTOS DE LA MADURACIN

por Justa M Poveda Colado

Visado en Ciudad Real, a 10 de julio de 2001

Fdo. Lourdes Cabezas Redondo Profesora Titular del Departamento de Qumica Analtica y Tecnologa de Alimentos de la Universidad de Castilla-La Mancha Trabajo presentado para optar al Grado de Doctor en Ciencia y Tecnologa de Alimentos

Fdo. Justa M Poveda Colado Licenciada en Ciencia y Tecnologa de Alimentos

DEPARTAMENTO DE QUMICA ANALTICA Y TECNOLOGA DE ALIMENTOS

JOSE MARA LEMUS GALLEGO, Profesor Titular de Universidad y Secretario del Departamento de Qumica Analtica y Tecnologa de Alimentos de la Universidad de Castilla-La Mancha,

CERTIFICA:
Que el presente trabajo de investigacin titulado Efecto de la utilizacin de distintos cultivos iniciadores en la proteolisis del queso manchego. Otros aspectos de la maduracin constituye la Tesis Doctoral que presenta D. Justa M Poveda Colado para aspirar al Grado de Doctor en Ciencia y Tecnologa de Alimentos, y ha sido realizado en los laboratorios de este Departamento bajo la direccin de la profesora Dra. D. Lourdes Cabezas Redondo.

Y para que as conste, expido y firmo el presente certificado en Ciudad Real a diez de julio de dos mil uno.

V B

Fdo. Mara Dolores Cabezudo Ibez Directora del Departamento

Fdo. Jos Mara Lemus Gallego Secretario del Departamento

A Pedro y a nuestro hijo

AGRADECIMIENTOS

Quiero expresar mi sincero agradecimiento a todas las personas que de una manera u otra han contribudo a la realizacin de esta tesis doctoral.

A la Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha, por la concesin de una beca predoctoral, que aport la financiacin y los medios necesarios.

A la directora de esta tesis, la Dra. Lourdes Cabezas, Profesora Titular del Departamento de Qumica Analtica y Tecnologa de Alimentos, por brindarme sus conocimientos y su confianza.

A la Dra. Mara Dolores Cabezudo, Directora del Departamento de Qumica Analtica y Tecnologa de Alimentos, por su aportacin crtica y su orientacin.

Al Dr. Javier Fontecha, del Instituto del Fro (CSIC) por haberme asesorado en el mtodo de anlisis de los cidos grasos y al Dr. Pedro J. Martn-lvarez, del Instituto de Fermentaciones Industriales (CSIC) por su ayuda en el tratamiento estadstico de una parte de los resultados.

Al Dr. Paul McSweeney, Profesor del University College Cork, en Cork, Irlanda, por haberme aceptado para formar parte de su equipo investigador durante la estancia realizada en su Departamento.

A los doctores Marisol Prez-Coello, por su ayuda en la cromatografa de gases y a Miguel ngel Gonzlez-Vias, por su colaboracin en el Anlisis Sensorial.

A todos los compaeros del Area de Tecnologa de Alimentos, profesores, becarios, etc., que en todo momento se interesaron por mi trabajo y me animaron.

A toda mi familia, por su apoyo incondicional y por sus palabras de nimo en los momentos difciles.

Finalmente, a Pedro, mi marido, por su ayuda, su paciencia, su apoyo moral y por su cario durante estos aos, y a mi hijo, porque l tambin ha soportado el trabajo duro de este ltimo ao.

NDICE GENERAL

ndice general

CAPTULO 1: INTRODUCCIN GENERAL SOBRE EL QUESO. EL

QUESO MANCHEGO

1.1. Aspectos histricos....................................................................................................3

1.2. Proceso de fabricacin del queso.............................................................................7

1.2.1. Seleccin y pretratamiento de la leche para la fabricacin de queso...........7 1.2.2. Acidificacin................................................................................................8 1.2.3. Coagulacin ...............................................................................................10 1.2.4. Corte y desuerado ......................................................................................12 1.2.5. Salado.........................................................................................................12 1.2.6. Maduracin ................................................................................................13

1.3. Bioqumica de la maduracin del queso ...............................................................15

1.3.1. Metabolismo de los hidratos de carbono (glucolisis) ................................15 1.3.1.1. Metabolismo de la lactosa por las bacterias lcticas...................15 1.3.1.2. Metabolismo del lactato por las bacterias lcticas ......................18 1.3.1.3. Metabolismo del citrato ..............................................................19 1.3.2. Lipolisis .....................................................................................................20 1.3.2.1. Agentes lipolticos ......................................................................20 1.3.2.2. Catabolismo de los cidos grasos ...............................................22 1.3.2.3. Tcnicas de anlisis para el estudio de la lipolisis ......................25 1.3.3. Proteolisis...................................................................................................26 1.3.3.1. Agentes proteolticos ..................................................................26 1.3.3.2. Catabolismo de los aminocidos.................................................30 1.3.3.3. Tcnicas para la evaluacin de la proteolisis en el queso ...........31

1.4. Quesos de oveja: El queso Manchego ...................................................................41

1.4.1. El queso Manchego....................................................................................43

III

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

1.4.1.1. Proceso de fabricacin................................................................ 46 1.4.2. Revisin bibliogrfica sobre el queso Manchego......................................52

1.5. Bibliografa .............................................................................................................59

1.6. Justificacin del trabajo.........................................................................................81

CAPTULO 2: INFLUENCIA DE LA POCA DE ELABORACIN EN LA PREDICCIN DEL TIEMPO DE MADURACIN DEL QUESO MANCHEGO

2.1. Introduccin: estado actual del tema ................................................................... 85

2.2. Material y Mtodos ................................................................................................87

2.2.1. Material Experimental ............................................................................... 87 2.2.2. Anlisis fsico-qumicos ............................................................................87 2.2.2.1. Determinacin de la actividad del agua...................................... 87 2.2.2.2. Determinacin del pH................................................................. 88 2.2.2.3. Determinacin del extracto seco................................................. 88 2.2.2.4. Determinacin de cloruros.......................................................... 88 2.2.2.5. Determinacin de nitrgeno y protena totales........................... 89 2.2.2.6. Determinacin de grasa .............................................................. 89 2.2.3. Estudio de la proteolisis.............................................................................89 2.2.3.1. Electroforesis en gel de urea-poliacrilamida .............................. 89 2.2.3.2. Fracciones nitrogenadas ............................................................. 93 2.2.3.3. Determinacin de tirosina y triptfano....................................... 94 2.2.4. Tratamiento estadstico.............................................................................. 95

2.3. Resultados y Discusin...........................................................................................97

2.3.1. Anlisis fsico-qumicos ............................................................................97

IV

ndice general

2.3.2. Proteolisis experimentada por las muestras de queso..............................104 2.3.2.1. Electroforesis en gel de urea-poliacrilamida.............................104 2.3.2.2. Fracciones nitrogenadas............................................................107 2.3.2.3. Contenido en tirosina y triptfano ............................................113 2.3.3. Anlisis Factorial en Componentes Principales.......................................117 2.3.4. Prediccin del tiempo de maduracin del queso Manchego....................119

2.4. Conclusiones..........................................................................................................131

2.5. Bibliografa............................................................................................................133

CAPTULO 3: LIPOLISIS EN EL QUESO MANCHEGO: ESTUDIO DE LOS CIDOS GRASOS LIBRES A LO LARGO DE LA MADURACIN Y SEGN LA POCA DE FABRICACIN

3.1. Introduccin: estado actual del tema..................................................................139

3.2. Material y Mtodos...............................................................................................143 3.2.1. Material experimental ..............................................................................143 3.2.2. Mtodo de extraccin de los cidos grasos libres....................................143 3.2.3. Anlisis por cromatografa de gases ........................................................145 3.2.4. Tratamiento estadstico ............................................................................148

3.3. Resultados y Discusin .........................................................................................149 3.3.1. Contenido en cidos grasos libres............................................................149 3.3.2. Estudio de la evolucin de los cidos grasos libres con el tiempo de maduracin .............................................................................................152 3.3.3. Estudio de la concentracin de los cidos grasos libres segn la poca de elaboracin (primavera, otoo e invierno) ..............................154 3.3.4. Contenido en cidos grasos de la fraccin triglicrica ............................164

3.4. Conclusiones..........................................................................................................169

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

3.5. Bibliografa ...........................................................................................................171

CAPTULO 4: ESTUDIO DE LA UTILIZACIN DE DISTINTOS CULTIVOS INICIADORES EN EL QUESO MANCHEGO. USO DE Lactobacillus plantarum COMO CULTIVO

ADJUNTO DEL STARTER

4.1. Introduccin..........................................................................................................179

4.1.1. Cultivos iniciadores o starters.................................................................185

4.2. Material y Mtodos ..............................................................................................191

4.2.1. Preparacin de los cultivos...................................................................... 191 4.2.2. Elaboracin de los quesos. ......................................................................192 4.2.3. Preparacin de las muestras para el anlisis............................................193 4.2.4. Anlisis microbiolgico........................................................................... 193 4.2.4.1. Preparacin de las muestras para el anlisis microbiolgico ... 193 4.2.4.2. Recuento de bacterias viables totales ....................................... 194 4.2.4.3. Recuento de lactococos ............................................................194 4.2.4.4. Recuento de leuconostoc ..........................................................194 4.2.4.5. Recuento de lactobacilos ..........................................................194 4.2.5. Anlisis fsico-qumicos ..........................................................................195 4.2.6. Estudio de la proteolisis...........................................................................195 4.2.6.1. Fraccin de nitrgeno soluble en agua .....................................195 4.2.6.2. Fraccin de nitrgeno soluble en agua a pH 4,6.......................195 4.2.6.3. Fraccin de nitrgeno soluble en etanol al 70%.......................196 4.2.6.4. Fraccin de nitrgeno soluble en cido fosfotngstico al 5% .. 196 4.2.6.5. Electroforesis en gel de urea-poliacrilamida ............................ 196

VI

ndice general

4.2.6.6. Anlisis de los pptidos de las fracciones insoluble y soluble en etanol al 70% por cromatografa lquida de alta resolucin en fase reversa (RP-HPLC) ..................................................................................................199 4.2.6.7. Anlisis de aminocidos libres..................................................200 4.2.7. Anlisis sensorial .....................................................................................201 4.2.7.1. Anlisis Sensorial Descriptivo ..................................................201 4.2.8. Anlisis estadstico ..................................................................................202

4.3. Resultados y Discusin .........................................................................................207

4.3.1. Anlisis Microbiolgico ..........................................................................207 4.3.1.1. Leche.........................................................................................207 4.3.1.2. Queso ........................................................................................208 4.3.2. Anlisis fsico-qumicos ..........................................................................211 4.3.3. Electroforesis en gel de urea-poliacrilamida ...........................................216 4.3.4. Fracciones nitrogenadas...........................................................................218 4.3.5. Anlisis de los pptidos de las fracciones insoluble y soluble en etanol al 70% por cromatografa lquida de alta resolucin en fase reversa (RP-HPLC) .................................................................................223 4.3.5.1. Fraccin de nitrgeno insoluble en etanol al 70% ....................224 4.3.5.2. Fraccin de nitrgeno soluble en etanol al 70% .......................235 4.3.6. Anlisis de aminocidos libres ................................................................249 4.3.7. Anlisis sensorial .....................................................................................262

4.4. Conclusiones..........................................................................................................269

4.5. Bibliografa............................................................................................................273

VII

CAPTULO 1

INTRODUCCIN GENERAL SOBRE EL QUESO. EL QUESO MANCHEGO.

Introduccin general sobre el queso

Aspectos histricos

1.1. ASPECTOS HISTRICOS

La fabricacin del queso se remonta a la Prehistoria; algunos historiadores afirman que la fabricacin de queso se origin en el valle del Tigris-Efrates hace ms de 8000 aos en lo que ahora se conoce como Irak. Fue necesaria la domesticacin de los animales para que el hombre descubriera el ordeo y con ello, la produccin de leche, para finalmente obtener el queso. El queso fue primeramente producido por la acidificacin natural de la leche (debido a la produccin de cido lctico por microorganismos contaminantes) con la consiguiente formacin de un cogulo, que una vez roto se separ en cuajada y suero. El suero poda ser consumido inmediatamente, mientras que la cuajada se conservaba mediante el salado, el secado al aire o por la accin combinada de ambos. El cido lctico, por tanto, parece haber sido el primer agente coagulante de la leche. Con el almacenamiento de la leche en sacos hechos a partir del estmago de animales, pronto se descubri que algn agente en l causaba la coagulacin de la leche de una forma ms rpida. As, el coagulante exgeno (cuajo) fue introducido por primera vez en la elaboracin del queso (Holsinger et al., 1995). La fabricacin del queso acompa a la expansin de la civilizacin a travs de Oriente Medio, Grecia y Roma. Hay datos que se remontan a las civilizaciones mediterrneas (Egipto, Mesopotamia, etc.) donde se han descubierto en diversas tumbas, jeroglficos, relieves, vasijas, etc., referentes a la cra del ganado y el ordeo. Tambin existen numerosas referencias de la produccin de queso en la Biblia y en la literatura de la Grecia y Roma clsicas. En Espaa hay referencias sobre el conocimiento del queso por las distintas civilizaciones que poblaron la Pennsula. Historiadores de la Roma clsica como Diodoro y el mismo Columela ofrecen su testimonio de la actividad ganadera y la produccin de quesos en la Pennsula, estos ltimos muy apreciados en las mesas romanas, principalmente los del Campo Espartario, nombre con el que los romanos conocan la regin de La Mancha. La expansin del Imperio Romano fue de especial importancia en la introduccin del queso en nuevas zonas geogrficas. Con la llegada de la Edad Media comienza una poca oscura para la elaboracin del queso. Son los monjes de los monasterios espaoles, franceses e italianos

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

los que recogieron las principales tcnicas queseras en pequeos tratados. Muchas de las variedades que an son populares hoy en da, como Saint Paulin, Wensleydale, Port du Salut y Trappist, tuvieron su origen en los monasterios. En nuestro pas, el primer documento en castellano que se conoce referente al queso es una Nodicia de Kesos, del convento de San Justo y Pastor, en Rozuela (Len), del ao 959. La elaboracin del queso se mantuvo esencialmente como un arte hasta que se empezaron a realizar los primeros intentos para estandarizar el procedimiento. Es durante los siglos XVII y XVIII, cuando la fabricacin de queso sufre los cambios ms importantes, apareciendo las primeras queseras con grandes capacidades de produccin, que incorporan los ms modernos adelantos en maquinaria y tcnicas de elaboracin, produciendo quesos muy uniformes en lneas automatizadas con escasa mano de obra. Paralelamente subsisten, con grandes dificultades, pequeas queseras que conservan la tradicin, ofreciendo al consumidor una gran variedad de tipos, aromas y sabores ms naturales y menos uniformizados. Muchos de estos quesos siguen teniendo un carcter meramente local, ligados a pequeas poblaciones montaosas, formando parte de su patrimonio cultural, conservando su rusticidad y caractersticas primitivas, pese al tiempo transcurrido. La transmisin de los mtodos de fabricacin de forma oral primero, y despus por escrito, el desconocimiento de la composicin exacta de los ingredientes y las transformaciones fsicas y qumicas de las que dependera la calidad final fueron la causa de que la fabricacin de queso fuera, hasta la mitad del siglo XIX, ms un arte que una ciencia. Es a partir de esta poca cuando el queso entra en la era cientfica y tecnolgica, como consecuencia de los descubrimientos cientficos de diversos investigadores. En nuestros das, el queso se produce fundamentalmente en fbricas altamente automatizadas en toda Europa, y en pases que en el pasado fueron poblados por emigrantes europeos, como Estados Unidos, Canad, Australia y Nueva Zelanda (Fox, 1993; Holsinger et al., 1995).

Introduccin general sobre el queso

Aspectos histricos

Los primitivos orgenes en la elaboracin del queso y la aplicacin de una ciencia artesana en su fabricacin, han dado origen a ms de 900 nombres diferentes, aunque posiblemente muchos de ellos son similares y se pueden agrupar en 18 tipos naturales (Robinson, 1979). De ah la gran dificultad de ofrecer una definicin de queso que recoja las caractersticas de todas las variedades. El Cdigo Alimentario Espaol (Annimo, 1991) define el queso como el producto fresco o madurado, slido o semislido, obtenido por separacin del suero despus de la coagulacin de la leche natural, de la desnatada total o parcialmente, de la nata, del suero de mantequilla o de una mezcla de algunos o de todos estos productos, por la accin del cuajo u otros coagulantes apropiados, con o sin hidrlisis previa de la lactosa. Existen numerosas clasificaciones para los diferentes tipos de quesos en base a distintos criterios: -procedencia de la leche: quesos de leche de vaca, de oveja, de cabra o de mezclas de estas tres leches -sistema de elaboracin: quesos artesanos e industriales -contenido en humedad: quesos blandos, semiduros o semiblandos y quesos duros -contenido en grasa: quesos desnatados (<10% en grasa), semidesnatados (mnimo 10%), magros (<20%), semigrasos (>20%), grasos (>40%), extragrasos (>45%) y doble grasos (>60%) -maduracin: quesos curados o madurados, quesos madurados con mohos, quesos frescos y quesos blancos pasteurizados

Introduccin general sobre el queso

Proceso de fabricacin del queso

1.2. PROCESO DE FABRICACIN DEL QUESO

La produccin de la mayora de las variedades de queso puede dividirse en dos fases bien definidas: elaboracin y maduracin. Mientras que algunas variedades de quesos se consumen frescas, sin nign perodo de maduracin (Cottage, crema de queso), la mayora de las variedades de queso experimentan una serie de complejas reacciones bioqumicas durante la maduracin, las cuales, si se producen debidamente, dan lugar a un producto con un sabor, un olor y una textura agradables. La bioqumica de la maduracin del queso y el desarrollo del sabor se discutirn ms adelante. La elaboracin del queso consiste bsicamente en un proceso de deshidratacin, donde la grasa y la casena de la leche se concentran entre 6 a 12 veces, dependiendo de la variedad. Las etapas fundamentales que tienen lugar durante la fabricacin del queso son (1) acidificacin; (2) coagulacin; (3) desuerado o sinresis; (4) moldeado y prensado; (5) salado. La cantidad de humedad retenida en la cuajada est influenciada por el grado y la extensin en que se producen estas 5 etapas, junto con la composicin qumica de la leche. Los fenmenos bioqumicos que tienen lugar durante la maduracin estn regulados por el pH, la humedad, el contenido en sal y la microbiota del queso. Estos factores, por tanto, condicionan el sabor, el aroma y la textura del queso madurado. La accin conjunta de la acidificacin, la deshidratacin y el salado de la cuajada, junto con la produccin de sustancias inhibitorias por las bacterias que forman parte del cultivo iniciador o starter y las condiciones anaerbicas que tienen lugar en la cuajada durante la maduracin, previenen el crecimiento de bacterias indeseables y as el queso se mantiene en adecuadas condiciones a lo largo de la maduracin, que puede oscilar entre 2-3 semanas hasta 2 aos o incluso ms tiempo (Fox, 1993).

1.2.1. Seleccin y pretratamiento de la leche para la fabricacin de queso En la industria, la elaboracin del queso comienza con la seleccin de leche de alta calidad microbiolgica y qumica. En la prctica, la leche se almacena a 4 C; en algunos casos (cuando la leche se va a almacenar durante largos perodos de tiempo) se realiza la termizacin de la misma para minimizar el crecimiento de bacterias psicrtrofas. A

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

continuacin la leche se pasteuriza (72 C, 15 s) y en el caso de algunas variedades de queso se estandariza (hasta un cierto valor de la relacin casena/grasa) justo antes de su utilizacin. La pasteurizacin de la leche destruye gran parte de la microbiota nativa, incluidas bacterias patgenas potenciales y otras bacterias no deseadas. Junto con la estandarizacin, la pasteurizacin permite la produccin de un queso de calidad ms uniforme (Fox, 1993). La pasteurizacin de la leche afecta a la proteolisis durante la maduracin del queso, fundamentalmente, a travs de sus efectos en la microbiota nativa; sin embargo, la pasteurizacin tambin origina una ligera desnaturalizacin de las protenas del suero, las cuales interactuan con las casenas (via formacin de enlaces intermoleculares disulfuro) y son incorporadas a la cuajada (Leaver et al., 1995). Se cree que la presencia en el queso de protenas del suero desnaturalizadas puede afectar negativamente a la accesibilidad de las casenas a las proteinasas durante la maduracin (Lau et al., 1991). Aunque la leche pasteurizada es la que ms se utiliza para la fabricacin de queso a escala industrial, todava se usa leche cruda para la fabricacin de algunos quesos denominados quesos artesanos.

1.2.2. Acidificacin La acidificacin es uno de los pasos ms importantes en la fabricacin de la mayora de las variedades de queso. Consiste en la fermentacin de la lactosa hasta la formacin de cido lctico, producida por la inoculacin de las bacterias lcticas starter, o en una fabricacin tradicional, por las bacterias lcticas nativas presentes en la leche cruda. En este ltimo caso, sin embargo, la produccin de cido lctico es a menudo impredecible, y como la microbiota de la leche es muy heterognea, con frecuencia se produce el desarrollo de una microbiota indeseable, lo cual da lugar a la produccin incontrolada de gas y a la aparicin de sabores anormales e indeseables en el queso. Por estas razones, la adicin de un cultivo iniciador o starter se ha convertido en una prctica universal.

Introduccin general sobre el queso

Proceso de fabricacin del queso

Los cultivos iniciadores o starter estn formados por microorganismos mesfilos y termfilos, cuya temperatura ptima de crecimiento, desde un punto de vista prctico, est por debajo y por encima de los 35 C, respectivamente. Los cultivos iniciadores mesfilos ms comunmente utilizados en la industria son Lactococcus lactis subsp. lactis y Lc. lactis subsp. cremoris, mientras que los termfilos son Streptococcus thermophilus y Lactobacillus helveticus u otras especies de lactobacilos. Como adjuntos del cultivo iniciador se han utilizado distintas especies de bacterias, como especies de Leuconostoc, de Lactobacillus y tambin la especie L. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis. Estas bacterias son generalmente aadidas a la leche en bajas concentraciones, y por tanto, no contribuyen significativamente a la produccin de cido durante la fabricacin. Los cultivos mesfilos de cepas definidas normalmente contienen una mezcla de 2 a 6 cepas seleccionadas y se preparan utilizando prcticas de cultivo que minimizan la aparicin de fagos. Las bacterias lcticas desempean desde el comienzo uno de los papeles ms importantes en la elaboracin del queso. El cido lctico producido por dichas bacterias no slo es capaz de coagular por s mismo la leche, sino que tambin favorece la accin del cuajo en una coagulacin mixta. El ndice y la extensin de la produccin de cido tiene un papel importante en varios aspectos de la fabricacin y de la maduracin del queso, entre ellos: 1) la actividad del cuajo durante la fabricacin; 2) el grado de retencin de cuajo en la cuajada; 3) la consistencia de la cuajada y el grado de sinresis de la misma; 4) el grado de solubilizacin de fosfato clcico en la cuajada (lo cual afecta a la susceptibilidad de las casenas a la proteolisis y a las propiedades reolgicas del queso; 5) la inhibicin del crecimiento de NSLAB (non starter lactic acid bacteria), as como de patgenos y de bacterias productoras de gas. El pH de la cuajada desciende al final de la fabricacin hasta alcanzar valores entre 4,6-5,1, sin embargo, el intervalo de tiempo requerido para alcanzar el pH final depende de la variedad de queso. Esta variacin tiene origen en las diferencias en la cantidad de cultivo iniciador aadido a la leche (0,2-5% v/v), el tiempo de coccin durante la

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

fabricacin, el estado de la cuajada durante la elaboracin, el nivel al cual se sala sta y el grado de enfriamiento de la cuajada (Lawrence et al., 1987; Fox, 1993).

1.2.3. Coagulacin Un paso fundamental en la fabricacin de cualquier variedad de queso es la coagulacin de la casena de la leche, con la consiguiente formacin de un gel que engloba tambin a la grasa presente en la misma. Existen dos tipos de coagulacin: coagulacin lctica o cida y coagulacin enzimtica. La coagulacin lctica se realiza por la accin de las bacterias lcticas presentes en la leche cruda o bien aadiendo un cultivo iniciador. De esta forma, la lactosa se transforma en cido lctico, lo que provoca un descenso en el pH de la leche, producindose la desestabilizacin de las micelas de casena y la consiguiente precipitacin de las mismas o coagulacin. Se sabe que la coagulacin enzimtica de la leche es un proceso que engloba dos pasos. En el primero (enzimtico) la quimosina del cuajo hidroliza la -casena en el enlace Phe105-Met106. Cuando esto sucede, el C-terminal hidrofbico del caseinomacropptido (-casena f106-169) se separa de la -casena (la cual se encuentra localizada en la superficie de las micelas de casena y es un factor esencial para la estabilidad de la micela), difunde al medio acuoso y se pierde en el suero. A continuacin se produce la desestabilizacin de la hidrofbica p--casena restante (-casena f1-105), causando la agregacin de las micelas y la coagulacin de la leche en presencia de una concentracin crtica de Ca2+, a temperaturas >20 C; esta es la segunda fase (no enzimtica) del proceso de coagulacin (Dalgleish, 1993; Fox, 1993). La coagulacin enzimtica de la leche (por el cuajo) es la ms empleada en la mayora de las variedades de queso, aunque lo que sucede en realidad es una coagulacin mixta, en la que siempre suele existir un predominio ms o menos acusado de uno de estos dos modos de coagulacin, segn la variedad de queso. Esto va a determinar las caractersticas de la cuajada obtenida.
10

Introduccin general sobre el queso

Proceso de fabricacin del queso

Tradicionalmente se ha estado empleando cuajo animal de ternero lactante en la fabricacin de la mayora de las variedades de queso, aunque en algunas variedades de quesos espaoles y portugueses se usa como coagulante el extracto de la flor de los cardos Cynara humilis y Cynara cardunculus. Sin embargo, actualmente la produccin del cuajo animal ha sido insuficiente para satisfacer la demanda. Esto ha llevado al uso de numerosos sustitutos del cuajo, entre los cuales se incluyen pepsinas bovina, ovina, porcina y de pollo. Los mohos son fuentes comunes de sustitutos del cuajo; as las proteinasas de Cryphonectria parasitica, Mucor pusillus y M. miehei se estn utilizando comercialmente. Tambin se est usando la quimosina recombinante de ternero, expresada en Aspergillus niger var. awamori, Kluyveromyces marxianus var. lactis y en Escherichia coli, y desde su aceptacin por las autoridades reguladoras para su uso en el queso, ha ganado una gran aceptacin en muchos, aunque no en todos los pases (Fox, 1993; Fox et al., 1994). Dependiendo del tipo de cuajo empleado van a variar las caractersticas sensoriales del producto final, tales como el amargor. Se observ que los extractos de la flor del cardo Cynara humilis tienen una actividad proteoltica mucho mayor que otras enzimas coagulantes de la leche (Cabezas, 1980). Nez et al. (1992) encontraron que en el queso Manchego slo parece afectarse el contenido en nitrgeno soluble y no se ven afectadas las caractersticas sensoriales y reolgicas al variar el tipo de cuajo, coincidiendo con los resultados obtenidos por Koch et al. (1986) en queso Edam y Bines et al. (1989) en queso Cheddar. Grappin et al. (1985) observaron cmo estaba influda la actividad de los enzimas coagulantes por el pH y el NaCl. El pH afecta a la actividad proteoltica del cuajo variando el contenido en fracciones nitrogenadas, mientras que el NaCl inhibe la hidrlisis de la casena por la quimosina. Junto con el cuajo tambin se suele aadir cloruro clcico a la leche para mantener el equilibrio entre el calcio soluble en la fase acuosa de la leche con el calcio coloidal ligado a las micelas de casena, debido a que la refrigeracin prolongada de la leche y,

11

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

sobre todo, la pasteurizacin, provocan un aumento del contenido en calcio soluble de la leche a expensas del calcio coloidal, lo cual conlleva una desmineralizacin de la cuajada.

1.2.4. Corte y desuerado Una vez que el gel se ha formado, se procede al corte, as las piezas de cuajada formada empiezan a expulsar rpidamente el suero. Este proceso se conoce como sinresis o desuerado. En muchos casos se realiza un recalentamiento de la cuajada para favorecer la expulsin del suero. El grado y la velocidad de la sinresis depende de diversos factores, entre ellos, la composicin de la leche, especialmente la concentracin de Ca2+, la concentracin de casena, el pH del suero, la temperatura de calentamiento de la cuajada, el grado de agitacin de la mezcla cuajada-suero y el tiempo.

1.2.5. Salado Aparte de la contribucin directa de la sal al sabor del queso, el grado de adicin de sal influye en la maduracin del queso y en su calidad a travs de los efectos en: 1) el crecimiento y la actividad microbiana, particularmente en el metabolismo de la lactosa residual en la cuajada por las bacterias del starter y no starter, lo cual, de hecho, afecta al pH; (2) la actividad de varios enzimas, incluyendo el coagulante (o cuajo), enzimas endgenas de la leche y enzimas de las bacterias del starter y no starter; (3) produciendo una mayor sinresis en la cuajada, lo cual disminuye el contenido en humedad del queso; (4) causando una disminucin en la actividad del agua del queso, lo que afecta a la actividad de diversos enzimas durante la maduracin (Scott, 1981; Guinee y Fox, 1993). El salado suele ser el ltimo paso en la fabricacin del queso y puede ser realizado de varias formas: por inmersin de la cuajada una vez prensada en una salmuera, que suele tener una concentracin del 18-20% en NaCl (por ej., queso Manchego), mediante la aplicacin de sal seca en la superficie del queso moldeado (por ej., quesos azules madurados por mohos, Gruyre de Comt, etc.) o bien mezclando sal seca con la cuajada antes del moldeado o prensado (por ej., quesos tipo Cheddar).

12

Introduccin general sobre el queso

Proceso de fabricacin del queso

1.2.6. Maduracin El cogulo obtenido despus del moldeado y salado se denomina queso fresco. ste puede comercializarse como tal o bien puede ser madurado, desarrollando unas caractersticas sensoriales propias de cada variedad de queso. Durante la maduracin del queso se llevan a cabo una serie de cambios fsicos, qumicos, microbiolgicos y enzimticos que van a conferir al producto final unas caractersticas determinadas. La bioqumica de la maduracin del queso se trata en el siguiente apartado.

13

Introduccin general sobre el queso

Bioqumica de la maduracin

1.3. BIOQUMICA DE LA MADURACIN DEL QUESO

1.3.1. Metabolismo de los hidratos de carbono (glucolisis) La glucolisis en el queso consiste en la transformacin de la lactosa en cido lctico por la accin de las bacterias lcticas presentes en la leche cruda o aadidas como cultivo iniciador. El acmulo de cido lctico facilita la coagulacin de la leche y la retraccin de la cuajada, influye en las reacciones enzimticas y previene el crecimiento de microorganismos perjudiciales o patgenos. La acidez desarrollada influye a su vez en el aroma de ciertos tipos de quesos, sobre todo en los quesos frescos. La glucolisis comienza con la coagulacin de la leche y el desuerado y prosigue durante la maduracin del queso con una intensidad variable, segn el tipo de queso. As pues, la fermentacin lctica juega un papel importante durante el afinado, ya que adems de las funciones comentadas anteriormente, no slo se produce cido lctico, sino que tambin se forman otros productos secundarios que son responsables del aroma.

1.3.1.1. Metabolismo de la lactosa por las bacterias lcticas La ruta del metabolismo de la lactosa durante la fabricacin del queso es caracterstica del tipo de bacterias lcticas presentes en el mismo. Las bacterias lcticas se dividen en dos grupos principales de especies segn la naturaleza y la concentracin de los productos finales resultantes de la fermentacin de la glucosa: homofermentativas y heterofermentativas. Las bacterias lcticas homofermentativas, que comprenden las especies de Streptococcus (S. mutans, S. thermophilus), Enterococcus (E. faecalis), Lactococcus (Lc. lactis subsp. lactis), Pediococcus (P. pentosaceus, P. halophilus) y Lactobacillus homofermentativos (Lb. casei, Lb. plantarum) convierten prcticamente toda la glucosa en cido lctico (90-95%). Las bacterias lcticas heterofermentativas fermentan la glucosa produciendo menos de 1,8 moles de cido lctico/mol de glucosa y

15

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

producen, adems de cido lctico, etanol, acetato y CO2. Los grupos principales que pertenencen a esta clase son los Leuconostoc (por ej., Ln. mesenteroides) y ciertos Lactobacillus (por ej., Lb. brevis). Las principales rutas metablicas utilizadas por las bacterias lcticas se muestran en la Figura 1.1. Lactococcus lactis subsp. lactis metaboliza la lactosa a cido L-lctico. La glucosa sigue la ruta glicoltica mientras que la galactosa es metabolizada por la va tagatosa. En los quesos elaborados con un starter termfilo (p. ej., quesos de tipo suizo) Streptococcus thermophilus utiliza la lactosa hidrolizndola por medio de la galactosidasa; la glucosa se metaboliza a L-lactato por la ruta glicoltica. S. thermophilus es incapaz de metabolizar la galactosa que secreta. Cuando la cuajada se ha enfriado suficientemente pueden crecer especies de Lactobacilllus. Los lactobacilos galactosa (+) convierten la galactosa por la ruta de Leloir a glucosa-1-fosfato, que despus es metabolizada a DL-lactato por la va glicoltica. Algunas variedades de quesos incluyen como starter especies de Leuconostoc, los cuales hidrolizan la lactosa por la galactosidasa a glucosa y galactosa. La glucosa es metabolizada por la ruta fosfocetolasa a cantidades equimolares de D-lactato, etanol y CO2, mientras que la galactosa es probablemente metabolizada por la ruta de Leloir a glucosa-1-fosfato. El cido lctico producido contribuye probablemente al sabor y al aroma de los quesos, especialmente los de coagulacin cida y los quesos frescos de coagulacin enzimtica. El etanol tambin puede contribuir directamente al sabor y al aroma del queso o puede participar en la formacin de steres con cidos grasos (Fox et al., 1990; Cogan y Hill, 1993). La mayor parte de la lactosa de la leche se pierde en el desuerado del queso en forma de lactosa o cido lctico (Huffman y Kristoffersen, 1984). Sin embargo, la cuajada al final de la fabricacin an contiene entre un 0,8-1,5% de lactosa (dependiendo de la variedad); esta lactosa residual es metabolizada generalmente por las bacterias del starter. La velocidad a la cual es metabolizada la lactosa depende en gran medida del contenido en sal en peso hmedo de la cuajada (Turner y Thomas, 1980).

16

Introduccin general sobre el queso

Bioqumica de la maduracin

Figura 1.1: Metabolismo de la lactosa y el lactato en el queso (Fox et al, 1990)

Figura 1.1: Rutas metablicas utilizadas por las bacterias lcticas (Tomada de Cogan y Daly, 1987)

17

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

1.3.1.2. Metabolismo del lactato por las bacterias lcticas El nivel de lactato inmediatamente despus de la fabricacin en queso Cheddar, Suizo y Camembert est en torno a 0,9, 1,2 y 1,0%, respectivamente (Turner y Thomas, 1980; Turner et al., 1983; Karahadian y Lindsay, 1987). El destino de la lactosa en el queso depende de la variedad. En queso Cheddar, quesos holandeses y variedades similares, las NSLAB isomerizan el L-lactato a DL-lactato (Thomas y Crow, 1983). La isomerizacin del L-lactato no es significativa desde el punto de vista del sabor y aroma, pero el D-lactato clcico, que es menos soluble que el L-lactato clcico, puede cristalizar en el queso y formar pequeos cristales blancos indeseables, especialmente en las superficies de corte (Dybing et al., 1988). El lactato puede ser metabolizado posteriormente en el queso Cheddar y en quesos de tipo holandeses; ciertas cepas de NSLAB includas Pediococcus pentosaceus y Lactobacillus plantarum, oxidan el lactato a acetato, CO2 y H2O. En quesos de tipo suizo, las bacterias del starter metabolizan completamente los azcares fermentables en aproximadamente, dos semanas. El cultivo iniciador secundario (bacterias propinicas) crece rpidamente cuando se transfiere a una cmara templada (22 C) y metaboliza el lactato a propionato, acetato y CO2. El CO2 generado es el responsable de la formacin de ojos, lo cual es caracterstico de los quesos de tipo suizo, mientras que el acetato y, particularmente, el propionato contribuyen al aroma y al sabor del queso (Turner et al., 1983). El metabolismo del lactato se da de forma muy intensa en quesos madurados por mohos, como en el queso Camembert y en el Brie (Karahadian y Lindsay, 1987; Fox et al., 1990). Despus de la fabricacin, los mohos de la superficie (Geotrichum candidum y Penicillium caseicolum) colonizan y dominan rpidamente la superficie de estos quesos, metabolizando rpidamente el lactato a CO2 y H2O, y provocando un incremento en el pH y la formacin de un gradiente de pH desde la superficie al centro; esto causa la difusin del lactato hacia el exterior. Cuando todo el lactato ha sido metabolizado, los mohos metabolizan las protenas, resultando en la formacin de NH3 que difunde al interior, produciendo un mayor aumento del pH. El metabolismo del lactato y de las protenas y el

18

Introduccin general sobre el queso

Bioqumica de la maduracin

resultante aumento del pH influyen en la solubilidad del fosfato clcico (lo que afecta a la textura) y a la actividad de la plasmina (que afecta a la proteolisis) durante la maduracin de estas variedades de quesos (Fox et al., 1990).

1.3.1.3. Metabolismo del citrato La leche contiene aproximadamente 8 mM de citrato, la mayor parte del cual (~90%) es soluble y se pierde en el suero durante la fabricacin del queso. Lc. lactis subsp. diacetylactis y especies de Leuconostoc metabolizan el citrato a compuestos como el diacetilo y el CO2 (Cogan, 1987; Cogan y Daly, 1987) (Figura 1.2). El diacetilo contribuye al aroma y al sabor de los quesos y de muchos tipos de leches fermentadas. Debido a la produccin de CO2, el metabolismo del citrato es el responsable de la formacin de los ojos caractersticos en los quesos tipo holandeses y de la textura abierta indeseable y los defectos de flotacin de la cuajada en queso Cheddar y Cottage, respectivamente (Fox et al., 1990).

acetato
TPP

CO TPP-acetaldehdo
Acetil-CoA

CITRATO
Citrato liasa

oxalacetato

Oxalacetato descarboxilas

piruvato
Acetolactato sintetasasa

CoASH

-acetolactato
Acetolactato descarboxilasa Acetona reductasa
+ NAD(P) NAD(P) TPP

CO acetona

2,3-butilnglicol

Diacetilreductasa

diacetilo

+ NAD(P)

NAD(P)

Figura 1.2: Ruta del metabolismo del citrato en Lactococcus lactis subsp. diacetylactis y en Leuconostoc (de Fox et al., 1990)

19

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

1.3.2. Lipolisis La grasa es esencial para el desarrollo de un aroma propio en el queso durante la maduracin. Los quesos que se elaboran normalmente con leche entera no desarrollan un sabor apropiado cuando se elaboran con leche desnatada o leche en la cual la grasa ha sido sustituda por otros constituyentes (Ohren y Tuckey, 1967; Foda et al., 1974; Wijensudera et al., 1998). De hecho, el principal problema en la elaboracin de quesos bajos en grasa es la consecucin de un buen sabor, propio del queso. Como en todos los alimentos que tienen un elevado contenido en grasa, la grasa del queso puede experimentar degradaciones via lipolisis (enzimtica) u oxidacin (qumica), si bien, el grado de oxidacin en los quesos es limitado debido probablemente a su bajo potencial redox y a la presencia en el queso de antioxidantes naturales (Adda et al., 1982). La lipolisis consiste en la hidrlisis de los triglicridos en glicridos parciales y cidos grasos libres (AGL). Los cidos grasos liberados contribuyen directamente al sabor y al aroma del queso, especialmente en quesos duros italianos y en variedades maduradas por mohos. Los cidos grasos libres contribuyen en menor medida al sabor del queso Cheddar joven y al de los quesos holandeses; sin embargo, en quesos extramaduros, como el Parmesano, los cidos grasos libres contribuyen al sabor en la medida en que son equilibrados por productos de la proteolisis y otras reacciones (Fox et al., 1995b).

1.3.2.1. Agentes lipolticos Las lipasas y esterasas en el queso provienen de la leche, del cuajo, del starter, del starter secundario o de las bacterias no starter, siendo las enzimas microbianas la principal fuente. La actuacin de las distintas enzimas depende de la variedad de queso. La leche contiene una lipoprotein-lipasa (LPL) nativa bien caracterizada (Olivecrona y Bengtsson-Olivecrona, 1991) y varias esterasas (Deeth y Fiztgerald, 1976). La LPL bovina es poco especfica y libera cidos grasos de las posiciones sn-1 y sn-3 de los mono, di y triglicridos y de la posicin sn-1 de los glicerofosfolpidos (Olivecrona et al., 1992). En la grasa de la leche los cidos grasos de cadena corta (responsables del

20

Introduccin general sobre el queso

Bioqumica de la maduracin

sabor y del olor) estn esterificados principalmente en la posicin sn-3 (Parodi, 1979) y por tanto, incluso una baja actividad de la LPL puede tener un efecto significativo en el sabor y al aroma del queso. La LPL est asociada fundamentalmente a las micelas de casena y, por tanto, pasa al queso. La LPL es la responsable probablemente de una lipolisis considerable en los quesos que se elaboran con leche cruda y tambin puede contribuir a la lipolisis en los quesos de leche pasteurizada, ya que se requiere un calentamiento a temperaturas por encima de 78 C durante 10 segundos para su completa inactivacin (Driessen, 1989). Las bacterias psicrtrofas (por ej., especies del gnero Pseudomonas) que dominan la microbiota de la leche refrigerada son una fuente potencialmente importante de lipasas en el queso si su concentracin supera recuentos de 107 ufc/mL (Cousins et al., 1977). Aunque los microorganismos psicrtrofos se destruyen durante la pasteurizacin, sus lipasas son termorresistentes y pueden tener actividad lipoltica durante la maduracin. A diferencia de las proteinasas de las bacterias psicrtrofas, las cuales son solubles en agua y se pierden en el suero, las lipasas de las mismas son adsorbidas en la superficie del glbulo graso y se concentran en la cuajada durante la fabricacin (Fox, 1989). Las lipasas de las bacterias psicrtrofas pueden causar enranciamiento en el queso despus de un largo perodo de maduracin (Sorhaug y Stepaniak, 1977). En la elaboracin de variedades de quesos duros italianos, como el Romano y el Provolone, se utilizan pastas de cuajo sin purificar. Estas pastas contienen una potente lipasa, llamada esterasa pregstrica (EPG), la cual cataliza la intensa lipolisis que es responsable del sabor picante caracterstico de estos quesos (Fox y Stepaniak, 1993). La EPG presenta generalmente una gran especificidad sobre los cidos grasos de cadena corta (especialmente el cido butrico) esterificados en la posicin sn-3. Las EPG del cuajo de ternera, cabrito y cordero poseen generalmente caractersticas similares, sin embargo, muestran sutiles diferencias en cuanto a especificidad, lo cual facilita la elaboracin de quesos italianos con diferentes perfiles de sabor y de aroma. Tambin se han ensayado lipasas de origen fngico que parecen dar resultados satisfactorios en la elaboracin de quesos (Fox y Stepaniak, 1993).

21

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

Generalmente, casi todos los microorganismos relacionados con la elaboracin de queso muestran alguna actividad lipoltica-esteroltica. Normalmente, la actividad de las bacterias lcticas y propinicas parece ser limitada pero los lactococos y leuconostoc podran ser ms activos que los lactobacilos y que Streptococcus thermophilus (Gripon et al., 1991). Por otro lado, la flora contaminante de muchas variedades de quesos incluye especies de Micrococcus y Pediococcus, las cuales han mostrado tener actividad lipoltica y esteroltica y podran por tanto, contribuir a la lipolisis durante la maduracin del queso (Bhowmik y Marth, 1990). En muchas variedades de quesos, la microbiota secundaria posee actividad lipoltica-esteroltica. Sin embargo, los mohos son los agentes lipolticos de mayor actividad. En variedades de quesos maduradas por mohos, la lipolisis es debida fundamentalente, a las lipasas de Penicillium roqueforti o P. camemberti. P. camemberti produce una lipasa extracelular con un pH ptimo alcalino mientras que se ha encontrado que P. roqueforti produce tres lipasas, una con un pH ptimo alcalino y dos con un pH ptimo cido (Gripon, 1993).

1.3.2.2. Catabolismo de los cidos grasos En la mayora de las variedades de queso, la lipolisis no es muy intensa. Generalmente no supera el 2% de los triglicridos en los quesos Gouda, Gruyre, Cheddar o Manchego. Sin embargo, en los quesos madurados por mohos en la superficie, el grado de lipolisis puede alcanzar hasta un 10% de los triglicridos, y en quesos azules pueden estar presentes en forma libre hasta el 25% de los cidos grasos totales. Tambin se han encontrado concentraciones relativamente altas de AGL en quesos duros italianos, como el Parmesano y el Romano. Los AGL liberados pueden participar en varias reacciones qumicas (Figura 1.3). La importancia de stas depende de la variedad de queso. La degradacin oxidativa de los AGL es la responsable de la formacin de C(n-1) metilcetonas y de los correspondientes

22

Introduccin general sobre el queso

Bioqumica de la maduracin

alcoholes secundarios de Cn cidos grasos (principalmente desde el C6:0 hasta el C12:0). Estos compuestos son altamente responsables del aroma caracterstico de los quesos azules y del queso Camembert (Gripon et al., 1991). Los AGL son primeramente oxidados a -cetocidos, los cuales son despus descarboxilados a las correspondientes metilcetonas con un tomo de carbono menos. Las metilcetonas tambin pueden formarse por la accin de los mohos a partir de los cetocidos presentes de forma natural a bajas concentraciones en la grasa lctea o por la oxidacin de cidos grasos monoinsaturados (Kinsella y Hwang, 1977). En quesos en los que no se da el crecimiento de mohos durante la maduracin, las metilcetonas se forman por medio de los cetocidos presentes en la leche (Adda et al., 1982). Las metilcetonas se pueden reducir a alcoholes secundarios (2-pentanol, 2heptanol), los cuales contribuyen al sabor de los quesos madurados por mohos. Los steres tambin juegan un papel importante en la formacin del sabor en el queso. La sntesis de los steres se da normalmente a partir de cidos grasos de cadena corta o media, as como de alcoholes alifticos (etanol), aromticos (alcohol feniletlico) o tioles (metanotiol). Los steres tambin pueden proceder de reacciones puramente qumicas, especialmente en quesos madurados durante largos perodos de tiempo (Adda et al., 1982). Las lactonas son steres cclicos que se originan como resultado de la esterificacin intramolecular de un hidroxicido para formar una estructura cclica con la prdida de agua. Las lactonas poseen fuertes aromas, que aunque no son aromas lcteos, pueden contribuir al sabor global del queso (Fox, 1993). Se sabe que las lactonas -C12, C14, -C16, -C10, -C12 y -C14, -C15, -C16 estan correlacionadas con el tiempo de maduracin y con la intensidad del sabor en el queso Cheddar (Fox et al., 2000).

23

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

TRIGLICRIDOS Lipasas

CIDOS GRASOS

-oxidacin

cidos grasos insaturados Oxidacin

-cetocidos -CO2 METILCETONAS Reduccin ALCOHOLES SECUNDARIOS

4- 5hidroxicidos CIDOS GRASOS LIBRES Esterificacin con alcoholes - LACTONAS

Hidroxiperxidos
Hidroxiperoxidasa -liasa

Ciclacin -H2O

ALDEHIDOS

Oxidacin

Reduccin

STERES

CIDOS

ALCOHOLES

Compuestos responsables del sabor

Figura 1.3: Rutas generales del catabolismo de los cidos grasos en el queso

24

Introduccin general sobre el queso

Bioqumica de la maduracin

1.3.2.3. Tcnicas de anlisis para el estudio de la lipolisis El estudio de la lipolisis experimentada por el queso o por los productos lcteos en general, se realiza por medio de la determinacin del contenido en cidos grasos libres. Los mtodos globales de determinacin de los AGL solamente permiten estimar el grado de lipolisis, pero para establecer la clasificacin de la muestra sobre la base de la percepcin organolptica, es necesario estimar las cantidades de los AGL individuales (De la Fuente y Jurez, 1993). Para ello es necesario, en un primer paso, el aislamiento de los AGL antes de proceder a su anlisis. Estos mtodos de aislamiento pueden estar basados en una separacin mecnica (BDI, 1985), en la extraccin con disolventes (Worsstoff et al., 1972; Pillay et al., 1980), en la adsorcin en fase slida (Harper et al., 1956), y en la extraccin con fludos supercrticos (Tuomala y Kallio, 1996). En la bibliografa revisada se han encontrado diversos mtodos para la determinacin del perfil de AGL en queso, siendo la cromatografa de gases la tcnica instrumental ms empleada para su anlisis y cuantificacin (Gray, 1975; Woo y Lindsay, 1982; Contarini et al., 1989; McNeill y Connolly, 1989; De Jong y Badings, 1990; Jurez et al., 1992). Algunos autores han utilizado la inyeccin directa de los cidos grasos sin derivatizar, pero esto presenta problemas de adsorcin de los cidos en los puntos activos de la columna, provocando malas separaciones. Por ello, lo ms frecuente es proceder a la derivatizacin de los cidos grasos previamente a su inyeccin en el equipo cromatogrfico. Tuomala y Kallio (1996) aplicaron la extraccin de CO2 supercrtico junto a la cromatografa de gases para el aislamiento e identificacin de cidos grasos y otros compuestos voltiles en queso suizo. Recientemente tambin se ha utilizado la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) para realizar el anlisis de los AGL. Garca et al. (1990) propusieron un mtodo para la determinacin de los AGL en grasa lctea utilizando un equipo de HPLC con una fase mvil de tres componentes. Esta tcnica ha sido utilizada por diversos autores para la cuantificacin de AGL en el queso (Macedo y Malcata, 1996; Sousa y Malcata, 1997).

25

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

De todos los mtodos, el propuesto por Metcalfe y Wang (1981), modificado posteriormente por Jurez et al. (1992) permite la separacin en un solo paso de la fraccin de los AGL y la de los combinados en los triglicridos, y ha dado buenos resultados en la leche y en el queso (Martnez-Castro et al., 1986; Martn-Hernndez et al., 1988; Jurez et al., 1992; De la Fuente et al., 1993). Por ello, se eligi este mtodo para el anlisis de los AGL en el queso Manchego (Captulo 3 de esta Memoria).

1.3.3. Proteolisis

1.3.3.1. Agentes proteolticos La proteolisis es el fenmeno bioqumico ms complejo y, posiblemente ms importante que tiene lugar durante la maduracin de la mayora de las variedades de queso. Los agentes proteolticos son enzimas procedentes de: 1) el cuajo o coagulante utilizado (fundamentalmente quimosina, tambin puede ser pepsina o proteinasas fngicas cidas; 2) la leche (generalmente plasmina y quizs catepsina D y otras proteinasas de clulas somticas) 3) las bacterias del starter 4) la flora ocasional no starter 5) el starter secundario (en algunas variedades de queso), como P. roqueforti, P. camemberti, Br. linens, especies de lactobacilos y 6) proteinasas exgenas aadidas para acelerar la maduracin o acentuar el sabor. La contribucin relativa de los enzimas proteolticos de estas fuentes depende de la variedad de queso, y ha sido estudiada en quesos elaborados en condiciones microbiolgicas controladas (Fox , 1993). La proteolisis que tiene lugar durante la maduracin del queso podra ser resumida como una hidrlisis inicial de las casenas catalizada, en primer lugar, por el cuajo residual y en menor grado, por la plasmina, resultando en la formacin de pptidos de peso molecular alto y medio, los cuales son sucesivamente degradados por el cuajo y los enzimas del starter y de la microbiota no starter presente en el queso. La produccin de pequeos pptidos y aminocidos libres es debida a la accin de las proteinasas y peptidasas bacterianas. As, durante la proteolisis las casenas son hidrolizadas a pptidos y aminocidos libres, los cuales participan directamente en el aroma y en el sabor del queso o sirven de precursores para el desarrollo del sabor (Fox, 1989).
26

Introduccin general sobre el queso

Bioqumica de la maduracin

La extensin de la proteolisis en el queso puede ser desde muy limitada (en quesos como el Mozzarella) hasta muy extensa (quesos azules). Los productos de la proteolisis van desde grandes polipptidos, de tamao comparable a casenas intactas, pasando por un rango de pptidos de tamao pequeo y medio hasta aminocidos libres (Fox et al., 1995a). La proteolisis es la principal responsable de: -cambios en la textura debidos a: a) la hidrlisis de la matriz proteica, b) disminucin en la actividad del agua causada por la unin de molculas de agua con grupos carboxilo y amino liberados, c) aumento del pH debido a la produccin de NH3 por la desaminacin de aminocidos libres. -contribucin directa al aroma y al sabor mediante la formacin de pptidos y aminocidos y en algunos casos, tambin es la causante de sabores indeseables (especialmente amargor, que est producido por la formacin de pptidos hidrfobos). -liberacin de sustratos, principalmente aminocidos libres, para otras reacciones generadoras de compuestos del sabor (p. ej., desaminacin, descarboxilacin, desulfuracin). -liberacin durante la masticacin de compuestos spidos del queso (Fox y McSweeney, 1996). Los coagulantes empleados para la leche consisten en preparaciones de proteinasas seleccionadas que poseen generalmente una actividad proteoltica considerable. La quimosina es la proteinasa que se encuentra en mayor proporcin en los cuajos animales tradicionales, siendo el resto pepsina. El papel principal de la quimosina en la fabricacin de queso es la hidrlisis especfica del enlace Phe105-Met106 de la protena estabilizadora de la casena, la -casena, durante la coagulacin de la leche. La mayor parte del cuajo aadido a la leche se pierde en el suero, pero aproximadamente un 6% queda retenido en la cuajada, dependiendo del tipo de coagulante, temperatura de coccin y pH en el momento del desuerado. El cuajo residual contribuye a la proteolisis en muchas variedades de queso (Creamer et al., 1985). En quesos de pasta cocida, como el

27

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

Emmental, la quimosina es desnaturalizada en su mayor parte y apenas contribuye a la maduracin. La plasmina es la principal proteinasa nativa de la leche, y ha sido objeto de diversos estudios y revisiones bibliogrficas (Grufferty y Fox, 1988; Bastian y Brown, 1996). El sistema proteoltico de la plasmina es complejo y consiste en el enzima activo (plasmina), su zimgeno (plasmingeno), activadores e inhibidores de la plasmina y de los activadores del plasmingeno (Figura 1.4), los cuales estn todos presentes en la leche. La plasmina, el plasmingeno y los activadores del plasmingeno estn asociados a las micelas de casena de la leche, mientras que los inhibidores de la plasmina se encuentran en la fase del suero. La plasmina es una proteinasa tripsn-serina con una actividad ptima a pH 7,5 y 37 C y es altamente especfica para enlaces peptdicos en el extremo Cterminal de residuos lisil y, en menor grado, arginil (Weinstein y Doolittle, 1972). Es especialmente activa sobre las s2- y -casenas; la hidrlisis de la ltima conlleva a la formacin de las -casenas (fragmentos C-terminales) y proteosas-peptonas (fragmentos N-terminales) (Farkye y Fox, 1992). La leche tambin contiene una proteinasa cida, conocida ahora como catepsina D, la cual es relativamente sensible al calor (se inactiva a 70 C/10 min.) y tiene un pH ptimo de 4,0 (Kaminogawa et al., 1980). La especificidad de la catepsina D es similar a la de la quimosina, con preferencia por la s1-cn, pero esta enzima presenta una escasa actividad coagulante de la leche (McSweeney et al., 1995). En quesos elaborados sin cuajo, la formacin del pptido s1cn f24-199 se ha atribudo a la proteasa cida de la leche (Visser y Groot-Mostert, 1977). Aparte de la catepsina D, tambin existen otras proteasas cidas en la leche, como la elastasa, la cual es capaz de degradar la s1- y la -cn en 6 horas de incubacin produciendo un amplio rango de pptidos detectables por electroforesis en gel de urea-poliacrilamida y posee una amplia especificidad sobre la -cn (Considine et al., 1998). Los enzimas microbianos son agentes proteolticos importantes en todos los tipos de quesos. Las bacterias lcticas poseen un sistema proteinasa-peptidasa que ha sido extensamente estudiado y revisado (Fox y McSweeney, 1996; Kungi et al., 1996). Las bacterias lcticas poseen una proteinasa asociada a la pared celular (PrtP), varias

28

Introduccin general sobre el queso

Bioqumica de la maduracin

Activadores del plasmingeno

Inhibidores de los activadores del plasmingeno

PLASMINGENO

PLASMINA

Inhibidores del plasmingeno

Casena

Polipptidos

Figura 1.4: El sistema plasmina en la leche.

oligoendopeptidasas (PepO y PepF), al menos dos aminopeptidasas genricas (PepN y PepC), una glutamil-aminopeptidasa (PepA), una prolil-dipeptidasa aminopeptidasa (PepX), una prolidasa (PepQ), una tripeptidasa genrica (PepT), y una dipeptidasa genrica (PepV); tambin poseen sistemas para el transporte de pptidos y aminocidos. Este sistema proteoltico es necesario para que se produzca el crecimiento de las bacterias lcticas hasta un nmero elevado en la leche (109-1010 ufc mL-1), que slo contiene bajos niveles de pptidos pequeos y aminocidos. La PrtP contribuye a la formacin de pptidos pequeos en el queso, posiblemente por la hidrlisis de grandes pptidos que provienen de la s1-cn por la quimosina o de la -cn por la plasmina, mientras que las aminopeptidasas, dipeptidasas y tripeptidasas, que son intracelulares, son liberadas tras la lisis celular y son las responsables de la produccin de aminocidos libres. Las bacterias lcticas no starters (NSLAB), aunque inicialmente estn presentes en bajos recuentos, crecen rpidamente hasta alcanzar alrededor de 107 ufc g-1 en 4 semanas y permanecen ms o menos constantes a lo largo de la maduracin (Folkertsma et al., 1996). As, dependiendo de la velocidad de la lisis del starter, las NSLAB pueden predominar en algunas variedades de queso durante la maduracin (Fox y McSweeney, 1996). Las

29

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

NSLAB son especialmente importantes en quesos de leche cruda. La actividad de las NSLAB parece complementar la accin proteoltica del starter, produciendo pptidos de peso molecular generalmente similar y aminocidos libres (Lynch et al., 1997). En muchas variedades de quesos se aade intencionadamente una flora secundaria, que junto con la accin de condiciones medioambientales determinadas, ejercen una serie de funciones, dependiendo en cada caso de los microorganismos utilizados. El sistema proteoltico de los starters secundarios tradicionales, como P. roqueforti (quesos azules), P. camemberti (quesos Camembert y Brie), Propionibacterium spp. (quesos suizos) y Br. linens (quesos de flora superficial) ha sido revisada por Fox y McSweeney (1996). Ambas especies producen aspartil proteinasas y metaloproteinasas; P. camemberti posee adems una proteinasa cida intracelular, mientras que P. roqueforti produce una carboxipeptidasa de amplia especificidad, amino- y carboxipeptidasas (Paquet y Gripon, 1980) y una metalo-aminopeptidasa extracelular (Gripon et al., 1991).

1.3.3.2. Catabolismo de los aminocidos Los productos finales de la proteolisis son los aminocidos libres. El catabolismo de los aminocidos resultantes puede dar lugar a la formacin de un diverso nmero de compuestos, como amoniaco, aldehidos, fenoles, indol y alcoholes, los cuales pueden contribuir de forma importante al desarrollo del sabor en el queso. El primer paso en el catabolismo de los aminocidos conlleva reacciones de descarboxilacin, desaminacin, transaminacin, desulfuracin o quizs hidrlisis de la cadena lateral del aminocido. En un segundo paso se da la conversin de los compuestos resultantes (aminas y cetocidos, as como de los aminocidos mismos) a aldehidos, fundamentalmente por la accin de las desaminasas sobre las aminas. La parte final del catabolismo de los aminocidos es la reduccin de los aldehidos a alcoholes, o su oxidacin a cidos. Los aminocidos azufrados pueden experimentar una extensa conversin, conduciendo a la formacin de un nmero de compuestos, como metanotiol y otros compuestos azufrados. Las rutas del catabolismo de los aminocidos libres han sido revisadas por Hemme et al., (1982), Fox et al., (1995a) y Fox y Wallace, (1997), y se resumen en la Figura 1.5. A

30

Introduccin general sobre el queso

Bioqumica de la maduracin

pesar de la importancia de estas rutas, an no se conocen con detalle los mecanismos de estas reacciones y los agentes que las producen. La concentracin de aminocidos libres depende de la variedad de queso y han sido utilizados como ndices de la maduracin (Aston et al., 1983; Puchades et al., 1989; McSweeney y Fox, 1997a). La concentracin de aminocidos libres en el queso en cualquier momento de la maduracin es el resultado neto de la liberacin de aminocidos a partir de las casenas y de su transformacin en productos catablicos. La concentracin de los aminocidos aumenta generalmente con la maduracin, a excepcin de la arginina, que se ha visto que disminuye en estados de maduracin avanzados (Puchades et al, 1989). La composicin de la fraccin aminoacdica del queso y las proporciones relativas de aminocidos individuales se han considerado como un factor importante para el desarrollo del sabor tpico del queso (Broome et al., 1990). Sin embargo, la proporcin relativa de aminocidos individuales respecto al total de aminocidos parece ser similar en muchas variedades. Adems, McGarry et al. (1994) y Christensen et al. (1995), comprobaron que al aumentar la concentracin de aminocidos libres en el queso o el uso de cepas de lactococos modificados genticamente para producir grandes cantidades de PepN no aceleraron la maduracin o la intensidad del sabor. Fox y Wallace, (1997) sugirieron que el sabor y la concentracin de aminocidos libres podra no estar correlacionada, ya que diferentes tipos de quesos (como Cheddar, Gouda y Edam) que poseen sabores muy diferentes, presentaron concentraciones y proporciones relativas de aminocidos libres muy similares. Estos resultados mostraron que la produccin de aminocidos no es el paso limitante en la maduracin del queso, aunque se piensa que quizs pueda serlo la modificacin qumica o enzimtica de los aminocidos.

1.3.3.3. Tcnicas para la evaluacin de la proteolisis en el queso Los mtodos para el seguimiento de la proteolisis durante la maduracin del queso pueden dividirse en tcnicas no especficas y especficas. Las tcnicas no especficas incluyen la cuantificacin del nitrgeno soluble en diversos extractantes o precipitantes y la liberacin de grupos reactivos. Las casenas son insolubles en muchos solventes, pero los pptidos producidos a partir de las mismas pueden ser solubles y as, la proporcin de

31

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

CASENAS

Aminocidos
Descarboxilacin Transaminacin Desaminacin oxidativa Degradaciones

- CO2 Aminas
Desaminaciones oxidativas

Aminocidos

-Cetocidos CH3SH

- NH4 Aldehdos
Reduccin Oxidacin

Fenoles

Indol

Alcoholes

cidos

Compuestos azufrados

Figura 1.5: Rutas generales del catabolismo de los aminocidos

nitrgeno soluble va aumentando con la proteolisis. Los mtodos no especficos son especialmente tiles para evaluar la extensin de la proteolisis en el queso, ya que los pptidos de pesos moleculares diferentes pueden ser precipitados con una cuidadosa eleccin del solvente; as, por ej., el extracto soluble en agua del queso Cheddar contiene numerosos pptidos de tamao intermedio y pequeo y aminocidos libres (McSweeney y Fox, 1997a), mientras que la fraccin soluble en cido fosfotngstico 5% contiene slo aminocidos libres (excepto Lys y Arg) y pptidos de tamao inferior a 600 Da (Jarret et al., 1982). Aunque algunas tcnicas no especficas ofrecen una informacin til sobre el grado de proteolisis y de la actividad de los agentes proteolticos, lo cierto es que dan poca

32

Introduccin general sobre el queso

Bioqumica de la maduracin

informacin sobre los pptidos que se acumulan o se degradan durante la maduracin del queso. Las tcnicas especficas se emplean para separar pptidos individuales o aminocidos libres utilizando, principalmente, la cromatografa o la electroforesis (McSweeney y Fox, 1997b). En los casos en que se requiere un estudio detallado de la proteolisis, se debe usar una combinacin de tcnicas especficas y no especficas siguiendo un esquema de fraccionamiento del nitrgeno del queso, como los descritos por OSullivan y Fox (1990), Cliffe et al. (1993), Singh et al. (1994) y Breen et al. (1995).

-Mtodos de extraccin y fraccionamiento del nitrgeno en el queso La forma ms sencilla y ms utilizada de preparar una fraccin nitrogenada soluble es probablemente la homogeneizacin del queso en agua. El problema reside en que se debera proceder a la estandarizacin de los diferentes procedimientos para obtener resultados comparables. Kuchroo y Fox (1982a) compararon varias tcnicas de extraccin del N soluble para queso Cheddar. Todas las tcnicas de homogeneizacin estudiadas excepto una, dieron resultados muy similares. Estos autores propusieron un esquema de fraccionamiento del nitrgeno soluble que se muestra a continuacin:

1. Rallar la muestra de queso 2. Pesar 20 g (u otra cantidad adecuada) en una bolsa de Stomacher; aadir el doble del peso de la muestra de agua 3. Homogeneizar en Stomacher a ~ 20C durante 10 min. 4. Calentar hasta 40 C y mantener durante 30 min. 5. Centrifugar a 3000 x g durante 30 min. 6. Filtrar el sobrenadante a travs de lana de vidrio Mediante este procedimiento se extrae ~ el 70% del nitrgeno soluble en agua; si se requiere una extraccin ms completa, se han de repetir los pasos del 2 al 6.

33

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

El extracto de queso soluble en agua contiene numerosos pptidos de pequeo y medio tamao, aminocidos libres y sus productos de degradacin, cidos orgnicos y sales. La extraccin con agua separa eficazmente los pptidos pequeos y medianos en el queso de las protenas y pptidos grandes. La cantidad de nitrgeno soluble en agua expresado como porcentaje del N total depende de la variedad de queso, y aumenta con la maduracin. El pH aproximado del extracto acuoso de quesos madurados internamente por bacterias (Cheddar, Holandeses, Suizo, Manchego) est en torno a 5,2 y hay muy poca diferencia entre los niveles de nitrgeno soluble en agua y el nitrgeno soluble en tampones a pH 4,6 (Fox, 1989). Sin embargo, en quesos en los que el pH aumenta de forma notable durante la maduracin (Camembert, Brie, Azul), el nitrgeno soluble en agua es mucho mayor que el nitrgeno soluble a pH 4,6, por lo cual es aconsejable el ajuste del pH durante el proceso de extraccin. Una vez extrada la fraccin de nitrgeno soluble en agua se procede a su fraccionamiento. Hasta la fecha se han utilizado varios agentes precipitantes de las protenas para fraccionar los extractos solubles en agua o a pH 4,6. As, se ha utilizado como agente precipitante el cido tricloroactico (TCA) entre el 2 al 12%, para precipitar pptidos de tamao mediano y pequeo de la fraccin de queso soluble en agua o a pH 4,5-4,6. Una de las desventajas del TCA es la necesidad de eliminarlo antes de proceder al estudio de esta fraccin por cromatografa o electroforesis. Una alternativa es el uso de etanol generalmente al 70%, el cual produce el mismo grado de precipitacin que el TCA 12% y presenta la ventaja de que puede ser eliminado fcilmente por evaporacin. Otra ventaja del etanol es que a diferencia del TCA, proporciona un fraccionamiento limpio de pptidos entre el sobrenadante y el precipitado (Fox, 1989). Otros agentes precipitantes ms especficos incluyen la mezcla de cido fosfotngstico (PTA) y cido sulfrico, cido sulfosaliclico al 5%, o cido pcrico. La precipitacin de los extractos acuosos con una mezcla de PTA/H2SO4 se ha utilizado frecuentemente para la preparacin de la fraccin de nitrgeno aminoacdico y se ha considerado como un buen ndice de la maduracin (Wilkinson et al., 1992; Btikofer et al., 1993; Picn et al., 1994; Guinee et al., 1995). En esta fraccin son solubles todos los
34

Introduccin general sobre el queso

Bioqumica de la maduracin

aminocidos libres (excepto lisina y arginina) y los pptidos de peso molecular inferior a 600 Da (Jarret et al., 1982). La concentracin de PTA ms comnmente utilizada es del 5%. Btikofer et al. (1993) realizaron un estudio en el cual participaron varios laboratorios europeos, con el fin de establecer una homogeneidad entre las diversas tcnicas empleadas para la extraccin de las fracciones nitrogenadas en el queso, comprobando que la fraccin de nitrgeno soluble en agua, en PTA, en TCA y en etanol fueron las fracciones mejor correlacionadas con el desarrollo del aroma del queso. Otra forma de evaluar la proteolisis es mediante el estudio de la liberacin de grupos amino o carboxilo. La liberacin de grupos amino se ha estudiado en queso por la reaccin con cido trinitrobencenosulfnico (TNBS) (Samples et al., 1984), fluorescamina (Creamer et al., 1985) o ninhidrina (Pearce et al., 1988) con resultados satisfactorios. Presentan la ventaja de medir un compuesto producido como consecuencia directa de la proteolisis, como es la formacin de grupos amino. La medida del contenido en tirosina en extractos alcohlicos, en TCA o en extractos acuosos tambin se ha utilizado para el seguimiento de la proteolisis, bien midiendo la absorbancia a 280 nm o, de una forma ms especfica, utilizando el reactivo de Folin-Ciocalteau. Vakaleris y Price (1959), midieron el contenido en tirosina y triptfano solubles en extractos de citrato sdico/HCl de queso por absorbancia a 270 y 290 nm. Aunque todas las tcnicas no especficas anteriores ofrecen una valiosa informacin de la extensin de la proteolisis y de la actividad de los agentes proteolticos, dan poca informacin acerca de los pptidos que se acumulan o son degradados en el queso a lo largo de la maduracin. Por esto, se hace necesaria la utilizacin de tcnicas especficas. As, las tcnicas que separan pptidos individuales han sido objeto de estudio en los ltimos aos (McSweeney y Fox, 1997b).

35

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

-Electroforesis La electroforesis es, posiblemente la tcnica ms utilizada para estudiar la proteolisis primaria en el queso. El primer estudio se debe a Lindqvist et al. (1953), que utilizaron la electroforesis en papel para estudiar la proteolisis en diversas variedades de quesos. Posteriormente, otros investigadores emplearon la electroforesis en geles de almidn (Vreeman y Van Riel, 1990; Van der Berg y De Koning, 1990; De Koning et al., 1992) para la separacin de las casenas y sus productos de degradacin en el queso, sin embargo, los geles de almidn son quebradizos y opacos, por lo que han sido reemplazados progresivamente por los geles de poliacrilamida. La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) se aplic por primera vez en el queso por Melachouris y Tuckey (1966) y Ledford et al. (1966). Esta tcnica se ha convertido en la tcnica electrofortica standard. Generalmente se emplean sistemas que contienen urea o dodecil sulfato sdico (SDS) como agentes desnaturalizantes. El uso de la electroforesis para el estudio de la proteolisis en el queso ha sido revisada por Shalabi y Fox (1987). Estos autores compararon la eficiencia de diversos protocolos, tampones y mtodos de tincin, y recomendaron el uso de geles de poliacrilamida en tampones Tris (pH 8,9) con un contenido en urea de 4,5 M, y el mtodo de tincin de Blakesley y Boezi (1977) con azul de Coomasie G 250. Otras tcnicas electroforticas son la electroforesis bidimensional y el isoelectroenfoque. Esta ltima tcnica consiste en la separacin de pptidos y protenas basndose en diferencias en sus puntos isoelctricos. Algunas de sus aplicaciones incluyen la deteccin de adulteracin de leches de oveja con leches de vaca o cabra (Addeo et al., 1983; 1990a, b; Conti et al., 1988; Moio et al., 1989; Amigo et al., 1992). Otra de las ventajas de la electroforesis en geles de poliacrilamida es que permite el aislamiento de pptidos del queso por excisin directa de las bandas o bien por electroblotting. Esta ltima tcnica es ms aconsejable porque permite una mayor recuperacin de la protena, debido a que la excisin ha de hacerse antes del teido del gel (ya que el tamao de las bandas puede cambiar tras el teido). Consiste en la transferencia

36

Introduccin general sobre el queso

Bioqumica de la maduracin

de pptidos desde el gel de poliacrilamida a una membrana de polivinildeno-difluoruro usando una clula de transferencia electrofortica y aplicando un voltaje constante, procediendo posteriormente al teido de las bandas. Estos pptidos pueden ser despus identificados por secuenciacin de su extremo N-terminal (ver ms adelante), pero son ms difciles de analizar por espectrometra de masas, ya que no pueden ser teidos para realizar este anlisis y deben ser eludos desde la matriz del bloting. Una tcnica que ha cobrado gran importancia en los ltimos aos es la electroforesis capilar (EC), debido a que permite separar pptidos procedentes de las casenas dentro de un amplio rango de pesos moleculares. Consiste en la separacin de pptidos en un capilar relleno con tampn bajo la influencia de un campo elctrico. La separacin se produce en base a la carga neta de los pptidos, sus masas y sus radios de Stokes (Young et al., 1992) y a veces, a otras propiedades de los pptidos. La electroforesis capilar presenta un gran potencial para la resolucin de mezclas complejas de pptidos. Tiene algunas desventajas respecto a las tcnicas electroforticas tradicionales, como son la eleccin del tampn y la necesidad de usar instrumentacin automtica de alta resolucin. Los tiempos de separacin son relativamente cortos, aunque solo se puede analizar una muestra cada vez. A diferencia de las tcnicas electroforticas convencionales, en las cuales las protenas y pptidos son visibles por teido, la electroforesis capilar posee monitorizacin continua por absorbancia en ultravioletavisible (UV). Sin embargo, la absorbancia en UV presenta la ventaja de que permite la deteccin de pequeos pptidos que no son visibles por el teido, y adems es una tcnica cuantitativa, a diferencia del resto de tcnicas electroforticas. Existen estudios que emplean esta tcnica para el estudio de las protenas de la leche y del queso (Recio et al., 1996a; Recio et al., 1996b; Molina et al., 1999a; Molina et al., 2000).

-Tcnicas cromatogrficas Hasta la fecha se han utilizado numerosas tcnicas cromatogrficas para la cuantificacin de pptidos o aminocidos en el queso, desde la cromatografa en papel (Kuchroo y Fox, 1982b, 1983a), cromatografa en capa fina sobre gel de slice (Kuchroo y Fox, 1982b, 1983a,b; Edwards y Kosikowski, 1983; Visser et al., 1983), cromatografa en

37

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

columna en distintos medios (Visser et al., 1975; Kuchroo y Fox, 1983a), pero los mtodos cromatogrficos ms utilizados en el anlisis de pptidos en el queso son la cromatografa de intercambio inico y de exclusin, y la cromatografa de alta resolucin en fase reversa (RP-HPLC). Mediante la cromatografa de exclusin en una columna calibrada se pueden estimar los pesos moleculares de pptidos. La muestra a analizar puede ser queso, pptidos de alto peso molecular, extractos de queso solubles en agua o pptidos solubles en PTA y los eluyentes ms comunes son agua y tampones diludos. Los cromatogramas se leen generalmente espectrofotomtricamente a longitudes de onda en el rango del UV. La cromatografa de intercambio inico se usa frecuentemente para el fraccionamiento de protenas de la leche, pero ha tenido un uso limitado en el anlisis del queso (Fox, 1989). La cromatografa lquida de alta resolucin en fase reversa (RP-HPLC) es una tcnica muy verstil y se ha utilizado frecuentemente para caracterizar pptidos en hidrolizados de casena (Le Bars y Gripon, 1989; McSweeney et al., 1993b) y tambin para separar pptidos de bajo peso molecular en distintas fracciones de queso. Normalmente se han utilizado extractos solubles en agua para el anlisis por RP-HPLC (Cliffe y Law, 1991; Gonzlez de Llano et al., 1991; McSweeney et al., 1993a), pero tambin se han estudiado otras fracciones como los extractos soluble e insoluble a pH 4,6 (Kaminogawa et al., 1986; Christensen et al., 1989), el permeato ultrafiltrado de 10 KDa (Singh et al., 1994), las fracciones soluble e insoluble en etanol al 70% (Zarmpoutis et al., 1996) y las fracciones procedentes de la cromatografa de exclusin (Cliffe et al., 1993; Molina et al., 1999b). El gradiente de elucin ms utilizado es el de agua/acetonitrilo o agua/metanol. La deteccin se realiza generalmente por espectrofotometra en el UV, a una longitud de onda generalmente entre 200 a 230 nm (se mide el grupo carbonilo en el enlace peptdico). El problema que presenta esta tcnica es que la comparacin de cromatogramas de diferentes estudios es difcil, ya que se utilizan distintas columnas y diferentes condiciones de elucin y longitudes de onda. No obstante, la RP-HPLC es muy til en la separacin de pptidos del queso solubles en agua. Debido a la complejidad que presenta la fraccin soluble en agua, algunos autores fraccionan este extracto con etanol al 70% previamente al anlisis (McSweeney y Fox, 1997b).

38

Introduccin general sobre el queso

Bioqumica de la maduracin

Para el anlisis de aminocidos libres generalmente se necesita desproteinizar la muestra para eliminar las interferencias producidas por pptidos. Los reactivos ms utilizados son el cido sulfosaliclico, cido tricloroactico, etanol, cido pcrico o Ba(OH)2/ZnSO4. Se aade un patrn interno para facilitar la cuantificacin de los aminocidos. Actualmente est muy extendido el uso de analizadores de aminocidos basados en la cromatografa de intercambio inico, que hacen que la determinacin de aminocidos sea un anlisis sencillo, preciso, cuantitativo y requiere poca preparacin de la muestra. Los aminocidos se detectan generalmente por derivatizacin post-columna, usando a menudo ninhidrina (Ard y Gripon, 1995; Zarmpoutis et al., 1996). Tambin se han determinado aminocidos libres por derivatizacin pre-columna en forma de dansilderivados (Polo et al., 1985), con OPA (ortoftaldehido) (Ramos et al, 1987; Btikofer et al., 1991) o como FMOC (fluorenilmetil cloroformato) derivados, (Btikofer et al., 1991), seguido del anlisis por RP-HPLC. Tambin se pueden determinar aminocidos libres en queso por cromatografa de gases (GC) despus de la derivatizacin con anhdrido heptabutrico (HFBA) con la formacin de los n-heptafluorobutiril-isobutil-derivados. Para ello es ms apropiada la GC capilar (Wood et al., 1985; Laleye et al., 1987; Bertacco et al., 1992). Las ventajas que presenta esta tcnica es que proporciona buenas recuperaciones de aminocidos aadidos, se pueden analizar todos los aminocidos de las protenas, la velocidad y precisin son comparables a las de los analizadores de aminocidos y el coste del equipamiento es menor a largo plazo. Sin embargo, no es una tcnica que se utilice con frecuencia. Las aminas en el queso se pueden cuantificar por RP-HPLC, usando derivatizacin pre-columna (Btikofer et al., 1990) y tambin por electroforesis capilar (FernndezGarca et al., 1999). Tambin la cromatografa de gases con deteccin por espectrometra de masas (GC-MS) permite la identificacin y cuantificacin de los compuestos voltiles del queso (Urbach, 1993), includos los compuestos resultantes del catabolismo de los aminocidos.

39

Introduccin general sobre el queso

El queso Manchego

1.4. QUESOS DE OVEJA: EL QUESO MANCHEGO

Los quesos de oveja deben su tipicidad a la composicin de la leche utilizada en su elaboracin. La leche de oveja se ha considerado siempre como una leche de caractersticas especficas y en ciertos casos, como un producto ms noble que las otras leches. La leche de oveja, al igual que la de cabra, est mucho menos estudiada que la leche de vaca. La Tabla 1.1 muestra la composicin global de las leches de oveja, cabra y vaca.

TABLA 1.1: Composicin global en % de la leche de oveja, cabra y vaca (Anifantakis, 1986; Ramos y Jurez, 1986).

COMPONENTES OVEJA Grasa Protenas Lactosa Cenizas Slidos totales 7,09 5,72 4,61 0,93 18,25

TIPO DE LECHE VACA 3,86 3,22 4,73 0,72 12,60 CABRA 4,37 3,41 4,53 0,63 13,61

La leche de oveja se caracteriza por ser especialmente rica en componentes queseros. As, presenta un contenido en grasa y en protena casi el doble que las leches de vaca y cabra, de ah que para cantidades de leche idnticas, se obtenga de media dos veces ms de queso con la leche de oveja que con la de vaca.

41

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

La leche de oveja presenta un olor y un gusto caractersticos. Asimismo, los quesos elaborados con leche de oveja poseen un aroma particular y presentan sabores tpicos y ms intensos que los elaborados con otros tipos de leche. El color de la grasa de la leche de oveja es netamente blanco, debido a la casi ausencia de caroteno; este pigmento amarillo s se encuentra en la leche de vaca, debido a esto, los quesos de oveja son ms blancos que los de vaca (Kosikowski, 1979). Los quesos de oveja se pueden clasificar atendiendo a los mismos criterios utilizados para los quesos en general, que han sido descritos anteriormente en este Captulo. El Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentacin recoge en el Catlogo de Quesos Espaoles (Annimo, 1990) los siguientes tipos de quesos de oveja: La Bureba, Ans-Hecho, Cceres, Castellano, Grazalema, Idiazbal, Mallorqun, Manchego, Oropesa, Pedroches, Roncal, La Serena, Serrat, Torta del Casar y Zamorano. Adems, existen otros tipos no incluidos en el Catlogo, como son el queso de Huelva, tambin llamado de los Montes de San Benito, el queso de Cincho, el de Aragn, el de Cervera, Urbasa y Gorbea. La produccin de los quesos de oveja puede ser industrial o artesanal, siendo esta ltima difcil de cuantificar dada la situacin de clandestinidad en que se encuentran muchas queseras, situadas en zonas donde la ganadera extensiva o semiextensiva con razas autctonas es la predominante, siendo las regiones de Andaluca y Extremadura donde el queso artesano presenta una de sus mayores potencialidades. El proceso de elaboracin artesanal posee en muchos casos, una serie de caractersticas distintivas respecto a la fabricacin a escala industrial: la utilizacin de la leche producida por las ovejas, generalmente de raza autctona, de la propia explotacin; la existencia de unas instalaciones rudimentarias; la estacionalidad de la produccin y la disponibilidad de una cantidad restringida de leche (Carmona, 1994), as como la utilizacin de cuajo natural de origen animal o vegetal y la maduracin en las propias salas de las explotaciones ovinas.

42

Introduccin general sobre el queso

El queso Manchego

En la actualidad, una gran variedad de los quesos de oveja que se fabrican en nuestro pas estn acogidos a las Denominaciones de Origen, por ejemplo, Manchego, Idiazbal, etc., controlndose as el proceso de fabricacin y maduracin, otorgando solamente a los mejores quesos la contraetiqueta numerada de su Denominacin de Origen.

1.4.1. El queso Manchego La Mancha es una regin con una antigua tradicin ganadera. Sus caractersticas agroclimticas han constitudo siempre un imperativo ecolgico para la explotacin del ganado ovino. En algunos yacimientos arqueolgicos de la Edad del Hierro y del Bronce se han encontrado restos de huesos y lana de oveja y de encellas as como vasos perforados para escurrir la cuajada y otros utensilios propios para fabricar queso. El ingenioso Hidalgo D. Quijote de La Mancha, de D. Miguel de Cervantes, es el ms antiguo documento escrito de notoriedad pblica que conocemos que vincula el queso con La Mancha. Los primeros antecedentes de la Denominacin de Origen Queso Manchego datan de 1945, promovida por las actividades de la Junta Provincial de Fomento Pecuario de Ciudad Real, pero no fue hasta el ao 1982, cuando el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentacin reconoce provisionalmente la Denominacin de Origen Queso Manchego. El 18 de Marzo de 1984 la Consejera de Agricultura de la Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha, aprueba el Reglamento de la Denominacin de Origen Queso Manchego y a efectos de ratificacin, se eleva dicho Reglamento al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentacin. El 21 de Diciembre de 1984 el Ministerio ratifica el Reglamento de la D. O. y de su Consejo Regulador y aprueba su publicacin en el B.O.E. En la Orden del 23 de noviembre de 1995 se publica la ratificacin del Reglamento de la Denominacin de Origen Queso Manchego y de su Consejo Regulador (BOE 19 de Mayo de 1995).

43

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

Segn el Reglamento de la Denominacin de Origen Queso Manchego y de su Consejo Regulador (BOE 19 de Mayo de 1995), se considera queso Manchego el elaborado exclusivamente con leche de oveja de la raza manchega, con una maduracin mnima de 60 das, pudiendo ser artesano o industrial segn haya sido elaborado con leche cruda o pasteurizada. Es un queso madurado, de semicurado a curado, de coagulacin enzimtica y de pasta prensada, no cocida y extragraso. Al trmino de su maduracin los quesos Manchegos deben presentar las siguientes caractersticas: A) Caractersticas qumicas: - pH: 4,8-5,8 - Extracto seco: mnimo del 55% - Grasa: mnima del 50% sobre el extracto seco - ndice de refraccin a 40 C: entre 1,4530-1,4557 - Para la deteccin de leches extraas se aplicar la normativa contemplada en el Real Decreto 1533/1991 del 18 de Octubre, por el que se aprueban los mtodos oficiales de anlisis de leches y productos lcteos. - Protena total: mnimo del 30% sobre el extracto seco - Concentracin de NaCl: mximo 2,3% B) Caractersticas fsicas: - Forma: cilndrica con caras sensiblemente planas - Altura: 7-12 cm - Dimetro: 9-22 cm - Peso: entre 1 y 3,5 Kg - Corteza: de color amarillo o verdoso negruzco en el caso de que no se limpie la superficie de los mohos desarrollados durante la maduracin. La corteza debe presentar las impresiones de los moldes o pleita en la superficie lateral y de la flor en las caras planas. La corteza se encontrar libre de parsitos.

44

Introduccin general sobre el queso

El queso Manchego

- Pasta: firme y compacta, de color variable desde el blanco hasta el marfil amarillento, pudiendo presentar pequeos ojos desigualmente repartidos. Aroma y sabor caractersticos. C) Caractersticas microbiolgicas: - Escherichia coli: mximo 1.000 ufc/g - Staphylococcus aureus: mximo 100 ufc/g - Salmonella- Shigella: ausencia en 25 g - Listeria monocitogenes: ausencia en 25 g Segn el Reglamento de la Denominacin de Origen Manchego la leche destinada a la elaboracin del queso Manchego proceder exclusivamente de ovejas de la raza manchega, siendo el producto natural obtenido del ordeo de las ovejas sanas. Debe estar exenta de calostros y productos medicamentosos que puedan incidir negativamente en la elaboracin, maduracin y conservacin del queso, as como en las condiciones higinicas y sanitarias del mismo. Las caractersticas que debe presentar son: - Materia grasa: mnimo del 6,5% - Lactosa: mnimo 4% - Protenas: mnimo 4,5% - Extracto seco: mnimo 11% - Impurezas macroscpicas: inferior al grado de la Norma UNE 34100 - Acidez: mxima 25 Dornic - Prueba de la reductasa con azul de metileno: 3 horas mnimo - Cenizas: mximo 0,8% La zona de produccin de la leche apta para la elaboracin del queso Manchego, as como la de produccin y maduracin de los mismos se extiende por las provincias de Albacete, Ciudad Real, Cuenca y Toledo.

45

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

Para evitar la comercializacin de quesos que no son autnticamente Manchegos, se coloca durante el prensado en una de las caras del queso una placa de casena con el nmero de serie y la leyenda de Manchego, as como una etiqueta expedida por el C.R.D.O. En la Tabla 1.2 se recogen los datos de las ganaderas y ovejas inscritas, as como de las queseras industriales y artesanales, y de las piezas elaboradas y autorizadas durante el perodo 1985-1999. Del total de piezas, un 85% corresponde a la elaboracin de quesos industriales y el resto, a la de quesos artesanos. Es de destacar el notable aumento de la exportacin en los ltimos aos, siendo Alemania, Francia, Holanda, Reino Unido y Estados Unidos los principales importadores.

1.4.1.1. Proceso de fabricacin En la Figura 1.6 se presenta un esquema de la fabricacin del queso de D.O. Manchego.

-Recogida y recepcin de la leche Actualmente, la obtencin de la leche se realiza fundamentalmente mediante el ordeo mecnico, aunque an perdura el ordeo manual en las pequeas lecheras. Se han venido utilizando recipientes de diversa ndole para la recogida de la leche, tales como cubos, jarros y cntaros, de variadas formas y materiales segn el lugar de procedencia, siendo los ms apropiados y los ms utilizados los de aluminio y los de acero inoxidable por su fcil limpieza.

-Enfriamiento y almacenamiento Una vez realizado el ordeo, la leche se enfra a 3-4 C y se transporta en cisternas isotermas refrigeradas hasta la fbrica, donde se almacena en silos isotermos. El almacenamiento de la leche no debe ser superior a 2 das hasta el momento de la

46

Introduccin general sobre el queso

El queso Manchego

elaboracin, con el fin de evitar el desarrollo de microorganismos psicrtrofos que puedan incidir de forma negativa en el aroma y en el sabor del producto final.

Tabla 1.2: Produccin de queso de D.O. Manchego (Consejo Regulador de la D.O. Manchego) Ganaderas Ao 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 inscritas 705 1.025 1.031 1.458 1.147 1.282 1.337 1.358 1.372 1.360 1.195 1.331 1.447 1.539 1.602 Queseras I 21 32 33 29 26 42 46 47 49 40 39 35 37 37 37 A 22 27 28 26 22 26 32 36 39 37 38 38 38 43 43 Piezas elaboradas 43.968 427.467 354.683 602.976 826.129 808.199 916.140 947.965 1.078.064 1.224.535 1.477.089 1.601.603 1.555.157 1.846.591 2.097.036 Piezas autorizadas 8.898 226.000 238.299 545.459 705.076 721.479 853.070 861.420 894.909 1.149.950 1.382.050 1.464.050 1.508.563 1.681.645 2.002.181 Piezas exportadas 720 18.870 30.124 54.265 58.434 75.929 106.825 146.797 207.638 284.881 278.204 396.938 500.129

I: Industriales A: Artesanales

47

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

-Acondicionamiento A continuacin se procede al acondicionamiento de la leche, en el cual se elimina cualquier material extrao que est presente en la misma mediante filtracin a travs de una malla o pao fino (en los quesos elaborados de forma tradicional). A nivel industrial, adems del filtrado automatizado, se higieniza la leche, centrifugando a alta velocidad para separar las partculas ms groseras. Tambin puede ser sometida a tratamientos de bactofugacin. Aunque en las elaboraciones artesanales se puede realizar la elaboracin de queso con leche cruda, a nivel industrial la leche requiere ser sometida a la pasteurizacin. Las condiciones habituales de pasteurizacin son de 72-74C/15-20 s. Algunas queseras artesanales aplican tratamientos con temperaturas inferiores durante ms tiempo, con el fin de reducir al mximo la presencia de grmenes que podran incidir de forma negativa en la maduracin del queso. Si la leche ha sido tratada trmicamente, no slo se destruye la microbiota patgena sino tambin la microbiota lctica presente, por lo que es necesaria la adicin de cultivos iniciadores o starter. El cultivo iniciador se aade a la leche previamente calentada antes de aadir el cuajo, de forma que se produzca una pequea maduracin. Segn la bibliografa revisada, para fabricar queso tipo Manchego se suele aadir a la leche previamente calentada a 30 C, un cultivo iniciador mesfilo en una proporcin del 0,5 al 1,5%. Aunque el C.R.D.O. Manchego no especifica cul debe ser ste, la leche es generalmente inoculada con cultivos comerciales mixtos, los cuales estn formados por cepas de Lactococcus lactis subsp. lactis, L. lactis subsp. cremoris, L. lactis subsp. lactis fermentadores del citrato y Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris. De estas bacterias lcticas, Lactococcus lactis subsp. lactis es la nica subespecie que se ha encontrado regularmente en el queso Manchego tradicional elaborado con leche cruda y a niveles suficientes como para influir en las caractersticas del producto (Nez et al., 1989).

48

Introduccin general sobre el queso

El queso Manchego

-Coagulacin El queso Manchego, al igual que la mayora de los quesos, se fabrica mediante una coagulacin mixta, es decir, mediante la accin conjunta del cuajo y de la acidificacin causada por la accin de las bacterias lcticas al utilizar como sustrato la lactosa. Tradicionalmente se usa el cuajo extrado del abomaso de terneros lactantes. ste se extrae industrialmente por maceracin a 20-30 C durante 3-4 das, en una salmuera al 10% de NaCl adicionada junto con algn antisptico en pequea cantidad. El C.R.D.O. Manchego no controla el tipo de cuajo que se debe emplear en la elaboracin de esta variedad de queso, por lo que se puede emplear cuajo animal, cuajo vegetal e incluso cuajos de origen fngico. Picn et al. (1994) estudiaron el efecto del uso de quimosina recombinante encapsulada en liposomas de Kluyveromyces lactis para la elaboracin de queso Manchego, observando que los quesos elaborados con este enzima coagulante presentaron un mayor contenido de pptidos de bajo peso molecular, una mayor resistencia a la rotura, aunque no se consigui un buen desarrollo del aroma al compararlos con los quesos control. Junto con la adicin del cuajo, en la elaboracin del queso Manchego se aaden aproximadamente 2,5 g. de cloruro clcico por cada 10 L de leche, aunque este parmetro no est controlado por el C.R.D.O.

-Corte, desuerado, moldeado y prensado de la cuajada Despus de la coagulacin se procede al corte de la cuajada. En las pequeas queseras se utilizan utensilios diversos, como las liras. En las instalaciones de mayor industrializacin se emplean cortadores de mltiples cuchillas u otros dispositivos con una serie de alambres montados en un marco de acero. La ruptura o corte de la cuajada hay que hacerla lentamente para no deshacer el cogulo, pues de lo contrario se formaran granos irregulares que desueran con dificultad. En la determinacin del punto de corte de la cuajada los maestros queseros han venido empleando desde hace muchos aos varios mtodos empricos, tales como la observacin del grado de adherencia de la cuajada a las

49

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

Recogida y recepcin de la leche de oveja Enfriamiento 3-4 C Almacenamiento (2-3 das mximo) Filtracin QUESOS ARTESANALES Leche cruda QUESOS INDUSTRIALES Pasteurizacin (72-74 C, 15-20 seg.) Adicin de cultivo iniciador Adicin de cuajo Coagulacin Corte de la cuajada (5-10 mm aprox.) Agitacin y calentamiento hasta 40 C (sinresis) Moldeado (impresin de la pleita y la flor) Prensado (4-12 horas) Salado en seco o en salmuera Maduracin (12-15 C, 60 das, 75-85%HR) Comercializacin

Figura 1.6: Esquema del proceso de fabricacin del queso Manchego

50

Introduccin general sobre el queso

El queso Manchego

paredes de la cuba o a una varilla introducida en la misma. En el queso Manchego, la cuajada obtenida ser sometida a cortes sucesivos hasta conseguir granos de tamao entre 5-10 mm, favorecindose as la salida del suero. A continuacin la masa se agita y se recalienta hasta alcanzar de modo paulatino una temperatura mxima de 40 C. Este aumento de temperatura provoca la concentracin de la matriz proteica con la consiguiente eliminacin de una nueva fraccin de suero y por otro lado, acelera el metabolismo de las bacterias retenidas en la cuajada, con lo cual aumenta la produccin de cido lctico, disminuye el pH y esta acidez facilita la retraccin de las partculas, favorecindose de nuevo el fenmeno del desuerado. El lactosuero es eliminado por sinresis, es decir, el cogulo formado se concentra por eliminacin de agua y de los constituyentes solubles. El moldeado consiste en introducir la cuajada en moldes para que los quesos, una vez elaborados, presenten el tamao, forma, peso y dimensiones caractersticas del queso Manchego. Los moldes dispondrn de los adecuados relieves para imprimir en las caras del queso la caracterstica flor y en los lados la pleita. A continuacin se realiza el prensado del queso, as se extrae el lactosuero que an puede quedar retenido en la cuajada. Durante esta operacin se coloca en una de las caras del queso una placa de casena suministrada por el C.R.D.O., donde aparece el nmero de serie para la identificacin individual de la pieza. El tiempo de prensado puede oscilar entre 4 y 12 horas, dependiendo del tamao del queso elaborado. Los sistemas de prensado han evolucionado mucho, pasando de las antiguas prensas de pesas y de husillo a las modernas prensas neumticas o hidrulicas horizontales y verticales que prensan los bordes endureciendo la pasta.

-Salado Los quesos Manchegos generalmente se salan por inmersin en una salmuera de concentracin del 18-20% de NaCl a una temperatura de 10 a 15 C, durante 48 horas como mximo.

51

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

-Maduracin Los quesos Manchegos de D.O. han de tener un perodo de maduracin no inferior a 60 das contados a partir de la fecha de moldeado. Durante este perodo se aplicarn las prcticas de volteo y limpieza necesarias hasta que el queso adquiera sus caractersticas peculiares. La corteza puede adquirir un color verde-negruzco si no se limpian los mohos que se desarrollan en la superficie durante la maduracin. El queso madura en cmaras con una humedad relativa del 75-85% y a una temperatura de 12-15 C.

-Conservacin y comercializacin Los quesos amparados por la D.O. nicamente pueden circular y ser expedidos por las queseras e instalaciones inscritas en los tipos de envase que no perjudiquen su calidad y prestigio aprobados por el C.R.D.O. El queso Manchego slo podr comercializarse conservando su corteza, las caractersticas externas y naturales de la maduracin. Podr ser parafinado o recubierto con sustancias inactivas, transparentes y autorizadas o embadurnados con aceite de oliva, pero en todos los casos, la corteza conservar su color y aspectos naturales y deber ser legible la impresin de la placa de casena. En ningn caso se autorizar el empleo de sustancias que proporcionen un color negro. El queso Manchego tambin puede ser comercializado en cajas de madera de buena calidad. Otra forma de conservar el queso Manchego muy extendida por toda la geografa manchega es su inmersin en aceite de oliva. sta se realizaba fundamentalmente de forma artesanal en los hogares y en establecimientos de restauracin, aunque en los ltimos aos la comercializacin de queso Manchego en aceite ha experimentado un notable aumento, debido, fundamentalmente, a que es un producto de alto valor aadido.

1.4.2. Revisin bibliogrfica sobre el queso Manchego Los primeros estudios efectuados sobre el queso Manchego datan de los aos 70. Estos primeros trabajos se centraron en el estudio de la microbiota bacteriana presente en el queso Manchego.

52

Introduccin general sobre el queso

El queso Manchego

Romn-Piana (1975) estudi la microbiota presenta a lo largo de la maduracin de quesos tipo Manchego comerciales elaborados con leche pasteurizada. Los lactococos (antes denominados estreptococos lcticos) constituyeron la flora predominante durante todas las etapas de la maduracin. Los micrococos y levaduras slo aparecieron en la superficie de los quesos sin parafinar, mientras que los lactobacilos (procedentes fundamentalmente de la microbiota ambiental) alcanzaron al final de la maduracin unos recuentos similares a los de lactococos. Posteriormente se sucedieron una serie de trabajos sobre la microbiota de quesos Manchegos artesanales (Nez y Martnez-Moreno, 1976) e industriales (MartnezMoreno y Nez, 1976), as como una serie de estudios especficos sobre la existencia y proliferacin en el queso Manchego de los siguientes gneros de bacterias: estreptococos (ahora lactococos), (Martnez-Moreno, 1976a), lactobacilos, leuconostoc, pediococos (Nez, 1976a, b, c) y micrococos (Martnez-Moreno, 1976b). A estas investigaciones les siguieron otras referentes a la proteolisis primaria (Ramos y Martnez-Castro, 1976; Marcos et al., 1976b; Marcos et al., 1978) y secundaria (Marcos et al., 1976a) experimentada por quesos Manchegos. Se estudiaron por electroforesis los productos de degradacin de las casenas a lo largo de la maduracin y se puso de manifiesto en los quesos de oveja que la -casena se degradaba en una proporcin mucho menor que la -casena. Por otro lado, Marcos et al. (1976a) encontraron una gran variabilidad en los porcentajes de las distintas fracciones nitrogenadas entre distintas muestras de quesos tipo Manchego comerciales. Estas diferencias fueron debidas a la utilizacin de distintas leches de partida, a diferencias e irregularidades en el proceso de elaboracin de los quesos y al diferente grado de maduracin del producto a la venta. Otros estudios han ido encaminados a la deteccin de posibles adulteraciones de la leche empleada en la elaboracin de queso Manchego (adicionando leche de vaca), utilizando distintas tcnicas (Ramos, 1976; Ramos et al. 1976). La electroforesis en gel de poliacrilamida result ser ms sensible y dio una mayor resolucin que la realizada en

53

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

acetato de celulosa, pudindose detectar hasta un 5% de leche de vaca en leche de oveja y un 10% de leche de vaca en el queso de oveja. Como se ha comentado anteriormente, la inmersin del queso Manchego en aceite de oliva es una prctica habitual de conservacin del mismo. Existen diversos estudios sobre la microbiota, composicin qumica, proteolisis primaria y secundaria (Ordez et al., 1978a), as como del contenido en aminocidos libres (Ordez y Burgos, 1980) y en cidos grasos (Jurez et al. 1980) de quesos Manchegos conservados en aceite de oliva. En estos estudios, se comprob que a partir del primer mes de conservacin en aceite todas las especies de microorganismos estudiadas disminuyeron, excepto los estreptococos (lactococos), que fueron los ms abundantes al final de la maduracin. Los quesos conservados en aceite mostraron un aumento gradual de la proteolisis primaria y secundaria a lo largo del perodo de maduracin en aceite, que fue superior a la observada para queso Manchego conservado convencionalmente (Ordez et al. 1978a). Ordez y Burgos (1980) encontraron en los quesos Manchegos conservados en aceite de oliva, que todos los aminocidos libres aumentaron durante la maduracin, excepto la arginina, que disminuy despus de los 6 meses de maduracin, y el glutmico, que permaneci constante a partir del cuarto mes. Al final de la maduracin, los aminocidos predominantes fueron: lisina, leucina, valina, fenilalanina e isoleucina. En cuanto a los cidos grasos, Jurez et al. (1980) observaron que en el centro del queso la composicin en cidos grasos era la normal para quesos de leche de oveja, sin embargo, debido a la penetracin del aceite a travs de la corteza del queso, la composicin en cidos grasos de las partes del queso cercanas a la corteza fue diferente, lo cual se reflej en una mayor proporcin de los cidos oleico y linoleico. Por otro lado, y con el conocimiento ya existente sobre la microbiota presente en el queso Manchego y sobre su actuacin durante la maduracin, se sucedieron una serie de estudios acerca de la inclusin de cepas seleccionadas como parte de un cultivo iniciador o starter para la elaboracin de queso Manchego. As, Ramos et al. (1981) propusieron un starter especfico para la elaboracin de queso Manchego. En este trabajo se ensayaron 4 combinaciones distintas de diversas

54

Introduccin general sobre el queso

El queso Manchego

cepas de bacterias lcticas en distintas proporciones, entre ellas, Streptococcus lactis (ahora Lactococcus lactis), Leuconostoc lactis, Lactobacillus casei y Lb. plantarum. De todos los cultivos starter ensayados el que produjo unos quesos de mejor calidad sensorial fue el compuesto por S. lactis (97%), Lb. casei (1%), Lb. plantarum (1%) y Ln. lactis (1%). Nez et al. (1981) tambin estudiaron la adicin de diversas cepas de Streptococcus lactis como cultivo iniciador para queso tipo Manchego y Nez et al. (1982) utilizaron starters liofolizados concentrados para la fabricacin de queso Manchego. Nez et al. (1984) investigaron la influencia de las condiciones de fabricacin (temperatura de coccin, temperatura y tiempo de salado) y de maduracin (temperatura de maduracin) en la supervivencia de cepas de enterobacterias en el queso Manchego. Las diferencias en el pH debido a la distinta retencin de suero en la cuajada (producidas a su vez por las diferentes temperaturas de coccin) influyeron en los recuentos de coliformes totales y fecales. La temperatura de salado no tuvo ningn efecto sobre los recuentos de Enterobacteriaceae, mientras que el tiempo de permanencia en la salmuera influy significativamente en los recuentos de enterobacterias y de coliformes fecales. La temperatura de maduracin fue la variable que mostr la mayor influencia en los recuentos de enterobacterias y de coliformes durante todo el perodo de maduracin. Nez et al. (1986) estudiaron el efecto de las temperaturas de coccin y de maduracin sobre la proteolisis y lipolisis del queso Manchego. Los niveles de nitrgeno soluble a pH 4,6, en cido ticloroactico y en cido fosfotngstico de los quesos madurados a 20 C fueron superiores que los alcanzados por las muestras maduradas a 5 C. Lo mismo sucedi con el contenido en AGL. Gaya et al. (1983) estudiaron el efecto de la inoculacin del queso Manchego con cepas de St. lactis (hoy Lactococcus lactis). Estos ltimos autores con el objetivo de disminuir los recuentos de bacterias pertenecientes al gnero Enterobacteriaceae durante la maduracin. Tras 60 das de maduracin, los quesos experimentales presentaron unos recuentos significativamente inferiores a los de los quesos control.

55

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

Fontecha et al. (1994) estudiaron las caractersticas bioqumicas de queso Manchego elaborado con un starter seleccionado, formado por Lactococcus lactis subsp. lactis IFPL 58 (0,5%) y Lc. lactis subsp. cremoris IFPL 26 (0,5%). El recuento microbiano total fue normal durante la elaboracin y la maduracin de los quesos. El nivel de nitrgeno no proteico y el de nitrgeno aminoacdico (en % del NT) fueron elevados (73,6 y 1,92%, respectivamente). A los 90 das de maduracin, el grado de hidrlisis experimentado por las s-casenas (66%) y de las -casenas (17%) produjo unos quesos de caractersticas sensoriales y texturales excelentes. Tambin se ha investigado sobre los cambios en las caractersticas

microbiolgicas, qumicas, reolgicas y sensoriales del queso Manchego envasado a vaco (Nez et al., 1986a), llegndose a la conclusin de que el contenido en humedad y las caractersticas reolgicas se vieron significativamente afectadas por el empaquetamiento a vaco de los quesos realizado tras 1, 2 3 semanas despus del salado. El material de embalaje no tuvo ningn efecto sobre las caractersticas del queso; aunque los quesos envasados a vaco presentaron una menor intensidad del sabor, no hubo diferencias en cuanto a la calidad del sabor entre los quesos envasados a vaco y los quesos control. Tambin existen estudios sobre el comportamiento y supervivencia de Staphylococcus aureus en el queso Manchego con diferentes condiciones de maduracin (Gaya et al., 1984; 1988; Nez et al., 1988). Gaya et al. (1990) estudiaron el efecto del aumento de la temperatura para acelerar la maduracin del queso Manchego. Ms recientemente, se han sucedido una serie de trabajos en los que se ha estudiado la influencia de ciertas actividades enzimticas microbianas especficas en las caractersticas de queso Manchego a lo largo de la maduracin, como son el efecto de la adicin de proteinasa neutra (Nez et al., 1991) y de enzimas procedentes de Aspergillus oryzae (Fernndez-Garca et al., 1993) para acelerar la maduracin, el efecto de la activacin del sistema lactoperoxidasa (Uceda et al., 1994), el empleo de enzimas proteolticas y lipolticas (Fernndez-Garca et al., 1994), el efecto de la adicin de una

56

Introduccin general sobre el queso

El queso Manchego

protenasa neutra de Bacillus subtilis encapsulada en liposomas (Picn et al., 1995), la actividad inhibitoria de la nisina producida por un starter sobre Listeria innocua en el queso durante la maduracin (Rodrguez et al., 1998), el efecto de la cistena proteinasa aislada de Micrococcus sp. INIA 528 en la maduracin del queso Manchego (Mohedano et al., 1998), el efecto de la adicin de proteinasas sobre la formacin de aminas bigenas (Fernndez-Garca et al., 1999), la adicin de cultivos iniciadores definidos y de cultivos iniciadores comerciales mixtos en quesos Manchegos elaborados con leche cruda y pasteurizada (Gmez et al., 1999), as como la formacin de pptidos hidrfilos e hidrfobos durante la maduracin de quesos Manchegos elaborados utilizando distintos coagulantes (Gaya et al., 1999). Tambin existen estudios recientes sobre el salado del queso tipo Manchego mediante un mtodo por impregnado a vaco (Chiralt y Fito, 1997; Guamis et al., 1997; Pava et al., 1999a; Pava et al., 1999b; Gonzlez et al., 1999). Por ltimo en nuestro grupo de investigacin se ha trabajado en las siguientes lneas de investigacin: identificacin y propiedades tecnolgicas de la microbiota del queso Manchego (Garca et al., 1995, 1997); electroforesis, prediccin del tiempo de maduracin del queso Manchego (Garca-Ruiz y Cabezas, 1995; Garca-Ruiz et al., 1998); proteolisis en queso Manchego conservado en aceite de oliva (Poveda et al., 1999a); composicin en cidos grasos libres y combinados de queso Manchego durante la maduracin (Poveda et al., 1999b; Poveda et al., 2000) y anlisis sensorial de quesos Manchegos y otras variedades de quesos europeos (Gonzlez-Vias et al., 2001).

57

Introduccin general sobre el queso

Bibliografa

1.5. BIBLIOGRAFA

-Adda, J., Gripon, J. C. y Vassal, L. (1982). The chemistry of flavour and texture development in cheese. Food Chemistry 9, 115-129. -Addeo, F., Chianese, L., Di Luccia, A., Petrilli, P., Mauriello, R. y Anelli, G. (1983). Identification of bovine casein variants by gel isoelectric focusing. Milchwissenschaft 38, 586-588. -Addeo, F., Moio, L. Chianese, L., Stingo, C. Resmini, E., Berner, I., Krause, D., Di Luccia, A. y Bocca, A. (1990b). Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine cheese by gel isolelectric focusing of -caseins. Michwissenschaft 45, 708-711. -Addeo, F., Moio, L. Chianese, L., Stingo, C. y Di Luccia, A. (1990a). Improved procedure for detecting bovine and ovine milk mixtures in cheese by isoelectric focusing on para--casein. Michwissenschaft 45, 221-224. -Amigo, L., Ramos, M., Calhau, L. y Barbosa, M. (1992). Comparison of electrophoresis, isoelectric focusing and immunodiffusion in determination of cows and goats milk in Serra da Strela cheeses. Lait 72, 95-101. -Anifantakis, E. M. (1986). Phisico-chemical properties of ewe milk and compared of cow milk. International Dairy Federation Documents 202, 42-43. -Annimo (1990). Catlogo de Quesos Espaoles. Ed. Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentacin. Madrid. -Annimo (1991). Cdigo Alimentario Espaol. Ed. Boletn Oficial del Estado. Coleccin textos legales, 6 Ed., Madrid, 105. -Ard, Y. y Gripon, J. C. (1995). Comparative study of peptidolysis in some semi-hard round-eyed cheese varities with different fat contents. Journal of Dairy Research 62, 543-547.

59

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

-Aston, J. W., Greive, P. A., Durward, I. G. Y Dulley, J. R. (1983). Proteolysis and flavour development in Cheddar cheese. Australian Journal of Dairy Technology 38, 55. -Bastian, E. D. y Brown, R. J. (1996). Plasmin in milk and dairy products: An update. International Dairy Journal 6, 435-457. -BDI (1985). Standard methods for the examination of dairy products. 15th Am. Pub. Health Assoc. Inc. New York. -Bertacco, G., Boschella, O. y Lercker, G. (1992). Gas chromatographic determination of free amino acids in cheese. Milchwissenschaft 47, 348-350. -Bhowmik, T. y Marth, E. H. (1990). Esterases of Micrococcus and Pediococcus species in cheese ripening: Identification and partial characterization. Journal of Dairy Science 73, 33-40. -Bines, V. E., Young, P. y Law, B. A. (1989). Comparison of Cheddar cheese made with a recombinant calf chymosin and with standard calf rennet. Journal of Dairy Research 56, 657-664. -Blakesley, R. W. y Boezi, J. A. (1977). A new staining technique for proteins in polyacrylamide gels using Coomassie brilliant blue G250. Analitical Biochemistry 82, 580-582. -BOE 19 de Mayo 1995. Reglamento de la Denominacin de Origen Queso Manchego y de su Consejo Regulador. Orden del Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentacin, 11 de Diciembre de 1995. -Bouton, Y. y Grappin, R. (1995). Comparaison de la qualit de fromages pte prese cuite frabriqus partir de lait cru ou microflitr. Lait 75, 31-44. -Breen, E. D., Fox, P. F. y McSweeney, P. L. H. (1995). Fractionation of water-soluble peptides from Cheddar cheese. Italian Journal of Food Science 7, 211-220.

60

Introduccin general sobre el queso

Bibliografa

-Broome, M. C., Krause, D. A. Y hickey, M. W. (1990). The use of non-atarter lactobacilli in Cheddar cheese manufacture. Australian Journal of Dairy Technology 45, 6773. -Btikofer, U., Fuchs, D., Bosset, J. O. y Gmur, W. (1991). Automated HPLC-amino acid determination by precolumn derivatization with OPA and FMOC and comparison with classical ion-exchange chromatography. Chromatographia 31, 441-447. -Btikofer, U., Fuchs, Murni, D. y Bosset, J. O. (1990). Beitrag zur Bestimmung biogener Amine in Kse. Vergleich einer verbesserten HPLC-mit einer IC-Methode und Anwendung bei verschiedenen Kasesorten. Mitt. Geb. Lebensmittelunters Hyg. 81, 120-133. -Btikofer, U., Ruegg, M. y Ardo, Y. (1993). Determination of nitrogen fractions in cheese, evaluation of a collaborative study. Lebensmittel-Wissenschaft undTechnologie 26, 271-275. -Cabezas, L. (1980). Ensayos sobre el coagulante de la leche del cardo Cynara humilis. Tesina de licenciatura. Facultad de Ciencias. Seccin Biolgicas. Universidad de Crdoba. -Carmona, M. A. (1994). Adicin de cultivos iniciadores y condiciones de maduracin en la fabricacin de queso de oveja artesano. Caractersticas qumicas y sensoriales. Tesis Doctoral. Universidad de Crdoba. -Chiralt, A. y Fito, P. (1997). Salting of Manchego-type cheese by vacuum impregnation. P. Fito, G. Barbosa y E. Ortega, Food Engineering 2000. New York: Chapman & Hall. -Christensen, J. E., Jonhson, M. E. Y Steel, J. L. (1995). Production of Cheddar cheese using Lactococcus lactis subsp. cremoris SK 11 derivative with enhanced aminopeptidase activity. International Dairy Journal 5, 367.

61

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

-Christensen, T. M. I. E., Kristiansen, K. R. y Madsen, J. S. (1989). Proteolysis in cheese investigated by high performance liquid chromatography. Journal of Dairy Research 56, 823-828. -Cliffe, A. J. y Law, B. A. (1991). A time course study of peptide production in accelerated-ripened Cheddar cheese using reverse phase high performance liquid chromatography. Food Biotechnology 5, 1-17. -Cliffe, A. J., Marks, J. D. y Mulholland, F. (1993). Isolation and characterization of nonvolatile flavours from cheese, peptide profile of flavour fractions from Cheddar cheese, determined by reverse phase high-perfomance liquid chromatography. International Dairy Journal 3, 379-387. -Cogan, T. M. (1987). Co-metabolism of citrate and glucose by leuconostoc spp.: Effects on growth, substrates and products, Journal of Applied Bacteriology 63, 551558. -Cogan, T. M. y Daly, C. (1987). Cheese starter cultures. Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology, Vol. 1, 2nd ed., P. F. Fox (ed.) Chapman & Hall, London. -Cogan, T. M. y Hill, C. (1993). Cheese starter cultures. Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology, Vol. 1, 2nd edn., P. F. Fox, ed. Chapman & Hall, London. -Considine, T., Healy, A., Kelly, A. L. y McSweeney, P. L. H. (1998). Proteolytic specificity of elastase on bovine -casein. Food Chemistry 66, 463-470. -Contarini, G., Zucchetti, S., Amelotyi, G. y Toppino, P. M. (1989). Metodiche analitiche e gascromatografiche per la valutazione della frazione acidica libera nei prodotti lattiero-caseari. Rivista Italiana delle Sostanze Grasse 66, 561-567. -Conti, A., Napolitano, L., Cantisani, S. M., Davoli, R. y Dall-Olio, S. (1988). Bovine beta-lactoglobuline H-isolation by preparative isoelectric-focusing in inmobilized pH gradients and preliminary characterization. Journal of Biochemical and Biophysical Methods 16, 205-214.

62

Introduccin general sobre el queso

Bibliografa

-Cousins, C. M., Sharpe, M. E. y Law, B. A. (1977). The bacteriological quality of milk for Cheddar cheesemaking. Dairy industries International 42, 12. -Creamer, L. K., Lawrence, R. C. y Gilles, J. (1985). Effect of acidification of cheese milk on the resultant Cheddar cheese. New Zealand Journal of Dairy Science and Technology 20, 185-203. -Dalgleish, D. G. (1993). The enzimatic coagulationof milk. Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology, Volume 1, P. F. Fox, ed. Chapman & Hall, London. -De Jong, C. y Badings, H. T. (1990). Determination of free fatty acids in milk and cheese. High Resolution Chromatography & Chromatography Communications 13, 9498. -De Koning, P. J., de Wit, J. N. y Driessen, F. M. (1992). Process conditions affecting agethickening and gelation of sterilized canned evaporated milk. Netherland Milk Dairy Journal 46, 3-18. -De la Fuente, M. A. y Jurez, M. (1993). Revisin: Determinacin de cidos grasos libres en productos lcteos. Revista Espaola de Ciencia y Tecnologa de Alimentos 33, 247-269. -Deeth, H. C. y Fiztgerald, C. H. (1976). Lipolysis in dairy products: a review. Australian Journal of Dairy Technology June, 53-61. -Driessen, F. M. (1989). Heat inactivation of lipases and proteinases (indigenous and bacterial). Heat-induced changes in milk, Bulletin 238, International Dairy Federation, Brussels. -Dybing, S. T., Wiegand, J. A., Brudvig, S. A., Huang, E. A. y Chandan, R. C. (1988). Effect of processing variables on the formation of calcium lactate crystals on Cheddar cheese. Journal of Dairy Science 71, 1701-1710. -Edwards, J. y Kosikowski, F. V. (1983). Bitter compounds from Cheddar cheese. Journal of Dairy Science 66, 727-734.

63

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

-Farkye, N. Y. y Fox, P. F. (1992). Contribution of plasmin to Cheddar cheese ripening: effect of added plasmin. Journal of Dairy Research 59, 209. -Fernndez-Garca, E, Olano, A., Cabezudo, D., Martn-Alvarez, P. J. y Ramos, M. (1993). Accelerated ripening of Manchego type cheese by added commercial enzyme preparation from Aspergillus oryzae. Enzyme Microbiology and Technology 15, 519-524. -Fernndez-Garca, E., Lpez-Fandio, R, Alonso, L. y Ramos, M. (1994). The use of lipolitic and proteolitic enzymes in the manufacture of Manchego cheese from ovine and bovine milk. Journal of Dairy Science 77, 2139-2149. -Fernndez-Garca, E., Tomillo, J. y Nez, M. (1999). Effect of added proteinases and level of starter culture on the formation of biogenic amines in raw milk Manchego cheese. International Journal of Food Microbiology, 52, 189-196. -Foda, F. A., Hammond, E. G., Reinbold, G. W. y Hotchkiss, D. K. (1974). Role of fat in flavor of Cheddar cheese. Journal of Dairy Science 57, 1137. -Folkertsma, B, Fox, P. F. y McSweeney, P. L. H. (1996). Acceleration of Cheddar cheese ripening at elevated temperatures. International Dairy Journal 6, 1117. -Fontecha, J., Pelez, C. y Jurez, M. (1994). Biochemical characteristics of a semi-hard ewes milk cheese. Zeitschift Lebensmittel Untersuchung Forschung 198, 24-28. -Fox, P. F. (1989). Proteolysis in cheese during manufacture and ripening. Journal of Dairy Science 72, 1379-1400. -Fox, P. F. (1993). Cheese: an overview. Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology, Volume 1, P. F. Fox, ed. Chapman & Hall, London. -Fox, P. F. y Mcsweeney, P. L. H. (1996). Proteolysis in cheese during ripening. Food Reviews International 12, 457-509. -Fox, P. F. y Stepaniak, L. (1993). Enzymes in cheese technology. International Dairy Journal 3, 609.

64

Introduccin general sobre el queso

Bibliografa

-Fox, P. F. y Wallace, J. M. (1997). Formation of flavour compounds. Advances in Applied Microbiology 45, 17-85. -Fox, P. F., Guinee, T. M., Cogan, T. M. y McSweeney, P. L. H. (2000). Biochemistry of Cheese Ripening. Fundamentals of Cheese Science. Aspen Publishers, Inc., Maryland. -Fox, P. F., Lucey, J. A. y Cogan, T. M. (1990). Glycolysis and related reactions during cheese manufacture and ripening. CRC Critical Reviews of Food Science and Nutrition 29, 237-253. -Fox, P. F., McSweeney, P. L. H. y Singh, T. K. (1995b). Methods for assesing proteolysis in cheese during ripening. Chemistry of Structure/Function Relationships in Cheese. Vol. 367, E. L. Malin & M. H. Tunick (eds.), Plenum Press, London. -Fox, P. F., Singh, T. K. y McSweeney, P. L. H. (1994). Proteolysis in cheese during ripening. Biochemistry of Milk Products, A. T. Andrews & J. Varley, eds. The Royal Society of Chemistry, Cambridge. -Fox, P. F., Singh, T. K. y McSweeney, P. L. H. (1995a). Biogenesis of flavour compounds in cheese. Chemistry of Structure/Function Relationships in Cheese, vol. 367, E. L. Malin and M. H. Tunik (eds), Plenum Press, London. -Garca, A., Cabezas, L. y Palop, M. L. (1995). Identificacin de la flora lctica en quesos de denominacin de origen Manchego. Microbiologie-Aliments-Nutrition 13, 275-280. -Garca, A., Palop, M. L. y Cabezas, L. (1997). Properties of lactic acid bacteria isolated from Manchego cheeses suitable for industrial applications. MicrobiologieAliments-Nutrition 15, 237-240. -Garca, H. S., Reyes, H. R., Malcata, F. X., Hill, C. G. y Amundson, C. H. (1990). Determination of the major free fatty acids in milkfat using a three-component mobile phase for HPLC analysis. Milchwissenschaft 45, 757-759.

65

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

-Garca-Ruiz, A. y Cabezas, L. (1995). Estudio de las diferencias entre la elaboracin artesanal e industrial de quesos Manchegos acogidos a la Denominacin de Origen. Alimentacin, Equipos y Tecnologa Julio-Agosto, 43-48. -Garca-Ruiz, A., Cabezas, L., Martn-lvarez, P. J. y Cabezudo, M. D. (1998). Prediction of the ripening times of Manchego cheese using multivariate statistical analyse: a preliminary study. Zeitschift Lebensmittel Untersuchung Forschung A 206, 382386. -Gaya, P., Carrera, E., Medina, M. y Nez, M. (1999). Formation of hydrophobic and hydrophilic peptides during the manufacture of ewes milk Manchego cheese using different milk coagulants. Milchwissenschaft 54, 556-558. -Gaya, P., Medina, M. y Nez, M. (1983). Accelerated decrease of Enterobacteriaceae counts during ripening of raw milk Manchego cheese by lactic culture inoculation. Journal of Food Protection 46, 305-308. -Gaya, P., Medina, M., Bautista, L. y Nez, M. (1984). Survival of Staphylococcus aureus in raw sheep milk Manchego cheeses ripened at different temperatures. 53rd Annual Meeting Society of Applied Bacterology, Lancaster. -Gaya, P., Medina, M., Bautista, L. y Nez, M. (1988). Influence of lactic starter inoculation, curd heating and ripening temperature on Staphylococcus aureus behavior in Manchego cheese. International Journal of Food Microbiology 6, 249-257. -Gaya, P., Medina, M.,Rodrguez-Marn, M. A. y Nez, M. (1990). Accelerated ripening of ewes milk Manchego cheese: The effect of elevated ripening temperatures. Journal of Dairy Science 73, 26-32. -Gmez, M. J., Rodrguez, E., Gaya, P., Nez, M. y Medina, M. (1999). Characteristics of Manchego cheese manufactured from raw and pasteurized ovine milk and with defined-strain or commercial mixed-strain starter cultures. Journal of Dairy Science 82, 2300-2307.

66

Introduccin general sobre el queso

Bibliografa

-Gonzlez de Llano, D., Ramos, M. y Martn-lvarez, P. J. (1991). Comparative study of different methods for evaluating proteolysis in blue cheese. Zeitschift Lebensmittel Untersuchung Forschung 196, 29-31. -Gonzlez, Ch., Fuentes, C., Andrs, A., Chiralt, A. y Fito, P. (1999). Effectiveness of vacuum impregnation brining of Manchego-type curd. International Dairy Journal 9, 143-148. -Gonzlez-Vias, M. A., Poveda, J. M. y Cabezas, L. (2001). Sensory and chemical evaluation of Manchego cheese and other cheese varieties available in the Spanish market. Journal of Food Quality 24, 157-165. -Grappin, R. T., Rank, T. C. and Olson, N. F. (1985). Primary proteolysis during ripening. Journal of Dairy Science 68, 531-540. -Gray, I. K. (1975). The quantitative analysis of free fatty acids in dairy products. New Zealand Journal of Dairy Science and Technology 10, 158-162. -Gripon, J. C., Monnet, V., Lamberte, G y Desmazeaud, M. J. (1991). Microbial enzymes in cheese ripening. Food Enzymes, P. F. Fox (ed.), Elsevier Applied Science, London. -Gruferty, M. B. y Fox, P. F. (1988). Milk alkaline proteinase: A review. Journal of Dairy Research 55, 609-630. -Guamis, B., Trujillo, A. J., Ferragut, V., Chiralt, A., Andrs, A. y Fito, P. (1997). Ripening control of Manchego type cheese salted by brine vacuum impregnation. International Dairy Journal 7, 185-192. -Guinee, T. P. y Fox, P. F. (1993). Salt in cheese: physical, chemical and biological aspects. Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology, Volume 1, P. F. Fox, ed. Chapman & Hall, London. -Guinee, T. P., Pudja, P. D., Reville, W. J., Harrington, D., Mulholland, E. O, Cotter, M. y Cogan, T. M. (1995). Composition, microstructure and maturation of semihard

67

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

cheeses from high protein ultrafiltered milk retentates with different levels of denatured whey proteins. International Dairy Journal 5, 543-568. -Harper, W. J., Schwartz, D. P. y Hagarawi, I. J. (1956). A rapid silica gel method for measuring total free fatty acids in milk. Journal of Dairy Science 39, 46-50. -Hemme, D., Bouillane, C., Metro, F. y Desmazeaud, M. J. (1982). Microbial catabolism of amino acids during cheese ripening. Science des Aliments 2, 113-123. -Holsinger, V. H., Smith, P. W. y Tunik, M. H. (1995). Overview: cheese chemistry and rheology. Chemistry of Structure-Function Realtionships in Cheese, E. L. Malin & M. H. Tunik, eds, Plenum Press, Nueva York. -Huffman, L. M. y Kristofersen, T. (1984). Role of lactose in Cheddar cheese manufacture and ripening. New Zealand Journal of Dairy Science and Technology 19, 151162. -Jarret, W. D., Aston, J. W. y Dulley, J. R. (1982). A simple method for stimating free amino acids in Cheddar cheese. Australian Journal of Dairy Technology 37, 5558. -Jurez, M., De la Fuente, M. A. y Fontecha, J. (1992). Improved gas chromatographic method for the determination of the individual free fatty acids in cheese using a capillary collumn and PTV inyector. Chromatographia 33, 351-356. -Jurez, M., Martnez-Castro, I. y Ramos, M. (1980). Composicin en cidos grasos de quesos Manchegos conservados en aceite. Proceeding 3er Congreso Nacional de Qumica y Tecnologa de Alimentos, Sevilla. 179-185. -Kaminogawa, S., Yamauchi, K., Miyazawa, S. y Koga, Y. (1980). Degradation of casein components by acid protease of bovine milk. Journal of Dairy Science 63, 701. -Kaminogawa, S., Yan, T. R., Azuma, N. y Yamauchi, K. (1986). Identification of low molecular weight peptides in Gouda-type cheese and evidence for the formation of these peptides from 23-N-terminal residues of s1-casein by proteinases of Streptococcus cremoris H61. Journal of Food Science 51, 1253-1256.

68

Introduccin general sobre el queso

Bibliografa

-Karahadian, C. y Lindsay, R. C. (1987). Integrated roles of lactate, ammonia and calcium in texture development of mould surface-ripened cheese. Journal of Dairy Science 70, 909-918. -Kinsella, J. E. y Hwang, D. H. (1977). Enzymes of Penicillium roqueforti involved in the biosynthesis of cheese flavor. CRC Critical Reviews in Food Science and Nutrition 8,191-228. -Koch, N., Prokopek, D. y Krusch, V. (1986). Manufacture of semihard cheese using chymosin produced by genetic engineering. Milchwitschaftliche Forschungsberichte 38, 193-197. -Kosikowski, F.V. (1979). Cheese and fermented milk foods, 3rd ed. Edwards Brothers, Michigan. -Kuchroo, C. N. y Fox, P. F. (1982a). Soluble nitrogen in Cheddar cheese: comparison of extraction procedures. Milchwissenschaft 37, 331-335. -Kuchroo, C. N. y Fox, P. F. (1982b). Fractionation of water-soluble nitrogen from Cheddar cheese: chemical methods. Milchwissenschaft 37, 651-653. -Kuchroo, C. N. y Fox, P. F. (1983a). Fractionation of the water-soluble nitrogen from Cheddar cheese: chromatographic methods. Milchwissenschaft 38, 76-79. -Kuchroo, C. N. y Fox, P. F. (1983b). A fractionation scheme for the water-soluble nitrogen in Cheddar cheese. Milchwissenschaft 38, 389-391. -Kungi, E. R. S., Mierau, I., Hagting, A., Poolman, B. y Konings, W. N. (1996). The proteolytic system of lactic acid bacteria. Antoine Van Leeuwenhoek 70, 187221. -Laleye, L. C., Simard, R. E., Grosselin, C., Lee, B. H. y Giroux, R. N. (1987). Assesment of Cheddar cheese quality by chromatographic analysis of free amino acids and biogenic amines. Journal of Food Science 52, 303-307, 311.

69

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

-Lamberet, G. y Lenoir, J. (1976). Les characteres du systeme lipolytique de l'espece Penicillium caseicolum. Purification et proprietes de la lipase majeure. Lait 56, 622-644. -Lau, K. Y., Barbano, D. M. y Rasmussen, R. E. (1991). Influence of pasteurization of milk on protein breakdown in Cheddar chees during aging. Journal of Dairy Science 74, 727-740. -Lawrence, R. C., Creamer, L. K. y Gilles, J. (1987). Texture development during cheese ripening. Journal of Dairy Science 70, 1748-1760. -Le Bars, D. y Gripon, J. C. (1989). Specificity of plasmin towards bovine s2-casein. Journal of Dairy Research 56, 817-821. -Leaver, J., Law, A. J. R., Horne, D. S. y Banks, J. M. (1995). Influence of heating regime and pH on the primary phase of renneting of whole milk. International Dairy Journal 5, 129-140. -Ledford, R. A., OSullivan, A. C. y Nath, K. R. (1966). Residual casein fractions in ripened cheese determined by polyacrylamide-gel electrophoresis. Journal of Dairy Science 49, 1098-1101. -Lindqvist, B., Storgards, T. y Goransson, M. B. (1953). Electrophoresis in paper as a mean of studying the ripening process in cheese. Proceedings 13th International Dairy Congress, The Hague, 3, 1261-1268. -Lynch, C. M., McSweeney, P. L. H., Fox, P. F., Cogan, T. M. y Drinan, F. D. (1996). Manufacture of Cheddar cheese with and without adjunct lactobacilli under controlled microbiological conditions. International Dairy Journal 6, 851-867. -Lynch, C. M., McSweeney, P. L. H., Fox, P. F., Cogan, T. M. y Drinan, F. D. (1997). Contribution of starter and non-starter lactobacilli to proteolysis in Cheddar cheese with controlled microflora. Le Lait 77, 441-459. -Macedo, A. C. y Malcata, F. X. (1996). Changes in the major free fatty acids in Serra cheese throughout ripening. International Dairy Journal 6, 1087-1097.

70

Introduccin general sobre el queso

Bibliografa

-Marcos, A., Esteban, M. A., Fernndez-Salguero, J., Mora, M. T. y Milln, R. (1976a). Componentes nitrogenados del queso tipo Manchego: I. Anlisis qumico de las principales fracciones. Anales de Bromatologa XXVIII-1, 57-68. -Marcos, A., Esteban, M. A., Fernndez-Salguero, J., Mora, M. T. y Milln, R. (1976b). Componentes nitrogenados del queso tipo Manchego: II.Electroforesis en gel de poliacrilamida. Anales de Bromatologa XXVIII-1, 69-80. -Marcos, A., Fernndez-Salguero, J. y Esteban, M. A. (1978). Hidrlisis relativa de las casenas del queso Manchego maduro y primeros productos de su degradacin proteoltica. Archivos de Zootecnia 27, 341-349. -Martnez-Castro, I, Alonso, L. y Jurez, M. (1986). Gas chromatographic analysis of free fatty acids and glycerides of milk fat using tetramethylammonium hidroxyde as catalyst. Cromatographia 21, 37-40. -Martnez-Moreno, J. L. (1976a). Flora microbiana del queso Manchego: III. Estreptococos. Anales del INIA, Serie General, 4, 41-56. -Martnez-Moreno, J. L. (1976b). Flora microbiana del queso Manchego: VII. Micrococos. Anales del INIA, Serie General, 4, 83-92. -Martnez-Moreno, J. L. y. Nez, M. (1976). Flora microbiana del queso Manchego: II. Evolucin de la flora microbiana de quesos Manchegos industriales. Anales del INIA, Serie General, 4, 33-40. -Martn-Hernndez, M. C., Alonso, L., Jurez, M. y Fontecha, J. (1988). Gas chromatographic method for determining free fatty acids in cheese. Cromatographia 25, 87-90. -McGarry, A., Law, J., Coffey, A., Daly, C., Fox, P. F. y Fitzgerald, G. F. (1994). Effect of genetically modifying the lactococcal proteolytic system in ripening and flavour development in Cheddar cheese. Applied Environmental Microbiology, 60, 4226.

71

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

-McNeill, G. P. y Connolly, J. F. (1989). A method for the quantification of individual free fatty acids in cheese: Application to ripening of Cheddar-type cheeses. Irish Journal of Food Science and Technology 13, 119-128. -McSweeney, P. L. H. y Fox, P. F. (1997a). Indices of Cheddar cheese ripening, pp. 7389. Proceedings of the 5th Cheese Symposium, Moorepark, Fermoy, Co. Cork. -McSweeney, P. L. H. y Fox, P. F: (1997b). Chemical methods for the characterization of proteolysis in cheese during ripening. Lait 77, 41-76. -McSweeney, P. L. H., Fox, P. F. y Olson, P. F. (1995). Proteolysis of bovina caseins by cathepsin D: Preliminary observations and comparison with chymosin. International Dairy Journal 5, 321-336. -McSweeney, P. L. H., Fox, P. F., Lucey, J. A., Jordan, K. M. y Cogan, T. M. (1993a). Contribution to the indigenous microflora to the maturation of Cheddar cheese. International Dairy Journal 3, 613-634. -McSweeney, P. L. H., Olson, N. F., Fox, P. F., Healy, A. y Hojrup, P. (1993b). Proteolytic specificity of chymosin on bovine s1-casein. Journal of Dairy Research 60, 401-412. -Melachouris, N. P. y Tuckey, S. L. (1966). Changes in the proteins in Cheddar cheese made from milk heated at different temperatures. Journal of Dairy Science 49, 800-805. -Metcalfe, L. D. y Wang, C. N. (1981). Rapid preparation of fatty acid methyl esters using organic base-catalyzed transesterification. Journal of Chromatography Science 19, 530-535. -Mohedano, A. F., Fernndez, J., Garde, S., Medina, M., Gaya, P. y Nez, M. (1998). The effecct of the cysteine proteinase from Micrococcus sp. INIA 528 on the ripening process of Manchego cheese. Enzyme and Microbial Technology 22, 391-396.

72

Introduccin general sobre el queso

Bibliografa

-Moio, L., Di Luccia, A. y Addeo, F. (1989). Fast isoelectric-focusing of milk-proteins on small ultrathin polyacrylamide gels containing urea. Electrophoresis 10, 533535. -Molina, E., de Frutos, M. y Ramos, M. (2000). Capillary electrophoresis characterization of the casein fraction of cheeses made from cows', ewes' and goats' milks. Journal of Dairy Research 67, 209-216. -Molina, E., Martn-lvarez, P. J. y Ramos, M. (1999a). Analysis of cows', ewes' and goats' milk mixtures by capillary electrophoresis: quantification by multivariate regression analysis. International Dairy Journal 9, 99-105. -Molina, E.; Ramos, M., Alonso, L. y Lpez-Fandio, R. (1999b). Contribution of low molecular weight water soluble compounds to the taste of cheeses made of cows, ewes and goats milk. International Dairy Journal 9, 613-621. -Nez, M, Guilln, A. M., Rodrguez-Marn, M. A., Marcilla, A. M., Gaya, P. y Medina, M. (1991). Accelerated ripening of ewes milk Manchego cheese: the effect of neutral proteinase. Journal of Dairy Science 74, 4108-4118. -Nez, M, Medina, M., Gaya, P., Guilln, A. M. y Rodrguez-Marn, M. A. (1992). Effect of recombinant chymosin on ewes milk coagulation and Manchego cheese characteristics. Journal of Dairy Research 59, 81-87. -Nez, M. (1976a). Flora microbiana del queso Manchego: IV. Lactobacilos. An. INIA, Ser. General, 4, 57-65. -Nez, M. (1976b). Flora microbiana del queso Manchego: V. Leuconostoc. Anales del INIA, Serie General 4, 67-74. -Nez, M. (1976c). Flora microbiana del queso Manchego: VI. Pediococos. Anales del INIA, Serie General 4, 75-81. -Nez, M. y Martnez-Moreno, J. L. (1976). Flora microbiana del queso Manchego: I. Evolucin de la flora microbiana de quesos Manchegos artesanales. Anales del INIA, Serie General 4, 11-31.

73

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

-Nez, M., Bautista, L., Medina, M. y Gaya, P. (1988). Staphylococcus aureus, thermonuclease and staphylococcal enterotoxins in raw ewes milk Manchego cheese. Journal of Applied Bacteriology 65, 29-34. -Nez, M., Garca-Aser, C., Rodrguez-Marn, M. A, Medina, M y Gaya, P. (1986). The effect of ripening and cooking temperatures on proteolysis and lipolysis in Manchego cheese. Food Chemistry 21, 115-123. -Nez, M., Gaya., P. y Medina, M. (1984). Influence of manufacturing and ripening conditions on the survival of Enterobacteriaceae in Manchego cheese. Journal of Dairy Science 68, 794-800. -Nez, M., Gaya., P., Medina, M., Rodrguez-Marn, M. A. y Garca-Aser, C. (1986a). Changes in microbiological, chemical, rheological and sensory characteristics during ripening of vacuum packaged Manchego cheese. Journal of Food Science 51, 1451-1455. -Nez, M., Martnez-Moreno, J. L. y Medina, M. (1981). Ensayo de diversas cepas de Streptococcus lactis de diversa capacidad acidificante como fermentos para queso tipo Manchego. Anales del INIA, Serie General 12, 65-72. -Nez, M., Medina, M. y Gaya, P. (1989). Ewes milk cheese: technology, microbiology and chemistry. Journal of Dairy Research 56, 303-321. -Nez, M., Nez, J. A: y Medina, M. (1982). Freeze-dried concentrated starters for direct inoculation of vat milk in Manchego cheese manufacture. Milchwissenschaft 37, 328-330. -OSullivan, M. y Fox, P. F. (1990). A scheme for partial fractionation of cheese peptides. Journal of Dairy Research 57, 135-139. -Ohren, J. A. y Tuckey, S. L. (1967). Relation of flavour development in Cheddar cheese to chemical changes in the fat of the cheese. Journal of Dairy Science 52, 598. -Olivecrona, T. y Bengtsson-Olivecrona, G. (1991) Indigenous enzymes in milk: Lipase, Food Enzymology, vol.1, P. F. Fox (ed.), Elsevier Applied Science, London.

74

Introduccin general sobre el queso

Bibliografa

-Olivecrona, T., Vilar, S. y Bengtsson-Olivecrona, G. (1992). Indigenous enzimes in milk. II. Lipases in milk. Advanced Dairy Chemistry, 1-Proteins. P. F. Fox (ed.), Elsevier Applied Science, London. -Ordez, J. A. y Burgos, J. (1980). Free amino acids of Manchego cheese ripened in olive oil. Milchwissenschaft 35, 69-71. -Ordez, J. A., Barneto, R. y Mrmol, M. P. (1978b). Identificacin de la flora que participa en la maduracin del queso Manchego. Anales de Bromatologa, XXX3-4, 361-373. -Ordez, J. A., Barneto, R. y Ramos, M. (1978a).Studies on Manchego cheese ripened in olive oil. Milchwissenschaft 33, 609-612. -Paquet, J. y Gripon, J. C. (1980). Intracellular peptide hydrolases of Penicillium roqueforti. Milchwissenschaft 35, 72. -Parodi, P. W. (1979) Stereospecific distribution of fatty acids in bovine milk fat triglycerides. Journal of Dairy Research 46, 75-81. -Pava, M., Guamis, B. Y Ferragut, V. (1999a). Effects of ripening time and salting method on glycolisis in Manchego-type cheese. Milchwissenschaft 54, 379-381. -Pava, M., Guamis, B., Trujillo, A. J., Capellas, M. y Ferragut, V. (1999b). Changes in microstructural, textural and colour characteristics during ripening of Manchegotype cheese salted by brine vacuum impregnation. International Dairy Journal 9, 91-98. -Pearce, K. N., Karahalios, D. y Friedman, M. (1988). Ninhydrin assay for proteolysis in cheese ripening. Journal of Food Science 53, 432-435, 438. -Picn, A, Gaya, P., Medina, M. y Nez, M. (1994). The effect of liposome encapsulation of chymosin derived by fermentation on Manchego cheese ripening. Journal of Dairy Science 77, 16-23.

75

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

-Picn, A., Gaya, M., Medina, M. y Nez, M. (1994). The effect of liposomeencapsulated cyprosins on Manchego cheese ripening. Journal of Dairy Science 79, 1699-1705. -Picn, A., Gaya, M., Medina, M. y Nez, M. (1995). The effect of liposomeencapsulated Bacillus subtilis neutral proteinase on Manchego cheese ripening. Journal of Dairy Science 78, 1238-1247. -Pillay, V. T., Myhr, A. N. y Gray, J. I. (1980). Lipolysis in milk. I. Determination of free fatty acids and treshold values forlipolyzed flavour detection. Journal of Dairy Science 48, 1213-1218. -Polo, C., Ramos, M. y Snchez, R. (1985). Free amino acids by high performance liquid chromatography and peptides by gel electrophoresis in Mahn cheese during ripening. Food Chemistry 16, 85-96. -Poveda, J. M., Cabezas, L. y Garca, A. (1999a). Changes in physicochemical properties and proteolysis in Manchego cheese preserved in olive oil. Milchwissenschaft 54, 252-255. -Poveda, J. M., Pzez-Coello, M. S. y Cabezas, L. (1999b). Evolution of the free fatty acid fraction in Manchego cheese during ripening. Milchwissenschaft 54, 685-687. -Poveda, J. M., Pzez-Coello, M. S. y Cabezas, L. (2000). Seasonal variations in the free fatty acid composition of Manchego cheese and changes during ripening. European Food Research and Technology 210, 314-317. -Puchades, R., Lemieux, L. y Simard, R. E. (1989). Evolution of free amino acids during ripening of Cheddar cheese containing added lactobacilli strains. Journal of Food Science 54, 885-888, 946. -Ramos, M. (1976). Aplicacin del mtodo inmunolgico a la deteccin de leche de vaca en queso Manchego. Revista Espaola de Lechera 101, 147-154.

76

Introduccin general sobre el queso

Bibliografa

-Ramos, M. y Jurez, M. (1986). Chromatografic, electrophoretic and inmunological methods for detecting mixtures of milk from different species. Bulletin International Dairy Federation 202, 175-190. -Ramos, M. y Martnez-Castro, I. (1976). Etude de la protolyse du fromage type Manchego au cours de laffinage. Le Lait 553-554, 164-176. -Ramos, M., Barneto, R. y Ordez, J. A. (1981). Evaluation of a specific starter for Manchego cheese production. Milchwissenschaft 36, 528-531. -Ramos, M., Cceres, I., Polo, C., Alonso, L. y Jurez, M. (1987). Effect of freezing on soluble nitrogen fraction of Cabrales cheese. Food Chemistry 24, 271-278. -Ramos, M., Martnez-Castro, I. y Jurez, M. (1976). Detection of cows milk in Manchego cheese. Journal of Dairy Science 60, 870-877. -Recio, I., De Frutos, M., Olano, A. y Ramos, M. (1996b). Protein changes in stored ultrahigh-temperature-treated milks studied by capillary electrophoresis and highperformance liquid chromatography. Journal of Agricultural and Food Chemistry 44, 3955-3959. -Recio, I., Lpez-Fandio, R., Olano, A., Olieman, C. y Ramos, M. (1996a). Study of the formation of caseinomacropeptides in stored ultra-high-temperature-treated milk by capillary electrophoresis. Journal of Agricultural and Food Chemistry 44, 3845-3848. -Robinson, R. K. (1979). A method for the objetive assessment of cheese flavour. Milk industry 81, 34-35. -Rodrguez, E., Gaya, P., Nez, M. y Medina, M. (1998). Inhibitory activity of a nisinproducing starter culture on Listeria innocua in raw ewes milk Manchego cheese. International Journal of Food Microbiology 39, 129-132. -Romn Piana, M. (1975). Etude de la flore microbienne du fromage espagnol Manchego. Le Lait 547, 401-413.

77

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

-Samples, D. R., Richter, R. L. y Dill, C. W. (1984). Measuring proteolysis in Cheddar cheese slurries, comparison of Hull and trinitrobenzene sulfonic acid procedures. Journal of Dairy Science 67, 60-63. -Scott, R. (1981). Cheesemaking practice. Elsevier Applied Science Publishers, London. -Shalabi, S. I. y Fox, P. F. (1987). Electrophoretic analysis of cheese: comparison of methods. Irish Journal of Food Science and Technology 11, 135-151. -Singh, T. K., Fox, P. F., Hojrup, P. y Healy, A. (1994). A scheme for fractionation of cheese nitrogen and identification of principal peptides. International Dairy Journal 4, 111-122. -Sorhaug, T. y Stepaniak, L. (1977). Psychrotrophs and their enzymes in milk and dairy products: Quality aspects. Trends in Food Science and Technology 8, 35-41. -Sousa y Malcata, (1997). Ripening of ovine milk cheeses: effects of plant rennet, pasteurization and addition of stater on lipolysis. Food Chemistry 59, 427-432. -Thomas, T. D. y Crow, V. L. (1983). Mechanism of D(-)-lactic formation in Cheddar cheese. New Zealand Journal of Dairy Science and Technology 18, 131-141. -Tuomala, T. y Kallio, H. (1996). Identification of free fatty acids and some other volatiles flavour compounds from Swiss cheese using on-line supercritical fluid extraction-gas chromatography. Zeitschift Lebensmittel Untersuchung Forschung 203, 236-240. -Turner, K. W. y Thomas, T. D. (1980). Lactose fermentation in Cheddar cheese and the effect of salt. New Zealand Journal of Dairy Science and Technology 18, 117123. -Turner, K. W., Morris, H. A, y Martley, F. G. (1983). Swiss-type cheese. II. The role of thermophilic lactobacilli in sugar fermentation, New Zealand Journal of Dairy Science and Technology 18, 117.

78

Introduccin general sobre el queso

Bibliografa

-Uceda, R, Guilln, A. M., Gaya, P., Medina, M. y Nez, M. (1994). Chemical and rheological characteristics of Manchego cheese manufactured from ewe raw milk preserved by activation of the lactoperoxidase system. Milchwissenschaft 49, 494-499. -Urbach, G. (1993). Relations between cheese flavour and chemical composition. International Dairy Journal 3, 389-422. -Vakaleris, B. y Price, W. (1959). A rapid spectrophotometric method for measuring cheese ripening. Journal of Dairy Science 42, 264-276. -Van der Berg, G. y de Koning, P. J. (1990). Gouda cheese-making with purified calf chymosin and microbiologically produced chymosin. Netherland Milk Dairy Journal 44, 189-205. -Visser, F. M. W. y Groot-Mostert, A. E. A. (1977). Contribution of enzymes from rennet, starter bacteria and milk to proteolysis and flavour development in Gouda cheese. 4. Protein breakdown: a gel electrophoretic study. New Zealand Milk Dairy Journal 31, 247. -Visser, S., Slangen, K. J. y Hup, G. (1975). Some bitter peptides from rennet-treated casein. A method for their purification, utilizing chromatographic separation o silica gel. Netherland Milk Dairy Journal 29, 319-334. -Visser, S., Slangen, K. J., Hup, G. y Stadhouders, J. (1983). Bitter flavour in cheese. 3. Comparative gel-chromatographic analysis of hydrophobic peptide fractions from twelve Gouda-type cheeses and identification of bitter peptides isolated from a cheese made with Streptococcus cremoris strain HP. Netherland Milk Dairy Journal 37, 181-192. -Vreeman, M. J. y Van Riel, J. A. M. (1990). The large-scale isolation of s2-casein from bovine casein. Netherland Milk Dairy Journal 44, 43-48. -Weinstein, M. J. y Doolittle, R. F. (1972). Differential specificities of thrombin, plasmin and trypsin with regard to synthetic and natural subtrates and inhibitors. Biochim. Biophys. Acta 258, 577.
79

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

-Wijesundera, C., Drury, L., Muthuku-Marappan, K., Gunasekaran, S. y Everett, D. W. (1998). Flavour development and distribution of fat globule size and shape in Cheddar-type cheeses made from skim milk homogeneised with AMF or its fractions. Australian Journal of Dairy Technology 53, 107. -Wilkinson, M. G., Guinee, T. P., OCallaghan, D. M. y Fox, P. F. (1992). Effect of commercial enzymes on proteolysis and ripening in Cheddar cheese. Lait 72, 449-459. -Witorama, I. P. y Ney, K. H. (1973). Isolation and identification of aliphatic amides in Cheddar, Emmental, Manchego and German blue cheeses. Zeitschift Lebensmittel Untersuchung Forschung 203, 230-235. -Woo, A. H. y Lindsay, R. C. (1982). Rapid method for quantitative individual free fatty acids in Cheddar cheese. Journal of Dairy Science 65, 1102-1109. -Wood, A. F., Aston, J. V. y Douglas, G. K. (1985). The determination of free amino acids in cheese by capillary column gas-liquid chromatography. Australian Journal of Dairy Technology 40, 166-169. -Worstorff, H., Heeschen, W. y Tolle, A. (1972). Free fatty acids in milk in relation to flow and conditions in milking machines. Milchwissenschaft 27, 447-480. -Young, P. M., Astephen, N. E. y Wheat, T. E. (1992). Effects of pH and buffer composition on peptide separations by high-perfomance liquid chromatography and capillary electrophoresis. Liquid Chromatography-Gas Chromatography 10, 26-30. -Zarmpoutis, I. V, McSweeney, P. L. H., Beechinor, J. y Fox, P. F. (1996). Proteolysis in the Irish farmhouse blue cheese Chetwynd. Irish Journal of Agricultural and Food Research 35, 25-36.

80

Introduccin general sobre el queso

Justificacin del trabajo

1.6. JUSTIFICACIN DEL TRABAJO

En la Unin Europea, la proporcin de leche que tiene como destino principal la elaboracin de queso, est en torno al 95% tanto en la de oveja como en la de cabra. En Espaa, el 27% de la leche de oveja se produce en Castilla-La Mancha, la cual es utilizada en la fabricacin de queso Manchego. El queso Manchego, constituye la variedad ms representativa de los producidos y elaborados a partir de leche de oveja, as como una de las 12 variedades protegidas por la Denominacin de Origen (Annimo 1996a, b) de las 84 oficialmente reconocidas. Ms de la mitad del queso producido con Denominacin Origen corresponde al queso Manchego con una produccin de 2.002.181 piezas en el ao 1999. Los primeros trabajos realizados en este Departamento y que culminaron con una Tesis Doctoral, leda en 1996, se centraron en: -Conocer la evolucin exacta de diferentes parmetros de composicin fsico-qumica y de los indicadores de la proteolisis primaria y secundaria a lo largo de la maduracin (desde los 15 das hasta los 150 das). Para ello se elaboraron quesos a escala semiindustrial siguiendo la tecnologa del Manchego. -Disear un modelo matemtico para determinar el tiempo de maduracin de los quesos del mercado. -Aislar e identificar las bacterias lcticas presentes en diferentes quesos Manchegos comerciales, estudindose las propiedades de inters tecnolgico (actividad acidificante y actividad proteoltica) y se propuso un cultivo iniciador o starter que podra ser utilizado para fabricar el queso Manchego. La Memoria que se presenta es una continuacin de los aspectos comentados anteriormente sobre el queso Manchego, ampliando los conocimientos del mismo, con el objetivo de mejorar su calidad y de que este tipo de queso pueda competir en el mercado Europeo con otras variedades de quesos ms conocidos internacionalmente.

81

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

El trabajo se estructur en tres partes: -Elaboracin de dos lotes de quesos siguiendo la tecnologa del Manchego en dos estaciones distintas del ao (invierno y primavera). -Mejora de la ecuacin predictiva propuesta por Garca-Ruiz et al. (1998) para determinar el tiempo de maduracin de quesos Manchegos del mercado, utilizando los datos fsicoqumicos y de proteolisis de estos lotes de quesos Manchegos elaborados en distintas estaciones. -Estudio de la lipolisis experimentada por los lotes quesos fabricados endistintas estaciones y a lo largo de la maduracin. -Estudio de la influencia de la utilizacin de diferentes starters sobre la proteolisis, caractersticas fsico-qumicas y sensoriales de quesos Manchegos fabricados a escala semiindustrial.

82

CAPTULO 2

INFLUENCIA DE LA POCA DE ELABORACIN EN LA PREDICCIN DEL TIEMPO DE MADURACIN DEL QUESO MANCHEGO

Prediccin del tiempo de maduracin

Introduccin

2.1. INTRODUCCIN: ESTADO ACTUAL DEL TEMA

Para estudiar la relacin entre dos bloques de parmetros medidos para un nmero determinado de muestras se pueden emplear diferentes modelos estadsticos, tales como MLR (Multiple Linear Regression), PCR (Principal Component Regression) y PLS (Partial Least Squares). Estos modelos estadsticos han sido utilizados ampliamente para relacionar la composicin fsica o qumica con caractersticas sensoriales en modelos de calibracin (Martens y Naes, 1993) y en la determinacin del porcentaje de composicin de mezclas de leche (Molina y Martn-lvarez, 1996). Santa-Mara et al. (1986) utilizaron el anlisis discriminante de diferentes valores de parmetros proteolticos de muestras de queso tipo Manchego para determinar el grado de maduracin de los quesos. Franco et al. (1992) tambin emplearon ese mismo mtodo estadstico para caracterizar quesos comerciales tipo Manchego segn las mezclas de leche utilizadas en su fabricacin. Actualmente no es un requisito indispensable indicar en las etiquetas de los quesos de D. O. Manchego el tiempo de maduracin que tienen antes de salir al mercado. El queso Manchego se comercializa desde los 60 das de maduracin (tiempo legal mnimo requerido), pudiendo encontrar en el mercado quesos de hasta 12 meses de curacin o incluso ms. Esta gran variabilidad en el tiempo de curacin del queso Manchego da lugar a que los quesos tengan distintos precios, debido al hecho de que tener que madurar el queso encarece el producto. Por lo tanto, sera interesante conocer el tiempo de maduracin de los quesos que van a comercializarse, sobre todo desde el punto de vista econmico. De esta forma se realiz un estudio en este Departamento con el propsito de desarrollar una ecuacin o modelo matemtico que permitiera calcular el tiempo de maduracin de quesos Manchegos comerciales. Ase elabor un lote de 21 quesos Manchegos y se maduraron hasta los 150 das. Estos quesos fueron fabricados en otoo.

85

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

Se analizaron en distintas fechas de maduracin y a los resultados obtenidos para las variables de composicin y de proteolisis se aplicaron diferentes modelos estadsticos de anlisis multivariante (MLR, PCR y PLS). El mtodo de PLS result ser el mejor para predecir el tiempo de maduracin de estos quesos (Garca-Ruiz et al., 1998). Con este mtodo se obtuvo un RMSEP (Root Mean Square Error of Prediction, error medio de prediccin) de 10,3 das, con lo cual, las diferencias encontradas entre los tiempos reales y los tiempos predichos con la ecuacin obtenida fueron en la mayora de los casos inferiores a 10 das. Sin embargo, este estudio se consider como un ensayo preliminar, ya que para asegurar la utilidad de esta ecuacin sera necesario realizar la prediccin con un mayor nmero de muestras, incluyendo quesos elaborados en otras pocas del ao, para as obtener unas conclusiones ms consistentes. As, este trabajo consisti en elaborar dos nuevos lotes de quesos Manchegos fabricados en la misma industria y en las mismas condiciones que los del trabajo citado anteriormente, estudiar sus caractersticas fsico-qumicas y de proteolisis, con el objetivo de obtener una nueva ecuacin o modelo de prediccin del tiempo de maduracin de los mismos.

86

Prediccin del tiempo de maduracin

Material y Mtodos

2.2. MATERIAL Y MTODOS

2.2.1. Material experimental Como material experimental se emplearon dos lotes de quesos elaborados a escala semiindustrial en dos pocas del ao (invierno y primavera), siguiendo la tecnologa del Manchego. En cada lote se fabricaron 21 quesos de un peso aproximado de 1,5 Kg. Los quesos recin elaborados fueron transportados en refrigeracin hasta el laboratorio, donde se almacenaron en una cmara de maduracin a 14 C y con una humedad relativa del 80%. Los quesos fueron madurados durante 15, 30, 45, 60, 90, 120 y 150 das, y para cada perodo de maduracin se destinaron tres quesos individuales, denominados A, B y C, con lo cual, el nmero total de quesos fue de 42. Para efectuar los anlisis se cort una muestra en forma de cua de unos 250 g de cada uno de los tres quesos correspondientes a cada tiempo de maduracin. Cada una de las muestras se trituraron con una picadora elctrica y se homogeneizaron, siendo congeladas a 20 C hasta efectuar los anlisis.

2.2.2. Anlisis fsico-qumicos Se realizaron los anlisis de la leche de partida y de las muestras de queso en las distintas fechas de maduracin consideradas. En la leche se determin el extracto seco, el pH, la acidez total, el nitrgeno total y la grasa. En las muestras de queso se determin la Aw, el pH, el extracto seco, el contenido en cloruros y el nitrgeno y protena totales.

2.2.2.1. Determinacin de la actividad del agua (Aw) La medicin de la Aw se realiz con un higrmetro de roco Decagon Devices CX2. Este aparato consta de una cmara con espejo y un ventilador que enfra el aire y lo hace circular por la superficie de la muestra. De esta forma determina la temperatura exacta de condensacin del vapor de agua, que est directamente relacionada con la Aw de la muestra. El ventilador, al enfriar el aire, permite la condensacin de ste, depositndose

87

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

sobre el espejo. Un microprocesador controla la formacin del condensado y mide la temperatura exacta de condensacin, realizando medidas en el intervalo de 0,03 a 1,00 unidades, con una precisin de 0,003 unidades. El procedimiento para efectuar las medidas consiste en colocar en cpsulas de plstico las muestras de queso homogeneizadas, formando una fina capa que cubre totalmente el fondo. Dichas cpsulas se tapan y se dejan a temperatura ambiente. Posteriormente se colocan destapadas una a una en la cmara de medicin del higrmetro para la lectura digital de la Aw y de la temperatura. Tanto la Aw como la temperatura son visualizadas en una pantalla de cristal lquido.

2.2.2.2. Determinacin del pH El valor del pH se determin con un pH-metro Crison 2002, mediante lectura directa, introduciendo en el caso de la leche un electrodo para lquidos. Para las muestras de queso se utiliz un electrodo de penetracin Ingold en la muestra una vez triturada y homogeneizada.

2.2.2.3. Determinacin del extracto seco Se realiz desecando una cantidad conocida de leche a una temperatura de 102 2 C hasta peso constante segn la Norma de la Federacin Internacional de Lechera (FIL 4A 1982), por desecacin de la muestra en una estufa de aire caliente a 110 C hasta peso constante.

2.2.2.4. Determinacin de cloruros El anlisis de cloruros se llev a cabo siguiendo el mtodo de la AOAC (1995), basado en el mtodo de Volhard modificado por Kosikowski (1982), en el cual, despus de la mineralizacin de la muestra con cido ntrico y la oxidacin simultnea con permanganato potsico, se adicionan 2 mL de nitrobenceno para aglomerar el precipitado

88

Prediccin del tiempo de maduracin

Material y Mtodos

y obtener una solucin limpia. Finalmente se realiza una valoracin con sulfocianuro potsico 0,1 N, utilizando como indicador sulfato amnico-frrico en solucin saturada.

2.2.2.5. Determinacin de nitrgeno y protena totales El contenido en nitrgeno total se determin por el mtodo de Kjeldahl (AOAC 1995). Para ello se utiliz un digestor Bchi 426 y un aparato de destilacin Bchi 316. El mtodo consiste en la transformacin del nitrgeno presente en la muestra en sulfato amnico, por ataque con cido sulfrico concentrado a ebullicin, en presencia del catalizador K-203 (sulfato sdico y sulfato de cobre). A continuacin la muestra se destila en medio alcalino recogiendo el destilado sobre cido clorhdrico 0,1 N. El exceso de cido se valora con hidrxido sdico 0,1 N, utilizando como indicador rojo de metilo. El valor de nitrgeno total obtenido se multiplic por un factor de 6,38 para obtener el contenido en protena total.

2.2.2.6. Determinacin de grasa Se llev a cabo mediante el mtodo de Heiss (1961), adaptacin del mtodo de Gerber. Consiste en la liberacin de la grasa por disolucin de las sustancias proteicas, separacin de la grasa por centrifugacin y posterior medida volumtrica de sta.

2.2.3. Estudio de la proteolisis

2.2.3.1. Electroforesis en gel de urea-poliacrilamida

-Preparacin de las muestras de casena A 10 g de queso se aadieron 16 mL de agua destilada y se homogeneizaron con un ultraturax. Se aadi cido actico al 10% (V/V) hasta pH 4,6 comprobado con un pHmetro Crison 2002. Se dej reposar 2 horas a temperatura ambiente y a continuacin se

89

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

centrifug a 3000 xg durante 20 minutos. El precipitado obtenido contiene las casenas del queso. ste se lav tres veces con alcuotas de 20 mL de tampn actico 4%-acetato sdico 0,4 M (mezcla 1:1, preparado en el momento antes de utilizarlo). Se centrifug cada vez a 3000 xg durante 10 min a 5 C. Por ltimo, se realizaron dos lavados con una mezcla al 50% de diclorometano y tampn actico-acetato, centrifugando en las mismas condiciones anteriores. Las casenas obtenidas se secaron entre papeles de filtro y se congelaron posteriormente a -20 C. Para realizar la electroforesis se pesaron 10 mg de casena y se disolvieron en 1 mL de urea 7 M, segn el mtodo de Assenat (1967), agitando hasta su completa disolucin.

-Reactivos - Solucin A cido clorhdrico 1 N.............................48,0 mL Tris-hidroximetil-aminometano (TRIS).....36,3 g N,N-tetrametilndiamina (TEMED)......0,46 mL Agua destilada.................................hasta 100 mL - Solucin B Acrilamida..................................................30,0 g N,N-metilnbisacrilamida (BIS).................0,8 g Agua destilada................................hasta 100 mL - Tampn de electrodos (pH= 8,3) Tris-hidroximetil-aminometano..................0,60 g Glicina.........................................................2,88 g Agua destilada..............................hasta 1.000 mL - Solucin de persulfato amnico al 0,56% - Azul de bromofenol al 0,05%

90

Prediccin del tiempo de maduracin

Material y Mtodos

- Urea 7 M - cido tricloroactico al 12% - Solucin de revelado Azul de Coomassie R 250..............................1 g Etanol ......................................................200 mL cido actico ............................................40 mL Agua destilada ............................... hasta 400 mL - Solucin diluyente Etanol .......................................................400 mL cido actico .............................................50 mL Glicerol ......................................................25 mL Agua destilada .............................hasta 1.000 mL - Solucin decolorante Etanol .......................................................400 mL cido actico............................................100 mL Glicerol ......................................................50 mL Agua destilada ............................ hasta 2.000 mL

-Preparacin del gel La concentracin de acrilamida y de agente de entrecruzamiento fueron definidas por la terminologa de Hjerten, siendo: %T= (g de acrilamida + g de bisacrilamida)/100 mL de solucin %C= (g de bisacrilamida x 100)/%T

91

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

La electroforesis de las casenas se realiz segn el mtodo descrito por Ramos et al. (1977). Las concentraciones de acrilamida utilizadas fueron: T= 7,7% C= 2,6%, aadindose un 28,75% de urea. La separacin electrofortica se llev a cabo en una cubeta modelo Protean ll Xi de 20 cm de Biorad, que permite la aplicacin de 14 muestras. La cubeta de electroforesis estuvo conectada a un sistema de refrigeracin modelo CH-5/PC-5 de Techne, a 13 C, para evitar que el calor producido por el paso de la corriente elctrica originase distorsin en las bandas electroforticas. El procedimiento seguido fue el siguiente: Se mezclaron 2,5 mL de la solucin A con 5 mL de la solucin B y 5,75 g de urea. Se aadi agua hasta un volumen final de 17,5 mL, se agit y se desaire. Se aadieron 2,5 mL de persulfato amnico al 0,56%. La mezcla se deposit entre dos placas de vidrio de 20 x 20 cm, que se fijaron a la cubeta de electroforesis.

-Electroforesis Se aplic en cada pocillo una pequea cantidad de tampn de los electrodos y a continuacin se introdujeron 15 L de la muestra preparada y 2 L de azul de bromofenol al 0,05% con objeto de observar el frente, y se complet de nuevo cada pocillo con tampn de los electrodos. A continuacin se conect la fuente de alimentacin Isco (mod. 452) aplicando un campo de 30 mA durante media hora para que las muestras penetrasen en el gel y despus se aplic 60 mA durante aproximadamente 6 horas, hasta que el frente marcado por el azul de bromofenol estuvo situado a 0,5 cm del extremo inferior de la placa.

92

Prediccin del tiempo de maduracin

Material y Mtodos

Una vez finalizado el ensayo, se introdujo el gel en cido tricloroactico al 12% durante 1 hora para evitar desplazamientos posteriores de las bandas separadas. Posteriormente, el gel se introdujo en una solucin de glicerol al 20% con el fin de prevenir la posible rotura del mismo por resquebrajamiento.

-Tincin del gel La solucin colorante final se prepar mezclando un volumen de la solucin de revelado con 19 volmenes de la diluyente. El gel permaneci en la solucin colorante durante una noche en agitacin, utilizando un agitador de balanceo SBS AB-2.

-Decoloracin del gel Se decolor el gel mantenindolo en 250 mL de solucin decolorante en el agitador de balanceo, hasta que las bandas permanecieron bien teidas sobre el fondo claro.

-Secado del gel El gel se coloc entre dos hojas de papel celofn empapadas en agua destilada y se dej secar a temperatura ambiente.

2.2.3.2. Fracciones nitrogenadas

-Fraccin de nitrgeno soluble en agua La fraccin de nitrgeno soluble en agua est formada por aquellos pptidos y aminocidos originados durante la maduracin del queso al hidrolizarse las casenas.

93

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

El procedimiento de anlisis est basado en el mtodo de Kuchroo y Fox (1982). Se homogeneizaron 10 g de queso con 50 mL de agua destilada mediante un ultraturax. A continuacin la muestra se mantuvo en un bao de agua a 40 C durante 30 min, centrifugndose a 3000 xg durante 30 min a 20 C. Se enfri con hielo durante media hora y se filtr a travs de papel Whatman n 40. Se utiliz una alcuota de 2 mL para la determinacin del nitrgeno segn la tcnica Kjeldahl (AOAC, 1995).

-Fraccin de nitrgeno soluble en cido fosfotngstico al 5% Esta fraccin est formada por pequeos pptidos y aminocidos de peso molecular menor de 600 daltons. El mtodo seguido para su determinacin fue el de Btikofer et al. (1993) y consiste en: A una alcuota de 20 mL de filtrado del nitrgeno soluble en agua, se aadieron 20 mL de una mezcla a partes iguales de cido fosfotngstico al 10% y cido sulfrico al 25%, preparada inmediatamente antes de ser utilizada. Se dej reposar durante 24 horas hasta que se produjo la precipitacin. Despus se filtr a travs de papel de filtro Whatman n 42, realizando el Kjeldahl en 5 mL de filtrado.

2.2.3.3. Determinacin de tirosina y triptfano La tirosina (tyr) y el triptfano (trp) se cuantificaron midiendo la absorbancia a 270 y 290 nm de longitud de onda, respectivamente, de una alcuota tomada de la fraccin de nitrgeno soluble (Fernndez-Salguero, 1982). Las concentraciones de tirosina y triptfano se calcularon a partir de las ecuaciones propuestas por Vakaleris y Price (1959): Ctyr = (0,95 A270 - 1,31 A290) x 10-3 Ctrp = (0,307 A290 - 0,02 A270) x 10-3 donde: Ctyr y Ctrp = moles de tirosina y triptfano por litro de extracto A270 y A290 = absorbancia del extracto a 270 y 290 nm

94

Prediccin del tiempo de maduracin

Material y Mtodos

2.2.4. Tratamiento estadstico Para observar si existan diferencias entre los dos lotes de quesos fabricados y entre los distintos tiempos de maduracin se aplic el anlisis de la varianza (ANOVA) de un factor a los datos de composicin fsico-qumica, utilizando el test de Student-NewmanKeuls (S-N-K). Tambin se utiliz, dentro de las tcnicas de anlisis multivariante, el Anlisis Factorial en Componentes Principales, utilizando la matriz de correlaciones y con rotacin Varimax. Estos tratamientos estadsticos se realizaron usando el programa estadstico SPSS para Windows, Versin 9.0.1. Los modelos de prediccin del tiempo de maduracin se obtuvieron mediante el Anlisis de Regresin por Mnimos Cuadrados Parciales (PLS), utilizando el programa Unscrumbler 6.1.

95

Prediccin del tiempo de maduracin

Resultados y Discusin

2.3. RESULTADOS Y DISCUSIN

2.3.1. Anlisis fsico-qumicos En la Tabla 2.1 se presentan los resultados de los anlisis fsico-qumicos de las leches utilizadas en la elaboracin de los dos lotes de quesos. Las mayores diferencias radicaron en los valores de pH y acidez, ES y protena total. Se sabe que la composicin de la leche vara estacionalmente, ya que depende de la alimentacin del animal, de sus condiciones fisiolgicas (estado de lactacin, edad y variacin gentica) y del clima predominante.

Tabla 2.1: Anlisis fsico-qumicos de las leches de INVIERNO y PRIMAVERA utilizadas en la elaboracin de los quesos Manchegos.

Leche Invierno Primavera

ES (%) 19,57 17,20

pH 6,61 6,09

Acidez (Dornic) 28 33

NP (%ES) 30,66 35,22

Grasa(%) 6,45 6,30

En la Tabla 2.2 se muestran los resultados de los anlisis fsico-qumicos de las muestras de quesos Manchegos (A, B y C) elaborados en dos estaciones: invierno y primavera y en la Tabla 2.3 se presentan la media de estos datos y la desviacin estndar, as como los resultados del ANOVA de un factor, utilizando como factor, en primer lugar, la estacin de fabricacin, y en segundo lugar, el tiempo de maduracin. En las Figuras 2.1 y 2.2 se representa grficamente la evolucin a lo largo de la maduracin de los parmetros analizados en las muestras de quesos Manchegos elaborados en invierno y en primavera.

97

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

Tabla 2.2: Resultados de los anlisis fsico-qumicos de los quesos Manchegos (A, B y C) elaborados en INVIERNO y PRIMAVERA.

Tiempo (das) 15 das Invierno

Muestra ES (%) A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C 54,17 53,88 54,89 53,61 55,06 54,25 55,77 56,65 55,75 57,70 55,97 56,98 58,17 58,53 59,36 58,08 59,38 60,39 61,09 59,61 61,21 61,41 62,10 60,82 63,92 62,66 62,56 63,94 63,85 64,78 67,98 68,03 67,21 66,55 66,48 67,07 68,55 69,44 69,31 68,46 69,80 69,30

pH 4,99 4,99 5,05 4,84 4,89 4,88 5,06 5,09 4,95 4,88 4,87 4,88 4,99 5,04 5,00 4,93 4,92 4,93 5,05 4,98 5,07 4,98 4,97 4,95 5,15 5,09 5,11 4,89 4,92 4,90 4,99 5,06 5,00 4,92 4,96 4,97 5,05 5,10 5,14 5,01 5,01 5,03

Aw 0,970 0,977 0,978 0,966 0,961 0,965 0,969 0,969 0,970 0,956 0,957 0,955 0,957 0,961 0,956 0,948 0,947 0,944 0,952 0,952 0,952 0,941 0,941 0,948 0,939 0,943 0,945 0,933 0,935 0,936 0,923 0,926 0,929 0,927 0,927 0,925 0,916 0,915 0,919 0,914 0,910 0,912

Primavera 30 das Invierno

Primavera 45 das Invierno

Primavera 60 das Invierno

Primavera 90 das Invierno

Primavera 120 das Invierno

Primavera 150 das Invierno

Primavera

Cloruros NP (%ES) (%ES) 2,75 37,90 2,71 38,22 2,33 38,73 3,38 40,90 3,56 40,58 3,21 42,36 2,55 38,54 2,77 39,30 3,09 38,02 3,45 40,83 3,84 40,45 3,76 40,64 2,89 38,09 2,41 38,60 2,96 39,11 4,05 41,09 4,01 40,70 3,96 40,39 2,80 38,73 2,89 38,41 2,84 38,66 3,79 41,21 3,67 40,19 3,58 40,19 2,64 38,60 2,95 38,15 2,67 38,85 3,75 40,83 3,81 39,30 3,70 39,62 3,00 38,73 2,70 38,60 2,92 37,64 3,64 39,94 3,67 40,00 3,76 39,62 3,14 38,92 2,95 38,41 2,67 39,05 3,74 40,07 3,78 40,07 3,75 39,68

98

Prediccin del tiempo de maduracin

Resultados y Discusin

El extracto seco (ES) es uno de los parmetros fsico-qumicos que experimenta mayores variaciones durante el proceso de maduracin. En este caso, los valores de ES aumentaron de forma regular durante la maduracin, oscilando entre un 54,3% a los 15 das hasta alcanzar un valor de 69,1% al final de la maduracin, para los dos lotes de quesos estudiados. Se encontraron diferencias significativas entre los valores obtenidos para las distintas fechas de maduracin en ambos lotes de quesos, segn puso de manifiesto el test de comparacin de medias (Tabla 2.3). No existieron diferencias entre los valores de ES entre las dos estaciones para todas las fechas de maduracin, a excepcin de las muestras de 120 das, que alcanzaron valores algo mayores para el lote de invierno. GarcaRuiz (1996) obtuvo resultados similares para un lote de quesos Manchegos elaborados en otoo en las mismas condiciones y madurados durante los mismos perodos de tiempo. Los valores obtenidos en el presente estudio fueron ligeramente inferiores a los obtenidos en queso Manchego por Picn et al. (1995) y similares a los encontrados por Fernndez-Garca et al. (1998) y Gmez et al. (1999) en queso Manchego. En cuanto al pH, ste se mantuvo ms o menos constante durante todo el perodo de maduracin, mostrando oscilaciones en torno a 5,0 no significativas, para el lote de invierno, y alrededor de 4,9 para los quesos de primavera. En este segundo lote de quesos hubo diferencias entre los valores de pH para algunas fechas de maduracin. En cuanto a las diferencias entre ambos lotes, stas resultaron ser significativas, en general, para todas las fechas estudiadas, excepto para las muestras de 60 y 120 das. Los menores valores de pH obtenidos para los quesos del lote de primavera respecto al de invierno podran ser debidos al menor valor de pH de la leche de partida. Garca-Ruiz et al. (1998) encontraron valores de pH similares para quesos Manchegos elaborados en otoo, madurados durante los mismos perodos de tiempo. Macedo y Malcata, (1996) encontraron que existan diferencias significativas entre el pH de quesos Serra elaborados en Mayo, Noviembre y Febrero. As, las muestras elaboradas en Mayo, mostraron valores de pH superiores a los obtenidos para los quesos elaborados en Noviembre y Febrero.

99

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

TABLA 2.3: Valores medios1 y desviacin estndar de los anlisis fsico-qumicos de los quesos Manchegos elaborados en INVIERNO y PRIMAVERA.
Tiempo de maduracin (das) ES (%) 15 30 45 60 90 120 150 15 30 45 60 90 120 150 15 30 45 60 90 120 150 15 30 45 60 90 120 150 15 30 45 60 90 120 150 Diferencias entre estaciones de fabricacin2 ns ns ns ns ns * ns ** * ** ns ** ns * * ** ** * * ns * ** ** ** ** ns * ** ** * ** ** ** ** **

INVIERNO 54,31a 0,52 56,06b 0,51 58,69c 0,61 60,64d 0,89 63,05e 0,76 67,74f 0,46 69,10g 0,48 5,01 0,03 5,03 0,07 5,01 0,03 5,03 0,05 5,12 0,03 5,02 0,04 5,10 0,05 0,975a 0,004 0,969b 0,001 0,958c 0,003 0,952d 0,000 0,942e 0,003 0,926f 0,003 0,917g 0,002 38,28 0,42 38,60 0,64 38,60 0,51 38,60 0,17 38,54 0,36 38,34 0,59 38,79 0,34 2,60 0,23 2,80 0,27 2,75 0,30 2,84 0,04 2,75 0,17 2,87 0,15 2,92 0,24

PRIMAVERA 54,31a 0,73 56,88b 0,87 59,28c 1,16 61,44d 0,64 64,19e 0,51 66,70f 0,32 69,19g 0,68 4,87a 0,03 4,88a 0,01 4,93b,c 0,01 4,97d 0,02 4,90a,b 0,02 4,95c,d 0,03 5,02e 0,01 0,964a 0,003 0,956b 0,001 0,946c 0,002 0,943d 0,004 0,935d 0,002 0,926e 0,001 0,912f 0,002 41,28 0,95 40,64 0,19 40,70 0,35 40,51 0,59 39,94 0,81 39,88 0,21 39,94 0,22 3,38a 0,18 3,68b 0,21 4,01c 0,04 3,68b 0,11 3,76b 0,05 3,68b 0,06 3,76b 0,02

pH

Aw

Protena (%ES)

Cloruros (%ES)

: Cada valor corresponde a la media del anlisis por duplicado, realizado a su vez en tres quesos independientes. 2 : Significacin estadstica de la varianza; ns: no significativo; *: P<0,05; **: P<0,01. a, b, c, d, e, f, g : Medias en la misma columna con superndices distintos son significativamente diferentes entre s segn el test de Student-Newman-Keuls (p<0,05).

100

Prediccin del tiempo de maduracin

Resultados y Discusin

Los valores de Aw disminuyeron como era de esperar a lo largo de la maduracin para las dos estaciones de fabricacin estudiadas. Esto es debido a la proteolisis que tiene lugar en los quesos durante la maduracin, en la cual se produce la hidrlisis de los enlaces peptdicos, dando lugar a ms grupos inicos, que tienden a fijar agua libre (Lawrence et al. 1987). Estos valores de la Aw oscilaron entre 0,975 ( a los 15 das) y 0,917 (a los 150 das) para el lote de quesos de invierno, y entre 0,964 ( a los 15 das) y 0,912 (a los 150 das) para los quesos de primavera. Los valores fueron significativamente distintos para prcticamente todas las fechas en ambas estaciones de fabricacin. Por estaciones, los valores de Aw fueron ligeramente superiores para los quesos de invierno, siendo estas diferencias significativas para todos los tiempos de maduracin estudiados, excepto a los 120 das (ver Tabla 2.3). Fontecha et al. (1994) encontraron unos valores de Aw en queso Manchego de 0,972 a los 15 das y 0,944 a los 90 das, similares a los obtenidos en este trabajo para las muestras de queso de ivierno del mismo tiempo de maduracin. Garca-Ruiz et al. (1998) obtuvieron valores de Aw ligeramente superiores a los del presente estudio en quesos Manchegos madurados durante los mismos perodos de tiempo, elaborados en otoo. La concentracin de cloruros en los quesos del presente estudio se mantuvo ms o menos constante durante todo el perodo de maduracin, sin presentar diferencias significativas entre las distintas fechas, con unos valores promedio de 2,79 (% ES) para el lote de invierno, y de 3,71 (% ES) para los quesos de primavera. El contenido en cloruros significativamente mayor de las muestras de queso elaboradas en primavera es debido posiblemente, a un mayor tiempo de inmersin en salmuera o a la utilizacin de una salmuera de una concentracin de NaCl ms elevada en el caso de los quesos de este lote, ya que la elaboracin fue realizada a escala semiindustrial y a que los quesos no fueron elaborados en la misma fecha. El contenido en protena total tambin fue constante durante el proceso de maduracin. Los quesos de primavera presentaron unos contenidos medios de protena significativamente superiores a los de invierno (40,41 frente a 38,54, respectivamente). Esto es debido a que la leche empleada en la elaboracin de los quesos de primavera tambin present un mayor valor en NP que la de invierno (35,22% frente a 30,66%,

101

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

ES (%)
75,00 70,00 65,00 60,00 55,00 50,00 15 30 45 60 90 120 150 Tiempo de maduracin (d)

pH
5,50 5,40 5,30 5,20 5,10 5,00 4,90 4,80 4,70 4,60 4,50 15 30 45 60 90 120 150 Tiempo de maduracin (d)

Aw
0,98 0,97 0,96 0,95 0,94 0,93 0,92 0,91 0,90 0,89 0,88 15 30 45 60 90 120 150 Tiempo de maduracin (d)

Invierno

Primavera

Figura 2.1: Evolucin del ES, el pH y la Aw a lo largo de la maduracin de los quesos Manchegos elaborados en INVIERNO y PRIMAVERA
102

Prediccin del tiempo de maduracin

Resultados y Discusin

Cloruros (% ES)
4,50 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 15 30 45 60 90 120 150 Tiempo de maduracin (d)

NP (% ES)
42,00 41,00 40,00 39,00 38,00 37,00 36,00 15 30 45 60 90 120 150

Tiempo de maduracin (d)

Invierno

Primavera

Figura 2.2: Evolucin del contenido en Cloruros y del Nitrgeno Proteico a lo largo de la maduracin de los quesos Manchegos elaborados en INVIERNO y PRIMAVERA

103

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

respectivamente). Es evidente que en la composicin de la leche influyen numerosos factores, como son las condiciones climticas y la alimentacin. Por otro lado tambin vara en funcin del estado de lactacin.

2.3.2. Proteolisis experimentada por las muestras de queso Es conocido que la proteolisis es uno de los fenmenos ms importantes que tienen lugar durante la maduracin del queso y que sus productos de degradacin, pptidos y aminocidos, tienen una influencia decisiva en las caractersticas del mismo.

2.3.2.1. Electroforesis en gel de urea-poliacrilamida La degradacin enzimtica de las casenas durante el perodo de maduracin de un queso juega un papel determinante en la liberacin de compuestos que contribuyen a dar al queso su textura y su aroma caractersticos. La velocidad de degradacin de las casenas a lo largo de la maduracin depende en gran medida de las condiciones tecnolgicas utilizadas durante la fabricacin del queso, de la poca de fabricacin y de las condiciones de maduracin (Collin et al., 1987). Las Figuras 2.3 y 2.4 muestran los electroforegramas de las muestras de quesos Manchegos elaborados en invierno y en primavera, respectivamente. Se puede comprobar que en todas las muestras aparecieron las bandas caractersticas de las casenas ovinas en el siguiente orden de mayor a menor movilidad electrofortica: productos de degradacin de la -casena, -casenas, -casenas y -casenas. A la vista de ambos electroforegramas se observa que en general, la proteolisis fue ms intensa en los quesos elaborados en invierno donde se pueden observar una mayor intensidad de las bandas correspondientes a los productos de degradacin de las y casenas que en los quesos elaborados en primavera. La proteolisis ms lenta experimentada por los quesos del lote de primavera podra ser debido a la mayor concentracin de sal de los mismos. Cabezas et al. (1993) encontraron, en un estudio

104

Prediccin del tiempo de maduracin

Resultados y Discusin

15

30

45

60

90

120

150

das

-cn

1-cn 2-cn s-cn

s-cn degr.

Figura 2.3: Electroforegramas de los quesos Manchegos elaborados en INVIERNO

105

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

15

30

45

60

90

120

150

das

-cn

1-cn 2-cn s-cn

s-cn degr.

Figura 2.4: Electroforegramas de los quesos Manchegos elaborados en PRIMAVERA

106

Prediccin del tiempo de maduracin

Resultados y Discusin

realizado sobre el queso Gruyre de Comt, que despus de 90 das de maduracin y tras haber permanecido en salmuera durante 10 horas, la proteolisis experimentada por los quesos se vi reducida y fue similar a la alcanzada por las muestras de 45 das de maduracin que no haban sido introducidas en salmuera. Puesto que el objetivo de realizar la electroforesis de estas muestras de quesos fue el de comprobar que la proteolisis haba transcurrido de una forma correcta y como los porcentajes de las distintas bandas electroforticas no aparecieron en la ecuacin de prediccin del tiempo de maduracin realizado previamente en quesos Manchegos elaborados en otoo (Garca-Ruiz et al., 1998), no se realiz la cuantificacin densitomtrica de las bandas electroforticas.

2.3.2.2. Fracciones nitrogenadas Los productos originados en la hidrlisis primaria de las molculas de casena son posteriormente hidrolizados, dando lugar a fracciones nitrogenadas de menor peso molecular y aminocidos. Este fenmeno fue descrito como proteolisis secundaria (Fox, 1989). El estudio de la degradacin proteoltica y la determinacin fraccionada de grupos de componentes nitrogenados con propiedades y pesos moleculares similares sirven de base para establecer los ndices clsicos de maduracin y degradacin del queso. El nitrgeno soluble (en % del NT) se ha considerado tradicionalmente como un ndice de maduracin, reflejando la extensin de la proteolisis. El comportamiento general de todas las fracciones nitrogenadas solubles durante la maduracin del queso se caracteriza por su tendencia al aumento como consecuencia de la accin conjunta de enzimas de distinta procedencia (microbianas, del cuajo y enzimas propias de la leche empleada en la fabricacin del queso) sobre las casenas.

107

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

En la Tabla 2.4 se presentan los valores de nitrgeno soluble en agua (NS) y nitrgeno soluble en cido fosfotngstico (N-PTA), expresados en peso en extracto seco, y de los valores de las relaciones NS/NT y N-PTA/NT de las muestras de queso elaboradas en invierno y primavera (quesos A, B y C). En la Tabla 2.5 se muestran los valores medios y desviacin standard de estos datos, as como los resultados del test de comparacin de medias por fechas de maduracin y por estaciones de fabricacin. La Figura 2.5 muestra la evolucin experimentada por estas fracciones nitrogenadas, expresadas como porcentaje del NT, las cuales se consideran ndices de la maduracin. Las concentraciones de nitrgeno soluble en agua (NS) y en nitrgeno soluble en cido fosfotngstico (N-PTA) aumentaron de forma progresiva con el tiempo de maduracin en ambos lotes de quesos, tal y como era de esperar, mostrando diferencias significativas entre las distintas fechas estudiadas. A la vista de los resultados del ANOVA considerando como factor la estacin de fabricacin, los valores de NS (expresados en %ES) fueron estadsticamente similares para ambos lotes de quesos en las primeras fechas de la maduracin (hasta los 60 das) y empezaron a ser significativamente distintos a partir de los 3 meses hasta el final de la maduracin, alcanzando niveles superiores las muestras de queso fabricadas en invierno. La relacin NS/NT x 100 fue del 13,34% a los 15 das y 26,59% a los 150 das para las muestras del lote de invierno, mientras que para las de primavera este ndice fue 10,06% y 21,30% a los 15 y 150 das, respectivamente. Nuevamente, el mayor contenido en sal de los quesos de primavera parece reflejarse en un menor grado de proteolisis experimentado por los mismos, ya que la sal afecta de forma negativa a la hidrlisis proteica (Schroeder et al., 1988; Cabezas et al., 1993). Garca-Ruiz et al. (1998) obtuvieron para quesos Manchegos elaborados en otoo de forma similar a los de este estudio y madurados durante el mismo perodo de tiempo, que los valores de NS/NT aumentaron desde el 17,14% a los 15 das hasta un 28,87% a los 150 das.

108

Prediccin del tiempo de maduracin

Resultados y Discusin

Tabla 2.4: Fracciones nitrogenadas de los quesos Manchegos (A, B y C) elaborados en INVIERNO y PRIMAVERA.

Tiempo (das) Invierno 15 Primavera

Muestra A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C

Invierno 30 Primavera

Invierno 45 Primavera

Invierno 60 Primavera

Invierno 90 Primavera

Invierno 120 Primavera

Invierno 150 Primavera

NS (%ES) 0,83 0,80 0,77 0,47 0,64 0,85 1,06 1,01 1,00 1,06 0,96 0,90 1,10 1,26 1,26 1,10 1,01 1,03 1,34 1,29 1,29 1,25 1,06 1,15 1,45 1,58 1,61 1,25 1,28 1,34 1,54 1,51 1,44 1,43 1,34 1,36 1,58 1,63 1,64 1,37 1,30 1,33

NS/NT x 100 13,97 13,36 12,69 7,33 10,06 12,80 17,55 16,40 16,78 16,56 15,14 14,13 26,80 20,83 18,43 17,08 15,83 16,27 22,08 21,43 21,29 19,35 16,83 18,25 23,97 26,42 26,44 19,53 20,78 21,58 25,37 24,96 24,41 22,84 21,37 21,90 25,90 27,08 26,80 21,82 20,70 21,38

N-PTA (%ES) 0,06 0,07 0,05 0,02 0,02 0,00 0,13 0,12 0,09 0,07 0,05 0,05 0,15 0,12 0,10 0,09 0,07 0,15 0,18 0,10 0,18 0,10 0,06 0,10 0,31 0,27 0,29 0,08 0,09 0,14 0,25 0,28 0,22 0,15 0,15 0,13 0,33 0,30 0,35 0,13 0,14 0,16

N-PTA/NT x 100 1,01 1,17 0,82 0,31 0,31 0,00 1,99 1,95 1,51 1,09 0,79 0,78 2,51 1,98 1,63 1,40 1,10 2,37 2,97 1,66 2,97 1,55 0,95 1,59 5,12 4,52 4,76 1,25 1,46 2,25 4,12 4,62 3,78 2,40 2,39 2,09 5,41 4,98 5,72 2,07 2,23 2,57

109

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

Tabla 2.5: Valores medios1 y desviacin estndar de las fracciones nitrogenadas de los quesos Manchegos elaborados en INVIERNO y PRIMAVERA. Tiempo de maduracin (das) NS (%ES) 15 30 45 60 90 120 150 15 30 45 60 90 120 150 15 30 45 60 90 120 150 15 30 45 60 90 120 150 INVIERNO PRIMAVERA Diferencias entre estaciones de fabricacin2 ns ns ns ns * * ** ** * ns ns ** ** ** ns ns ns * ** ** ** ** ** ns ns ** ** **

0,80a 0,03 1,02b 0,03 1,21c 0,09 1,31d 0,03 1,55e 0,09 1,49e 0,05 1,62e 0,03 0,06a 0,01 0,11b 0,11 0,12b 0,12 0,15b 0,15 0,29c,d 0,02 0,25c 0,03 0,33d 0,03 13,34a 0,64 19,91b 0,56 22,02c 4,31 21,60c 0,42 25,61c,d 1,42 24,91c,d 0,48 26,59d 0,62 1,00a 0,18 1,82b 0,27 2,04b 0,44 2,53b 0,76 4,80c,d 0,30 4,17c 0,42 5,37d 0,37

0,65a 0,19 0,97b 0,08 1,05b 0,05 1,15b,c 0,10 1,29c,d 0,05 1,38d 0,05 1,33c,d 0,04 0,01a 0,01 0,06b 0,01 0,10b,c 0,04 0,09b,c 0,02 0,10b,c 0,03 0,14c 0,01 0,14c 0,02 10,06a 2,74 15,28b 1,22 16,39b 0,63 18,14b 1,26 20,63c 1,03 22,04c 0,74 21,30c 0,56 0,21a 0,18 0,89b 0,18 1,62b,c 0,66 1,36b,c 0,36 1,65b,c 0,53 2,29c 0,18 2,29c 0,26

N-PTA (%ES)

NS/NT x 100

N-PTA/NT x 100

: Cada valor corresponde a la media del anlisis por duplicado, realizado a su vez en tres quesos independientes. 2 : Significacin estadstica de la varianza; ns: no significativo; *: P<0,05; **: P<0,01. a, b, c, d, e, f, g : Medias en la misma columna con superndices distintos son significativamente diferentes entre s segn el test de Student-Newman-Keuls (p<0,05).

110

Prediccin del tiempo de maduracin

Resultados y Discusin

NS/NT x 100
30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 15 30 45 60 90 120 150 Tiempo de maduracin (d)

N-PTA/NT x 100
6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 15 30 45 60 90 120 150 Tiempo de maduracin (d)

Invierno

Primavera

Figura 2.5: Evolucin de los ndices de maduracin NS/NT x 100 y N-PTA/NT x 100 a lo largo de la maduracin de los quesos Manchegos elaborados en INVIERNO y PRIMAVERA

111

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

En diferentes trabajos realizados por otros investigadores sobre la proteolisis secundaria experimentada en distintos quesos de oveja se obtuvo lo siguiente: Gaya et al. (1990) encontraron en queso Manchego de 4 meses de maduracin elaborados con leche pasteurizada valores medios del NS de 6,74%. Uceda et al. (1994), encontraron un valor de NS soluble a pH 4,6 de 16,78 (% NT) para queso Manchego de 60 das de maduracin. Guindeo et al. (1990) hallaron para queso Urbasa un porcentaje de NS/NT a los 90 das de maduracin del 28,6%. Por ltimo, Ibez et al. (1995) obtuvieron para queso Idiazbal valores de NS/NT de 8,38% y 16,84% a los 15 y 180 das, respectivamente. La fraccin de nitrgeno soluble en cido fosfotngstico, que contiene aminocidos libres y pptidos de pequeo tamao, es una fraccin relevante para la intensidad del sabor del queso Manchego (Gaya et al., 1990). Los valores de N-PTA fueron significativamente superiores para los quesos elaborados en invierno respecto a los de primavera durante todo el proceso de maduracin, excepto a los 45 y 60 das. De nuevo, la mayor concentracin de sal de los quesos de primavera podra haber frenado la proteolisis secundaria experimentada por estas muestras. Garca-Ruiz et al. (1998) obtuvieron para quesos Manchegos elaborados en otoo unos valores para la relacin N-PTA/NT que oscilaron entre 1,54% a los 15 das y 3,90% a los 150 das. Mohedano et al. (1998) obtuvieron en queso Manchego de los 60 das de maduracin un valor de N-PTA de 8,20%, notablemente superior al obtenido en el presente estudio para las muestras con el mismo tiempo de maduracin. Gmez et al (1999) obtuvieron para el N-PTA (% NT) de queso Manchego elaborado con leche pasteurizada, unos resultados ligeramente inferiores a los de este estudio.

112

Prediccin del tiempo de maduracin

Resultados y Discusin

2.3.2.3. Contenido en tirosina y triptfano La contribucin de cada uno de los aminocidos y su evolucin a lo largo de la maduracin de los quesos ha sido de gran inters por su influencia decisiva en la calidad organolptica del producto. El catabolismo de los aminocidos es el aspecto menos estudiado y caracterizado de la maduracin del queso, y es muy probable que los productos del catabolismo de los aminocidos sean los principales contribuyentes al sabor de muchas variedades de quesos. En la Tabla 2.6 se muestran las concentraciones en mg/100 g ES de los aminocidos tirosina y triptfano solubles de las muestras de queso elaboradas en invierno y primavera (quesos A, B y C). Tambin en la Tabla 2.7 se presentan las medias y desviacin standard de estos datos y los resultados del ANOVA y del test de S-N-K. En la Figura 2.6 se muestra la evolucin de los mismos a lo largo de la maduracin. Los valores de tirosina aumentaron con el tiempo de maduracin en los dos lotes de quesos estudiados y slo fueron significativamente diferentes entre ambos lotes a los 15 (p<0,05), 30 y 150 das (p<0,001). En el caso del triptfano los valores aumentaron hasta los 45 das en el caso de las muestras elaboradas en invierno, y hasta los 90 para las de primavera, para luego disminuir hasta el final de la maduracin, alcanzando concentraciones finales de 157,61 y 190,35 mg /100 g ES para las muestras de invierno y primavera, respectivamente. El contenido en triptfano fue significativamente superior para las muestras de primavera respecto a las de invierno desde los 60 das hasta el final del perodo de maduracin. Los valores obtenidos de las concentraciones de tirosina y triptfano para las muestras de quesos Manchegos elaborados en otoo (Garca-Ruiz, 1996), fueron a los 150 das de maduracin, 484,97 y 142,80, respectivamente.

113

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

Tabla 2.6: Concentracin de los aminocidos tirosina y triptfano de los quesos Manchegos (A, B y C) elaborados en INVIERNO y PRIMAVERA.

Tiempo (das) Invierno 15 Primavera Invierno 30 Primavera Invierno 45 Primavera Invierno 60 Primavera Invierno 90 Primavera Invierno 120 Primavera Invierno 150 Primavera

Muestra A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C

Tyr Trp (mg/100 gES) (mg/100 gES) 306,35 135,78 280,48 157,78 170,50 250,01 368,03 127,07 131,15 346,39 358,54 141,29 316,85 144,74 315,13 149,50 195,34 323,96 379,22 199,31 402,57 193,62 374,01 207,41 372,03 195,94 360,69 196,98 358,05 208,51 413,46 226,00 429,17 191,73 365,49 232,42 428,29 179,41 396,90 193,66 396,06 182,91 397,75 226,69 396,01 203,24 413,14 232,32 421,39 161,87 446,30 171,82 430,39 203,50 410,93 264,92 457,26 237,93 454,01 223,43 442,87 166,02 150,86 452,14 448,86 159,43 399,91 204,40 475,80 176,38 192,44 456,78 505,40 157,56 517,34 150,49 535,13 164,78 418,27 200,47 193,08 447,03 446,38 177,50

114

Prediccin del tiempo de maduracin

Resultados y Discusin

TABLA 2.7: Valores medios1 y desviacin estndar de las concentraciones de los aminocidos tyr y trp a lo largo de la maduracin de los quesos Manchegos elaborados en INVIERNO y PRIMAVERA.

Tiempo de maduracin (das) Tyr (mg/100 g ES )

15 30 45 60 90 120 150 15 30 45 60 90 120 150

INVIERNO

PRIMAVERA

Diferencias entre estaciones de fabricacin2 * ** ns ns ns ns ** ns ns ns * * * *

278,94a 28,20 318,65b 4,68 363,59c 7,43 407,08d 18,37 432,69d,e 12,61 447,96e 4,70 519,29f 14,96 154,69a 17,57 163,19a,b 27,94 200,48b 6,98 185,33a,b 7,43 179,06a,b 21,74 158,77a 7,60 157,61a 7,15

357,65a 10,85 385,27a,b 15,21 402,71a,b 33,17 402,30a,b 9,43 440,73b 25,86 444,16b 39,49 437,23b 16,42 133,17a 7,32 200,11b 6,93 216,72b,c 21,88 220,75b,c 15,43 242,10c 21,05 191,08b 14,06 190,35b 11,72

Trp (mg/100 g ES )

: Cada valor corresponde a la media del anlisis por duplicado, realizado a su vez en tres quesos independientes. 2 : Significacin estadstica de la varianza; ns: no significativo; *: P<0,05; **: P<0,01. a, b, c, d, e, f, g : Los valores medios en una columna con un superndice distinto son significativamente diferentes (P<0,05) segn el test de Student-Newman-Keuls.

115

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

Tyr (mg/100g ES)

600,00 500,00 400,00 300,00 200,00 100,00 0,00 15 30 45 60 90 120 150 Tiempo de maduracin (d)

Trp (mg/100g ES)

300,00 250,00 200,00 150,00 100,00 50,00 0,00 15 30 45 60 90 120 150 Tiempo de maduracin (d)

Invierno

Primavera

Figura 2.6: Evolucin del contenido en tirosina y triptfano a lo largo de la maduracin de los quesos Manchegos elaborados en INVIERNO y PRIMAVERA

116

Prediccin del tiempo de maduracin

Resultados y Discusin

2.3.3. Anlisis factorial en Componentes Principales Se aplic el Anlisis de Componentes Principales (ACP) a las muestras de quesos Manchegos elaboradas en invierno y primavera, teniendo en cuenta las variables fsicoqumicas y de proteolisis secundaria de los quesos de ambos lotes para todas las fechas de maduracin: ES (%), pH, Aw, Cloruros (%ES), NP (%ES), NS (%ES), N-PTA (%ES), NS/NT x 100, N-PTA/NT x 100, Tyr (mg/g ES) y Trp (mg/g ES). En la Tabla 2.8 se muestran los resultados obtenidos del ACP. La varianza total explicada por los dos primeros Componentes Principales (CP) fue del 83,35%. El CP 1 explic el 54,94% de la varianza total, y las variables ms correlacionadas con el mismo fueron ES, NS, Aw, Tyr, NS/NT x 100, N-PTA y N-PTA/NT x 100. El CP 2 explic el 28,41% de la varianza total y estuvo ms correlacionado con los cloruros y con el NP. La Figura 2.7 muestra la representacin en el plano definido por el CP 1 y el CP 2 de las muestras de queso objeto de este estudio. Se puede comprobar que las muestras de ambos lotes se distribuyeron a lo largo del eje CP 1 segn su tiempo de maduracin, desde los 15 hasta los 150 das, si bien esta separacin fue ms evidente para las muestras del lote de invierno. Esto podra ser debido a una menos intensa proteolisis experimentada por las muestras de queso elaboradas en primavera, es decir, que los quesos maduraron de una forma ms lenta. Por otro lado, a lo largo del eje CP 2 las muestras se agruparon en dos grandes poblaciones, las cuales coinciden con los dos lotes de quesos, el lote elaborado en invierno, en la parte negativa del eje, y en la parte positiva, los quesos elaborados en primavera. Las variables que diferenciaron entre las dos poblaciones de quesos (invierno y primavera) fueron el contenido en cloruros y la protena total. Estas diferencias parecen estar ocasionadas por las diferencias en la leche de partida empleada en la elaboracin de los quesos. Los resultados del ACP pusieron de manifiesto que los quesos se diferenciaron por su tiempo de maduracin y por la estacin de fabricacin, en base a su distinta composicin y parmetros proteolticos, al igual que lo haba hecho previamente el ANOVA.

117

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

Tabla 2.8: Resultados del Anlisis de Componentes Principales de los resultados fsicoqumicos y de proteolisis secundaria de las muestras de quesos Manchegos fabricados en INVIERNO y PRIMAVERA.

Componente Principal

% Varianza explicada

% Varianza acumulada

Variables ms correlacionadas con cada Componente Principal y sus coeficientes ES NS Aw Tyr NS/NT N-PTA N-PTA/NT Cloruros NP (0,950) (0,937) (-0,916) (0,905) (0,888) (0,820) (0,813) (0,936) (0,891)

54,94

54,94

28,41

83,35

2 ,0 90 1 ,5 15 45 60 45 45 60 60

Componente Principal 2

1 ,0 15 ,5 0 ,0 15

30 30 0 3

1 9090 150 50 120 120 150 120

45 - ,5 - 1 ,0 - 1 ,5 - 2 ,0 -2 -1 0 1 2 30 30 1 51 51 5 30 45 60 45 6 06 0 120 120 90 120 90 90 150 150 150

LO TE
P r im a v e r a In v ie r n o

C o m p o n e n te P r in c ip a l 1

Figura 2.7: Representacin de las muestras de queso elaboradas en INVIERNO y PRIMAVERA en el plano definido por los dos primeros Componentes Principales, obtenidos con los resultados fsico-qumicos y de proteolisis secundaria.

118

Prediccin del tiempo de maduracin

Resultados y Discusin

2.3.4. Prediccin del tiempo de maduracin del queso Manchego Una vez efectuado el estudio de las caractersticas fsico-qumicas y de la proteolisis de las muestras de queso Manchegos elaborados en invierno y en primavera, y comprobadas las diferencias existentes entre ambos lotes de quesos, se procedi al estudio de la prediccin del tiempo de maduracin. Para ello, tambin se consideraron los datos correspondientes a los anlisis fsico-qumicos y proteolisis de un tercer lote de quesos elaborados en otoo, que fueron analizados previamente (Garca-Ruiz, 1996, Tesis Doctoral). En primer lugar se realiz la prediccin del tiempo de maduracin del queso Manchego, se realiz el Anlisis de Componentes Principales de los tres lotes de quesos elaborados en las tres estaciones, con el objetivo de comprobar si existan diferencias entre los mismos, al igual que ocurri con los lotes de invierno y primavera entre s. En la Tabla 2.9 se presentan los resultados obtenidos del Anlisis de Componentes Principales aplicado a las variables fsico-qumicas y de proteolisis secundaria de los quesos elaborados en las tres estaciones (invierno, primavera y otoo). Se obtuvieron dos componentes principales, los cuales explicaron el 81,60% de la varianza total. El CP 1 estuvo correlacionado con las fracciones nitrogenadas, el ES, la Aw y la concentracin de tirosina, y el CP 2 estuvo ms correlacionado con el contenido en protena total y con los cloruros, al igual que ocurra al aplicar el ACP a los lotes de invierno y primavera. La Figura 2.8 muestra la representacin de las muestras en el plano definido por el CP 1 y el CP 2. Se puede observar que las muestras se distribuyeron a lo largo del eje CP 1 segn su tiempo de maduracin creciente, y a lo largo del eje CP 2 las muestras se agruparon en general, en tres poblaciones, coincidiendo con los quesos elaborados en las tres estaciones consideradas, al igual que ocurri en el caso del ACP aplicado a los lotes de invierno y primavera, si bien las muestras de quesos elaborados en otoo e invierno aparecen algo ms prximas entre s en las ltimas fechas de maduracin.

119

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

Tabla 2.9: Resultados del Anlisis de Componentes Principales de las variables fsicoqumicas y de proteolisis secundaria de las muestras de quesos Manchegos fabricados en INVIERNO, PRIMAVERA y OTOO

Componente Principal

% Varianza explicada

% Varianza acumulada

Variables ms correlacionadas con cada Componente Principal y sus coeficientes NS NS/NT ES N-PTA/NT N-PTA Aw Tyr NP Cloruros (0,963) (0,933) (0,911) (0,903) (0,900) (-0,840) (0,791) (0,868) (0,859)

54,50

54,50

27,10

81,60

Componente Principal 2

15 15 15

90 45 45 45 60 90 90 33 0 0 60 60 1 21 5 0 1 5 0 0 30 120 150 120 45 30 60 45 45 6 06 0 90 90 90 20 1 60 60 60 P rim a ve ra O to o In v ie rn o -1 0 1 1 2 2 3

120 11 2 0 20

150

0 15 15 15 -1 30 30 3 03 0 15 5 45 4 15 -3 -2 -2 30 15 -1 45

150 120 150 90 90 150 1 2 0 9 01 5 0 1 5 0

LO TE

-2

C o m p o n e n te P rin cip a l 1

Figura 2.8: Representacin de las muestras de queso elaboradas en INVIERNO, PRIMAVERA y OTOO, en el plano definido por los dos primeros Componentes Principales, obtenidos con las variables fsico-qumicas y de proteolisis secundaria.
120

Prediccin del tiempo de maduracin

Resultados y Discusin

Los quesos elaborados en las distintas estaciones se diferenciaron entre s fundamentalmente por el contenido total en protena y en cloruros. Estos parmetros generalmente no presentan oscilaciones significativas a lo largo de la maduracin del queso, por lo que las nicas diferencias entre los quesos elaborados en distintas estaciones podran estar causadas, por tanto, por la distinta composicin de la leche de partida (originada por el estado de lactacin del animal, su alimentacin, etc) y por un diferente tratamiento de la cuajada en la elaboracin de los quesos, especialmente en el salado y sobre todo al tratarse de una elaboracin semiindustrial, como en este caso. A continuacin, se intent elaborar un modelo estadstico de prediccin del tiempo de maduracin para mejorar la ecuacin propuesta por Garca-Ruiz et al. (1998). Estos autores obtuvieron, utilizando los datos correspondientes a un lote de quesos Manchegos elaborados en otoo, a escala semiindustrial y madurados durante 15, 30, 45, 60, 90, 120 y 150 das, mediante PLS (Partial Least Squares), la siguiente ecuacin para predecir el tiempo de maduracin de quesos Manchegos del mercado: tiempo = -141,895 - 531,794 Aw + 103,871 pH + 6,236 NT + 32,192 NS + 1,838 NS/NT + 10,704 N-PTA/NT con un R2 = 0,969, SD = 9,15 y RMSEPvalid = 10,30 das, donde: R2 es el coeficiente de determinacin, SD es la desviacin estndar residual, y RMSEPvalid (RMSEP de validacin interna) es el error medio de prediccin de validacin del modelo, que se aplica al conjunto de muestras con el cual se ha obtenido el modelo de prediccin, y se define matemticamente como:

RMSEPvalid=

(
i=1

(ti-t(i))2/n

1/2

121

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

siendo: ti= tiempo real de maduracin de los quesos del conjunto de calibrado, t(i)= tiempo predicho cuando la muestra i-sima es eliminada para el clculo del modelo, n= nmero de muestras en el conjunto de calibrado (en este caso, n=21). En el presente trabajo se realiz un estudio similar encaminado a la mejora de esta ecuacin, incluyendo un mayor nmero de muestras en el anlisis estadstico y considerando en este caso otros dos lotes de quesos elaborados en otras dos estaciones (primavera e invierno), con el objetivo de incluir el posible efecto de la poca de fabricacin. As, en primer lugar se obtuvo un modelo de PLS de prediccin del tiempo de maduracin con los datos del lote de invierno. Utilizando estos datos de invierno y las once variables predictoras: Aw, pH, ES, Cloruros, NT, NS, N-PTA, NS/NT, N-PTA/NT, Tyr y Trp, se obtuvo el siguiente modelo de PLS, en el cual se necesitaron 4 componentes: tiempo = -685,00 Aw 98,81 pH + 2,77 ES 6,99 Cloruros + 31,08 NT + 15,20 NS 8,64 NS/NT + 42,64 N-PTA + 2,67 N-PTA/NT + 0,10 Tyr 0,19 Trp + 840,30 con R2 = 0,983, s = 5,19 y RMSEPvalid. = 8,83 das Los valores predichos con este modelo para todos los quesos de los tres lotes (invierno, primavera y otoo) se representan grficamente en la Figura 2.9: En esta representacin se observa que la dispersin de las muestras es bastante notable. Adems, esto tambin se reflej en el RMSEP de validacin externa o de evaluacin (RMSEPeval), que es el error medio de prediccin de evaluacin del modelo, y se aplica al conjunto de muestras en el cual se quiere realizar la prediccin, y se define matemticamente como:

RMSEPeval=

(
B

i=1

(ti-t(i))2/e

1/2

122

Prediccin del tiempo de maduracin

Resultados y Discusin

150

Predicted Y 150-i 150-i

100

i: invierno p: primavera o: otoo

90-p 90-i 90-i 90-i 90-p 30-p 30-p 30-p 30-o 30-o 30-i 30-i 30-o 45-p 45-p 45-p 45-i 45-i 45-i 45-o 45-o 60-p 60-i 60-p 60-i 60-p 60-i 60-o 60-o 60-o 90-o 90-o 90-o

120-i 120-p 120-i 120-p 120-o 120-o 120-o

150-p 150-o 150-p 150-o 150-o

50

15-o 15-p 15-p 15-o 15-o 15-i 15-i 15-i

Y Reference 50 100 150

0 RESULT16, (Y-var, PC): (Tiempo,4)

Figura 2.9: Representacin grfica de los valores predichos para los quesos de los tres lotes con el modelo de PLS correspondiente a los datos de INVIERNO

donde: e= n de muestras del conjunto de evaluacin ti= tiempo real de maduracin t(i)= tiempo predicho por el modelo Al calcular el RMSEPeval sobre las poblaciones de quesos de primavera y otoo, ste result ser de 25,91 das, el cual es un valor demasiado alto. Paralelamente, se realiz el mismo planteamiento, es decir, la elaboracin de una ecuacin de prediccin, con el lote de primavera (P); despus combinando los lotes dos a dos: invierno y primavera (I+P), otoo e invierno (O+I) y otoo y primavera (O+P) y, finalmente, con los tres lotes: invierno, primavera y otoo (I+P+O) y se obtuvieron los modelos estadsticos cuyas caractersticas se recogen en la Tabla 2.10:

123

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

Tabla 2.10: Modelos estadsticos de PLS de prediccin del tiempo de maduracin para los lotes de quesos Manchegos de OTOO (O), PRIMAVERA (P) e INVIERNO (I) y sus combinaciones.

Grupo de validacin NC* Lote I Lote P Lotes I+P Lotes O+I Lotes O+P Lotes I+P+O 4 4 4 4 3 3

s 5,19 4,57 6,63 6,70 8,17 9,03

R2 0,983 0,987 0,976 0,975 0,964 0,958

RMSEPvalid 8,83 10,11 8,93 8,90 10,63 10,50

Grupo de evaluacin Lotes P+O Lotes I+O Lote O Lote P Lote I -

RMSEPeval 25,91 16,51 18,03 10,65 18,82 -

*: Nmero de componentes Seguidamente, y para mejorar los modelos anteriores, ya que en todos se necesitaron al menos 3 componentes para explicar la varianza total, lo cual an es un nmero elevado de componentes, se obtuvo una nueva ecuacin de prediccin del tiempo de maduracin, con los quesos de los tres lotes, utilizando en este caso los cuadrados de las variables y sus dobles productos: tiempo = 200,04 - 245,32 Aw + 1,09 ES - 128,76 Aw2 + 5,30 Aw pH + 1,38 Aw ES 20,10 Aw NT + 0,21 pH ES + 0,01 ES2 +0,02 ES [Cloruros] + 0,07 ES NT + 0,26 ES NS + 9,10 x 10-4 ES [tyr] En este caso se obtuvieron 2 componentes principales y unos valores de: s=7,69, R2=0,970 y RMSEPvalid=8,31 das.

124

Prediccin del tiempo de maduracin

Resultados y Discusin

En la Tabla 2.11 se presentan los valores predichos, en validacin, con este modelo para el tiempo de maduracin de los quesos de cada uno de los tres lotes (otoo, invierno y primavera).

Tabla 2.11: Valores medios predichos para el tiempo de maduracin de los quesos Manchegos elaborados en OTOO, INVIERNO y PRIMAVERA

OTOO Tiempo real (d) 15 30 45 60 90 120 150 Tiempo predicho (d) 18 39 45 72 91 125 152

INVIERNO Tiempo real (d) 15 30 45 60 90 120 150

PRIMAVERA

Tiempo Tiempo real Tiempo predicho (d) (d) predicho (d) 15 12 11 30 30 37 45 55 59 60 73 75 90 99 100 120 134 122 150 154 143

A continuacin, y para seguir mejorando el modelo de prediccin, se aplic la regresin lineal mltiple por mnimos cuadrados a las once variables, la cual puso de manifiesto que las variables que influan ms significativamente en el tiempo de maduracin fueron la Aw, el pH y el ES. Por ello, y con el objetivo de reducir el nmero de variables necesario para predecir el tiempo de maduracin, se consideraron nicamente estas variables y se introdujeron adems sus cuadrados y sus dobles productos, con el objetivo de mejorar el modelo. As, se obtuvo la siguiente ecuacin de prediccin del tiempo de maduracin: tiempo = -364,400 Aw + 41,902 pH + 1,344 ES 22,275 Aw pH + 1,804 Aw ES + 0,252 pH ES 192,406 Aw2 + 4,179 pH2 + 0,011 ES2 + 75,168 con slo 2 componentes, y con las siguientes caractersticas:

125

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

R2 = 0,984, s = 7,88 y RMSEPvalid = 8,48 das. Estos valores mejoran algo los anteriores y el modelo presenta la ventaja de utilizar slo las tres variables mencionadas, con lo cual la prediccin del tiempo de maduracin sera mucho ms sencilla y rpida de conocer, realizando nicamente estos sencillos anlisis. La representacin grfica de los valores predichos (en validacin), en funcin de los reales utilizando este modelo, se muestra en la Figura 2.10:

140

100 T_PRED

60 Lote: 1(O) Lote: 2(I) 20 Lote: 3(P)

-20 -20 20 60 T_REAL 100 140

Figura 2.10: Representacin grfica de los valores predichos (en validacin), en funcin de los reales para los quesos de los tres lotes con el modelo de tres variables (Aw, pH y ES), obtenido con los lotes de OTOO (O), INVIERNO (I) y PRIMAVERA (P).

126

Prediccin del tiempo de maduracin

Resultados y Discusin

A continuacin se procedi a realizar la evaluacin del modelo, utilizando para ello un conjunto de muestras diferente al conjunto con el cual se haba formulado el modelo. As, este modelo de prediccin con slo tres variables se aplic a los datos correspondientes a un lote de quesos Manchegos comerciales, elaborados en la misma fbrica que los anteriores y madurados durante los mismos perodos de tiempo. Estos quesos constituyeron el conjunto de evaluacin 1. Los valores predichos se presentan en la Tabla 2.12.

Tabla 2.12: Valores predichos con el modelo de tres variables (Aw, pH y ES) del tiempo de maduracin de las muestras de quesos Manchegos comerciales del conjunto de evaluacin 1

Tiempo real Tiempo predicho (d) (d) 15 20,70 15 26,80 15 26,23 30 30 30 45 45 45 60 60 60 90 90 90 120 120 120 150 150 150 43,11 45,96 47,79 46,45 40,83 35,94 49,91 52,23 57,43 77,66 83,42 71,78 83,28 87,80 91,88 142,69 127,56 131,64

127

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

Los valores predichos para el tiempo de maduracin de las 21 muestras de quesos comerciales (conjunto de evaluacin 1), con este modelo, se representan en funcin de los valores reales en la Figura 2.11. En este caso, se obtuvo un RMSEPeval de 15,1 das. En la Figura 2.11 se observa que existi un mayor error en la prediccin para las muestras de quesos de 120 das de maduracin.

160
a

140 120 Tiempo predicho (das) 100 80 60

c a b a b c c b a b a c

c b

c b a

40 20 0 0 40
b c a

Lote comercial

80 Tiempo real (das)

120

160

Figura 2.11: Representacin grfica de los valores predichos en funcin de los reales para los quesos comerciales del conjunto de evaluacin 1 con el modelo de tres variables (Aw, pH y ES)

Por ltimo, se aplic tambin este modelo de prediccin a una serie de quesos Manchegos industriales del mercado, de diferentes tiempos de maduracin (2, 4, 6, 8 y 12 meses), elaborados en distintas fbricas registradas en la D. O. Manchego, y se obtuvieron los valores de prediccin que aparecen en la Tabla 2.13.

128

Prediccin del tiempo de maduracin

Resultados y Discusin

Tabla 2.13: Valores predichos con el modelo de tres variables(Aw, pH y ES) para los quesos Manchegos comerciales del conjunto de evaluacin 2

Muestra* 2MA 2MB 2MC 2MD 2ME 2MF 4MA 4MB 4MC 4MD 6MA 6MB 6MC 6MD 6ME 6MF 8MA 8MB 12ME 12MF

Tiempo real Tiempo predicho (d) (d) 50,72 60 66,93 60 80,59 60 93,04 60 116,35 60 111,52 60 120 120 120 120 180 180 180 180 180 180 240 240 360 360 93,17 127,18 106,92 83,57 120,17 157,43 125,53 130,98 129,25 131,48 181,17 171,06 181,18 163,46

* A, B, C, D, E y F corresponden a las distintas fbricas Los valores predichos con este modelo para el tiempo de maduracin de las muestras de quesos comerciales del conjunto de evaluacin 2, se representan en funcin de los valores reales en la Figura 2.12.

129

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

400 350 300 250 T_PRED 200

8MA 8MB

150 100 50 0 0 50 100 150

2ME 2MF 2MD 2MC 2MB 2MA 4MB 4MC 4MA 4MD

6MB 6MD 6MF 6MC 6ME 6MA

12MA 12MB

200 T_REAL

250

300

350

400

Figura 2.12: Representacin grfica de los valores predichos en funcin de los reales para los quesos comericales del conjunto de evaluacin 2 con el modelo de tres variables (Aw, pH y ES)

Cabe resaltar que el modelo de prediccin se ajust mejor para las muestras con tiempos de maduracin cortos (hasta los 4-6 meses), pero no dio buenos resultados para las muestras con un tiempo de maduracin superior. Esto podra ser debido a que el modelo de prediccin se obtuvo con muestras de quesos madurados durante un tiempo mximo de 150 das (5 meses), con lo cual, el modelo no se podra utilizar para realizar la prediccin de muestras de quesos con tiempos de maduracin superiores. Adems, tambin cabe destacar que, para muestras con un mismo tiempo real de maduracin, hubo diferencias en el tiempo predicho segn la fbrica donde haban sido elaborados los quesos (Tabla 2.13).

130

Prediccin del tiempo de maduracin

Conclusiones

2.4. CONCLUSIONES
1. Se encontraron diferencias significativas entre los dos lotes de quesos Manchegos elaborados en invierno y primavera en todas las variables fsico-qumicas analizadas en la mayora de las fechas de maduracin estudiadas, a excepcin del ES. 2. La proteolisis primaria fue ms intensa en los quesos Manchegos elaborados en invierno, donde se observ una mayor intensidad de las bandas correspondientes a los productos de degradacin de las y -casenas. 3. Las concentraciones de nitrgeno soluble en agua y nitrgeno soluble en cido fosfotngstico aumentaron de forma significativa y progresivamente conforme avanzaba el tiempo de maduracin en los dos lotes de quesos estudiados (invierno y primavera). Las diferencias entre los dos lotes empezaron a ser significativas a partir de los 60 das de maduracin. 4. El ACP aplicado a las variables fsico-qumicas y a las fracciones nitrogenadas de los dos lotes de quesos Manchegos separ las muestras a lo largo del CP 2 en dos grupos bien diferenciados (quesos de primavera y quesos de invierno). Las muestras se separaron segn su tiempo de maduracin a lo largo del CP 1. 5. La Regresin Lineal Mltiple por Mnimos Cuadrados Parciales (PLS) puso de manifiesto que las variables ms correlacionadas con el tiempo de maduracin de los quesos fueron la Aw, el pH y el ES. De esta forma se mejor la ecuacin de prediccin del tiempo de maduracin del queso Manchego propuesta por Garca-Ruiz et al. (1998), utilizando nicamente estas variables junto con sus cuadrados y sus dobles productos. 6. Al aplicar este modelo de prediccin a un lote de quesos Manchegos comerciales elaborados en la misma fbrica y madurados durante los mismos perodos de tiempo que los quesos utilizados para formular la ecuacin, el error de prediccin RMSEPeval fue de tan solo 15 das.

131

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

7. En el caso de la prediccin del tiempo de maduracin de los quesos Manchegos elaborados en una fbrica diferente a la de los quesos con los cuales se formul el modelo de prediccin, el tiempo de maduracin predicho se ajust ms al real para las muestras de quesos con un tiempo de maduracin entre 4 a 6 meses.

132

Prediccin del tiempo de maduracin

Bibliografa

2.5. BIBLIOGRAFA

-AOAC: Official Methods of Analysis. (1995). 13th edition. Washington DC.

-Assenat, L. (1967). Contribution a ltude dune mthode didentification des laits et des fromages ou moyen de lelectrophorse sur gel polyacrilamide. Le Lait 47, 393414, 496-502.

-Btikofer, V, Regg, M. y Ard, Y. (1993). Determination of nitrogen fractions in cheese: evaluation of a collaborative study. Lebensmittel Wissenschaft Technology 20, 271-275.

-Cabezas, L., Martn-lvarez, P. J. y Cabezudo, M. D. (1993). Proteolysis in Gruyre de Comt cheese accentuating the effect of traditional salting. Revista Espaola de Ciencia y Tecnologa de Alimentos 33, 501-516.

-Collin, J.C., Berdaqu, J.L., Dognin-Bergeret, M. y Grappin, R. (1987). Affinage et qualit du Gruyre de Comt. IV. tude de la protolyse. Le Lait 67, 299-318.

-Fernndez-Garca, E., Ramos, M., Polo, C., Jurez, M. y Olano, A. (1988). Enzime accelerated ripening of Spanish hard cheese. Food Chemistry 28, 63-80.

-FIL: Federacin Internacional de Lechera (1982). Norma n 4 A.

-Fontecha J., Pelez, C. y Jurez, M. (1994). Biochemical characteristics of a semi-hard ewes milk cheese. Zeitschift Lebensmittel Untersuchung Forschung 198, 24-28.

-Fox, P.F. (1989). Proteolysis during cheese manufacture and ripening. Journal of Dairy Science 72, 1379-1400.

133

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

-Franco, C. M., Quinto, E. J., Centeno, J. A., Acitores, M. I. y Cepeda, A. (1992). Ejemplo de caracterizacin de quesos comerciales tipo Manchego, mediante la utilizacin del anlisis discriminante BMDP7M. Anales de Bromatologa 44, 199-202.

-Garca-Ruiz, A. (1996). Estudio estadstico para predecir el tiempo de maduracin del queso Manchego e identificacin de la microbiota. Tesis Doctoral. Facultad de Ciencias Qumicas. Universidad de Castilla-La Mancha. Ciudad Real.

-Garca-Ruiz, A., Cabezas, L., Martn-lvarez, P. J. y Cabezudo, M. D. (1998). Prediction of the ripening times of Manchego cheese using multivariate statistical analyse: a preliminary study. Zeitschift Lebensmittel Untersuchung Forschung A 206, 382386.

-Gaya, P., Medina, M.,Rodrguez-Marn, M. A. y Nez, M. (1990). Accelerated ripening of ewes milk Manchego cheese: The effect of elevated ripening temperatures. Journal of Dairy Science 73, 26-32.

-Gmez, M. J., Rodrguez, E., Gaya, P., Nez, M. y Medina, M. (1999). Characteristics of Manchego cheese manufactured from raw and pasteurized ovine milk and with defined-strain or commercial mixed-strain starter cultures. Journal of Dairy Science 82, 2300-2307.

-Guindeo, M. J., Astiasarn, Y. y Bello, J. (1990). Estudio del proceso de maduracin del queso Urbasa elaborado de modo artesanal con leche de oveja de la raza lacha. Rev. Agroqum. Tecnol. Aliment. 3014, 469-475.

-Heiss, E. (1961). Essai de dosage de la matire grasse dans le fromage par des methodes rapides. Dtsc. Molk. Ztg. 82, 67-70.

134

Prediccin del tiempo de maduracin

Bibliografa

-Ibez, F. C., Torres, M. I., Ordez, A. I. y Barcina, Y. (1995). Effect of composition and ripening on casein breakdown in Idiazbal cheese. Chem. Mikrobiol. Technol. Lebensm. 17 (1/2) 37-44.

-Kosikowski, F.V. (1982). Analysis. Cheese and fermented milk foods. F. V. Kosikowski and Associated, Brooktondale, New York.

-Kuchroo, C.N. y Fox, P.F. (1982). Soluble nitrogen in Cheddar cheeses: comparison of extraction procedures. Milchwissenschaft 37, 331-335.

-Lawrence, R. C., Creamer, L. K. y Gilles, J. (1987). Texture development during cheese ripening. Journal of Dairy Science 70, 1748- 1760.

-Macedo, A. C. y Malcata, F. X. (1996). Changes in the major free fatty acids in Serra cheese throughout ripening. International Dairy Journal 6, 1087-1097.

-Martens, H. y Naes, T. (1993). Multivariate calibration. Wiley, Chichester.

-Mohedano, A. F., Fernndez, J., Garde, S., Medina, M., Gaya, P. y Nez, M. (1998). The effecct of the cysteine proteinase from Micrococcus sp. INIA 528 on the ripening process of Manchego cheese. Enzyme and Microbial Technology 22, 391-396.

-Molina, E. y Martn-lvarez, P. J. (1996). Comparacin de diferentes tcnicas de regresin para la prediccin de los procentajes de leche de vaca, oveja y cabra en queso de mezcla. Revista Espaola de Lechera 73, 33-43.

-Picn, A., Gaya, M., Medina, M. y Nez, M. (1995). The effect of liposomeencapsulated Bacillus subtilis neutral proteinase on Manchego cheese ripening. Journal of Dairy Science 78, 1238-1247.

135

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

-Ramos, M., Martnez-Castro, I. y Jurez, M. (1977). Detection of cows milk in Manchego cheese. Journal of Dairy Science 60, 870-877.

-Santa-Mara, G., Ramos, M. y Ordez, J. A. (1986).Application of linear discriminant analysis to the different proteolysis parameters for assesing the ripening of Manchego cheese. Food Chemistry 19, 225-234.

-Schroeder, C. L., Bodyfelt, F. W., Wiatt, C. J. y McDaniel, M. R. (1988). Reduction of sodium chloride in Cheddar cheese: effect on sensory, microbiological and chemical properties. Journal of Dairy Science 71, 2010.

-SPSS for Windows. (1999). Version 9.0.1.

-Uceda, R, Guilln, A. M., Gaya, P., Medina, M. y Nez, M. (1994). Chemical and rheological characteristics of Manchego cheese manufactured from ewe raw milk preserved by activation of the lactoperoxidase system. Milchwissenschaft 49, 494-499.

-Unscrambler Users Guide. (1996). Camo A/, Trondheim.

-Vakaleris, B. y Price, W. (1959). A rapid spectrophotometric method for measuring cheese ripening. Journal of Dairy Science 42, 264-276.

136

CAPTULO 3 LIPOLISIS EN EL QUESO MANCHEGO: ESTUDIO DE LOS CIDOS GRASOS LIBRES A LO LARGO DE LA MADURACIN Y SEGN LA POCA DE FABRICACIN

Lipolisis en queso Manchego

Introduccin

3.1. INTRODUCCIN: ESTADO ACTUAL DEL TEMA

La grasa del queso afecta a su calidad de varias formas: en cuanto al aporte nutricional, por su contribucin a las caractersticas reolgicas y estructurales y, fundamentalmente, por su papel en el desarrollo del aroma. Esta participacin de la grasa del queso en la formacin del aroma est determinada por el contenido en cidos grasos libres (AGL), bien de una forma directa, por el sabor que confieren de por s los AGL de cadena corta y media, o bien indirectamente, como precursores de otras sustancias responsables del aroma como metil-cetonas, alcoholes, lactonas y steres (Forss, 1979). Los cidos grasos de cadena corta confieren a los quesos caractersticas sensoriales propias, ya que presentan umbrales de percepcin muy bajos (Brennaud et al., 1989) y son responsables de sabores fuertes y picantes (De la Fuente et al., 1993).

Los AGL contribuyen al aroma y al sabor de muchos tipos de quesos. Quesos duros italianos como el Parmesano y Romano, el queso Majorero, de Fuerteventura, y quesos azules como el Roquefort, Stilton, Gorgonzola, Danablu y Cabrales deben sus sabores caractersticos a los niveles relativamente elevados de AGL producidos durante la maduracin, debido a las lipasas presentes en las pastas de cuajo sin purificar empleadas en su fabricacin o por las lipasas fngicas, segn cada variedad. Adems, en quesos en los que los niveles de AGL son relativamente bajos, como el Cheddar, Gouda, Emmental y Manchego, los AGL aportan, sin embargo, una contribucin esencial al aroma del queso (Stadhouders y Veringa, 1973; Otherholm et al., 1976; Law y Sharpe, 1977; FernndezGarca et al., 1988).

En general, se consideran dos fuentes principales para la formacin de AGL en quesos madurados. En primer lugar, por lipolisis de la grasa de la leche y, en segundo lugar, a partir de la metabolizacin de hidratos de carbono y protenas por las bacterias lcticas; as, cidos como el actico, propinico y butrico pueden provenir de fermentaciones. Aunque se considera que es la va lipoltica la ruta principal para la formacin de AGL en el queso (Bills et al., 1969).

139

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

La actividad lipoltica en el queso es bien conocida (Albrecht y Jaynes, 1955; Deeth y Fiztgerald, 1976; Sorhaug y Stepaniak, 1977; El Soda, 1986; Driessen, 1989; Olivecrona y Bengtson-Olivecrona, 1991); se sabe que las lipasas pueden proceder de la leche (lipasa nativa, aunque no resiste la pasteurizacin) de los microorganismos (microbiota nativa de la leche, microorganismos aadidos como cultivo iniciador y como flora secundaria, como son las lipasas fngicas) y esterasas pregstricas que se encuentran en las preparaciones de cuajo sin purificar (De la Fuente y Jurez, 1993).

La extensin de la lipolisis puede evaluarse mediante la determinacin de los AGL (Woo et al., 1984). La concentracin de AGL en el queso depende de la composicin estacional de la leche. As, depende de la alimentacin del animal y de sus condiciones fisiolgicas (estado de lactacin, edad y variacin gentica) y de la relativa actividad lipsica (Anon, 1991; Njera et al., 1993). As por ejemplo, la proporcin relativa del cido butrico alcanza su mnimo al final del perodo de lactacin (en julio), mientras que el mximo se presenta al comienzo. Los cidos esterico y oleico siguen una evolucin inversa (Routaboul, 1981).

La composicin cualitativa de los cidos grasos de la grasa lctea de oveja es similar a la de vaca y cabra, presentando ms de 64 cidos grasos, aunque se observan diferencias entre las tres especies animales (Walstra y Jennes, 1984; Galvano y Scena, 1984). As, la grasa de la leche de oveja y de la de cabra poseen un mayor contenido de cidos grasos de cadena corta y media que la grasa de la leche de vaca (20-25% frente a 10-12%, respectivamente), mientras que su contenido en cidos grasos insaturados es inferior al de la leche de vaca (Lowenstein et al., 1980; Anifantakis, 1986; Gonzlez de Llano y Ramos, 1989). El perfil de AGL en quesos de oveja ha sido estudiado por diversos autores como Olmedo y Coll-Helln (1976) y Gatusso y Fazio (1980), quienes mostraron que los AGL que se encuentran en la leche en mayores concentraciones son los cidos palmtico y oleico y, en menor cantidad, caproico, caprlico, linoleico y linolnico. El olor y el gusto caractersticos de la leche de oveja estn en estrecha relacin con su contenido en AGL de cadena corta y media (Luquet, 1991).

140

Lipolisis en queso Manchego

Introduccin

La extensin de la lipolisis se ha usado como un ndice de la maduracin en muchos tipos de queso. En el queso Manchego la lipolisis no es muy importante en trminos cuantitativos (Ramos y Martnez-Castro, 1976), pero desde el punto de vista cualitativo juega un papel esencial en el desarrollo de su aroma tpico (Fernndez-Garca et al., 1988).

En la bibliografa revisada existen pocos trabajos acerca del estudio de la lipolisis en el queso Manchego. En algunos slo se analizan los AGL totales mediante valoracin con KOH etanlica (Nez et al., 1986a, b). Se han encontrado trabajos que estudian la composicin en cidos grasos totales en queso Manchego conservado en aceite de oliva (Jurez et al., 1980) y de AGL tambin en queso Manchego conservado en aceite de oliva (De la Fuente et al., 1993).

Los objetivos de este trabajo fueron conocer la composicin en AGL del queso Manchego, estudiar su evolucin con el tiempo de maduracin y comprobar si las diferencias en la composicin estacional de la leche de partida tienen algn efecto en las concentraciones de AGL encontradas en el queso.

141

Lipolisis en queso Manchego

Material y Mtodos

3.2. MATERIAL Y MTODOS

3.2.1. Material experimental

Como material experimental se emplearon tres lotes de quesos elaborados a escala semiindustrial en tres pocas distintas del ao (primavera, otoo e invierno), siguiendo la tecnologa del Manchego. En cada lote se fabricaron 21 quesos de un peso aproximado de 1,5 Kg. Los quesos recin elaborados fueron transportados en refrigeracin hasta el laboratorio, donde se almacenaron en una cmara de maduracin a 14 C y a una humedad relativa del 80%. Los quesos fueron madurados durante 15, 30, 45, 60, 90, 120 y 150 das, y para cada perodo de maduracin se destinaron tres quesos individuales, con lo cual, el nmero total de quesos elaborados fue de 63 (El lote de quesos elaborados en otoo fue objeto de un estudio previo (Garca-Ruiz, 1996).

Para realizar el anlisis se cort una muestra en forma de cua de unos 100 g de cada uno de los tres quesos correspondientes a cada tiempo de maduracin. Las muestras se trituraron con una picadora elctrica y se mezclaron homogneamente, siendo congeladas a 20 C hasta efectuar el anlisis.

3.2.2. Mtodo de extraccin de los cidos grasos libres

El mtodo utilizado para el anlisis de los AGL de las muestras de queso fue el propuesto por Metcalfe y Wang (1981), modificado posteriormente por Jurez et al. (1992). Este mtodo presenta la ventaja de que se pueden obtener en un nico paso y en fases separadas los metilsteres de los AGL y de los cidos grasos de los triglicridos. Consiste en la extraccin de la grasa del queso con ter etlico en una papilla acidificada hasta pH 1,5 con cido sulfrico. Como patrn interno se utiliz una disolucin de cido n-nonanoico al 0,6% p/v en ter etlico. La metilacin de los cidos grasos de las fracciones glicerdica y de la de AGL se llev a cabo empleando como catalizador hidrxido de tetrametilamonio (HTMA) al 20% en metanol. El empleo de HTMA permite la transformacin de los glicridos en steres metlicos y, en unos instantes, a temperatura ambiente y en fase separada, se obtiene la conversin de los AGL en jabones de TMA,

143

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

que se convierten en steres metlicos en el inyector del cromatgrafo. En la Figura 3.1 se muestra un esquema del procedimiento seguido en la extraccin.

10 g queso + 5 mL H2O (d) + H2SO4 25% metanol hasta pH=1,5 (0,7-1,3 mL) + 1mL cido nonanoico 0,6% p/v en dietileter (patrn interno) + 10 mL dietileter (T hielo) Agitar 3 min Centrifugar 5min/ 0C Filtrar fase orgnica a travs de Na2SO4 anhidro 5 min. Tomar 3 mL del filtrado + 0,2 mL HTMA 25% metanol Agitar 1-2 min Reposo 15 min Separar fases

Fase superior: steres metlicos de los AG de los triglicridos Lavar Inyectar

Fase inferior: jabones de TMA de los AGL Neutralizar con HCl 2N metanlico hasta pH9 usando azul de timol como indicador Lavar Inyectar

Figura 3.1: Mtodo de extraccin de las muestras para el anlisis cromatogrfico

144

Lipolisis en queso Manchego

Material y Mtodos

Se realizaron dos extracciones por cada muestra, y cada una de estas se inyect por duplicado en el cromatgrafo.

3.2.3. Anlisis por cromatografa de gases

El equipo utilizado fue un cromatgrafo de gases Perkin-Elmer modelo 8700, equipado con un inyector PTV y un detector de ionizacin de llama. La columna empleada fue una HP-5 de metilsilicona, de longitud, 30 m, dimetro, 0,25 mm y espesor o dimetro interno, 0,25 m.

Con el objetivo de optimizar el anlisis se ensayaron distintas condiciones cromatogrficas (temperatura del inyector, volumen de inyeccin, split, splitless y programa de temperaturas en la columna), hasta obtener un cromatograma con una adecuada resolucin de los picos. Las condiciones cromatogrficas definitivas fueron:

-Programa de temperaturas de la columna: 60 C durante 3 min, posteriormente una rampa de 8 C/min hasta alcanzar 230 C, mantenimiento 5 min. -T inyector: 300 C -T detector: 280 C -Gas portador: N2; presin en cabeza de columna: 19 psi. -Vol. de inyeccin: 0,1 L en splitless 0,05 min. -Relacin de split: 1:25

La identificacin de los cidos grasos se hizo por comparacin con los tiempos de retencin obtenidos al inyectar sustancias patrn de los siguientes cidos grasos: C4:0 C6:0, C8:0 C10:0, C12:0, C14:0, C16:0, C18:0 y C18:1, todos de pureza > 99% por CG (Sigma-Aldrich). Estos cidos grasos patrn fueron sometidos al mismo tratamiento de metilacin que las muestras con HTMA.

El anlisis cuantitativo de los cidos grasos se realiz utilizando rectas de calibrado preparadas con concentraciones conocidas de las sustancias patrn anteriormente citadas. Para ello se prepar una disolucin madre en eter etlico conteniendo los patrones de los

145

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

cidos grasos anteriormente citados, en las concentraciones indicadas en la Tabla 3.1. Para la preparacin de esta disolucin madre se tom como referencia la composicin en AGL de una muestra de queso de 2 meses de maduracin (Jurez et al., 1992), con el fin de que los compuestos estuviesen en proporciones similares a las que se encuentran realmente en un queso, y se prepar 10 veces ms concentrada, con el objetivo de realizar distintas diluciones y obtener varios puntos para las rectas de calibrado. De nuevo, estas disoluciones patrn fueron sometidas al mismo proceso de extraccin y metilacin que la muestra (Ver Figura 3.1).

Tabla 3.1: Disolucin madre de cidos grasos patrn preparada en dietilter

Compuesto C4:0 C6:0 C8:0 C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1

Tiempo de retencin (min.) 2,15 5,40 10,03 14,15 17,74 20,97 23,95 27,00 26,63

Concentracin en AGL (mg/Kg) 4.290 4.570 6.090 7.010 3.950 6.860 19.750 6.760 19.900

% 5,42 5,77 7,69 8,85 4,99 8,66 24,94 8,54 25,13

La Figura 3.2 muestra el cromatograma obtenido para una de las diluciones preparadas a partir de la disolucin madre. Las rectas de calibrado para cada cido graso aparecen en la Tabla 3.2, junto con el coeficiente de correlacin R2. Adems se muestra como ejemplo, un cromatograma correspondiente al anlisis de los AGL de una de las muestras de quesos Manchegos (Figura 3.3).

146

Lipolisis en queso Manchego

Material y Mtodos

C16:0

C18:1 C4:0 PI C8:0 C6:0 C12:0 C18:0 C10:0 C14:0

Figura 3.2: Cromatograma de la mezcla patrn de cidos grasos

Tabla 3.2: Rectas de calibrado para cada unos de los cidos grasos analizados

cido graso Butrico (C4:0) Caproico (C6:0) Caprlico (C8:0) Cprico (C10:0) Larico (C12:0) Mirstico (C14:0) Palmtico (C16:0) Esterico(C18:0) Oleico (C18:1)

Ecuacin de la recta y = 0,0233 + 0,800 x y = 0,0189 + 0,943 x y = 0,0191 + 1,000 x y = 0,0251 + 1,040 x y = -0,0457 + 1,130 x y = -0,1590 + 1,170 x y = -1,0200 + 1,260 x y = -0,4520 + 1,310 x y = -1,1500 + 1,200 x

R2 0,980 0,997 0,999 0,999 0,998 0,994 0,998 0,998 0,999

147

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

C16:0 P.I.

C14:0 C10:0 C12:0 C18:0 C4:0 C6:0 C8:0 C18:1

Figura 3.3: Cromatograma de los cidos grasos libres de una muestra de queso Manchego de 15 das

3.2.4. Tratamiento estadstico

Se aplic el anlisis de regresin lineal por mnimos cuadrados, el anlisis de la varianza (ANOVA) de un factor, utilizando el test de Student-Newman-Keuls, y el anlisis de Componentes Principales (ACP), utilizando el programa estadstico SPSS para Windows, Versin 9.0.1.

148

Lipolisis en queso Manchego

Resultados y Discusin

3.3. RESULTADOS Y DISCUSIN

3.3.1. Contenido en cidos grasos libres

La Tabla 3.3 muestra las concentraciones medias de AGL individuales de los quesos Manchegos elaborados en primavera, otoo e invierno, a los diferentes tiempos de maduracin estudiados. En esta tabla tambin se muestran los resultados del anlisis de la varianza (ANOVA) de un factor, considerando como factor el tiempo de maduracin.

En general, la lipolisis experimentada por las muestras de queso Manchego analizadas no fue muy intensa, tal y como era de esperar, debido posiblemente a la escasa actividad lipoltica de las bacterias lcticas (Ordez, 1987).

Los AGL encontrados en mayor proporcin en las muestras de queso, independientemente del tiempo de maduracin y de la estacin de fabricacin, fueron los cidos palmtico (C16:0) y oleico (C18:1), con porcentajes individuales entre el 28 al 34% del total de AGL. Los cidos mirstico (C14:0) y esterico (C18:0) aparecieron en proporciones intermedias (entre el 9 y el 12%). El cido butrico (C4:0) fue el AGL de cadena corta presente en mayor proporcin (del 1 al 7%). Esta distribucin se dio para las tres estaciones de elaboracin estudiadas y se mantuvo a lo largo del perodo de maduracin. Aunque los AGL de cadena corta se encontraron, en general, en bajas concentraciones, hay que destacar que son muy importantes en cuanto a que contribuyen directamente al aroma del queso (Njera et al., 1993; Macedo y Malcata, 1996).

Estos resultados son coincidentes con los encontrados en la leche de oveja por Olmedo y Coll-Helln (1976) y Gatusso y Fazio (1980), quienes comprobaron que los cidos palmtico y oleico fueron los AGL predominantes en la leche, mientras que el caproico y el caprlico estaban en bajas concentraciones. Otros autores hallaron resultados similares para quesos elaborados con leche de oveja. As, en los quesos Roncal e Idiazbal, el butrico y el palmtico fueron los AGL de cadena corta y larga encontrados en mayor concentracin, respectivamente (Gmez et al., 1987; Njera et al., 1994).

149

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

En queso Manchego conservado en aceite de oliva, los AGL mayoritarios tambin fueron el oleico y el palmtico, seguidos por el mirstico, y por ltimo, el cido butrico (De la Fuente et al., 1993). En este caso, las concentraciones en AGL fueron mucho mayores que las cuantificadas en el presente estudio, sumando un total de AGL de 32.404 mg/Kg. Esto es debido al largo perodo de maduracin experimentado por este tipo de queso, ya que la inmersin en aceite permite su conservacin durante largos perodos de tiempo (hasta dos aos).

Tambin Macedo y Malcata (1996) obtuvieron en queso Serra (elaborado con leche cruda de oveja) un perfil de AGL mayoritarios similar al obtenido en este trabajo, con la excepcin de que el AGL de cadena media predominante fue el cprico.

En cuanto a la concentracin total de AGL de los quesos por estaciones de fabricacin, el lote de primavera seguido por el de invierno fueron, en general, los que presentaron las mayores concentraciones durante la maduracin (3802 y 3616 mg/Kg a los 150 das de maduracin, respectivamente), mientras que fueron menores para el lote de otoo (2547 mg/Kg, al final de la maduracin). Si se considera el contenido en grasa de las leches de partida (6,3, 7,6 y 6,5 g/100 mL leche, para los lotes de primavera, otoo e invierno, respectivamente), parece ser que ste no afecte de una forma significativa al grado de lipolisis experimentada por los quesos durante la maduracin.

Macedo y Malcata (1996) estudiaron la concentracin de AGL en queso Serra elaborado con leche cruda de oveja a lo largo de la maduracin y en tres pocas distintas del ao (Noviembre, Febrero y Mayo). Al final del perodo de maduracin (35 das) los quesos elaborados en Mayo presentaron, en general, contenidos de AGL

significativamente superiores a los de los quesos elaborados en Noviembre y Febrero. Estos autores concluyeron que esto fue debido a los mayores valores de pH y a las temperaturas de maduracin ms elevadas que se dieron durante el mes de Mayo (esta variedad de queso se madura a temperatura ambiente), lo cual afecta a la actividad de las lipasas. Por otro lado, Virgili et al. (1994), en un estudio realizado sobre el queso Parmesano-Reggiano elaborado en las cuatro estaciones del ao, encontraron que los quesos elaborados en invierno fueron los que presentaron un mayor contenido en AGL.

150

Lipolisis en queso Manchego

Resultados y Discusin

Tabla 3.3: Concentraciones medias (mg/Kg) y desviacin standard de los AGL en queso Manchego a lo largo de la maduracin elaborados en tres estaciones distintas del ao (1 fila: primavera; 2 fila: otoo; 3 fila: invierno).

Tiempo de maduracin (das) cido graso C4:0 15 26a3 60a2 80a14 20a0 17a1 48a,b11 26a,b4 17a3 49a11 30 26a9 61a0 65a4 22a5 17a0 31a4 37b,c3 17a3 38a3 45 38a,b4 71a4 109b8 26a5 29a,b1 56a,b4 32a,b7 29b3 45a2 60 90 120 150

31a10 56b6 47a,b5 85c24 108b18 118b23 166c11 149b,c27 176c37 179c13 206d15 252e11 19a3 41b,c9 79b25 21a4 33b5 74b11 38b3 43b,c10 74b8 44c6 30b5 69b10 33b1 71d2 106c8 36b,c3 59c1 87c4 58c5 52c8 133d14 69d8 38b5 110d10

C6:0

C8:0

C10:0

128a,b8 130a,b23 115a,b5 97a14 171c17 147b,c5 232d28 114a6 107a3 142b0 144b16 136b3 230c9 156b6 182a32 174a11 158a6 222b11 222b28 236b14 318c22 120a,b3 118a,b13 115a,b8 102a8 148c12 137b,c4 197d20 108a5 105a2 132c0 115a9 112a8 173b,c6 126d7 125a,b16 140b,c8 112a4 150c13 146c17 152c10 202d7 285a1 275a27 271a24 250a17 287a141 325a11 453b49 259a14 257a5 311b3 266a13 256a26 386c12 299a,b21 275a31 333b20 256a10 322b34 330b44 338b27 443c12 881a,b9 873a,b49 869a,b59 825a36 1008c41 953b,c19 1176d96 701a,b18 686a,b19 788c3 683a,b26 670a57 944c35 766b,c40 690a,b59 844c51 656a26 775a,b,c8 795b,c10 779a,b,c4 994d35 320a,b5 324a,b35 326a,b20 308a12 357b12 335a,b8 405c32 227a,b7 227a,b5 251b3 217a9 217a23 279c4 244a,b10 255a36 330b25 252a11 333b27 305a,b52 308a,b22 348b14 891a,b29 844a,b35 881a,b58 837a31 964b54 967b20 1153c10 669a,b21 701b1 842c21 622a22 609a43 814c31 716b41 652a,b55 826d46 605a24 761c,d61 686a,b,c7 739b,c,d6 816c16

C12:0

C14:0

C16:0

C18:0

C18:1

: Medias en la misma fila con superndices distintos son significativamente diferentes entre s segn el test de Student-Newman-Keuls (p<0,05).

a,b,c

151

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

3.3.2. Estudio de la evolucin de los AGL con el tiempo de maduracin El anlisis de la varianza de los AGL individuales, considerando como factor el tiempo de maduracin, mostr que la concentracin de los AGL vari con el tiempo de maduracin (p<0,05; ver Tabla 3.3), si bien el incremento no fue progresivo en todos los casos. Contarini y Topino (1995) encontraron este mismo efecto en queso Gorgonzola (queso de vena azul italiano), sin embargo, estos resultados difieren de los encontrados por Jurez et al. (1983) en queso de Cabrales, en el que el contenido en AGL disminua a lo largo de la maduracin. Esto podra explicarse por el hecho de que los AGL aumentan con el tiempo de maduracin segn va teniendo lugar la lipolisis, pero en quesos con un alto grado de lipolisis (debido a largos perodos de maduracin, a las lipasas contenidas en las pastas de cuajo sin purificar o a las lipasas fngicas) los AGL pueden ser convertidos en otros compuestos tales como metilcetonas, alcoholes, lactonas, aldehidos, etc. (Rafecas et al., 1985), o tambin pueden ser reincorporados a los triglicridos.

Los AGL que ms aumentaron durante la maduracin fueron los de cadena corta (C4:0, C6:0 y C8:0), que en algunos casos llegaron a triplicar su concentracin al final de la maduracin. Los AGL de cadena media (C10:0, C12:0 y C14:0) experimentaron aumentos moderados, mientras que los menores incrementos fueron para los AGL de cadena larga (C16:0, C18:0 y C18:1). El mayor incremento de la concentracin de AGL de cadena corta con la maduracin podra explicarse por el hecho de que las lipasas (fundamentalmente procedentes de la leche y de los microorganismos) que participan en la maduracin del queso, son sn-1,3-especficas e hidrolizan preferentemente residuos de cidos grasos de cadena corta, por ser stos los que se encuentran esterificados predominantemente en las posiciones 1 y 3 del triglicrido (De la Fuente et al., 1993) y por otro lado, los cidos de cadena larga son ms susceptibles de reincorporarse a los triglicridos mediante la sntesis de steres catalizada por lipasas (Sousa y Malcata, 1997). Macedo y Malcata (1996) y Sousa et al. (1997) tambin encontraron en queso Serra que los cidos grasos de cadena corta fueron los que experimentaron mayores incrementos a lo largo de la maduracin.

Con el objetivo de conocer si exista alguna relacin lineal entre la concentracin de AGL y el tiempo de maduracin, se aplic el anlisis de regresin lineal con el tiempo a cada AGL por separado. Las Tablas 3.4, 3.5 y 3.6 muestran los resultados obtenidos para
152

Lipolisis en queso Manchego

Resultados y Discusin

Tabla 3.4: Regresin lineal entre la concentracin de AGL y el tiempo de maduracin: y=mx+b, para los quesos de PRIMAVERA R2 0,806 0,772 0,596 0,613 0,678 0,634 0,699 0,639 0,749 m 0,261 0,26 0,243 0,707 0,529 1,106 2,038 0,529 1,922 b 21,62 12,58 19,99 94,09 95,31 225,98 792,11 300,53 793,56

C4:0 C6:0 C8:0 C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1

Tabla 3.5: Regresin lineal entre la concentracin de AGL y el tiempo de maduracin: y=mx+b, para los quesos de OTOO R2 0,884 0,777 0,609 0,470 0,321 0,293 0,250 0,218 0,022 m 0,815 0,349 0,227 0,560 0,269 0,520 0,986 0,211 0,267 b 45,32 13,01 15,37 105,90 104,75 252,52 676,40 221,89 690,75

C4:0 C6:0 C8:0 C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1

Tabla 3.6: Regresin lineal entre la concentracin de AGL y el tiempo de maduracin: y=mx+b, para los quesos de INVIERNO R2 0,905 0,900 0,875 0,824 0,714 0,674 0,491 0,382 0,208 m 1,337 0,671 0,487 0,991 0,487 0,997 1,565 0,480 0,784 b 55,04 26,23 31,97 144,54 111,63 256,23 676,81 271,29 674,33

C4:0 C6:0 C8:0 C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1

153

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

cada uno de los tres lotes de quesos estudiados, respectivamente. En general, los coeficientes de correlacin (R2) fueron mayores para los AGL de cadena corta. As para los lotes de primavera y otoo se obtuvo un valor del R2 para el C4:0 de 0,806 y 0,884, respectivamente, y para el lote de invierno, los valores R2 fueron superiores a 0,800 para los cidos C4:0, C6:0, C8:0 y C10:0 (R2=0,905, 0,900, 0,875 y 0,824, respectivamente). Por todo esto, y como muchos autores han sugerido (De la Fuente et al. 1993; Macedo y Malcata, 1996; Sousa et al., 1997; Sousa y Malcata, 1997), esta fraccin de los AGL (AGL de cadena corta) podra ser utilizada como un ndice de la maduracin de los quesos. Sousa y Malcata (1997) sugirieron que, para el estudio de la lipolisis en quesos a lo largo de la maduracin, sera mucho ms til y dara ms informacin el ndice de liberacin de AGL (calculado como el cociente entre la cantidad de cidos grasos liberados en un perodo de tiempo determinado y dicho tiempo), ms que las medidas absolutas de las concentraciones de AGL en un momento concreto de la maduracin.

3.3.3. Estudio de la concentracin de los AGL segn la poca de elaboracin (primavera, otoo e invierno)

A continuacin se aplic el anlisis de la varianza considerando como factor la estacin de elaboracin. En las Figuras 3.4, 3.5 y 3.6 se representa en forma de histogramas las concentraciones, en mg/Kg, de AGL individuales para los tres lotes de quesos, y con una letra pequea sobre cada barra, por grupos de tres, los resultados del test de comparacin de medias (test de S-N-K). Segn se observa en la Figura 3.4, las muestras de quesos elaboradas en invierno presentaron unas concentraciones de AGL de cadena corta (C4:0, C6:0 y C8:0) significativamente mayores que los otros dos lotes (primavera y otoo). Cabe destacar que, en el caso del cido butrico (C4:0) existieron diferencias significativas entre los tres lotes de quesos para todas las fechas de maduracin estudiadas (excepto a los 30 das de maduracin). El cido caproico (C6:0) present unas concentraciones similares en los lotes fabricados en primavera y en otoo (a excepcin de los 120 das de maduracin), siendo en todos los casos inferiores a las del lote de invierno. Para el cido caprlico (C8:0) slo se obtuvieron diferencias significativas entre los tres lotes de quesos en las muestras con mayores tiempos de maduracin (90, 120 y 150 das). En el caso de los AGL de cadena media slo se observaron diferencias significativas entre los tres lotes de quesos en

154

Lipolisis en queso Manchego

Resultados y Discusin

Butrico (C4:0)
300
c

250
c

200 mg/Kg 150

c b

b b

b a

100
b

c b b a b a a a a

50 0

15

30

45

60 Das de maduracin

90

120

150

Caproico (C6:0)
140 120 100

b c b

mg/Kg

80 60 40 20 0 15 30 45

b a a

b b a b a a a a,b a a a a a a

60 90 Das de maduraci n

120

150

Caprlico (C8:0)
120 100 80 mg/Kg 60
b b a a a b a a a a a a a b b c

c c b b a

40 20 0 15

30

45

60 Das de maduraci n

90

120

150

P RIMAV ERA

OTOO

INVIERNO

Figura 3.4: Concentraciones (mg/Kg) de los AGL C4:0, C6:0 y C8:0 en quesos Manchegos elaborados en distintas estaciones del ao a lo largo de la maduracin
155

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

Cprico (C10:0)
350 300 250 mg/Kg 200 150 100 50 0 15 30 45 60 Das de maduracin 90 120 150
a a b a a b b a c a c a b b a c b b a b c

Larico (C12:0)
250 200 mg/Kg 150
a a b a b a a a b a a a b a a a a b c b a

100 50 0 15

30

45

60 Das de maduracin

90

120

150

Mirstico (C14:0)
500 400
b b a a b a a a a b a a a a a b a a

mg/Kg

300 200 100 0

a a

15

30

45

60 Das de maduracin

90

120

150

P IM R O IN R O R AVE A TO O VIE N

Figura 3.5: Concentraciones (mg/Kg) de los AGL C10:0, C12:0 y C14:0 en quesos Manchegos elaborados en distintas estaciones del ao a lo largo de la maduracin
156

Lipolisis en queso Manchego

Palmtico (C16:0)
1400 1200
a a a a b a a c b b b

Resultados y Discusin

1000 mg/Kg 800 600 400 200 0

a b b

a b

a b

15

30

45

60

90

120

150

Das de maduracin

Esterico (C18:0)
450 400 350 mg/Kg 300 250 200 150 100 50 0 15 30 45 60 Das de maduracin 90 120 150
a b b b a a b b b b a a c a b b b a c a

Oleico (C18:1)
1400 1200 1000 mg/Kg 800 600 400 200 0 15 30 45 60 90 120 150 Das de maduracin P AVE RIM RA OTOO INVIE RNO
a a b b a a a a a b a c b b b a b b b b a

Figura 3.6: Concentraciones (mg/Kg) de los AGL C16:0, C18:0 y C18:1 en quesos Manchegos elaborados en distintas estaciones del ao a lo largo de la maduracin
157

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

algunos de los tiempos de maduracin estudiados (Figura 3.5) y por ltimo, los AGL de cadena larga (C16:0-C18:1) se encontraron en general, en concentraciones significativamente mayores en el lote de primavera respecto al resto de las muestras (Figura 3.6).

Posteriormente se aplic el Anlisis de Componentes Principales a los resultados de AGL obtenidos para las muestras de queso Manchego elaborados en primavera, otoo e invierno, por separado, con el objetivo de conocer cmo se distribuan las muestras segn el tiempo de maduracin, en base a su contenido en AGL. Las variables ms correlacionadas con los dos primeros Componentes Principales y el porcentaje de varianza explicado por los mismos se muestra en las Tablas 3.7, 3.8 y 3.9, para los lotes de primavera, otoo e invierno, respectivamente. Las Figuras 3.7, 3.8 y 3.9 muestran la representacin de las muestras en el plano definido por los CP 1 y CP 2, para los quesos de primavera, otoo e invierno, respectivamente.

En el caso de los quesos elaborados en primavera, los dos primeros componentes principales explicaron el 98,1% de la varianza total. Las variables ms correlacionadas con ambos CP fueron los AGL mirstico (C14:0), con el CP 1 y butrico (C4:0), con el CP 2 (Tabla 3.7). Al representar el conjunto de las muestras en el plano definido por los CP 1 y 2 se obtuvo la distribucin que se muestra en la Figura 3.7. Se observa que la muestra de 150 das de maduracin aparece separada del resto, debido a su mayor concentracin en los AGL mirstico y caprlico; el resto de muestras se distribuye a lo largo del CP 2 segn su contenido en cido butrico, siendo los quesos de 90, 120 y 150 das los que presentaron las mayores concentraciones de este cido.

En el caso de las muestras de otoo, el CP 1 explic el 82,1% de la varianza total, y las variables ms correlacionadas con el mismo fueron los AGL de cadena corta (butrico, caproico y caprlico, ver Tabla 3.8). El CP 2 (16,2% de la varianza total) estuvo ms correlacionado con los cidos oleico y esterico. Al representar las muestras en el plano definido por estos dos componentes principales se observa la existencia de dos grupos de muestras: en la parte positiva del CP 1 se encuentran las muestras de queso de 60, 90, 120 y 150 das de maduracin, las cuales poseen los mayores contenidos en los

158

Lipolisis en queso Manchego

Resultados y Discusin

Tabla 3.7: Anlisis de Componentes Principales aplicado a las concentraciones de AGL de las muestras de queso Manchego elaborados en PRIMAVERA

Componente Principal

% Varianza explicada

% Varianza acumulada

Coeficientes y variables ms correlacionadas con cada Componente Principal mirstico 0,920 caprlico 0,830

94,5

94,5

3,6

98,1

butrico

0,905

2,0

90
1,5

Componente Principal 2

1,0

,5

120 45

150

0,0

60
-,5

-1,0

15 15 30 30

-1,5 -2,0 -1,5 -1,0 -,5 0,0 ,5 1,0 1,5 2,0 2,5

Componente Principal 1

Figura 3.7: Representacin de las muestras de PRIMAVERA en el plano definido por los dos componentes principales, obtenidos del ACP de los AGL.

159

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

Tabla 3.8: Anlisis de Componentes Principales aplicado a las concentraciones de AGL de las muestras de queso Manchego elaborados en OTOO

Componente Principal

% Varianza explicada

Coeficientes y variables ms % Varianza correlacionadas acumulada con cada Componente Principal butrico 0,975 82,1 caproico 0,964 caprlico 0,888

82,1

16,2

98,3

oleico

0,980

esterico 0,905

2,0

1,5

45

120

Componente Principal 2

1,0

,5

0,0

30 15

150

-,5

-1,0

60 90

-1,5 -1,5 -1,0 -,5 0,0 ,5 1,0 1,5 2,0

Componente Principal 1

Figura 3.8: Representacin de las muestras de OTOO en el plano definido por los dos componentes principales, obtenidos del ACP de los AGL.

160

Lipolisis en queso Manchego

Resultados y Discusin

Tabla 3.9: Anlisis de Componentes Principales aplicado a las concentraciones de AGL de las muestras de queso Manchego elaborados en INVIERNO

Componente Principal

% Varianza explicada

Variables ms correlacionadas % Varianza con cada acumulada Componente Principal caproico 0,961 81,4 butrico 0,944

81,4

caprlico 0,936 oleico 0,965

14,7

96,1

esterico 0,895

2,0 1,5

30 150

Componente Principal 2

1,0 ,5

60 120 90 15

0,0

-,5 -1,0

45
-1,5 -2,0 -2,0 -1,5 -1,0 -,5 0,0 ,5 1,0 1,5 2,0

Componente Principal 1

Figura 3.9: Representacin de las muestras de INVIERNO en el plano definido por los dos componentes principales, obtenidos del ACP de los AGL.

161

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

AGL de cadena corta (C4:0, C6:0 y C8:0) y en la parte negativa del mismo, las muestras menos maduras, con las menores concentraciones de estos AGL.

Para las muestras de invierno el CP 1 explic el 81,4% de la varianza total, mientras que el CP 2 explic el 14,7%. Las variables ms correlacionadas con cada uno de los dos componentes principales fueron los mismos cidos que en el caso de los quesos del lote de otoo (Tabla 3.9). La representacin de las muestras en el plano formado por los ejes CP 1 y CP 2 muestra cmo, de nuevo, las muestras con un tiempo de maduracin igual o superior a 60 das aparecen en la parte positiva del CP 1 (Figura 3.9), presentando mayores concentraciones en AGL de cadena corta que el resto de las muestras.

Por ltimo se aplic el ACP a los tres lotes de quesos en conjunto para comprobar si stos se agrupaban por estaciones de fabricacin. El porcentaje de varianza total explicada por los dos primeros CP fue del 94,4% (Tabla 3.10) y las variables ms correlacionadas con los mismos fueron los AGL de cadena corta (con el CP 1) y los AGL de cadena larga (con el CP 2). Al representar las muestras en el plano definido por el CP 1 y el CP 2, se pueden considerar tres grupos, coincidentes con las tres estaciones de fabricacin (Figura 3.10). En la parte superior izquierda de la figura, se encuentran las muestras de primavera, las cuales poseen un menor contenido en AGL de cadena corta que el resto de muestras y concentraciones relativamente altas de AGL de cadena larga; en la parte central aparecen la muestras elaboradas en otoo, con contenidos intermedios de AGL de cadena corta y concentraciones ms bajas de AGL de cadena larga que los de primavera; muy prximas a las anteriores, situadas algo ms hacia la derecha, se encuentran las muestras de invierno, con bajas cantidades de AGL de cadena larga y con las mayores concentraciones de AGL de cadena corta. Se puede comprobar que los resultados obtenidos del ACP coincidieron con los del ANOVA.

Considerando que todos los quesos fueron elaborados de la misma forma, con el mismo cultivo iniciador, con leche de oveja y madurados bajo las mismas condiciones de temperatura y humedad relativa, se puede confirmar que las diferencias encontradas en la concentracin en AGL entre los tres lotes estudiados se debe a la variacin estacional de la

162

Lipolisis en queso Manchego

Resultados y Discusin

Tabla 3.10: Anlisis de Componentes Principales aplicado a los AGL de muestras de queso Manchego fabricados en PRIMAVERA, OTOO e INVIERNO, con diferentes tiempos de maduracin (15, 30, 45, 60, 90, 120 y 150 das)

Componente Principal

% Varianza explicada

% Varianza acumulada

Coeficientes y variables ms correlacionadas con cada Componente Principal caproico 0,985 cprico butrico caprlico oleico 0,949 0,948 0,941 0,980 0,965 0,894

64,9

64,9

29,5

94,4

palmtico esterico

Componente Principal 2

ESTAC IO N
-1 PRIM AVERA O TO O -2 -2 -1 0 1 2 3 INVIERNO

C om ponente Principal 1

Figura 3.10: Representacin de las muestras de PRIMAVERA, OTOO e INVIERNO en el plano definido por los dos componentes principales, obtenidos del ACP de los AGL.

163

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

leche de partida, la cual vara como se ha comentado anteriormente, con la alimentacin del animal, su estado fisiolgico, la edad, etc.

Los resultados encontrados en el presente trabajo ponen de manifiesto que la composicin en AGL de quesos elaborados en distintas pocas del ao vara fundamentalmente con respecto a la concentracin de AGL de cadena corta y larga; esta variacin no es muy acusada, puesto que en todos los estados de maduracin estudiados cada lote de quesos mostr una composicin relativa o un perfil en AGL similar, tpico de los quesos de oveja. Sin embargo, las pequeas variaciones observadas entre quesos elaborados en distintas estaciones del ao se han de tener en cuenta, sobre todo las referentes a la concentracin en AGL de cadena corta, por ser stos los que contribuyen de una manera ms directa al sabor y al aroma de los quesos.

3.3.4. Contenido en cidos grasos de la fraccin triglicrica

Con el objetivo de profundizar en el estudio de los cidos grasos presentes en el queso Manchego y debido a que el mtodo utilizado en la extraccin de los AGL permite a la vez obtener la fraccin de cidos grasos esterificados en los triglicridos, se procedi al estudio de los mismos en los quesos elaborados en otoo e invierno. Las Figuras 3.11 y 3.12 muestran la comparacin de los porcentajes de cidos grasos en la fraccin de los AGL y en la de los triglicridos para los quesos Manchegos al inicio (15 das) y al final de la maduracin (150 das), elaborados en otoo e invierno, respectivamente.

En general, el perfil de cidos grasos de la fraccin triglicrica para los quesos elaborados en otoo fue similar al de la fraccin de los AGL (Figura 3.11). Los cidos grasos mayoritarios, segn la longitud de la cadena hidrocarbonada, fueron de nuevo el butrico (cadena corta), el mirstico (cadena media) y el palmtico (cadena larga).

Si se compara el contenido en cidos grasos de ambas fracciones, se observa que, al inicio del perodo de maduracin, los cidos grasos de cadena larga presentaron unos porcentajes considerablemente mayores en la fraccin de AGL que en la de los triglicridos.

164

Lipolisis en queso Manchego

Resultados y Discusin

A)

35 30 25

20 15 10 5 0 C4:0 C6:0 C8:0 C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1

B)

35 30 25

20 15 10 5 0

C4:0

C6:0

C8:0

C10:0

C12:0

C14:0

C16:0

C18:0

C18:1

TG

AGL

Figura 3.11: Comparacin de los porcentajes de cidos grasos en la fraccin triglicrica y la de los AGL para los quesos elaborados en OTOO. A) 15 das de maduracin; B) 150 das de maduracin

165

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

Figura : Comparacin de los porcentajes de cidos grasos en la fraccin triglicrica y la de A) los AGL para los quesos elaborados en OTOO. A) 15 das de maduracin; B) 150 das de maduracin
30 25 20

%
15 10 5 0 C4:0 C6:0 C8:0 C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1

B)

30 25 20

%
15 10 5 0 C4:0 C6:0 C8:0 C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1

TG

AGL

Figura 3.12: Comparacin de los porcentajes de cidos grasos en la fraccin triglicrica y la de los AGL para los quesos elaborados en INVIERNO. A) 15 das de maduracin; B) 150 das de maduracin

166

Lipolisis en queso Manchego

Resultados y Discusin

Con el transcurso de la maduracin, los cidos grasos de cadena corta aumentaron en la fraccin de los AGL. El cido butrico experiment la variacin ms notable con la maduracin, llegando a invertirse su proporcin en ambas fracciones entre los 15 y los 150 das de maduracin.

Todo esto podra ser debido, como se ha comentado anteriormente a que, por un lado, las lipasas hidrolizan preferentemente residuos de cidos grasos esterificados en las posiciones 1 y 3 del triglicrido, y son los cidos grasos de cadena corta los que se encuentran esterificados predominantemente en estas posiciones (De la Fuente et al., 1993), por ello se van liberando al medio, y por otro lado, a que los cidos grasos de cadena larga son ms susceptibles de ser reincorporados a los triglicridos mediante la sntesis de steres catalizada por lipasas (Sousa y Malcata, 1997).En el caso de las muestras de queso fabricadas en invierno se observ el mismo comportamiento (Figura 3.12).

Estos resultados son coincidentes con los encontrados por De la Fuente et al. (1993) para queso Manchego conservado en aceite de oliva, en el que los cidos grasos de cadena corta fueron ms abundantes en la fraccin de los AGL que en la de los triglicridos.

167

Lipolisis en queso Manchego

Conclusiones

3.4. CONCLUSIONES
1. La lipolisis experimentada por las muestras de queso Manchego no fue muy intensa, tal y como era de esperar para esta variedad de queso.

2. El perfil de AGL en las muestras de queso Manchego analizadas fue tpico de los quesos de oveja. Los AGL mayoritarios encontrados fueron, segn la longitud de la cadena hidrocarbonada y de su grado de saturacin, el butrico (C4:0) saturado de cadena corta, con porcentajes del 1 al 7% del total, el mirstico (C14:0), saturado de cadena media, con porcentajes entre el 9 y el 12% del total, el palmtico (C16:0), saturado de cadena larga, entre el 26 y el 33% y el oleico (C18:1), insaturado de cadena larga, entre el 23 y el 34% del total de AGL.

3. En general, se observ una tendencia al aumento de los AGL conforme avanzaba el tiempo de maduracin. Este aumento fue mucho ms acusado para los AGL de cadena corta (C4:0, C6:0 y C8:0), los cuales llegaron, en algunos casos, a triplicar su concentracin desde el inicio (15 das) hasta el final del perodo de maduracin (150 das).

4. Los AGL de cadena corta mostraron una buena correlacin con el tiempo de maduracin (coeficientes de correlacin R2 superiores a 0,8), por lo que podran ser utilizados a la hora de establecer ndices de maduracin segn el contenido en AGL.

5. En general, el lote de quesos Manchegos elaborados en primavera present las mayores concentraciones de AGL totales durante el perodo de maduracin estudiado, seguido por el lote de invierno. El lote de quesos con menor contenido en AGL totales fue el elaborado en otoo. La leche de partida con un mayor contenido en grasa total fue la del lote de otoo, con lo cual parece ser que este parmetro no afecta de forma significativa al grado de lipolisis experimentada por los quesos. El distinto grado de lipolisis podra ser debido a diferencias en la actividad lipsica, o a diferencias en la manipulacin de la cuajada en cada caso, ya que los quesos fueron elaborados a escala semiindustrial.

169

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

6. Segn los resultados del ANOVA, los quesos Manchegos elaborados en invierno tuvieron contenidos significativamente mayores de AGL de cadena corta que el resto (p<0,05), mientras que los de primavera, presentaron las mayores cantidades de AGL de cadena larga (p<0,05).

7. El Anlisis de Componentes Principales de las muestras de queso de cada uno de los tres lotes por separado puso de manifiesto que, en general, a partir de los 45-60 das de maduracin, los quesos experimentaron un aumento en su contenido en AGL de cadena corta. Esto sera importante a considerar si se tiene en cuenta que los quesos Manchegos de D. O. slo pueden salir al mercado con un tiempo mnimo de maduracin de 60 das, con lo cual, a partir de ese momento probablemente poseeran cantidades considerables de AGL de cadena corta que, como ya se ha comentado anteriormente, influyen de forma significativa en el aroma y en el sabor del queso.

8. El anlisis de Componentes Principales de los datos de concentracin de AGL de los tres lotes en conjunto corrobor los resultados del ANOVA y puso de manifiesto que existen diferencias entre los quesos de primavera, otoo e invierno, fundamentalmente en cuanto a su contenido en AGL de cadena corta y larga. El lote de primavera present las menores concentraciones en AGL de cadena corta y las ms altas para los de cadena larga; el lote de otoo present concentraciones intermedias de estos cidos, y el lote elaborado con leche de invierno tuvo las mayores concentraciones de AGL de cadena corta y los contenidos ms bajos en AGL de cadena larga.

9. Los cidos grasos mayoritarios encontrados en la fraccin de los triglicridos fueron los mismos que los de la fraccin de AGL, si bien los cidos grasos de cadena corta fueron, al principio de la maduracin, algo ms abundantes en la fraccin de los triglicridos, y con el transcurso de la maduracin se fueron liberando hasta alcanzar proporciones iguales o incluso mayores en algunos casos, en la fraccin de AGL que en la de los triglicridos.

170

Lipolisis en queso Manchego

Bibliografa

3.5. BIBLIOGRAFA

-Albrecht, T. W. y Jaynes, H. O. (1955). Milk lipases. Journal of Dairy Science 38, 137144.

-Anifantakis, E. M. (1986). Comparison of the physico-chemical propperties of ewes and cows milk. Federacin Internacional de Lechera 202, 42-53.

-Anon (1991). Determination of free fatty acids in milk and milk products. FIL-IDF Standard 265. International Dairy Federation, Brussels.

-Bills, D. D., Scanlan, R. A., Lindsay, R. C. y Sather, L. (1969). Free fatty acids and the flavour of dairy products. Journal of Dairy Science 52, 1340-1345.

-Brennaud, C., Ha, J. K. y Lindsay, R. C. (1989). Journal of Sensory Studies, 4, 105-120.

-Contarini, G. y Topino, P. M. (1995). Lipolysis in Gorgonzola cheese during ripening. International Dairy Journal 5, 141-155.

-De la Fuente, M. A. y Jurez, M. (1993). Revisin: Determinacin de cidos grasos libres en productos lcteos. Revista Espaola de Ciencia y Tecnologa de Alimentos 33, 247-269.

-De la Fuente, M. A., Fontecha, J. y Jurez, M. (1993). Fatty acid composition of the triglyceride and free fatty acid fractions in different cow-, ewe- and goat-milk cheeses. Zeitschift Lebensmittel Untersuchung Forschung 196, 155-158.

-Deeth, H. C. y Fiztgerald, C. H. (1976). Lipolysis in dairy products: a review. Australian Journal of Dairy Technology June, 53-61.

171

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

-Driessen, F. M. (1989). Heat inactivation of lipases and proteinases (indigenous and bacterial), in: Heat-induced changes in milk, Bulletin 238, International Dairy Federation, Brussels.

-El Soda, M., El-Wahab, H. A., Ezzat, N., Desmazeaud, M. J. y Ismail, A. (1986). The esterolytic and lipolytic activities of the lactobacilli. II. Detection of esterase system of Lactobacillus helveticus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus lactis and Lactobacillus acidophilus. Lait 66, 431.

-Fernndez-Garca, E., Ramos, M., Polo, C., Jurez, M. y Olano, A. (1988). Enzyme accelerated ripening of Spanish hard cheese. Food Chemistry, 28, 63-80.

-Forss, D. A. (1979). Review of the progress of dairy science: Mechanisms of formation of aroma compounds in milk and milk products. Journal of Dairy Research, 46, 691-706.

-Galvano, G. y Scena, V. (1984). Research on the milk of domestic rumiants. 1. Considerations and comparisons of fatty acids of the lipidic fraction of the milk of sheeps, goats, cows and buffaloes. World Reviews of Animal Production XX, 71-79.

-Garca-Ruiz, A. (1996). Estudio estadstico para predecir el tiempo de maduracin del queso Manchego e identificacin de la microbiota. Tesis Doctoral. Universidad de Castilla-La Mancha, Ciudad Real.

-Gatusso, A. M. y Fazio, G. (1980). Characteristics and composition of milk fat from sheep of Sicilian breeds. Rivista Italiana delle Sostanze Grasse 57, 530-535.

-Gmez, R., Fernndez-Salguero, J. y Marcos, A. (1987). Composicin en cidos grasos libres y combinados de algunas variedades de quesos comerciales. Grasas y Aceites 38, 23-26.

172

Lipolisis en queso Manchego

Bibliografa

-Gonzlez de Llano, D. y Ramos, M. (1989). Composicin qumica de la leche de oveja. Ovis 2, 9-19.

-Jurez, M., De la Fuente, M. A. y Fontecha, J. (1992). Improved gas chromatographic method for the determination of the individual free fatty acids in cheese using a capillary collumn and PTV inyector. Chromatographia 33, 351-356.

-Jurez, M., Alonso, L. y Ramos, M. (1983). Lipolisis y proteolisis del queso de Cabrales durante la maduracin. Revista de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos 23, 541-551.

-Jurez, M., Martnez-Castro, I. y Ramos, M. (1980). Composicin en cidos grasos de quesos Manchegos conservados en aceite. Proceeding 3er Congreso Nacional de Qumica. Sevilla. Qumica y Tecnologa de Alimentos, 179-185.

-Law, B. A. y Sharpe, M. E. (1977). The influence of the microflora of Cheddar cheese on flavour development. Dairy Industries International 42, 10-14.

-Lowenstein, M., Stephen, J. S., Harold, M. B. y Frank, J. F. (1980). Research on goat milk: a review. Journal of Dairy Science 63, 1631-1636.

-Luquet, F. M. (1991). Leche de oveja: Composicin y propiedades. Leche y productos lcteos: vaca, oveja y cabra, parte II. Ed. Acribia (Zaragoza).

-Macedo, A. C. y Malcata, F. X. (1996). Changes in the major free fatty acids in Serra cheese throughout ripening. International Dairy Journal 6, 1087-1097.

-Metcalfe, L. D. y Wang, C. N. (1981). Rapid preparation of fatty acid methyl esters using organic base-catalyzed transesterification. Journal of Chromattography Science 19, 530-535.

173

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

-Njera, A. I., Barrn, L. J. R. y Barcina, Y. (1993). Review: Lipid fraction composition of cows, sheeps and goats cheese, and the influence on its quality. Revista Espaola de Ciencia y Tecnologa de Alimentos 33, 345-363.

-Njera, A. I., Barrn, L. J. R. y Barcina, Y. (1994). Changes in free fatty acids during the ripening of Idiazbal cheese:influence of brining time and smoking. Journal of Dairy Research 61, 281-288.

-Nakae, T. y Elliot, J. A. (1965a). Volatile fatty acids produced by some lactic acid bacteria. I. Factors influencing production of volatile fatty acids from casein hidrolisate. Journal of Dairy Science 48, 287-291.

-Nakae, T. y Elliot, J. A. (1965b). Volatile fatty acids produced by some lactic acid bacteria. II. Selective formation of fatty acids by degradation of amino acids. Journal of Dairy Science 48, 293-297.

-Nez, M., Gaya., P., Medina, M., Rodrguez-Marn, M. A. y Garca-Aser, C. (1986a). Changes in microbiological, chemical, rheological and sensory characteristics during ripening of vacuum packaged Manchego cheese. Journal of Food Science 51, 1451-1455.

-Nez, M., Garca-Aser, C., Rodrguez-Marn, M. A, Medina, M. y Gaya, P. (1986b). The effect of ripening and cooking temperatures on proteolysis and lipolysis in Manchego cheese. Food Chemistry 21, 115-123.

-Olivecrona, T. y Bengtsson-Olivecrona, G. (1991). Indigenous enzymes in milk: Lipase. Food Enzymology, vol.1, P. F. Fox (ed.), Elsevier Applied Science, London.

-Olmedo, G. R. y Coll-Helln, L. (1976). Contribucin al estudio de la grasa de leche de ovejas espaolas. Anales de Bromatologa 38, 211-340.

174

Lipolisis en queso Manchego

Bibliografa

-Ordez, J. A. (1987). Aspectos microbiolgicos y bioqumicos de la maduracin del queso. Industrias Lcteas Espaolas 106, 48-51.

-Otherholm, A., Ordal, Z. J. y Witter, L. D. (1976). Glycerol ester hydrolase activity of Propionibacterium shermanii. Journal of Dairy Science 53, 592.

-Rafecas, M., Boatella, J. y De la Torre, M. C. (1985). Determinacin y evolucin de los cidos grasos libres y totales durante la maduracin de un queso tipo Parmesano. Anales de Bromatologa 37, 229-241.

-Ramos, M. y Martnez-Castro, I. (1976). tude de la protolyse du fromage type Manchego au cours de laffinage. Lait 56, 164-176.

-Routaboul, M. (1981). Communic. Inter. Lab. Societ des Caves. Roquefort, 1981.

-Sorhaug, T. y Stepaniak, L. (1977). Psychrotrophs and their enzymes in milk and dairy products: Quality aspects. Trends in Food Science and Technology 8, 35-41.

-Sousa, M. J. y Malcata, F. X. (1997). Ripening of ovine milk cheeses: effects of plant rennet, pasteurization and addition of stater on lipolysis. Food Chemistry 427432.

-Sousa, M. J., Balao, V. M. y Malcata, F. X. (1997). Evolution of free fatty acid profile during ripening in cheeses manufactured from bovine, ovine and caprine milks with extracts of Cynara cardunculus as coagulant. Zeitschift Lebensmittel Untersuchung Forschung A 205, 104-107.

-SPSS for Windows (1999). Version 9.0.1.

-Stadhouders, J. y Veringa, H. A. (1973). Fat hydrolysis by lactic acid bacteria in cheese. Netherland Milk Dairy Journal 27, 77-91.

175

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

-Virgili, R., Parolari, G., Bolzoni, L., Barbieri, G., Mangia, A., Careri, M., Spagnoli, S., Panari, G. y Zannoni, M. (1994). Sensory-chemical relationships in ParmigianoRegiano cheese. Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie 27, 491-495.

-Walstra, P. y Jennes, R. (1984). Qumica y Fsica Lactolgica. Ed. Acribia, Zaragoza.

-Woo, A. H., Kollodge, S. y Lindsay, R. C. (1984). Quantification of major free fatty acids in several cheese varieties. Journal of Dairy Science 67, 960-968.

176

CAPTULO 4

ESTUDIO DE LA UTILIZACIN DE DISTINTOS CULTIVOS INICIADORES EN EL QUESO MANCHEGO. USO DE Lactobacillus plantarum COMO CULTIVO ADJUNTO DEL starter.

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Introduccin

4.1. INTRODUCCIN: ESTADO ACTUAL DEL TEMA

La leche constituye un sistema fsico-qumico muy complejo. Es una mezcla de sustancias en equilibrio definidas: lactosa, glicridos de los cidos grasos, casenas, albminas, sales, etc. Es uno de los alimentos de mayor valor biolgico, y por lo tanto, de gran utilidad para la alimentacin humana y animal. Pero por otro lado, debido a su riqueza en nutrientes, al pH que posee la leche fresca (en torno a 6,6) y a la temperatura de ordeo (37 C), constituye un medio ideal para el desarrollo y multiplicacin de los microorganismos.

Incluso aunque el animal est sano, existen siempre bacterias banales que contaminan la leche en el momento del ordeo. Y si adems el animal est enfermo, los microrganismos pueden alcanzar el interior de la ubre por va endgena (debido a la presencia o a la actuacin de microorganismos como Mycobacterium tuberculosis, Brucella, etc). Pero es fundamentalmente durante el ordeo cuando se dan las principales fuentes de contaminacin de la misma: a travs del equipo de ordeo y utillaje, del aire y por medio del personal.

La actividad de algunos microorganismos que contaminan la leche es beneficiosa para el hombre ya que participa activamente en los cambios fsicos, qumicos y organolpticos que experimenta la leche durante la preparacin de los diversos productos lcteos. Por otro lado, la actividad microbiana incontrolada es perjudicial y da lugar a la alteracin de la misma.

En diversos pases los quesos pueden ser elaborados tanto con leche cruda como con leche pasteurizada. La pasteurizacin de la leche a 65 C durante 30 minutos o a 72C/15-17s, destruye los microorganismos patgenos, contaminantes y algunos otros microorganismos que pueden producir algn tipo de defecto en la fabricacin del queso. Se suelen denominar quesos artesanales los elaborados con leche cruda e industriales los fabricados con leche pasteurizada.

179

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

Hoy en da todava existen variedades de quesos que se elaboran artesanalmente; la microbiota de estos quesos puede llegar a ser muy compleja e incluir numerosas especies bacterianas. Sin embargo, la mayora de los quesos elaborados actualmente se fabrican de forma industrial, es decir, con leche pasteurizada, ya que se controla mejor la acidez, se asegura una mayor uniformidad del producto y se mejoran las condiciones sanitarias en la fabricacin. Sin embargo, muchos fabricantes de queso, consideran que los quesos elaborados con leche cruda dan lugar a productos con un aroma y un sabor ms intenso.

Cuando la leche se somete a un tratamiento trmico la flora lctica es destruda, y como estas bacterias desempean un papel esencial en la elaboracin de los quesos y de los distintos productos lcteos, es imprescindible aadir a la leche cultivos iniciadores o starters.

En la fabricacin de la mayora de las variedades de queso, se aaden a la leche, antes de la coagulacin, cepas de diferentes especies de bacterias lcticas cuidadosamente seleccionadas. Estas cepas se denominan cultivos iniciadores o starters, y se definen como cultivos de una o varias cepas, pertenecientes a una o varias especies de bacterias deseables, que se utilizan para inocular la leche pasteurizada, fundamentalmente con el objeto de iniciar la fermentacin. Su funcin principal es la produccin de cido lctico y, en algunos casos, la produccin de compuestos responsables del sabor, como cido actico, acetaldehido y diacetilo. La produccin de cido tiene, por tanto, tres funciones importantes: favorece la actividad del cuajo, ayuda al desuerado de la cuajada, reduciendo as el contenido en humedad del queso, y ayuda a prevenir el crecimiento de bacterias indeseables en el queso. Estos cultivos se denominan iniciadores o starters porque son los que inician la produccin de cido.

Teniendo en cuenta las funciones de un cultivo iniciador, la eleccin de las cepas que lo forman ha de llevarse a cabo siguiendo unos criterios de aptitud tecnolgica y organolptica, como son: su capacidad acidificante, la capacidad de producir compuestos responsables del aroma, capacidad de degradacin de las protenas (actividad proteoltica), temperatura ptima de crecimiento, comportamiento en asociacin con otras especies microbianas, y en algunos casos, la actividad lipoltica.

180

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Introduccin

El grupo de las bacterias lcticas sensu stricto est constitudo por los siguientes gneros: 1. Bacterias en forma de coco: Streptococcus, Lactococcus, Vagococcus, Enterococcus, Pediococcus, Aerococcus, Tetragenococcus, Leuconostoc y Atopobium. 2. Bacterias en forma de bacilo: Lactobacillus y Carnobacterium. 3. Otros gneros afines: Bifidobacterium, Micrococcus, Brevibacterium y

Propionibacterium.

De estos gneros de bacterias lcticas los ms utilizados en la industria lctea como cultivos iniciadores o starters pertenecen a los gneros: Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus y Leuconostoc. Todas las bacterias lcticas empleadas en quesera como cultivos iniciadores son Gram-positivas, catalasa-negativas, inmviles y no formadoras de esporas.

Los lactococos son clulas en forma de coco dispuestas en cadenas de longitud variable. Poseen un metabolismo homofermentativo, produciendo exclusivamente cido L-lctico a partir de la lactosa. Su temperatura ptima de crecimiento es de 30 C. Las especies de lactococos ms comnmente encontradas en la leche son: Lactococcus lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. cremoris y Lc. raffinolactis. Clasificaciones anteriores distinguan Streptococcus diacetylactis, capaz de fermentar el citrato y producir diacetilo, pero actualmente este microorganismo no se diferencia de Lc. lactis subsp. lactis (Mundt, 1986).

Los lactococos se aaden para formar parte de los cultivos iniciadores. Constituyen la flora predominante al principio de la maduracin en la mayora de los quesos (con recuentos superiores a 109 ufc/g) y aseguran la transformacin de la lactosa residual en cido lctico. Algunas especies producen adems pequeas cantidades de compuestos secundarios (acetaldehido, etanol, cido actico, etc.) que contribuyen al aroma del queso. La biovariedad diacetylactis es el origen de la formacin de diacetilo por degradacin del citrato y tambin produce cantidades importantes de acetaldehido. Pero su presencia en una gran proporcin en los cultivos starters puede ser responsable de defectos en el aroma.

181

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

Los lactococos estn dotados de un sistema proteoltico complejo y, por ello, son los principales agentes proteolticos en los quesos de pasta prensada tipo Cheddar, Gouda o Saint-Paulin. Debido a su riqueza en enzimas proteolticos, los lactococos intervienen en la degradacin de las casenas, principalmente por sus proteasas de pared y por sus diferentes peptidasas intracelulares o unidas a las envolturas (Monnet et al., 1993; Pritchard y Coolbear, 1993).

As, los lactococos completan la accin del cuajo, liberando pptidos de pequeo tamao y aminocidos libres (Desmazeaud y Gripon, 1977), los cuales son el origen de compuestos que intervienen directamente en el sabor de los quesos o constituyen precursores de los aromas.

Por otro lado, las proteasas de pared de los lactococos pueden conducir a la aparicin de defectos de amargor, debido a la liberacin de pptidos cortos apolares. Esto es por lo que las investigaciones han ido dirigidas a la caracterizacin de diferentes cepas con actividades X-prolil-dipeptidil-aminopeptidasa, que pueden degradar ciertos pptidos amargos ricos en residuos prolil (Monnet et al., 1993).

Los leuconostoc son clulas con forma esfrica o lenticular dispuestas en pares y en cadenas y se encuentran comnmente en cultivos mesfilos. Por tanto, pueden ser confundidos con los lactococos y con lactobacilos heterofermentativos. Se diferencian de los lactococos en dos aspectos fundamentales: (1) fermentan los azcares de forma heterofermentativa, produciendo cantidades equimolares de lactato, etanol y CO2; (2) producen el ismero D del lactato ms que el L. Las especies de leuconostoc que ms comnmente se encuentran asociadas a la leche, y por tanto, al queso, son: Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, Ln. mesenteroides subsp. dextranicum, Ln. mesenteroides subsp. cremoris, Ln. paramesenteroides y Ln. lactis. Los leuconostoc se presentan en los quesos en un nmero variable (entre 103 y 104 ufc/g) y son abundantes sobre todo en los quesos de leche cruda (Devoyod y Poullain, 1988).

182

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Introduccin

Al ser bacterias heterofermentativas, producen etanol, cido actico y diacetilo, contribuyendo de forma importante a la formacin del aroma. Debido tambin a la produccin de CO2, participan en la abertura precoz del queso Roquefort (48 primeras horas), facilitando as la implantacin regular del Penicillium roqueforti (Devoyod y Muller, 1969). Tambin su presencia es deseable en el queso Manchego por la produccin de los pequeos ojos caractersticos de su pasta, por lo que en algunos casos han sido incluidos en la composicin del starter (Ramos et al., 1981; Gmez et al., 1999).

Las principales funciones de este gnero de bacterias son: cierta produccin de cido, contribucin a la proteolisis y a la lipolisis, y produccin de gas y de compuestos del aroma. En lo que concierne a la produccin de cido, a excepcin de Leuconostoc lactis, que es capaz de acidificar la leche, las otras especies de Leuconostoc no acidifican la leche ms que muy lentamente. Esta es la razn principal por la que los leuconostoc son siempre utilizados en cultivos iniciadores mixtos junto con bacterias lcticas acidificantes, principalmente con lactococos (Johansen y Kibenich, 1992).

Los leuconostoc son utilizados generalmente para producir compuestos aromticos como diacetilo y acetona. As, a veces se incluyen en los cultivos iniciadores, especies de leuconostoc productores de aroma, como Ln. mesenteroides, Ln. dextranicum y/o Ln. lactis. Adems la utilizacin de los leuconostoc, fundamentalmente la especie Ln. mesenteroides subsp. cremoris en presencia de Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis evita una produccin excesiva de acetaldehido.

Los lactobacilos son clulas con forma de bacilo o bastn que pueden ser largos y delgados, o cortos, y normalmente aparecen dispuestos en forma de cadenas. Este gnero se divide en tres grupos: homofermentativos obligados o estrictos, heterofermentativos facultativos y heterofermentativos obligados. Los homofermentativos obligados fermentan las hexosas exclusivamente por la va glicoltica, es decir, homofermentativamente a DL-, L- y/o D-lactato. Este grupo incluye todos los lactobacilos termfilos que forman parte de cultivos starters: Lb. helveticus, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus y Lb. delbrueckii subsp. lactis. Los lactobacilos heterofermentativos facultativos fermentan

homofermentativamente las hexosas a lactato, y de forma heterofermentativa, las pentosas

183

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

y el gluconato a lactato y acetato. En este grupo se encuentran algunas de las especies presentes en cultivos iniciadores artesanales y en quesos maduros: Lb. casei, Lb. paracasei, Lb. plantarum y Lb. curvatus. Generalmente se les conoce con el nombre de bacterias lcticas no starter (non starter lactic acid bacteria, NSLAB) o lactobacilos mesfilos. El grupo de los heterofermentativos obligados fermentan los azcares de forma heterofermentativa produciendo concentraciones equimolares de lactato, etanol y CO2. Tambin pueden producir pequeas cantidades de acetato. Generalmente, las especies de este grupo producen NH3 a partir de la arginina. Las especies de lactobacilos pertenecientes a este grupo son Lb. brevis y Lb. fermentum, que tambin se consideran como NSLAB.

Los lactobacilos son especialmente abundantes en los quesos de pasta cocida, donde se utilizan formando parte del starter como especies termfilas heterofermentativas. La primera funcin que realizan es la acidificacin, que favorece la sinresis. De esta forma, se obtiene un extracto seco suficientemente elevado y un valor de pH suficientemente bajo como para que el queso pueda experimentar un perodo largo de maduracin (Accolas et al., 1980). El cido lctico producido es utilizado a continuacin por las bacterias propinicas.

La segunda funcin que realizan los lactobacilos es contribuir a las caractersticas sensoriales del producto obtenido. Las clulas bacterianas van a liberar proteasas y peptidasas que participarn en la maduracin, junto con la plasmina, en el caso de los quesos de pasta cocida. En efecto, los lactobacilos termfilos poseen un sistema proteoltico importante (El Soda y Desmazeaud, 1982) anlogo al de los lactococos, con actividades peptidsicas elevadas que se traducen, al final de la maduracin, en proporciones considerables de pptidos pequeos y aminocidos libres.

En todos los quesos, los lactobacilos mesfilos homofermentativos Lb. plantarum y Lb. casei estn presentes en un nmero considerable y se desarrollan activamente en el transcurso de la maduracin. Debido a que poseen actividad proteoltica y peptidsica (El Soda et al., 1978; El Soda et al., 1983) y lipoltica (El Soda et al., 1986), estos microorganismos intervienen en el afinado de los quesos y participan en la formacin del

184

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Introduccin

aroma, si bien an no se conoce su papel de forma precisa (Khalid y Marth, 1990; Peterson y Marshall, 1990).

4.1.1. Cultivos iniciadores o starters

Los cultivos que se emplean como starters se dividen en cultivos mesfilos (con una temperatura ptima de crecimiento en torno a 30 C), y termfilos (con una temperatura ptima alrededor de 42 C). Cada uno de estos grupos se puede subdividir a su vez en cultivos de cepas definidas y cultivos mixtos.

Los cultivos de cepas definidas son cultivos puros, cuyas caractersticas fisiolgicas son conocidas y estn identificadas. Estas cepas son aisladas

fundamentalmente de cultivos mixtos, pero tambin de productos fermentados por las bacterias lcticas de la flora nativa y de plantas. Antes de ser utilizadas comercialmente, se estudian sus propiedades tecnolgicas ms importantes, como la tolerancia a la sal, y la habilidad para crecer y producir cido lctico en la leche, resistir el ataque de bacterifagos, utilizar el citrato y producir queso de buena calidad.

Los cultivos mixtos contienen un nmero desconocido de cepas de la misma especie. Tambin suelen contener bacterias de diferentes gneros dentro de las bacterias lcticas, como especies de Lactococcus y Leuconostoc en el caso de los cultivos mixtos mesfilos, y especies de Streptococcus y de Lactobacillus en el caso de cultivos mixtos termfilos. Los cultivos mixtos suelen utilizarse por fabricantes a pequea escala, mientras que los cultivos definidos se utilizan en grandes plantas queseras.

La especies de Lactococcus utilizadas como starters ms comnmente encontradas en cultivos mixtos son Lactococcus lactis subsp. cremoris y Lc. lactis subsp. lactis y su funcin ya se ha comentado anteriormente. Tambin muchos cultivos que se utilizan como starters contienen en su formulacin cepas de especies de Leuconostoc, ya que muchas de ellas son capaces de metabolizar el citrato y producir CO2 y compuestos aromticos.

185

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

En los quesos elaborados con leche cruda, la produccin de cido lctico es a menudo impredecible, y como la microbiota de la leche es muy heterognea, a menudo se produce el desarrollo de microbiota indeseable, lo cual da lugar a la produccin incontrolada de gas y a la aparicin de sabores anormales e indeseables en el queso. Por estas razones, la adicin de un cultivo starter a la leche pasteurizada se ha convertido en una prctica universal. Sin embargo, se sabe que la pasteurizacin afecta de forma negativa a la calidad e intensidad del sabor y del aroma de algunos quesos, como el Manchego (Gaya et al., 1990), ya que elimina en parte algunos de los sabores tpicos del queso. Los cambios producidos en la leche debidos a la pasteurizacin incluyen la inactivacin de enzimas, una ligera desnaturalizacin de las protenas del suero y la destruccin de la microbiota termolbil. Segn McSweeney et al. (1993), en un estudio realizado en queso Cheddar, la alteracin de la microbiota de la leche, principalmente de las NSLAB, causada por la pasteurizacin, es probablemente el factor que afecta de una manera ms significativa al proceso de maduracin. Segn Gaya et al. (1990), para que un queso Manchego fabricado con leche pasteurizada adquiriera la misma intensidad del sabor y del aroma que un queso Manchego elaborado con leche cruda y madurado durante 60 das, necesitara ser madurado durante 92 das, a la misma temperatura.

Por otro lado, el hecho de que el queso elaborado con leche cruda desarrolla un sabor ms intenso que el de leche pasteurizada (Gaya et al., 1990; Lau et al., 1991) ha provocado un creciente inters en la adicin de NSLAB como adjuntos del cultivo starter a la leche pasteurizada en la elaboracin de queso (Peterson y Marshall, 1990; McSweeney et al., 1993; Lane y Fox, 1996; Lynch et al., 1996; Gmez et al., 1996a, Lynch et al., 1997). Estas bacterias son fundamentalmente cepas seleccionadas de especies de lactobacilos mesfilos. La razn de su adicin como cultivos adjuntos del starter radica en que estas bacterias se han encontrado en elevados recuentos en el queso maduro (en torno a 108 ufc/g), y se piensa, por tanto, que deben de tener alguna funcin. Sin embargo y aunque se ha investigado extensamente sobre este tema en las ltimas dcadas, el papel de estas bacterias en el desarrollo del sabor del queso no est del todo establecido. Estudios realizados en quesos Cheddar (McSweeney et al., 1993) y Comt (Bouton y Grappin, 1995) elaborados con leche cruda y pasteurizada han demostrado que la microbiota nativa de la leche (fundamentalmente NSLAB) es la principal responsable de

186

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Introduccin

las diferencias en las caractersticas entre los quesos de leche cruda y pasteurizada. Estos autores comprobaron que los elevados recuentos de NSLAB encontrados en queso de leche cruda durante la maduracin causaban un aumento en la intensidad del sabor y del aroma y una ligera aceleracin de la proteolisis (especialmente a nivel de la formacin de aminocidos libres). Recientemente se est incluyendo el uso de NSLAB en el cultivo iniciador para la fabricacin del queso, sobre todo en el queso Cheddar. La adicin de cepas definidas de lactobacilos mesfilos como adjuntos de las cepas de Lactococcus utilizados como starter a la leche pasteurizada, como una alternativa al uso de leche cruda, contribuye a la maduracin del queso (Lane y Fox, 1996; Peterson y Marshall, 1990), acelera la formacin de aminocidos libres (Lynch et al., 1996; Fox et al., 1998) intensifica el sabor y el aroma (Muir et al., 1996) y reduce la acumulacin de pptidos amargos en el queso (Bartels et al, 1987; Lemieux et al., 1989; Gmez et al., 1996b).

Debido a las condiciones que se dan durante la maduracin, el interior del queso es un medio hostil para el desarrollo de bacterias. Presenta un pH relativamente bajo (en torno a 5), posee un contenido en sal relativamente alto (2-4%), carece de hidratos de carbono fermentables, es un medio anaerbico y puede contener bacteriocinas producidas por las bacterias del starter. Por todo esto, el queso es un medio altamente selectivo y la microbiota no starter est dominada principalmente por algunas especies de lactobacilos mesfilos (Lb. casei, Lb. paracasei, Lb. plantarum y Lb. curvatus).

Las NSLAB crecen y se desarrollan desde recuentos iniciales muy bajos (<50 ufc/g) hasta aproximadamente 107-108 ufc/g en tres meses y constituyen la microbiota predominante en quesos madurados durante largos perodos de tiempo.

Muchas cepas pertenecientes a Lb. paracasei y a Lb. plantarum poseen un complejo peptidoltico y pueden, por lo tanto, contribuir a la proteolisis del queso durante la maduracin (Beresford et al., 1998).

En la elaboracin del queso Manchego, la leche es generalmente inoculada con cultivos comerciales mixtos, los cuales estn formados por cepas de Lactococcus lactis

187

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

subsp. lactis, Lc. lactis subsp. cremoris, Lc. lactis subsp. lactis fermentadores del citrato y Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris (Gmez et al., 1999).

En diversos trabajos se ha encontrado la presencia de especies de leuconostoc y de lactobacilos mesfilos durante la maduracin del queso Manchego (Nez, 1976; Nez et al., 1989; Cogan et al., 1997). Ramos et al. (1981) propusieron un cultivo iniciador para la elaboracin de queso Manchego que contena especies de leuconostoc y de lactobacilos. Adems, recientemente se ha estudiado la adicin de bacterias lcticas (lactococos fundamentalmente) aisladas de quesos Manchegos de alta calidad elaborados con leche cruda, a la leche pasteurizada para la fabricacin de esta variedad de queso (Gmez et al., 1999). Sin embargo, no se ha realizado ningn estudio sobre la utilizacin de los lactobacilos como adjuntos del starter en la elaboracin de queso Manchego.

En un estudio previo realizado en este Departamento sobre la identificacin de la microbiota del queso Manchego, Lb. plantarum fue la especie predominante de los 148 aislados (28,89%), seguida de Lb. casei subsp. casei (14,43%), Lc. lactis subsp. lactis (13,40%), Ln. mesenteroides subsp. dextranicum (10,31%) y Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides (10,31%), (Garca et al., 1995). Adems se estudiaron las propiedades tecnolgicas (actividad acidificante y proteoltica) de los distintos aislados (Garca et al., 1997) y en base a estas propiedades se seleccionaron tres cepas pertenecientes a cada uno de los tres gneros de bacterias lcticas Lactococcus, Leuconostoc y Lactobacillus de entre todas las ensayadas.

En el presente estudio se utilizaron estas cepas para fabricar dos lotes de quesos Manchegos, elaborados cada uno con una combinacin diferente de las cepas seleccionadas. Adems se fabric un tercer lote de quesos Manchegos empleando un cultivo iniciador mixto comercial.

188

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Introduccin

Los objetivos perseguidos en este estudio fueron:

1) Estudiar las posibles diferencias existentes entre los distintos lotes de quesos, elaborados con diferentes cultivos iniciadores, fundamentalmente a nivel de la proteolisis primaria y secundaria, estudiando el perfil de pptidos y aminocidos libres, utilizando como herramienta estadstica el Anlisis Multivariante.

2) Investigar los cambios experimentados a lo largo de la maduracin en cada uno de los tres lotes de quesos elaborados con los distintos cultivos iniciadores o starters.

3) Conocer el posible efecto de la utilizacin de Lactobacillus plantarum como adjunto del starter en la elaboracin del queso Manchego y en las caractersticas sensoriales del mismo.

189

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Material y Mtodos

4.2. MATERIAL Y MTODOS

4.2.1. Preparacin de los cultivos

Los microorganismos utilizados en el presente trabajo fueron aislados de quesos Manchegos artesanales de buena calidad (Garca et al., 1995) y seleccionados por sus propiedades tecnolgicas (Garca et al., 1997). Las cepas seleccionadas y utilizadas en la elaboracin de los quesos objeto de este estudio fueron las siguientes: Lactococcus lactis subsp. lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum y Lactobacillus plantarum, las cuales estaban conservadas en congelacin a 20 C en criotubos en caldo MRS con glicerina como agente crioprotector, formando parte de la coleccin de bacterias lcticas del grupo de Productos Lcteos, en el Departamento de Tecnologa de Alimentos. Para su utilizacin como cultivo iniciador se liofilizaron, para lo cual las tres cepas se desarrollaron en medio caldo MRS durante una noche, a 30 C los lactococos y leuconostocs, y a 37 C los lactobacilos. Las clulas se recogieron por centrifugacin (8000 g, 15 min) y se lavaron con agua destilada dos veces para eliminar por completo el medio de cultivo. A continuacin las clulas se resuspendieron en 5 mL de leche lactosada (leche descremada en polvo reconstituda al 10% y adicionada de lactosa al 4%). La suspensin celular se reparti en viales de liofilizacin.

Los cultivos iniciadores se prepararon a partir de las cepas liofilizadas, combinando dichas cepas en las proporciones necesarias para dar lugar a los cultivos iniciadores correspondientes a cada lote, tal y como se describe a continuacin:

Lote 1: Lc. lactis subsp. lactis (80%) + Ln. mesenteroides subsp. dextranicum (20%).

Lote 2: Lc. lactis subsp. lactis (80%) + Ln. mesenteroides subsp. dextranicum (10%) + Lb. plantarum (10%).

Para la elaboracin de los quesos del lote 3 se utiliz un cultivo starter comercial mixto concentrado liofilizado (Ezal, Dang-Saint-Romain, France), compuesto por cepas de Lactococcus lactis y de Streptococcus thermophilus.

191

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

Las cepas liofilizadas correspondientes a los lotes de queso 1 y 2 se inocularon conjuntamente en leche descremada estril a una concentracin final del 1% (aproximadamente 107 ufc/mL). Los cultivos se incubaron a 22 C hasta que se alcanz una acidez correspondiente a un pH entre 4,6-4,7 (aproximadamente 22 h). El cultivo as obtenido se conserv a 4 C durante una noche hasta el momento de su utilizacin.

4.2.2. Elaboracin de los quesos

Se elaboraron tres lotes de quesos, a escala semiindustrial, siguiendo la tecnologa del Manchego en una quesera situada en la provincia de Ciudad Real. Para ello se utilizaron tres cubas con 200 L de leche pura de oveja pasteurizada (65 C/30 min). Posteriormente a la pasteurizacin, la leche se dej enfriar hasta unos 28-30C y se procedi a la inoculacin al 1% con los cultivos iniciadores anteriormente descritos para cada uno de los lotes.

Despus de dejar transcurrir aproximadamente 30 minutos para que se desarrollasen las bacterias lcticas, se aadieron a cada cuba 7,5 g de cuajo (Marschall, fuerza 1/150.000), producindose la coagulacin en 45 min. A continuacin se procedi al corte de la cuajada hasta un tamao de grano aproximadamente de 5 mm. Seguidamente, se recalent la cuajada hasta una temperatura de 38 C durante 10-15 min., para favorecer la sinresis y tras desuerar se llenaron los moldes de plstico con la flor y la pleita impresas, caractersticas del Manchego. Los quesos (de aproximadamente 1Kg de peso cada uno) se prensaron durante 5-6 h a unos 15 C y se salaron por inmersin en salmuera al 20% en NaCl a la misma temperatura durante aproximadamente 22 h. Al cabo de este tiempo, los quesos se transportaron hasta el laboratorio en condiciones de refrigeracin y se introdujeron en una cmara de maduracin a una temperatura de 12 C y con una humedad relativa del 85%, donde fueron madurados durante 15, 30, 45, 60, 90, 120 y 150 das. Cada lote elaborado estuvo constitudo por 21 quesos, destinndose tres quesos iguales para cada una de las fechas de maduracin a estudiar, con lo que el nmero total de quesos analizados fue de 63. Todos los anlisis se realizaron por duplicado.

192

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Material y Mtodos

4.2.3. Preparacin de las muestras para el anlisis

Para realizar los anlisis se tomaron muestras de la leche pasteurizada, antes y despus de la adicin del cultivo iniciador, de las cuajadas elaboradas y de los quesos a los 15, 30, 45, 60, 90, 120 y 150 das de maduracin, para los tres lotes de quesos elaborados.

En el caso de los quesos, para cada una de las fechas de maduracin consideradas y para cada lote, se tomaron de los tres quesos individuales las siguientes muestras:

-una porcin de unos 50 g para el anlisis microbiolgico;

-una cua de unos 250 g de peso, que tras ser desprovista de la corteza (1,5 cm de grosor) se tritur con una picadora elctrica y se homogeneiz. Una vez realizados los anlisis fsico-qumicos inmediatos (pH, Aw y extracto seco) se congel en tarros de cristal de cierre hermtico hasta realizar los posteriores anlisis;

-una porcin correspondiente aproximadamente a medio queso para el anlisis sensorial;

-el resto se utiliz para el anlisis de pptidos y aminocidos.

4.2.4. Anlisis microbiolgico

Se efectuaron recuentos de microorganismos totales, de lactococos, de leuconostoc y de lactobacilos en la leche pasteurizada empleada en la fabricacin, antes y despus de la inoculacin en cada una de las tres cubas, en la cuajada de cada uno de los lotes de quesos fabricados y en los quesos en todas las fechas de maduracin consideradas en este estudio.

4.2.4.1. Preparacin de las muestras para el anlisis microbiolgico

En el caso de la leche se tomaron 10 mL de cada una de las cubas y se homogeneizaron con 90 mL de citrato sdico al 2% (p/v) estril, previamente calentado a 45 C, durante 2 min a intervalos de 30 s en un triturador de palas.

193

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

En el caso de la cuajada se tom una porcin de 10 g y en los quesos una porcin de 3,3 g aproximadamente de cada uno de los tres quesos independientes (para hacer un total de 10 g) correspondientes a cada una de las fechas de maduracin y se homogeneizaron de la misma forma con 90 mL de citrato sdico al 2% (p/v) estril previamente calentado a 45 C.

A partir de los homogeneizados se realizaron las diferentes diluciones decimales en citrato sdico estril al 2%.

4.2.4.2. Recuento de bacterias viables totales

El recuento de bacterias viables totales se realiz en medio PCA (Plate Count Agar) segn las recomendaciones de la APHA (1976). A partir de la dilucin correspondiente, se efectu la siembra en profundidad (por duplicado) en placas de Petri estriles. Una vez solidificado el medio, las placas se incubaron a 30 C durante 72 h.

4.2.4.3. Recuento de lactococos

Se realiz segn Terzaghi y Sandine (1975) en medio agar (Merck, Darmstad, Alemania) LM 17. Se realiz la siembra en superficie de 0,1 mL de la dilucin correspondiente y las placas se incubaron a 30 C durante 48 h. Se contaron las colonias de color blanco con forma lenticular y tamao igual o mayor a 0,5 mm de dimetro.

4.2.4.4. Recuento de leuconostoc

Se realiz por siembra en superficie en agar leuconostoc (ADSA), incubando las placas a 30 C durante 48 h. Se contaron las colonias de aspecto mucoide.

4.2.4.5. Recuento de lactobacilos

Los recuentos de lactobacilos se realizaron en agar Rogosa (Merck, Darmstad, Alemania). Se efectu la siembra en superficie de 0,1 mL de las diluciones

194

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Material y Mtodos

correspondientes y se incubaron las placas a 37 C durante 48-72 h en anaerobiosis (GasPack System, BBL). Se contaron las colonias blancas con forma lenticular con un dimetro igual o mayor a 0,5 mm.

Todos los recuentos se efectuaron en las placas que contenan entre 30 y 300 colonias.

4.2.5. Anlisis fsico-qumicos

Las determinaciones de la actividad del agua (Aw), del pH, del extracto seco (ES), de cloruros, de nitrgeno total (NT) y de nitrgeno proteico (NP) se realizaron segn se ha indicado previamente en el Captulo 2 de esta Memoria.

4.2.6. Estudio de la proteolisis

4.2.6.1. Fraccin de nitrgeno soluble en agua

La obtencin de la fraccin de nitrgeno soluble en agua (NS) est descrita en el Captulo 2 de esta Memoria.

4.2.6.2. Fraccin de nitrgeno soluble en agua a pH 4,6

Se extrajeron las fracciones insoluble y soluble en agua a pH 4,6 de las muestras de queso de los distintos lotes elaborados y en todas las fechas de maduracin. Para ello, una muestra de 50 g queso se mezcl con 100 g de agua y se homogeneiz durante 5 min en un agitador de palas. Se ajust el pH del homogeneizado hasta 4,6 con HCl 1M, se dej reposar durante 30 min a temperatura ambiente y se volvi a ajustar el pH. El homogeneizado resultante se mantuvo a 40 C en bao de agua durante 1h y se centrifug a 3000 g durante 30 min a 4 C. El sobrenadante (fraccin soluble a pH 4,6) se filtr a travs de lana de vidrio y se congel para realizar su posterior fraccionamiento. El precipitado (fraccin insoluble en agua a pH 4,6) se liofiliz para realizar posteriormente la electroforesis en gel de urea-poliacrilamida (Ver apartado 4.2.6.5.).

195

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

4.2.6.3. Fraccin de nitrgeno soluble en etanol al 70%

A 30 mL de la fraccin soluble en agua a pH 4,6 se aadieron 70 mL de etanol absoluto. La mezcla se mantuvo durante 30 min a temperatura ambiente y se centrifug a 3000 g durante 30 min a 20 C. El sobrenadante (fraccin soluble en etanol, que contiene los pptidos de menor tamao y tambin aminocidos libres) se filtr a travs de papel de filtro Whatman n 1 y se le extrajo el etanol en un rotavapor a 30 C a vaco. El precipitado (fraccin insoluble en etanol, que contiene pptidos de mayor tamao) se redisolvi en la mnima cantidad de agua y se liofiliz hasta su posterior anlisis por cromatografa lquida de alta resolucin en fase reversa (RP-HPLC).

4.2.6.4. Fraccin soluble en cido fosfotngstico al 5%

La fraccin soluble en cido fosfotngstico (N-PTA) se prepar como se ha descrito anteriormente (Captulo 2 de esta memoria).

4.2.6.5. Electroforesis en gel de urea-poliacrilamida

Se realiz la electroforesis en gel de urea-poliacrilamida (pH 8,9) de la fraccin insoluble a pH 4,6 del queso. Para ello se sigui el mtodo de Andrews (1983) con las modificaciones descritas por Shalabi y Fox (1987). Se utiliz una cubeta vertical modelo Protean II XI (Biorad). Las concentraciones de acrilamida y bisacrilamida fueron T= 4% y C= 12,5%, siendo T= (g acrilamida + g bisacrilamida)/100; C= g bisacrilamida x 100/%T. La tincin de los geles se realiz con azul de Coomassie brillante G 250, segn el mtodo de Blakesley y Boezi (1977).

-Preparacin de las muestras de casena

Se disolvieron 10 g de las muestras de la fraccin insoluble en agua a pH 4,6 en 1 mL de tampn de la muestra (ver disoluciones stock), calentando a 50 C durante unos minutos.

196

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Material y Mtodos

-Disoluciones stock

1. Disolucin de acrilamida Acrilamida 40% p/v en agua

2. Tampn del gel de concentracin 4,15 g tris-(hidroximetil)-metilamina 192,85 g urea 2,86 mL HCl -Disolver y diluir hasta 500 mL con agua y ajustar el pH a 7,6 con HCl

3. Tampn del gel de separacin 32,15 g tris-(hidroximetil)-metilamina 192,85 g urea 2,86 mL HCl -Disolver y diluir hasta 500 mL con agua y ajustar el pH a 8,9 con HCl

4. Tampn de los electrodos 15 g tris-(hidroximetil)-metilamina 73 g glicina -Disolver y diluir hasta 5 L con agua y ajustar el pH a 8,4 con HCl

5. Tampn de la muestra 1,5 g tris-(hidroximetil)-metilamina 98 g urea 0,8 mL HCl 1,4 mL 2-mercaptoetanol 0,3 g azul de bromofenol -Disolver y diluir hasta 200 mL con agua

6. Persulfato amnico 10% p/v en agua

197

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

7. Solucin de teido Una disolucin acuosa de Azul de Coomassie Brillante G 250 se aade a un volumen igual de H2SO4 y se deja una noche. A continuacin la disolucin se filtra a travs de papel de filtro Whatman n 1 y el filtrado se mezcla con KOH 10 M en la proporcin 9:1. Se aade cido tricloroactico hasta conseguir una disolucin final al 12% p/v en tricloroactico.

-Disoluciones para la preparacin del gel

Estas disoluciones no se preparan hasta el da de la realizacin de la electroforesis.

1. Disolucin del gel de concentracin 5 mL de disolucin de acrilamida 45 mL de tampn del gel de concentracin 0,1 g N, N, N, N-metilenbisacrilamida -Todo esto se mezcla y se filtra a travs de papel de filtro Whatman n 113. Al filtrado se aaden 50 L de N,N N,N-tetrametilndiamina (TEMED).

2. Disolucin del gel de separacin 22,5 mL de disolucin de acrilamida 52,5 mL de tampn de gel de separacin 0,375 g N, N, N, N-metilenbisacrilamida -Se mezcla todo y se filtra a travs de papel de filtro Whatman n 113. Al filtrado se aaden 50 L de TEMED.

-Preparacin del gel

Una vez montado el equipo de electroforesis e inmediatamente antes de su uso, se aadieron 282 L de persulfato amnico al 10% a la disolucin del gel de separacin, para iniciar la polimerizacin. Esta disolucin se deposit entre dos placas de vidrio de 20 x 20 cm, fijadas a la cubeta de electroforesis, y a continuacin se verti una fina capa de agua,

198

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Material y Mtodos

dejando polimerizar completamente el gel (40-60 min). Transcurrido este tiempo se retir cuidadosamente la capa de agua con papel de filtro y se aadieron 300 L de persulfato amnico a la disolucin del gel de concentracin. Se mezcl y se deposit sobre el gel de separacin, introduciendo finalmente un peine formador de pocillos que permite la aplicacin de 15 muestras. Se dej polimerizar el gel de concentracin (aproximadamente 60 min) y posteriormente se retir el peine. El gel se coloc en el equipo de electroforesis, llenando ste con tampn de los electrodos.

-Electroforesis

Primero se aplic a los geles un voltaje de 280 V durante 30-40 min. A continuacin se aplicaron las muestras (caseinato sdico: 8 L, casena ovina: 5 L y las muestras de casena: 11 L). Se utiliz agua fra en recirculacin para la refrigeracin del sistema. La electroforesis se realiz a voltaje constante de 280 V a travs del gel de concentracin y a 300 V a travs del gel de separacin.

-Teido y decoloracin del gel

Los geles se tieron por inmersin en la disolucin de teido durante toda la noche. La decoloracin se efectu cambiando los geles varias veces a un recipiente con agua destilada hasta que el fondo apareci de color claro.

4.2.6.6. Anlisis de los pptidos de las fracciones insoluble y soluble en etanol al 70% por cromatografa lquida de alta resolucin en fase reversa (RP-HPLC)

Se estudi el perfil peptdico de las fracciones insoluble y soluble en etanol al 70%. Para ello se utiliz un equipo Varian (Varian Associates Inc., Walnut Creek, Ca, USA) formado por un colector de muestras (modelo 410), un sistema de distribucin de disolventes con tres bombas (modelo 230), un espectrofotmetro programable ProStar de longitud de onda mltiple (modelo 310), conectados a un ordenador en el que estaba instalado un programa para el control del sistema y adquisicin de datos Varian Star Workstation. Se utiliz una columna analtica Nucleosil RP-8 (250 x 4mm, 5 m de

199

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

tamao de partcula, 300 de tamao de poro) y una precolumna (4,6 x 10 mm) (Capital HPLC Ltd., Broxburn, West Lothian, UK). La elucin se monitoriz a 214 nm utilizando una fase mvil de dos disolventes: A) cido trifluoroactico 0,1% (v/v) (TFA, calidad secuenciacin; Sigma, St. Louis, USA) en agua desionizada calidad HPLC (milli-Q system, Waters Corp.) y B) TFA al 0,1% en acetonitrilo (calidad HPLC, Rathburn Chemicals Ltd., Walkerburn, Escocia). Las muestras liofilizadas de las fracciones insoluble y soluble en etanol se disolvieron en el disolvente A (10 mg/mL), se filtraron a travs de un filtro de acetato de celulosa de 0,45 m (Sartorius GmbH, Gottingen, Alemania) y se inyect una alcuota del filtrado utilizando un flujo de elucin de 0,75 mL/min. El gradiente utilizado empez con 100% de A durante 5 min, continu con un gradiente lineal hasta 50% de A (50% de B) durante 55 min, se mantuvo 50% de A (50% de B) durante 6 min, a continuacin un gradiente lineal hasta 40% de A (60% de B) durante 4 min y se mantuvo 40% de A (60% de B) durante 3 min. La columna se lav con 95% de B (5% de A) durante 5 min y a continuacin se equilibr con 100% de A durante 5 min para proceder a las condiciones iniciales de elucin antes de la siguiente inyeccin. El tiempo total de adquisicin de datos en el cromatograma fue de 70 min.

4.2.6.7. Anlisis de aminocidos libres

Las concentraciones de aminocidos libres se determinaron a partir de la fraccin de nitrgeno soluble en agua a pH 4,6. Para ello se tomaron 10 mL de esta fraccin y se precipitaron los pptidos de alto peso molecular con el mismo volumen de cido tricloroactico al 24%, para conseguir as una concentracin en cido tricloroactico del 12%. Se agit en vortex durante algunos minutos y se mantuvo a temperatura ambiente durante 1 h. A continuacin se centrifug a 13000 g durante 30 minutos y el sobrenadante se diluy con tampn citrato sdico 0,2 M, pH 2,2 para dar aproximadamente 250 nmol de cada residuo de aminocido. Las muestras se diluyeron (1:2) con patrn interno (norleucina, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. USA) para dar 125 nmol de cada residuo de aminocido por volumen de inyeccin, y se filtraron a travs de un filtro de 0,2 m (Gelman, Ltd., Dun Laoire, Dublin, Ireland). Se inyectaron 50 L del filtrado en el analizador. Los aminocidos se separaron mediante cromatografa de intercambio inico con derivatizacin post-columna con ninhidrina y deteccin colorimtrica en el visible,

200

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Material y Mtodos

utilizando un analizador de aminocidos Beckman modelo 6300 (Beckman Instruments Ltd., High Wycombe, UK), equipado con una columna de intercambio catinico de iones Na+ Beckman modelo P-N 338052 (12 cm x 0,4 cm). Los aminocidos se detectaron a 570 nm a excepcin de la prolina, que se detect a 400 nm. Los resultados se recogieron en un sistema de adquisicin de datos Minichrom (VG Data systems, Altrincham, Cheshire, UK).

4.2.7. Anlisis sensorial

Las muestras de quesos fueron evaluadas sensorialmente a partir de los 60 das de maduracin, debido a que este tiempo es el mnimo exigido por el Consejo Regulador de D. O. Manchego para su comercializacin. As, se evaluaron las muestras de 60, 90, 120 y 150 das de maduracin. Para ello se utiliz un panel de cata formado por 10 jueces, los cuales posean experiencia en la evaluacin de diversos tipos de quesos (Gonzlez-Vias et al., 2001a) y del queso Manchego (Gonzlez-Vias et al., 2001b).

4.2.7.1. Anlisis Sensorial Descriptivo (ISO 6564, 1985 y ISO 11036, 1994)

Se realizaron varias sesiones, catndose las muestras de cada fecha de maduracin por duplicado en das consecutivos. A cada juez se le presentaron 3 muestras en cada sesin, a temperatura ambiente, dispuestas al azar. Para todos los atributos las muestras se cortaron en forma de cubo de unos 1,5 cm3 y se dispusieron en platos pequeos, excepto para la evaluacin del aspecto al corte, que se realiz en medio queso. Para la identificacin de las muestras se utilizaron claves de tres dgitos, con dos nmeros y una letra central al azar.

Los atributos a juzgar fueron seleccionados previamente por consenso entre los jueces, los cuales utilizaron algunas referencias para evaluar cada uno de los atributos de acuerdo con las recomendaciones del COST 95 (1999). Para evaluar su intensidad se utilizaron escalas no estructuradas de 10 cm. Finalmente todos los jueces emitieron su impresin global sobre las muestras evaluadas, utilizando una escala hednica no estructurada de 10 cm (0= impresin mala hasta 10= excelente).

201

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

En la Figura 4.1 se presenta el formulario presentado a los catadores para la evaluacin del queso Manchego.

Las pruebas se realizaron en una sala de cata que reuna todas las condiciones especificadas en la Norma ISO 8589 (1988).

4.2.8. Anlisis estadstico

Se aplic el Anlisis de la Varianza (ANOVA) de un factor, utilizando el test de Student-Newman-Keuls (S-N-K) a los valores de composicin fsico-qumica y fracciones nitrogenadas de los tres lotes de quesos elaborados, en las distintas fechas de maduracin estudiadas.

Los perfiles peptdicos de las fracciones de nitrgeno insoluble y soluble en etanol al 70% se analizaron mediante anlisis estadstico multivariante, utilizando el Anlisis de Componentes Principales (ACP) y en algunos casos el Anlisis de Conglomerados o Clusters. Los datos para estos anlisis se obtuvieron reconociendo visualmente picos similares en los cromatogramas y usando la altura de pico como variable, como en Pripp et al. (1999).

A los datos obtenidos para los aminocidos libres se aplic el ACP, el Anlisis de Conglomerados y tambin el Anlisis de correlacin con el tiempo.

El ACP se aplic utilizando la matriz de correlacin y con rotacin Varimax y el Anlisis de Conglomerados se aplic usando como regla de similitud de muestras las distancias eucldeas al cuadrado, y el mtodo de Ward como mtodo de unin de conglomerados.

202

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Material y Mtodos

FORMULARIO EVALUACIN SENSORIAL DEL QUESO MANCHEGO JUEZ:

ASPECTO DEL CORTE:

FECHA:

0 -Coloracin:
Blanco

10
Amarillo intenso

0 -Ojos:
OLOR:
Ninguno

10
Muchos

0 -Intensidad:
Poco intenso

10
Muy intenso

0 -Calidad:
Muy mala

10
Excelente

SENSACIN PERCIBIDA EN LA PRIMERA MORDIDA:

0 -Dureza:
Blando

10
Duro

0 -Fragilidad:
Ninguna

Muchas partculas pequeas a la 1 mordida

10

0 -Elasticidad:
Ninguna

10
Muy elstico

Figura 4.1: Formulario para la evaluacin sensorial del queso Manchego

203

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

SENSACIN PERCIBIDA CUANDO EL QUESO EST LISTO PARA TRAGAR:

0 -Adherencia No se adhiere a los dientes:

10
Se adhiere algo a los dientes pero se desprende fcilmente Muy adherente

-Pastosidad/ Cremosidad:

10

ATRIBUTOS PERCIBIDOS EN CUALQUIER ETAPA Y POR CUALQUIER VA:

-Grasiento:

10

-Con agua:

10

-Picante:

10

-cido:

10

-Salado:

10

-Amargo:

10

IMPRESIN GLOBAL:

0
Mala

10
Excelente

Figura 4.1 (continuacin): Formulario para la evaluacin sensorial del queso Manchego
204

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Material y Mtodos

Todos los tratamientos estadsticos se realizaron usando el programa estadstico SPSS para Windows, Versin 9.0.1.

205

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

4.3. RESULTADOS Y DISCUSIN

4.3.1. Anlisis microbiolgico

Con el objetivo de conocer el comportamiento de las bacterias lcticas utilizadas para fabricar los tres lotes de quesos objeto de este estudio, se realiz el recuento de los diferentes gneros de bacterias lcticas as como de las bacterias viables totales, en la leche pasteurizada empleada en la fabricacin de los quesos (antes y despus de ser inoculada) y en los quesos elaborados madurados hasta los 150 das.

Hay que resaltar que a pesar de que se emplearon medios de cultivo selectivos para cada uno de los gneros de bacterias lcticas, stos no resultaron serlo del todo, por lo que se encontraron algunas dificultades a la hora de efectuar los recuentos de una forma precisa, sobre todo en las primeras fechas de maduracin.

4.3.1.1. Leche

Los recuentos de bacterias viables totales, de lactococos, leuconostocs y lactobacilos en la leche se presentan en la Tabla 4.1.

Tabla 4.1: Recuentos bacterianos (ufc mL1) en la leche utilizada en la elaboracin de quesos Manchegos elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes (lote 1, lote 2 y lote 3).

Leche Microorganismos antes de ser inoculada Lactococos Leuconostocs Lactobacilos Bacterias totales <10 <10 <10 3,8 x 103

Leche inoculada Lote 1 2,8 x 108 3,9 x 108 <10 4 x 108 Lote 2 >3 x 106 >3 x 106 2,7 x 106 4 x 108 Lote 3 2,7 x 108 2,2 x 108 <10 5,1 x 109

207

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

En la leche antes de ser inoculada los recuentos de lactococos, leuconostocs y lactobacilos fueron menores de 10 ufc/mL, y el recuento de bacterias viables totales fue de 3,8 x 103 ufc/mL, lo que refleja la eficacia de la pasteurizacin, que produjo una leche de buena calidad microbiolgica. Cabe destacar que despus de la inoculacin de las leches para los lotes 1 y 3, en los cuales no se aadieron lactobacilos en el cultivo iniciador, los recuentos de stos fueron menores de 10 ufc/mL, mientras que en la leche del lote 2 este valor fue de 2,7 x 106 ufc/mL.

Tambin aparecieron recuentos de leuconostoc en la leche inoculada con el cultivo iniciador 3, el cual no los contena. Esto pudo ser debido probablemente a una contaminacin.

4.3.1.2. Queso

Los recuentos microbianos de lactococos, leuconostocs, lactobacilos y bacterias viables totales, en las muestras pertenecientes a los tres lotes de quesos Manchegos se muestran en la Figura 4.2.

Los recuentos de lactococos en los quesos de los lotes 1, 2 y 3 fueron inmediatamente despus del prensado, alrededor de 108-109 ufc/g, y disminuyeron en aproximadamente 3 ciclos logartmicos a los 150 das. Esta disminucin fue ms acusada para los quesos del lote 3 (elaborados con el cultivo comercial). Esto est de acuerdo con los resultados encontrados por otros autores en estudios previos en queso Cheddar (Martley y Lawrence, 1972; McSweeney et al., 1993) y en queso Gouda (Visser, 1977), los cuales tambin observaron una disminucin progresiva en la poblacin de los lactococos hasta el final de la maduracin.

Los leuconostoc experimentaron un fuerte descenso (entre 3 y 5 unidades logartmicas) en los quesos de los lotes 1 y 2 desde el principio hasta el final de la maduracin. Los quesos del lote 2 mostraron menores recuentos de leuconostocs durante la maduracin que los quesos del lote 1, debido a la menor proporcin a la que haban sido inoculados en la leche de partida.

208

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

Los recuentos de lactobacilos en los quesos del lote 2 (en el cual haban sido aadidos como adjunto del cultivo starter) fueron, inmediatamente despus del prensado, del orden de 106 ufc/g y aumentaron durante la maduracin hasta alcanzar 108 ufc/g desde los 45 das hasta el final de la maduracin. Los quesos de los lotes 1 y 3 presentaron recuentos nulos de lactobacilos slo inmediatamente despus del prensado, alcanzando niveles de hasta 107 y 106 ufc/g, respectivamente, al final de la maduracin. Esto es debido probablemente, a la contaminacin producida posteriormente a la pasteurizacin, procedente de las instalaciones, el ambiente, el personal, utensilios, etc., ya que en ambos lotes no fueron aadidos lactobacilos como parte del cultivo iniciador. Se sabe que la fabricacin de queso en cubas abiertas puede llevar a una interpretacin errnea de los resultados, ya que los lactobacilos de la microbiota nativa y contaminante de la leche pueden crecer en una leche pasteurizada en la cual no han sido aadidos expresamente y alcanzar elevados recuentos (McSweeney et al., 1994). Otros autores tambin encontraron valores similares a los hallados en este trabajo para los recuentos de lactobacilos al final de la maduracin en queso Cheddar, al cual no se haban aadido lactobacilos en su elaboracin (McSweeney et al., 1993; McSweeney et al., 1994; Lane y Fox, 1996; Lynch et al., 1996; Lynch et al., 1997). En el presente estudio, aunque los lactobacilos estuvieron presentes en los tres lotes de quesos estudiados, los recuentos en los quesos del lote 2 (a los cuales se haban aadido expresamente como adjunto del cultivo starter) fueron superiores a los otros dos lotes durante todo el proceso de maduracin.

En cuanto a los recuentos de bacterias viables totales, stos experimentaron un descenso general a lo largo de la maduracin para los tres lotes de quesos elaborados, presentando recuentos finales del orden de 107-108.

209

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

log (UFC/g)
10 9

LACTOCOCOS

log (UFC/g)
10 9 8

LEUCONOSTOCS

8 7 6 5 4 3 C 0 15 30 45 60 90 120 150

7 6 5 4 3 2 1 0 0 C 15 30 45 60 90 120 150

tiempo de maduracin (d)

tiempo de maduracin (d)

log (UFC/g)
10 9 8

LACTOBACILOS

log BACTERIAS VIABLES TOTALES (UFC/g)

11 10 9

7 6 5 4 3 5 2 1 0 0 C 15 30 45 60 90 120 150 4 3 0 C 15 30 45 60 90 120 150 8 7 6

tiempo de maduracin (d)

tiempo de maduracin (d)

Figura 4.2.: Recuentos microbiolgicos de lactococos, leuconostocs, lactobacilos y bacterias viables totales a lo largo de la maduracin en los quesos Manchegos elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes: lote 1 C: Cuajada lote 2 lote 3

210

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

4.3.2. Anlisis fsico-qumicos

Los valores medios y las desviaciones estndar de extracto seco (ES), pH, actividad del agua (Aw), protena total y cloruros de los tres lotes de quesos Manchegos se muestran en la Tabla 4.2 (A), as como los resultados del ANOVA considerando como factor el lote (o cultivo iniciador empleado). En la Figura 4.3 se muestra grficamente la evolucin del extracto seco, de la actividad del agua y del pH con el tiempo de maduracin.

Los valores de ES mostraron diferencias significativas (p<0,05) entre los tres lotes de quesos en las primeras fechas de maduracin (desde los 15 hasta los 60 das), siendo los quesos del lote 1 los que presentaron valores algo ms elevados de ES. Al final de la maduracin (150 das) los quesos alcanzaron valores similares de ES.

El pH present diferencias significativas entre lotes en la mayora de las fechas estudiadas. Al final de la maduracin, los quesos del lote 3 presentaron valores de pH significativamente ms bajos que los otros dos lotes de quesos.

Los valores de Aw slo presentaron diferencias significativas entre lotes a los 30 y a los 90 das de maduracin.

El contenido en protena total no mostr diferencias significativas entre los tres lotes, debido a que todos los quesos fueron elaborados con la misma leche de partida.

La concentracin de cloruros no fue, en general, significativamente diferente para los tres lotes, si bien los quesos del lote 2 mostraron concentraciones algo mayores que los otros dos a los 30 y a los 90 das de maduracin, debido posiblemente a que la fabricacin de los quesos se realiz de forma semiartesanal.

Todos estos valores fueron similares a los observados para el queso Manchego por otros autores (Fontecha et al., 1994; Picn et al., 1995; Garca-Ruiz et al., 1998).

211

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

A continuacin se aplic el ANOVA de un factor a estos mismos datos, considerando en este caso como factor, el tiempo de maduracin, con el objetivo de observar las posibles diferencias existentes entre muestras con distintos tiempos de maduracin. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 4.2 (B).

El test de Student-Newman-Keuls mostr que los valores de ES fueron diferentes significativamente para la mayora de los tiempos de maduracin en los tres lotes, aumentando desde valores en torno a 55-57% a los 15 das, hasta alcanzar, al final de la maduracin, cantidades alrededor de 67-68%.

La Aw disminuy con el tiempo de maduracin en los tres lotes de muestras analizadas (tal y como era de esperar). Los valores tambin fueron significativamente diferentes entre las distintas fechas estudiadas.

El pH no mostr una tendencia clara con la maduracin, sino que oscil entre 5,05,2 en general, para los tres lotes de quesos.

El nitrgeno proteico prcticamente no mostr variaciones significativas desde el inicio al final de la maduracin y en cuanto a la concentracin de cloruros slo se encontraron diferencias significativas entre algunos tiempos de maduracin en los lotes 1 y 2.

Estos resultados son coincidentes con los obtenidos para las muestras de queso Manchego elaboradas en invierno y en primavera, maduradas durante los mismos perodos de tiempo, correspondientes al estudio realizado en el Captulo 2 de esta Memoria.

212

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

TABLA 4.2 (A):Valores medios1 y desviacin estndar de las variables fsico-qumicas de los quesos Manchegos elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes.
Tiempo de maduracin (das) ES (%) 15 30 45 60 90 120 150 15 30 45 60 90 120 150 15 30 45 60 90 120 150 15 30 45 60 90 120 150 15 30 45 60 90 120 150

LOTE 1 56,82a 0,26 59,25a 0,26 58,96a 0,75 62,16a 1,16 64,78 0,88 65,73 0,82 67,36 0,67 5,001a 0,027 5,058a 0,014 5,138 0,038 5,095a 0,018 5,054 0,067 5,060a 0,045 5,184a 0,034 0,962 0,001 0,958a 0,002 0,957 0,002 0,944 0,001 0,936a 0,005 0,929 0,008 0,925 0,001 38,79 38,66 38,20 38,81 38,34 38,01 38,89 0,19 0,12 0,28 0,15 0,35 0,29 0,59

LOTE 2 56,91a 1,23 57,52b 0,25 57,99a 0,54 59,75b 0,71 63,92 0,63 63,98 1,32 67,00 0,65 5,182b 0,034 5,102a 0,021 5,037 0,017 5,103a 0,039 5,122 0,019 5,067a 0,029 5,170a 0,008 0,961 0,003 0,955a 0,001 0,950 0,001 0,942 0,002 0,930a 0,001 0,923 0,004 0,914 0,003 38,15 37,67 37,64 39,06 37,85 37,51 38,07 0,28 0,16 0,16 0,29 0,32 0,42 0,39

LOTE 3 54,42b 0,75 56,72b 0,87 56,54b 0,69 58,72b 0,90 63,08 0,56 63,67 1,05 67,73 1,12 5,107c 0,047 5,180b 0,059 5,054 0,058 4,979b 0,020 5,014 0,036 4,929b 0,068 5,079b 0,059 0,970 0,006 0,966b 0,005 0,958 0,009 0,950 0,008 0,954b 0,004 0,936 0,011 0,920 0,015 38,41 38,58 38,20 38,60 37,96 37,32 38,58 0,29 0,80 0,61 0,36 0,27 0,84 0,28

pH

Aw

Protena (%ES)

Cloruros (%ES)

3,13 0,22 3,25a 0,18 3,35 0,09 3,61 0,20 3,77a 0,18 3,81 0,30 3,69 0,16

3,71 0,10 4,33b 0,05 4,51 0,22 4,69 0,16 4,73b 0,08 4,96 0,12 4,76 0,10

2,88 0,93 3,62a 0,94 3,82 1,08 3,60 0,54 2,72c 0,30 4,05 1,21 4,05 1,27

: Cada valor corresponde a la media del anlisis por duplicado, realizado a su vez en tres quesos independientes. a,b,c : Medias en la misma fila con superndices distintos son significativamente diferentes entre s segn el test de Student-Newman-Keuls (p<0,05).

213

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

ES (%)
70,00

65,00

60,00

55,00

50,00 15

30

45

60

90

120

150

tiempo de maduracin (d)

pH
5,400 5,200 5,000 4,800 4,600 4,400 4,200 4,000 15 30 45 60 90 120 150

tiempo de maduracin (d)

Aw
0,980 0,960 0,940 0,920 0,900 0,880 15

30

45

60

90

120

150

tiempo de maduracin (d)

Figura 4.3: Evolucin del ES, pH y Aw a lo largo de la maduracin de los quesos Manchegos elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes: lote 1 lote 2 lote 3
214

TABLA 4.2 (B):Valores medios1 y desviacin estndar de la composicin de los quesos Manchegos elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes.
Tiempo de maduracin (das)

Lote 1

15 30 45 60 90 ES (%) 56,82a 0,26 59,25b 0,26 58,96b 0,75 62,16c 1,16 64,78d 0,88 pH 5,001a,b 0,027 5,058 a,b 0,014 5,138 a,b 0,038 5,095 a,b 0,018 5,054 a,b 0,067 Aw 0,962a 0,001 0,958 a,b 0,002 0,957b 0,002 0,944c 0,001 0,936c 0,005 Protena 38,79a 0,19 38,66a 0,12 38,20a 0,28 38,81a 0,15 38,34a 0,35 3,25a,b 0,18 3,35a,b,c 0,09 3,61b,c 0,20 3,77c 0,18 Cloruros 3,13a 0,22

120 65,73d 0,82 5,060a 0,045 0,929d 0,008 38,01a 0,29 3,81c 0,30

150 67,36e 0,67 5,184b 0,034 0,925e 0,001 38,89a 0,59 3,69b,c 0,16

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

215

Lote 2

ES (%) 56,91a 1,23 pH 5,182a 0,034 Aw 0,961a 0,003 Protena 38,15a 0,28 Cloruros 3,71a 0,10

57,52a 0,25 5,102b 0,021 0,955b 0,001 37,67a 0,16 4,33b 0,05

57,99a 0,54 5,037c 0,017 0,950c 0,001 37,64a 0,16 4,51b,c 0,22

59,75b 0,71 5,103b 0,039 0,942d 0,002 39,06b 0,29 4,69c,d 0,16

63,92c 0,63 5,122b 0,019 0,930e 0,001 37,85a 0,32 4,73c,d 0,08

63,98c 1,32 5,067b,c 0,029 0,923f 0,004 37,51a 0,42 4,96d 0,12

67,00d 0,65 5,170a 0,008 0,914g 0,003 38,07a 0,39 4,76c,d 0,10

Lote 3

ES (%) 54,42a 0,75 pH 5,107a,b 0,047 Aw 0,970a 0,006 Protena 38,41a 0,29 Cloruros 2,88a 0,93

56,72a 0,87 56,54a 0,69 58,72b 0,90 63,08c 0,56 63,67c 1,05 67,73d 1,12 a b,c,d c,d b,c,d d 5,180 0,059 5,054 0,058 4,979 0,020 5,014 0,036 4,929 0,068 5,079a,b,c 0,059 0,966a 0,005 0,958a 0,009 0,950a,b 0,008 0,954 a,b 0,004 0,936b,c 0,011 0,920c 0,015 38,58a 0,80 38,20a 0,61 38,60a 0,36 37,96a 0,27 37,32a 0,84 38,58a 0,28 3,62a 0,94 3,82a 1,08 3,60a 0,54 2,72a 0,30 4,05a 1,21 4,05a 1,27

Resultados y Discusin

: Cada valor corresponde a la media del anlisis por duplicado, realizado a su vez en tres quesos independientes. : Medias en la misma fila con superndices distintos son significativamente diferentes entre s segn el test de Student-Newman-Keuls (p<0,05).

a,b,c

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

4.3.3. Electroforesis en gel de urea-poliacrilamida

Se realiz la electroforesis en gel de urea-poliacrilamida de la fraccin insoluble en agua a pH 4,6 de todas las muestras de los quesos de 90 das de maduracin, elaborados con los tres cultivos iniciadores diferentes (Figura 4.4), con el objetivo de observar, en primer lugar, si existan diferencias entre los tres quesos independientes dentro de un mismo lote, y luego estudiar las posibles diferencias entre lotes. Una vez comprobado que no existan diferencias dentro de un mismo lote de quesos, se realiz la electroforesis de las muestras de quesos a los distintos tiempos de maduracin (15, 30, 45, 90 y 150 das), considerando solamente una muestra por lote (Figura 4.5).

No se realiz cuantificacin densitomtrica de las bandas electroforticas, ya que la electroforesis es una tcnica ms bien cualitativa que cuantitativa, y lo que se pretenda era observar la evolucin de la proteolisis de estos quesos.

Los electroforegramas mostraron una degradacin de las casenas a lo largo de la maduracin tpica para el queso Manchego. La mayor parte de la -casena permaneci intacta, mostrando solamente un ligera degradacin al final del perodo de maduracin. Esto es propio de los quesos de leche de oveja en general, en los cuales la -casena presenta cierta resistencia a la hidrlisis (Marcos et al., 1978). En el caso del queso Manchego, esta baja degradacin de la -casena con la maduracin ha sido obsevada por diversos autores (Ramos et al., 1981; Fontecha et al., 1994; Garca-Ruiz et al., 1998). Se comprob que la s-casena fue degradada mucho ms extensamente que la casena a lo largo de la maduracin, y las bandas correspondientes a sus productos de degradacin (s-cn degr.) aumentaron en intensidad segn avanzaba la maduracin. Las bandas correspondientes a las -casenas, las cuales son productos de degradacin de la -casena por la accin de la plasmina, tambin experimentaron un aumento de su intensidad a lo largo de la maduracin.

216

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

90 d a b 1 2 3 b a

-cn 1-cn 2-cn s-cn s-cn degr.

Figura 4.4: Electroforegramas de la fraccin insoluble a pH 4,6 de los quesos de 90 das de maduracin elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes (1, 2 y 3)
a: caseinato sdico b: casena ovina 15 d a b 1 2 3 1 45 d 2 3 1 90 d 2 3 1 150 d 2 3 a -cn 1-cn 2-cn s-cn s-cn degr.

Figura 4.5: Electroforegramas de la fraccin insoluble a pH 4,6 de los quesos.de 15, 45, 90 y 150 das de maduracin elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes (1, 2 y 3)
a: caseinato sdico b: casena ovina

217

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

No se apreciaron diferencias cualitativas entre los electroforegramas de los tres lotes de quesos para cada tiempo de maduracin. Esto era de esperar, ya que los agentes responsables de la proteolisis a este nivel (proteolisis primaria) son el cuajo y la plasmina (McSweeney et al., 1994), mientras que las peptidasas de los lactococos y de las NSLAB del starter actan sobre los pptidos liberados en la proteolisis primaria (Wallace y Fox, 1997), producindose as la proteolisis secundaria.

Otros autores, en estudios realizados en queso Cheddar elaborados con y sin cultivos adjuntos de lactobacilos, tampoco encontraron diferencias en los geles de ureaPAGE entre los quesos que contenan lactobacilos y los quesos control (McSweeney et al., 1994; Lane y Fox, 1996; Lynch et al., 1996).

4.3.4. Fracciones nitrogenadas

Las Tablas 4.3 (A) y 4.3 (B) muestran los valores de las fracciones nitrogenadas nitrgeno soluble en agua (NS) y nitrgeno soluble en cido fosfotngstico (N-PTA), as como las relaciones NS/NT x 100 y NPTA/NT x 100, consideradas como ndices de la proteolisis. Tambin aparecen los resultados del ANOVA considerando como factor el lote (Tabla 4.3 (A)) y el tiempo de maduracin (Tabla 4.3 (B)). En la Figura 4.6 se representa la evolucin de estos ndices con el tiempo de maduracin.

Segn puso de manifiesto el Test de Student-Newman-Keuls, no existieron diferencias significativas entre los valores de NS de los quesos elaborados con distintos cultivos iniciadores, a excepcin de las muestras de 15 y 45 das del lote 2 (Tabla 4.3 (A)). Esto es debido a que, aunque los compuestos nitrogenados solubles del queso pueden ser producidos por las bacterias del starter y por la plasmina, son producidos fundamentalmente por la accin del cuajo (Visser, 1977).

Lynch et al. (1996), en un estudio realizado sobre la utilizacin de lactobacilos adjuntos en queso Cheddar, tambin encontraron niveles similares de NS en los quesos elaborados con y sin lactobacilos adjuntos del starter.

218

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

Por otro lado, en cuanto a la evolucin con el tiempo de maduracin, las concentraciones de NS, as como el ndice NS/NT x 100, aumentaron de forma significativa a medida que los quesos maduraban (Tabla 4.3 (B)) debido a la accin desarrollada por los agentes proteolticos que intervienen en la maduracin del queso. As, las cantidades de NS aumentaron desde valores en torno a 0,6 (en % ES) a los 15 das hasta alcanzar valores alrededor de 1,3 (%ES) a los 150 das, para los tres lotes de quesos. La relacin NS/NT x 100 present unos valores al comienzo de la maduracin (15 das) en torno al 10% para los tres lotes de quesos, alcanzando a los 150 das valores que oscilaron en torno al 21%.

Estos valores de la relacin NS/NT x 100 obtenidos para los tres lotes de quesos Manchegos elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes fueron similares a los obtenidos para los quesos Manchegos elaborados en primavera con un cultivo iniciador mixto comercial, y analizados a los mismos perodos de tiempo que aparecen en el Captulo 2 de esta Memoria, y algo inferiores a los encontrados en los quesos del lote de invierno, elaborados y madurados de la misma forma.

En cuanto al N-PTA, no existieron diferencias significativas en ningn caso entre los tres tipos de quesos elaborados con diferentes cultivos iniciadores (Tabla 4.3. (A)). Esto concuerda con Lane y Fox (1996), en un estudio realizado en queso Cheddar sobre la utilizacin de lactobacilos como adjuntos del starter, donde se puso de manifiesto que las proteinasas del starter (lactococos) eran los principales agentes que contribuan a la produccin de pptidos pequeos y aminocidos libres. En dicho estudio, la actividad peptidsica de los lactobacilos adjuntos fue enmascarada por las bacterias del starter, es decir, por los lactococos, cuyo sistema peptidsico es capaz de degradar un amplio rango de pptidos de medio y pequeo tamao a aminocidos.

En el presente estudio, el hecho de que no se observaran diferencias en cuanto a las cantidades de N-PTA producidas en los tres lotes de quesos podra ser debido, en primer lugar, a que se produjo una proliferacin inevitable de lactobacilos en los quesos de los lotes 1 y 3 (que no contenan lactobacilos en el cultivo iniciador) (ver Figura 4.2), y por otro lado, se podra haber producido este efecto de enmascaramiento de la actividad

219

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

TABLA 4.3 (A): Valores medios1 y desviacin estndar de las fracciones nitrogenadas de los quesos Manchegos elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes (lotes 1, 2 y 3).

Tiempo de maduracin (das) NS (g/100g ES) 15 30 45 60 90 120 150 15 30 45 60 90 120 150 15 30 45 60 90 120 150 15 30 45 60 90 120 150

LOTE 1 0,63a 0,02 0,82 0,06 0,95a 0,03 1,04 0,03 1,13 0,07 1,21 0,15 1,38 0,05 0,06 0,05 0,04 0,02 0,07 0,02 0,12 0,01 0,13 0,01 0,16 0,01 0,19 0,03 10,37 0,40 13,55 1,49 15,91a 0,42 17,15 0,45 18,74 1,08 20,27 2,41 22,61 0,82 0,97 0,84 0,60 0,35 1,13 0,38 1,90 0,24 2,14 0,14 2,73 0,16 3,17 0,43

LOTE 2 0,52b 0,06 0,63 0,08 0,85b 0,05 1,05 0,01 1,10 0,05 1,22 0,06 1,30 0,02 0,01 0,02 0,03 0,01 0,05 0,03 0,09 0,02 0,11 0,03 0,14 0,02 0,16 0,00 8,67 1,03 10,75 2,51 14,41b 0,83 17,13 0,22 18,47 0,84 20,82 0,78 21,81 0,52 0,20 0,34 0,49 0,17 0,78 0,43 1,41 0,34 2,29 0,15 2,31 0,35 2,67 0,03

LOTE 3 0,57a,b 0,03 0,63 0,12 0,96a 0,04 1,06 0,08 1,05 0,07 1,26 0,05 1,27 0,05 0,01 0,00 0,04 0,02 0,09 0,01 0,08 0,03 0,13 0,01 0,15 0,01 0,20 0,02 9,47 0,64 10,47 4,00 16,05a 0,49 17,50 1,33 17,63 1,08 21,58 0,54 20,97 0,71 0,15 0,00 0,58 0,29 1,43 0,22 1,40 0,47 2,13 0,14 2,55 0,25 3,25 0,34

N-PTA (g/100g ES)

NS/NT x 100

N-PTA/NT x 100

: Cada valor corresponde a la media del anlisis de tres quesos independientes realizado a su vez por duplicado. a, b : Medias en la misma fila con superndices distintos son significativamente diferentes entre s segn el test de Student-Newman-Keuls (p<0,05).

220

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

TABLA 4.3 (B): Valores medios1 y desviacin estndar de las fracciones nitrogenadas de los quesos Manchegos elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes (lotes 1, 2 y 3).

Tiempo de maduracin (das) NS (g/100g ES) 15 30 45 60 90 120 150 15 30 45 60 90 120 150 15 30 45 60 90 120 150 15 30 45 60 90 120 150

LOTE 1 0,63a 0,02 0,82b 0,06 0,95c 0,03 1,04c 0,03 1,13d 0,07 1,21e 0,15 1,38f 0,05

LOTE 2 0,52b 0,06 0,63a 0,08 0,85b 0,05 1,05a 0,01 1,10a 0,05 1,22a 0,06 1,30a 0,02

LOTE 3 0,57a,b 0,03 0,63a 0,12 0,96a 0,04 1,06a 0,08 1,05a 0,07 1,26a 0,05 1,27a 0,05 0,01a 0,00 0,04a 0,02 0,09b 0,01 0,08b 0,03 0,13c 0,01 0,15c 0,01 0,20d 0,02 9,47a 0,64 10,47a 4,00 16,05b 0,49 17,50ba 1,33 17,63b 1,08 21,58c 0,54 20,97c 0,71 0,15a 0,00 0,58a 0,29 1,43b 0,22 1,40b 0,47 2,13c 0,14 2,55c 0,25 3,25d 0,34

N-PTA (g/100g ES)

0,06a,b 0,05 0,01a 0,02 0,04a 0,02 0,03a 0,01 a,b,c 0,07 0,02 0,05a 0,03 0,12b,c 0,01 0,09b 0,02 0,13c,d 0,01 0,11b,c 0,03 0,16d,e 0,01 0,14c 0,02 0,19e 0,03 0,16c 0,00 10,37a 0,40 13,55b 1,49 15,91c 0,42 17,15c,d 0,45 18,74d,e 1,08 20,27e 2,41 22,61f 0,82 0,97a 0,84 0,60a 0,35 1,13a 0,38 1,90b 0,24 2,14b 0,14 2,73b,c 0,16 3,17c 0,43 8,67a 1,03 10,75b 2,51 14,41c 0,83 17,13d 0,22 18,47d 0,84 20,82e 0,78 21,81e 0,52 0,20a 0,34 0,49a 0,17 0,78a 0,43 1,41b 0,34 2,29c 0,15 2,31c 0,35 2,67c 0,03

NS/NT x 100

N-PTA/NT x 100

: Cada valor corresponde a la media del anlisis de tres quesos independientes realizado a su vez por duplicado. a, b : Medias en la misma columna con superndices distintos son significativamente diferentes entre s segn el test de Student-Newman-Keuls (p<0,05).

221

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

% NS/NT
25,00

20,00

15,00

10,00

5,00

0,00 15 30 45 60 90 120 150

tiempo de maduracin (d)

% N-PTA/NT
3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 15 30 45 60 90 120 150

tiempo de maduracin (d)

Figura 4.6: Evolucin a lo largo de la maduracin de los ndices de proteolisis nitrgeno soluble en agua (NS) y nitrgeno soluble en cido fosfotngstico (N-PTA) referidos a nitrgeno total (NT) para los quesos Manchegos elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes: lote 1 lote 2 lote 3

222

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

peptidsica de los lactobacilos por parte de las cepas de lactococos del starter, ya que stos estaban en mayor proporcin en el cultivo iniciador.

Sin embargo, Lynch et al. (1996), en un estudio en queso Cheddar encontraron valores superiores de nitrgeno aminoacdico (comparable a la fraccin de N-PTA) en los quesos que contenan lactobacilos aadidos como adjuntos del starter respecto a los quesos control.

Al igual que en el caso del NS, tambin se produjo un aumento significativo del NPTA con el tiempo de maduracin (Tabla 4.3 (B)). As los valores oscilaron entre 0,01 y 0,06 (%ES) a los 15 das de maduracin, y entre 0,16 y 0,20 (%ES) a los 150 das, para los tres lotes de quesos. Slo se encontraron diferencias significativas en el lote 1.

La relacin N-PTA/NT x 100 (Fig. 4.6) fue casi nula al principio de la maduracin para los tres lotes de quesos analizados y aument significativamente hasta valores en torno al 3% del NT al final de la maduracin.

Estos valores de N-PTA/NT x 100 fueron en general, similares a los observados para los quesos del lote de primavera y de nuevo algo inferiores a los del lote de quesos elaborados en invierno (Captulo 2 de esta Memoria).

4.3.5. Anlisis de los pptidos de las fracciones insoluble y soluble en etanol al 70% por cromatografa lquida de alta resolucin en fase reversa (RP-HPLC)

El estudio de las fracciones insoluble y soluble en etanol al 70% se realiz en primer lugar en todos los quesos de 90 das de maduracin; as, se analizaron todas las muestras de los tres lotes de quesos para esta fecha (9 muestras en total), con el fin de comprobar si existan diferencias entre los perfiles cromatogrficos de los tres quesos independientes pertenecientes a un mismo lote, es decir, elaborados con el mismo cultivo iniciador. Este estudio se realiz solamente para una fecha de maduracin debido a la dificultad de analizar el elevado nmero de quesos elaborados (63 en total) y se eligi la fecha de 90 das por ser un tiempo de maduracin intermedio, y porque a los 90 das se

223

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

considera que los quesos ya han experimentado cambios notables debidos a la maduracin. Posteriormente se realiz el estudio por tiempos de maduracin, analizandose las muestras de 15, 45, 90 y 150 das.

4.3.5.1. Fraccin de nitrgeno insoluble en etanol al 70%

En las Figuras 4.7, 4.8 y 4.9 se presentan los cromatogramas de la fraccin insoluble en etanol al 70% de los tres quesos Manchegos de 90 das elaborados en cada uno de los tres lotes (lotes 1, 2 y 3). Por comparacin visual de los cromatogramas se comprob que no existan diferencias entre los perfiles peptdicos de los tres quesos dentro de un mismo lote; sin embargo, s se apreciaron diferencias entre los distintos lotes, fundamentalmente para los picos con tiempos de elucin desde el minuto 25 hasta el final del cromatograma. Lynch et al. (1996) slo encontraron pequeas diferencias entre los perfiles de RP-HPLC de la misma fraccin de quesos Cheddar elaborados con y sin lactobacilos como adjuntos del cultivo starter.

Para interpretar estos perfiles peptdicos de una forma estadstica, se aplic el Anlisis de Componentes Principales (ACP) a los cromatogramas de las muestras de quesos de 90 das. Los tres primeros componentes principales (CP) explicaron el 92,1% de la varianza total (Tabla 4.4). Las variables (o picos) que mejor se correlacionaron con cada CP y sus coeficientes tambin se muestran en la misma tabla. La Figura 4.10 muestra la distribucin de las muestras en el plano definido por el CP 1 y el CP 2. Las muestras aparecen separadas en tres grupos, coincidiendo con los tres lotes de quesos elaborados con distintos cultivos iniciadores, y dentro de cada grupo se encuentran las tres muestras de quesos individuales. A la vista de estos resultados se puede decir que, los quesos elaborados con el mismo cultivo iniciador presentaron el mismo perfil de pptidos de la fraccin insoluble en etanol al 70%, y por otro lado, que las muestras se separaron, en base a su perfil de pptidos de la fraccin insoluble en etanol al 70%, segn el cultivo starter empleado en su fabricacin. Las muestras situadas en la parte positiva del CP 1 (lote 3) presentaron mayores cantidades de los pptidos 6, 9, 20, 18, 45, 11 y 8 (ordenados segn su coeficiente de correlacin con el CP1 (ver Tabla 4.4), mientras que las muestras localizadas en la parte negativa de este eje (muestras del lote 2) presentaron menores

224

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

EtOH-Insoluble 90 das Lote 1

mA 100 75 50 25
17 19 14 27 30 2829

24 23 25

32 36 31 33 35 34 37 38 39 42 43 41 40 44 45

0 -25 -50

1 4 2 3 5

13 10 6 8 9 11 12 7

18 20 21 15 16 22

10

20

30

40

50

60

mA 100 75 50 25
17 19 24 23 26 25 32 31 33 35 34 36 42 41 40 43 37 38 44 39 45 14 27 30 29 28

0 -25 -50

1 4 2 3

13 10 8 9 11 12 5 6 7

21 15 16 18 20 22

10

20

30

40

50

60

mA 100 75 50 25 0 -25 -50 10 20 30 40 50 60 Minutos

1 4 2 3 5 13 10 12 6 8 9 11 7 14 24 23 26 25 17 19 18 20 21 16 22 15 27 30 29 28 32 31 33 3435 36 42 41 40 37 38 39 43 45

44

Figura 4.7: RP-HPLC cromatogramas de la fraccin de NS insoluble en etanol al 70% de los tres quesos Manchegos de 90 das de maduracin, elaborados con el
225

cultivo iniciador 1 (Lote 1).

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

EtOH-Insoluble 90 d Lote 2

mA 100 75 50 25 0 -25
1 4 3 2 19 16 18 20 21 15 13 17 10 12 8 9 11 5 67 14

27

28 32 26 25 23 2224 30 29 31 33 34 35 37 38 39 36

40 41 42 43

44 45

10

20

30

40

50

60

mA 100 75
14

27

28 36 30 25 24 26 23 19 16 1 4 2 3 5 6 78 9 10 13 15 12 11 18 20 21 22 17 29 32 40 31 33 34 35 42 43 37 38 39 44 45 41

50 25 0 -25

10

20

30

40

50

60

mAU 100 75 50 25 0 -25

16 1 4 2 3 19 24 23 25

27

28 14 30 26 29 31 33 35 34 37 38 39 32 36 40 41 42 43 44 45

21 15 18 20 22 17 13 10 12 6 8 9 11 5 7

10

20

30

40

50

60 Minuto

Figura 4.8: RP-HPLC cromatogramas de la fraccin de NS insoluble en etanol al 70% de los tres quesos Manchegos de 90 das de maduracin, elaborados con el cultivo iniciador 2 (Lote 2).
226

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

EtOH-Insoluble 90 d Lote 3

mA 100 75 50 25 0
1 89 2 3 4 5 67 10 13 11 12 19 14 27 26 25 23 17 16 18 20 24 22 21 15 282930 34 36 33 35 37 38 39

32 31 40 42 41 43 45

44

-25 -50 10

20

30

40

50

60

mA 100 75 50 25 0
1 10 13 11 12 19 14 27 26 25 17 20 23 16 18 24 22 21 15 282930 34 36 33 35 37 38 39

32 31 40 42 41 43 45

44

-25 -50 10

3 4

89 6 7

20

30

40

50

60

mA 100
14

75 50 25 0 -25 -50 10 20 30 40 50 60
1 2 3 4 5 67 89 10 13 11 12 19 17 16 18 20 15 27 26 25 23 24 22 21 32 29 28 30 31 33 34 35 36 3738 39 40

42 43 41

44

45

Minutos

Figura 4.9: RP-HPLC cromatogramas de la fraccin de NS insoluble en etanol al 70% de los tres quesos Manchegos de 90 das de maduracin, elaborados con el cultivo iniciador 3 (Lote 3).
227

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

TABLA 4.4: Resultados del Anlisis de Componentes Principales de la fraccin insoluble en etanol al 70% de los extractos solubles en agua de los quesos Manchegos de 90 das de maduracin elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes.

Componente Principal

Varianza explicada (%)

Varianza total (%)

Variables (picos) altamente correlacionadas con los CP y sus coeficientes 6 9 20 18 45 11 8 36 3 21 29 4 30 35 (0,983) (0,982) (0,968) (0,965) (0,961) (0,936) (0,932) (-0,916) (0,993) (0,979) (0,970) (0,963) (0,947) (0,925)

50,90

50,90

28,53

79,42

12,65

92,07

43 (0,895)

228

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

2,5

2,0

Componente Principal 2

1,5 1,0

,5 0,0 -,5

-1,0 -1,5 -1,5 -1,0 -,5 0,0 ,5 1,0 1,5 2,0

Componente Principal 1

Figura 4.10: Representacin en el plano definido por los dos componentes principales obtenidos del ACP del perfil de pptidos de la fraccin insoluble en etanol de las muestras de quesos Manchegos de 90 das elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes: lote 1 ( ), lote 2 ( ) y lote 3 ( ).

Distancia 0 5 10 15 20 25 +---------+---------+---------+---------+---------+

lOTE 2 2 2 1 1 1 3 3 3

Figura 4.11: Dendrograma obtenido del Anlisis de Conglomerados del perfil de pptidos de la fraccin insoluble en etanol de las muestras de quesos Manchegos de 90 das elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes: lotes 1, 2 y 3.
229

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

alturas de pico para los mismos pptidos. La mayora de estos picos eluyen a tiempos de retencin entre 22 y 33 min., es decir, a bajas concentraciones de acetonitrilo, por lo que podran ser consideradas como pptidos hidroflicos. Por ltimo, las muestras del lote 1, situadas en la parte positiva del CP 2, tuvieron una mayor altura de pico para los pptidos 3, 21, 29, 4, 30 y 35 que los quesos de los otros dos lotes (ver Figuras 4.7, 4.8 y 4.9).

Cuando se aplic el Anlisis de Conglomerados o clusters a las mismas muestras se confirmaron los resultados obtenidos en el ACP, ya que stas se agruparon en tres clusters o grupos, coincidiendo de nuevo con los tres inculos distintos empleados en la fabricacin de los quesos (Figura 4.11). En este caso las muestras de los lotes 1 y 2 se agruparon dentro de un grupo ms general, separado de las muestras pertenecientes al lote 3. Esto podra ser debido a la similitud existente entre los dos cultivos starter de estos quesos, los cuales estaban formados por cepas aisladas de quesos Manchegos elaborados con leche cruda, a diferencia del cultivo mixto comercial utilizado en la fabricacin de los quesos del lote 3. Estos resultados muestran de nuevo que existieron diferencias significativas en el perfil peptdico de la fraccin insoluble en etanol de los quesos segn el cultivo iniciador utilizado en cada caso.

Una vez comprobado que no existan diferencias entre los perfiles cromatogrficos de los tres quesos pertenecientes a un mismo lote (en el caso de los quesos de 90 das) se procedi al estudio de las muestras de queso de las distintas fechas de maduracin. As, en este caso se consideraron las fechas de 15, 45, 90 y 150 das y solamente se analiz un queso dentro de cada lote.

En las Figuras 4.12, 4.13, 4.14 y 4.15 se muestran los cromatogramas de la fraccin insoluble en etanol de las muestras de queso de 15, 45, 90 y 150 das de maduracin, respectivamente.

En estas figuras se observan a simple vista claras diferencias entre los perfiles de los tres lotes de quesos, para cada uno de los distintos tiempos de maduracin estudiados. Estas diferencias aparecen fundamentalmente en las zonas del cromatograma con tiempos de elucin entre 28 y 45 minutos y a partir del minuto 55.

230

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

EtOH-Insoluble 15 das

mA
43

75 50 25 0 -25 -50 10 20 30 40 50 60 Minuto

1 2 3 4 5 13 10 6 8 9 11 12 7 14 32 24 27 23 26 28 30 31 19 35 25 15 33 34 29 21 36 16 18 20 22 17 42 41 40 37 38 39 44 45

mA

75 50 25 0 -25 -50 10 20 30 40
1 2 3 4 5 6 78 13 10 12 9 11 14 27 25 26 19 20 23 24 18 21 1617 22 15 28 30 29 31 32 33 35 36 34

LOTE 2
40 42 43 41 44 37 38 39 45

50

60 Minuto

mA

LOTE 3
75 50 25 0
1 25 26 24 28 30 20 23 29 21 13 17 19 22 18 16 8 10 12 15 6 7 9 11 14 32 31 33 36 35 34 41 27 40 42 43 44 37 38 45

39

-25 -50 10

3 4

20

30

40

50

60 Minuto

Figura 4.12: RP-HPLC cromatogramas de la fraccin de NS insoluble en etanol al 70% de los quesos Manchegos de 15 das de maduracin, elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes (lotes 1, 2 y 3).
231

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

EtOH-Insoluble 45 das

mA 10 75 50 25 0 -25
1 2 3 4 14 27 32 45 36 37 38 39 41 43 40 42 44

LOTE 1

25 28 30 31 24 26 29 33 35 19 23 34 21 13 1618 20 10 15 17 22 6 8 9 11 12 5 7

10

20

30

40

50

60 Minuto

mA 10 75
32

LOTE 2

50 2 0 -25
1 2 10 13 12 8 5 6 7 9 11 27 28 14 25 24 26 19 23 1618 2021 22 17 15 30 29 33 35 34 31 36 38 37 39 43 40 41 42 44 45

3 4

10

20

30

40

50

60 Minuto

mA 10 7 50 2 0 1 2 3 4 14 27 26 28 23 16 19 25 13 18 20 22 24 10 12 15 17 21 8 5 6 7 9 11 2930 32 43 31 33 35 34 36 37 38 39 42 40 41 44 45

LOTE 3

10

30

40

50

60 Minuto

Figura 4.13: RP-HPLC cromatogramas de la fraccin de NS insoluble en etanol al 70% de los quesos Manchegos de 45 das de maduracin, elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes (lotes 1, 2 y 3).
232

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

EtOH-Insoluble 90 das

mA 100
14

27 30 2829

LOTE 1
32 36 31 33 35 34 37 38 39 42 43 41 40 44

75 50 25 0 -25
1 4 2 3 5 13 10 6 8 9 11 12 7 19 17 15 16 18 20 21 22 24 23 25

45

20

40

50

mA 100 75
14

27

LOTE 2
28 32 26 25 23 24 22 19 16 1 4 2 3 13 10 8 9 11 12 56 7 18 20 21 15 17 30 29 31 33 34 35 37 38 39 44 45 36 40 41 42 43

50 25 0 -

20

40

50

mA 100 75 50 25 0 -25
1 2 3 4 5 67 19 14 27 26 25 23 17 16 18 20 24 22 10 13 21 89 15 1112 282930 34 36 33 35 37 38 39

LOTE 3
32 31 40 42 41 43 45

44

20

40

50

6 Minuto

Figura 4.14: RP-HPLC cromatogramas de la fraccin de NS insoluble en etanol al 70% de los quesos Manchegos de 90 das de maduracin, elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes (lotes 1, 2 y 3).
233

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

EtOH-Insoluble 150 das

mA 10 75 50
14 28 29 27 30 26 23 24 25

LOTE 1

25 0 -25
1 3 4

19 17 16 20 13 15 18 21 22 10 12 6 8 9 11 5 7

32 31 33 35 34

36 38 37

45 40 41 43 42 39 44

20

40

50

mA 100 75 50 25 0
1 14 27 28 25 24 2930 23 26

LOTE 2

19 16 13 20 22 15 18 21 10 17 6 8 9 11 12 5 7

32 35 31 33 34

36 37 38 39

40 41 43 42

45 44

20

40

50

mA 10

LOTE 3
75 50 2 0 -25
1 3 4 5 10 12 6 8 11 13 7 9 14 27 28 29 30

23 26 24 19 25 16 20 22 18 15 17 21

32 35 31 33 34

36 37 38 39

40 41 43 42

45 44

20

40

50

Minuto

Figura 4.15: RP-HPLC cromatogramas de la fraccin de NS insoluble en etanol al 70% de los quesos Manchegos de 150 das de maduracin, elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes (lotes 1, 2 y 3).
234

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

Si se observa la evolucin del perfil peptdico de la fraccin insoluble en etanol con el tiempo de maduracin, dentro de los quesos de un mismo lote, se puede apreciar que, en general, a los 15 das, los picos mayoritarios son los que eluyen en la regin del final del cromatograma (picos nmero 40 al 45). A los 45 das se da un descenso acusado de estos picos y un ligero incremento de los picos 14 al 32 (regin central del cromatograma). A los 90 das de maduracin, los picos de la zona central aumentan de forma muy notable, sobre todo para los lotes 1 y 2, alcanzando en esta fecha los mximos valores de todo el perodo de maduracin estudiado, a la vez que se produce un ligero aumento en la altura de los picos que eluyen en la zona final del cromatograma (pptidos nmeros 37 al 45). Por ltimo, a los 150 das todos estos pptidos comentados anteriormente experimentan una disminucin, siendo sta ms acusada para los pptidos que eluyen desde el min. 55 hasta el final del cromatograma, los cuales llegan casi a desaparecer.

Los pptidos que forman parte de esta fraccin insoluble en etanol al 70% corresponden a pptidos de tamao grande e intermedio, originados por una primera hidrlisis de las casenas. A lo largo de la maduracin los pptidos de mayor tamao van siendo hidrolizados por los agentes proteolticos y van originando pptidos de menor peso molecular, los cuales eluyen a tiempos de retencin menores. Al final de la maduracin, todos estos pptidos sufren una disminucin acusada, debido a que seguramente se han transformado en pptidos de menor tamao, los cuales aparecen probablemente en la fraccin soluble en etanol 70%.

Sin embargo, y aunque se observ una evolucin del perfil peptdico a lo largo de la maduracin en los tres lotes de quesos elaborados, al aplicar el ACP no se obtuvo una buena separacin de las muestras segn su tiempo de maduracin.

4.3.5.2. Fraccin de nitrgeno soluble en etanol al 70%

Las Figuras 4.16, 4.17 y 4.18 muestran los cromatogramas de la fraccin de nitrgeno soluble en etanol al 70% de los tres quesos Manchegos de 90 das

235

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

EtOH-Soluble 90 das Lote 1

mAU 40 30 20 10 0 -10 -20 -30

15

19

16 37 42 32 41

44

43

4 18 5 3 9 10 8 7 11 17 13 14 12 26 28 20 22 23 25 21 24 27 29 30 31 35 38 33 34 36 3940

10

20

30

40

50

60 Minutos

mAU 40 30 20 10 0 -10 -20

1

15 16

19 44 32 37 42

4 18 5 10 9 3 8 11 13 14 12 17 31 30 33 34 36 35 38

41

43

28 26 29 20 27 24 25 21 23 22

3940

-30

10

20

30

40

50

60 Minutos

mAU 40 30 20 10 0 -10 -20 -30

1 2 6

15 16

19

44

42 37

41 4 18 20 23 21 22 32 38 39 40

43

1314 5 3 8 7 9 10 11 12

17

31 26 28 30 24 25 27 29

33 34

36 35

10

20

30

40

50

60 Minutos

Figura 4.16: RP-HPLC cromatogramas de la fraccin de NS soluble en etanol al 70% de los tres quesos Manchegos de 90 das de maduracin, elaborados con el cultivo iniciador 1 (Lote 1).
236

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

EtOH-Soluble 90 das Lote 2

mA 50
1

15

19

32 37

25
6

16 42 31 41 43 30 4 14 13 5 3 8 7 9 10 11 12 18 17 20 23 25 24 21 22 27 33 29 34 36 38 35 40 39 26 28 44

-25

10

20

30

40

50

60 Minutos

mA 50
1

15

19 32 37

16

25

6 26 28

31 30 33 29

41 34 36 38 35 40 39

44 42 43

0
4 13 14 5 3 8 7 9 10 11 12 17 18 20 25 21222324 27

-25

10

20

30

40

50

60 Minutos

mA
1

15

19

32

37

50
6 16 44 31 26 28 30 33 27 29 34 36 35 38 40 39 41 42 43

25

0
4 5 3 8 7 10 9 11 13 14 12 25 18 20 22 21 23 24 17

-25

10

20

30

40

50

60 Minutos

Figura 4.17: RP-HPLC cromatogramas de la fraccin de NS soluble en etanol al 70% de los tres quesos Manchegos de 90 das de maduracin, elaborados con el cultivo iniciador 2 (Lote 2).
237

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

EtOH-Soluble 90 das Lote 3

mAU 50

15

16

19 37

25
14 6 13 17 11 5 3 7 8 9 10 12 18 26 20 22 24 23 25 21 28 30 31

32 41 42 36 33 34 35 38 39 40

44

0
4

43

27 29

-25

10

20

30

40

50

60 Minutos

mAU 50

15

16

19 37 32

25
14 6 41 13 21 4 11 17 5 3 7 8 9 10 12 18 26 28 27 29 20 22 24 25 23 30 31 33 36 34 35 38 40 39 42

44

43

-25

10

20

30

40

50

60 Minutos

mAU 50

15 16

19 37

25
6 30 14 13 4 5 10 8 3 7 9 11 12 17 26 21 23 18 20 22 24 25 28 31

32 44 41 33 34 36 38 35 40 39 42 43

27

29

-25

10

20

30

40

50

60 Minutos

Figura 4.18: RP-HPLC cromatogramas de la fraccin de NS soluble en etanol al 70% de los tres quesos Manchegos de 90 das de maduracin, elaborados con el cultivo iniciador 3 (Lote 3).
238

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

correspondientes a cada uno de los lotes (lotes 1, 2 y 3) elaborados con distintos cultivos iniciadores. Al igual que en el caso de la fraccin insoluble, los perfiles cromatogrficos observados a simple vista de la fraccin soluble en etanol de las muestras de los tres quesos pertenecientes al mismo lote fueron similares.

Se aplic nuevamente el ACP a los perfiles cromatogrficos de las muestras de queso de 90 das, tomando como variable la altura de pico. Los tres primeros CP explicaron el 85,1% de la varianza total (Tabla 4.5). La Figura 4.19 muestra la representacin de las muestras en el plano definido por los ejes CP 1 y CP 2. De nuevo, las muestras se agruparon por lotes, es decir, segn el cultivo iniciador empleado en su fabricacin, de la misma forma que ocurra en el caso de la fraccin insoluble en etanol.

Las muestras situadas en la parte positiva del eje CP 1 (muestras del lote 2, que contenan Lb. plantarum como adjunto del starter) presentaron unos valores ms elevados para los picos 28, 25, 37, 26 y 34, mientras que las muestras localizadas en la parte negativa del mismo eje (muestras del lote 1, sin Lb. plantarum) tuvieron las menores cantidades de estos mismos picos. Las muestras del lote 3 (elaboradas con el cultivo comercial) presentaron cantidades intermedias de estos mismos pptidos. El CP 2 distribuy a las muestras de acuerdo a la altura de los picos 14, 13, 21 y 39, presentando los quesos del lote 3 los mayores valores.

De todos estos pptidos ms correlacionados con los componentes principales 1 y 2, se conoce la secuencia de la cadena aminoacdica de algunos de ellos. As, el pptido nmero 37 pertenece a la -casena y los pptidos nmeros 13, 14, 26 y 28 corresponden a distintos fragmentos de la s1-casena (Poveda et al., resultados sin publicar).

Esta distribucin de las muestras se volvi a poner de manifiesto cuando se aplic el Anlisis de Conglomerados (Ver Figura 4.20), donde las muestras aparecen separadas en los mismos grupos, segn el cultivo iniciador utilizado en su elaboracin. En este caso, las muestras pertenecientes al lote 2 aparecen a mayor distancia de las muestras de los lotes 1 y 3, a diferencia de lo que ocurra en el caso de la fraccin insoluble en etanol. Esto

239

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

TABLA 4.5: Resultados del Anlisis de Componentes Principales de la fraccin soluble en etanol al 70% de los extractos solubles en agua de los quesos Manchegos de 90 das elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes (lotes 1, 2 y 3).

Componente Principal

Varianza explicada (%)

Varianza total (%)

Variables (picos) altamente correlacionadas con los CP y sus coeficientes 28 25 37 26 34 (0,982) (0,980) (0,965) (0,945) (0,922)

44,9

44,9

29,1

74,0

14 13 21 39

(0,994) (0,986) (0,961) (0,935)

11,1

85,1

27 (0,881) 28 (0,739)

podra ser debido a la influencia del adjunto utilizado (Lb plantarum), que podra haber contribuido a una mayor produccin de los pptidos 28, 25, 37, 26 y 34.

Al igual que en el caso de la fraccin insoluble en etanol, una vez comprobado que no existan diferencias significativas entre los perfiles cromatogrficos de la fraccin soluble en etanol 70% de los tres quesos pertenecientes a un mismo lote (para los quesos de 90 das) se procedi al estudio de las muestras de queso de las fechas de maduracin consideradas anteriormente (15, 45, 90 y 150 das), analizando un nico queso dentro de cada lote.

240

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

2,0

1,5

Componente Principal 2

1,0

,5

0,0

-,5

-1,0 -1,5 -2,0 -1,5 -1,0 -,5 0,0 ,5 1,0 1,5

Componente Principal 1

Figura 4.19: Representacin en el plano definido por los dos componentes principales obtenidos del ACP del perfil de pptidos de la fraccin soluble en etanol de las muestras de quesos Manchegos de 90 das elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes: lote 1 ( ), lote 2 ( ) y lote 3 ( ).

Distancia LOTE
2 2 2 3 3 3 1 1 1 0 5 10 15 20 25 +---------+---------+---------+---------+---------+

Figura 4.20: Dendrograma obtenido del Anlisis de Conglomerados del perfil de pptidos de la fraccin soluble en etanol de las muestras de quesos Manchegos de 90 das elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes: lotes 1, 2 y 3.

241

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

En las Figuras 4.21, 4.22, 4.23 y 4.24 se muestran los cromatogramas RP-HPLC de la fraccin soluble en etanol 70 % de las muestras de queso de tres lotes a los 15, 45, 90 y 150 das de maduracin, respectivamente.

Se puede observar que en el caso de los tres lotes de quesos, los pptidos correspondientes a la primera zona del cromatograma (picos desde el n 4 al 14) experimentaron un aumento progresivo con el tiempo de maduracin, y los picos mayoritarios de la zona central del cromatograma (picos 15, 16, 19) aumentaron hasta los 90 das, alcanzando en este punto el valor mximo, y despus disminuyeron a los 150 das de maduracin.

Cabe resaltar adems, que en las muestras del lote 3, los pptidos nmeros 13 y 14 presentaron una mayor altura de pico que en los otros dos lotes, tal y como puso de manifiesto el ACP en el caso de las muestras de 90 das de maduracin.

Se aplic el ACP a estas muestras con el objetivo de ver la evolucin de los pptidos de la fraccin soluble en etanol con el tiempo de maduracin. La Tabla 4.6 muestra los resultados obtenidos.

Los tres primeros CP explicaron el 67,67% de la varianza total. Al representar el conjunto de muestras en el plano definido por el CP 1 y el CP 2 se obtuvo la distribucin que se muestra en la Figura 4.25. En ella se aprecia la existencia de 3 grupos de muestras. A la derecha, en la parte positiva del CP 1 se encuentran las muestras de 45 das ms una de 90 das, las cuales poseen los mayores contenidos en los pptidos 25, 37, 32, 28 y 34, ms correlacionados con el CP 1. En la parte superior izquierda de la grfica estn situadas las restantes muestras de 90 das junto con las de 150 das, las cuales poseen las mayores cantidades de los pptidos 17, 18, 20 y 2. Por ltimo, en la parte inferior izquierda se encuentran las muestras con menor tiempo de maduracin (15 das), las cuales poseen pequeas cantidades de todos estos pptidos (los correlacionados con ambos ejes).

242

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

EtOH-Soluble 15 das

mA
2

15

19

50 25

LOTE 1
37 44 42 6 16 23 9 10 8 7 11 14 13 12 17 18 26 20 24 21 22 25 30 32 31 27 28 29 33 43 38 40 39 41

0
3

4 5

36 3435

-25

10

20

30

40

50

60 Minutos

mA 50 25 0 -25
1

15

LOTE 2
44 42 16 37 41 39 19 4 23 26 20 22 24 25 17 18 21 27 31 30 32 33 36 3435 38 40 43

6 5 3 7 8 9

10 11

13 12 14

28 29

10

30

40

50

60 Minutos

mA 50
1

15 2 19 37 42

LOTE 3
32

44

25
16 30

43 41 36 39 40 38 34 35 33

0
4 6

-25
3

7 8

10

13 14 11 12

17 18

28 31 26 27 29 21 23 20 22 24 25

10

20

30

40

50

60 Minutos

Figura 4.21: RP-HPLC cromatogramas de la fraccin de NS soluble en etanol al 70% de los quesos Manchegos de 15 das de maduracin, elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes (lotes 1, 2 y 3).
243

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

EtOH-Soluble 45 das

15

19

mA
1

32

2 37

LOTE 1
44 6 16 30 26 31 28 23 9 10 11 14 13 12 17 18 20 24 21 22 25 27 29 33 36 3435 40 41 38 39 42 43

5 2 0
3 4 5

-25

7 8

10

20

50

6 Minuto

mA
2

15

19

32

37

5 2 0 -25

1 30 16 31 26 6 23 4 3 5 7 8 10 9 14 13 12 11 17 18 28 25 27 29 20 21 24 22 33 34 36 35 38

LOTE 2
41 44 42

40 39

43

10

20

50

6 Minuto

mA 5
1

15 19 30 16 31

32

37

LOTE 3
44 42 34 28 36 33 35 38 40 41 39 43

2 0
6 23 26 25 24

14 13 7 8 9 11 12 10

17 18

20 21 22

27

29

-25
3

10

20

50

6 Minuto

Figura 4.22: RP-HPLC cromatogramas de la fraccin de NS soluble en etanol al 70% de los quesos Manchegos de 45 das de maduracin, elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes (lotes 1, 2 y 3).
244

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

EtOH-Soluble 90 das

mAU
1

2 15 6 16

19

50

LOTE 1
37 42 32 41

44

25

43

4 18 26 28 20 22 23 25 21 24 27 29 30 31 33 35 38 34 36 3940

-25
3

5 9 10 8 11

17 13 14 12

10

20

30

40

50

60 Minutos

mAU
1

15

19

32

37

50
16

LOTE 2
6 26 28 31 30 33 41 34 36 38 27 29 35 40 39 44 42 43

25

0
4 13 14 5 3 8 7 9 10 11 12 17 18 20 25 21222324

-25

10

20

30

40

50

60 Minutos

mAU 50 25

15 16

19 37

32

LOTE 3
44 41 33 34 36 38 35 40 39 42 43

30 14 13 26 21 23 18 20 22 24 25 28 31

0
4 5 8 3 7 9 10

-25

11 12

17

27

29

10

20

30

40

50

60 Minutos

Figura 4.23: RP-HPLC cromatogramas de la fraccin de NS soluble en etanol al 70% de los quesos Manchegos de 90 das de maduracin, elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes (lotes 1, 2 y 3).
245

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

EtOH-Soluble 150 das

mAU

15

50 25 0

6 19 4 16 32 13 17 18 28 31 20 23 21 29 26 22 24 25 27 30 34 35 36 38

LOTE 1
44 42 37 41 43

-25
5 3 7 8 9

11 10 12

14

33

3940

10

20

30

40

50

60 Minutos

mAU
1

15

50
6 16 19

32

LOTE 2
37 42 41 43 44

25

0
4 13 14 5 7 3 8 9 10 11 12 17 18 23 2022 26 25 21 24 27

28 30 31 29

33

34 35 38 36

40 39

-25

10

20

30

40

50

60 Minutos

mAU 50

2 1

15

LOTE 3
6 19 37 16 13 32 14 4 5 11 10 3 7 8 9 12 17 18 31 20 22 28 30 21 29 24 26 27 23 25 33 34 35 38 36 41 40 39 42

44

25

43

0 -25

10

20

30

40

50

60 Minutos

Figura 4.24: RP-HPLC cromatogramas de la fraccin de NS soluble en etanol al 70% de los quesos Manchegos de 150 das de maduracin, elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes (lotes 1, 2 y 3).
246

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

TABLA 4.6: Resultados del Anlisis de Componentes Principales de la fraccin soluble en etanol al 70% de los extractos solubles en agua de los quesos Manchegos de 15, 45, 90 y 150 das elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes (lotes 1, 2 y 3).

Componente Principal

Varianza explicada (%)

Varianza total (%)

Variables (picos) altamente correlacionadas con los CP y sus coeficientes 25 37 32 28 34 17 18 20 2 (0,956) (0,935) (0,934) (0,907) (0,902) (0,910) (0,898) (0,857) (0,852)

30,12

30,12

23,84

53,96

6,31

67,67

44 (0,926) 42 (0,909) 43 (0,884)

En la Figura 4.26 se muestra el dendrograma obtenido tras aplicar el Anlisis de Conglomerados a las muestras anteriores. Se puede observar la existencia de dos grupos generales: el primero contiene las muestras de 15 das, y el otro, el resto de muestras. Este segundo grupo se subdivide a su vez en otros dos: por un lado, las muestras de queso de 150 das y por otro, las de 90 y 45 das. Estos resultados concuerdan bastante con los obtenidos en el Anlisis de Componentes Principales.

Cabe destacar que, en este caso la separacin de las muestras de quesos por tiempos de maduracin fue mejor que en el caso de la fraccin insoluble en etanol.

247

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

2,0 1,5

Componente Principal 2

1,0 ,5 0,0 -,5 -1,0 -1,5 -2,0 -1,5 -1,0 -,5 0,0 ,5 1,0 1,5 2,0 2,5

Tiem po (d) 15 45 90 150

Com ponente Principal 1

Figura 4.25: Representacin en el plano definido por los dos Componentes Principales, obtenidos del ACP del perfil de pptidos de la fraccin soluble en etanol de las muestras de quesos Manchegos de 15, 45, 90 y 150 das elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes: lotes 1, 2 y 3.

Distancia Tiempo (d)

150 150 150 45 45 90 90 45 90 15 15 15 0 5 10 15 20 25 +---------+---------+---------+---------+---------+

Figura 4.26: Dendrograma obtenido del Anlisis de Conglomerados del perfil de pptidos de la fraccin soluble en etanol de las muestras de quesos Manchegos de 15, 45, 90 y 150 das elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes: lotes 1, 2 y 3.
248

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

4.3.6. Anlisis de aminocidos libres

Para completar y profundizar en el estudio de la proteolisis experimentada por las muestras de queso se realiz el anlisis de los aminocidos libres.

En la Figura 4.27 se muestra la evolucin de la concentracin de aminocidos libres totales de las muestras de queso de los tres lotes estudiados con el tiempo de maduracin.

mg aminocidos libres Kg-1 ES

40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 15 45 90 150

Tiempo de maduracin (d)

Lote 1 Lote 2 Lote 3

Figura 4.27: Evolucin del contenido en aminocidos libres totales a lo largo de la maduracin de los quesos Manchegos elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes: lotes 1, 2 y 3.

249

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

Las concentraciones de aminocidos libres totales aumentaron con la maduracin en los tres lotes, si bien en los lotes 2 y 3 se dio una disminucin a los 45 das y luego volvieron a aumentar de nuevo hasta el final de la maduracin. Al final del perodo de afinado el lote de quesos que present una mayor concentracin de aminocidos libres totales fue el lote 1 (35.681,44 mg/Kg ES), seguido por el lote 2 (30.318,57 mg/Kg ES) y con la menor concentracin, el lote 3 (24.939,26 mg/Kg ES).

En otras variedades de quesos, como el Suizo (Hintz et al., 1956), Edam (Ali, 1960), Cabrales (Sala-Trepat y Burgos, 1972), Ulloa (Ordez y Burgos, 1977), Cheddar (Weaver y Kroger, 1978; Wallace y Fox, 1997) y Mahn (Polo et al., 1985), as como tambin en el queso Manchego (Ordez y Burgos, 1980), en los que se estudi el contenido y evolucin en aminocidos libres totales durante la maduracin, tambin se observ un aumento progresivo del contenido total de los mismos con el tiempo de afinado.

Al igual que en el caso del anlisis de pptidos de las fracciones insoluble y soluble en etanol de estas muestras de quesos, el estudio de los aminocidos se realizar en primer lugar atendiendo al estudio de las posibles diferencias entre lotes (para las muestras de 90 das de maduracin) y despus a las diferencias por tiempos de maduracin (muestras de 15, 45, 90 y 150 das).

Se aplic el ANOVA de un factor a las muestras de quesos Manchegos de 90 das elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes (incluyendo los tres quesos independientes dentro de cada lote), considerando como factor el lote. Los resultados se muestran en la Tabla 4.7. Hubo diferencias significativas entre lotes para los siguientes aminocidos: asprtico, glutmico, cistena, tirosina y arginina.

A continuacin se aplic el Anlisis de Componentes Principales, a todo el conjunto de muestras de 90 das. En la Tabla 4.8 se recogen los resultados de este anlisis. Los dos primeros CP explicaron el 81,7% de la varianza total, y los aminocidos ms correlacionados con cada uno fueron: alanina, serina, metionina e isoleucina (con el CP 1) y cistena, arginina y leucina (con el CP 2).

250

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

TABLA 4.7: Valores medios1 y desviacin estndar de las concentraciones de aminocidos libres de los quesos Manchegos de 90 das de maduracin elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes.

aminocido Asp Thr Ser Glu Pro Gly Ala Cys Val Met Ile Leu Tyr Phe His Lys NH3 Arg
1

lote 1 596,25a 72,53 394,66 63,61 1189,30 212,05 4078,14a 645,67 891,38 203,57 269,10 94,30 538,55 101,60 384,71a 31,60 3000,73 426,48 491,11 95,89 616,54 154,24 4252,77 566,33 1190,84a 185,74 2333,97 364,10 528,89 65,56 1127,08 153,26 576,05a 61,76 52,30a 23,48

lote 2 880,32b 69,86 332,81 22,47 939,91 71,10 4188,38a 365,60 978,39 50,71 217,19 5,29 459,68 31,37 331,58a,b 14,51 2533,51 210,97 437,12 44,04 519,48 42,39 3469,04 288,01 709,88b 139,57 1773,51 168,57 735,99 246,09 1410,38 120,60 779,64a 136,34 172,02a 55,43

lote 3 543,65a 67,09 381,41 86,07 1374,80 320,80 2384,88b 462,56 809,48 132,85 186,92 61,25 616,29 164,97 269,84b 53,19 2525,65 451,70 660,61 120,37 632,14 125,69 3093,84 691,97 1253,76a 210,40 1949,73 475,10 469,26 166,91 1055,38 249,12 1088,74b 173,32 384,44b 151,80

a, b

: Cada valor corresponde a la media del anlisis de tres quesos independientes. : Medias en la misma fila con superndices distintos son significativamente diferentes entre s segn el test de Student-Newman-Keuls (p<0,05).

251

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

TABLA 4.8: Resultados del Anlisis de Componentes Principales de las concentraciones de aminocidos libres individuales de los quesos Manchegos de 90 das elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes.

Componente Principal

Varianza explicada (%)

Varianza total (%)

Variables (a) altamente correlacionadas con los CP y sus coeficientes ala ser met ile (0,967) (0,965) (0,954) (0,931)

51,26

51,26

30,41

81,67

cys (0,976) arg (-0,949) leu (0,925) asp (0,930) lys (0,895)

11,68

93,35

La Figura 4.28 muestra la representacin de las muestras en el plano definido por el CP 1 y el CP 2. Se puede observar que las muestras se separaron en tres grupos coincidiendo con los tres lotes de quesos, elaborados cada uno con un cultivo iniciador diferente. Las muestras del lote 2 constituyeron un grupo ms homogneo, con concentraciones intermedias de los aminocidos ms correlacionados con ambos ejes. Las muestras pertenecientes al lote 1, situadas en la parte positiva del CP 2, poseen altas concentraciones de cistena y leucina y bajas de arginina. Por ltimo las muestras del lote 3, situadas en la parte negativa del CP 2 poseen las concentraciones ms bajas de cistena y leucina y las ms elevadas de arginina.

Estos resultados concuerdan con los obtenidos en el ANOVA, si bien cabe destacar que existen pequeas diferencias al aplicar un mtodo estadstico u otro.

252

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

2,0 1,5

Componente Principal 2

1,0 ,5 0,0 -,5 -1,0 -1,5 -2,0 -2,0 -1,5 -1,0 -,5 0,0 ,5 1,0 1,5 2,0 2,5

Componente Principal 1

Figura 4.28: Representacin en el plano definido por los dos Componentes Principales obtenidos del ACP de las concentraciones de aminocidos libres individuales de las muestras de quesos Manchegos de 90 das elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes: lote 1 ( ), lote 2 ( ) y lote 3 ( ).

En la Tabla 4.9 se presentan los resultados en mg aminocidos libres individuales/ Kg ES de queso de las muestras de quesos Manchegos elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes, analizados a los 15, 45, 90 y 150 das de maduracin y en las Figuras 4.29 y 4.30 se representa la evolucin de estas concentraciones de aminocidos libres individuales frente al tiempo de maduracin. Los aminocidos mayoritarios a lo largo del perodo de maduracin estudiado fueron, en general para todas las fechas consideradas, glutmico, valina, leucina, fenilalanina y lisina, para los tres lotes de quesos.

253

Tabla 4.9: Concentracin de aminocidos libres (mg/Kg ES) de las muestras de queso Manchegos elaborados con los tres cultivos iniciadores (lotes 1, 2 y 3)
45 das Lote 3 1084,62 459,46 1188,13 2551,52 696,55 168,92 691,68 249,05 1656,70 559,10 654,60 2096,66 689,75 1348,95 461,58 1501,40 482,56 623,69 17164,91 12693,32 0,00 424,72 853,96 557,57 10616,83 925,34 656,93 210,03 292,01 1338,98 699,06 1040,79 354,28 583,83 1657,93 0,00 11801,68 777,07 301,37 789,88 2307,45 1584,80 1542,94 3598,91 976,47 1913,56 598,96 950,93 522,54 39,90 18767,01 226,42 187,93 295,93 439,50 202,96 188,36 302,42 380,39 1896,86 1314,86 1447,86 2516,86 2776,94 487,78 568,43 3801,58 826,58 1967,37 1013,20 1549,55 697,50 134,42 22860,34 308,42 189,87 255,09 354,40 347,27 281,11 209,76 420,57 425,66 495,35 64,17 74,67 84,23 176,68 222,72 257,64 806,24 329,25 3044,27 792,40 773,67 3876,92 1482,80 2491,69 568,23 1342,28 1282,85 212,05 23985,75 475,88 506,83 619,79 714,39 1022,78 962,70 1931,16 2063,65 1015,50 3346,17 4610,48 2917,97 665,59 345,95 780,06 967,79 1021,97 1743,59 1681,44 7362,65 1746,22 404,72 899,15 390,07 3948,40 846,45 1139,38 6592,30 1664,08 3107,71 1354,00 2215,02 1066,55 0,00 35681,44 198,79 81,33 210,50 325,10 355,58 480,67 468,39 458,37 507,93 400,07 518,79 960,85 620,51 794,93 Lote 1 Lote 2 Lote 3 Lote 1 Lote 2 Lote 3 Lote 1 Lote 2 1052,32 402,98 1440,06 6733,77 1516,92 316,29 742,19 318,37 3276,87 776,05 938,21 4709,73 662,56 2174,01 1025,31 2495,98 1221,47 515,49 30318,57 90 das 150 das Lote 3 721,24 402,10 1647,73 2855,43 1501,22 340,93 786,82 285,06 2898,73 665,38 830,81 4329,07 1424,89 2243,97 591,77 1956,88 1070,62 386,60 24939,26

15 das

Aminocido (g/g ES)

Lote 1

Lote 2

Asp 580,66

374,31

1273,88

Thr

153,47

Ser

456,41

1053,33

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

Glu 779,41 134,10 713,02 225,27

1306,74

3662,16

Pro

441,41

254
590,52 855,66 714,85 588,78 791,34 672,16

Gly

62,84

Ala

259,54

Cys

154,67

Val

805,31

1382,53

Met

164,64

Ile

244,11

Leu

1127,61

2039,53

Tyr

443,20

Phe

604,17

1030,62

His

127,04

Lys

371,07

1604,82

NH3

211,62

Arg

208,38

TOTAL

7516,54

18692,66

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

Estos aminocidos fueron tambin los predominantes durante la maduracin de otras variedades diferentes de quesos, como en los quesos Gruyre y Sbrinz (Lavanchy y Sieber, 1993).

En queso Cheddar los aminocidos libres ms abundantes durante la maduracin fueron glutmico, leucina, valina, isoleucina, lisina y fenilalanina (Law et al., 1976; Dilanian, 1980; Hickey et al., 1983; Puchades et al., 1989; Wilkinson, 1993).

Tambin, Barcina et al., (1995) observaron que los aminocidos libres mayoritarios en queso Idiazbal (elaborado con leche de oveja) a lo largo de la maduracin fueron glutmico (con un valor de 275,9 mg/100 g ES a los 180 das de maduracin), leucina (125,4 mg/100 g ES), valina (81,3 mg/100 g ES), fenilalanina (78,5 mg/100 g ES) y lisina (73,9 mg/100 g ES). Menda et al. (2000) en un estudio realizado tambin en quesos Idiazbal elaborados con leche cruda, leche cruda adicionada con cultivo starter y con leche pasteurizada con cultivo starter, encontraron como aminocidos mayoritarios en los tres casos glutmico, leucina y valina.

Ordez y Burgos (1980) encontraron que los aminocidos libres mayoritarios en queso Manchego conservado en aceite de oliva fueron lisina, leucina, valina, fenilalanina e isoleucina. En estos quesos el cido glutmico no fue el aminocido mayoritario como ocurre en la mayora de las variedades.

En las muestras de queso Manchego del presente estudio elaboradas con los tres cultivos iniciadores diferentes se observ, como era de esperar, una tendencia de casi todos los aminocidos a aumentar con el tiempo de maduracin, ya que a medida que transcurre la proteolisis stos van siendo liberados por los agentes proteolticos, fundamentalmente por los enzimas microbianos, a travs de diferentes procesos bioqumicos que tienen lugar durante la maduracin del queso. La proteolisis de la s1casena, la cual posee un elevado contenido en los aminocidos leucina, fenilalanina y valina, se da durante los primeros das de la maduracin, y predomina sobre la proteolisis de la -casena (Frau et al., 1997). El elevado contenido en cido glutmico de las muestras de queso podra ser debido a la contribucin de diferentes factores, como el

255

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0

15 das

mg kg-1 ES

Asp Thr

Ser

Glu Pro

Gly Ala Cys Val Met

Ile

Leu Tyr Phe

His

Lys NH3 Arg

Aminocido

7000 6000

45 das

mg kg-1 ES

5000 4000 3000 2000 1000 0

Asp Thr Ser Glu Pro Gly Ala Cys Val Met Ile Leu Tyr Phe His Lys NH3 Arg

Aminocido Lote 1 Lote 2 Lote 3

Figura 4.29: Evolucin del contenido en aminocidos libres individuales (mg/Kg ES de queso) a los 15 y 45 das de maduracin de las muestras de los quesos Manchegos elaborados con cultivos iniciadores diferentes: lotes 1, 2 y 3.

256

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

7000 6000 5000

90 das

mg kg-1 ES

4000 3000 2000 1000 0

Asp Thr Ser Glu Pro Gly Ala Cys Val Met Ile Leu Tyr Phe His Lys NH3 Arg

Aminocido

7000 6000 5000

150 das

mg kg-1 ES

4000 3000 2000 1000 0

Asp Thr Ser Glu Pro Gly Ala Cys Val Met Ile Leu Tyr Phe His Lys NH3 Arg

Aminocido

Lote 1

Lote 2

Lote 3

Figura 4.30: Evolucin del contenido en aminocidos libres individuales (mg/Kg ES de queso) a los 90 y 150 das de maduracin de las muestras de los quesos Manchegos elaborados con cultivos iniciadores diferentes: lotes 1, 2 y 3.

257

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

elevado porcentaje de glutmico en la casena y la formacin de glutmico a partir de glutamina, valina, leucina e isoleucina, debido a las actividades glutaminasa y transaminasa. Aunque la prolina es uno de los aminocidos mayoritarios en la -casena, las concentraciones de prolina libre no fueron muy elevadas en las muestras de quesos estudiadas, lo cual es indicativo del bajo grado de hidrlisis experimentado por la casena.

Se aplic el ACP a los resultados de los aminocidos libres de las muestras de queso de 15, 45, 90 y 150 das, para los tres lotes de quesos elaborados. Este anlisis gener dos CP, los cuales explicaron el 88,8% de la varianza total (Tabla 4.10). Los aminocidos ms correlacionados con cada eje fueron fenilalanina, valina, leucina, cistena y tirosina, con el CP 1, y cido asprtico y arginina con el CP 2. Al representar el conjunto de muestras en el plano definido por estos dos CP se obtuvo la Figura 4.31. Se observa la existencia de cuatro grupos, los cuales coinciden con los cuatro tiempos de maduracin estudiados, si bien una de las muestras de 15 das aparece agrupada con las de 45 das. Las muestras situadas en la parte negativa del CP 1 (muestras de 15 y 45 das) poseen menores contenidos en los aminocidos phe, val, leu, cys y tyr que las muestras situadas en la parte positiva del mismo (muestras de 90 y 150 das de maduracin). Teniendo en cuenta que este CP explic un elevado porcentaje de la varianza total (75,6%), se puede decir que el contenido en estos aminocidos libres separ al conjunto de las muestras en dos grupos generales: muestras de corto tiempo de maduracin y muestras con un elevado tiempo de maduracin. Cuando se aplic a estas muestras el Anlisis de Conglomerados se obtuvieron los mismos grupos: por un lado las muestras de 15 y 45 das, y por otro las de 90 y 150 das (Figura 4.32).

Finalmente se aplic el anlisis de correlacin de las concentraciones de aminocidos libres con el tiempo de maduracin. En la Tabla 4.11 se muestran los coeficientes de correlacin de los aminocidos libres con el tiempo de maduracin. Las concentraciones de aminocidos libres individuales presentaron una correlacin con el tiempo superior a 0,9 en los quesos del lote 1 para todos los aminocidos excepto para la arginina. En el caso de los quesos del lote 2, solamente se obtuvieron coeficientes de correlacin superiores a 0,9 para los aminocidos prolina, glicina, valina y leucina, y en

258

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

TABLA 4.10: Resultados del Anlisis de Componentes Principales de las concentraciones de aminocidos libres individuales de los quesos Manchegos de 15, 45, 90 y 150 das de maduracin elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes.

Componente Principal

Varianza explicada (%)

Varianza total (%)

Variables (a) altamente correlacionadas con los CP y sus coeficientes phe val leu cys tyr (0,980) (0,961) (0,957) (0,934) (0,902)

75,62

75,62

13,18

88,80

asp (0,894) arg (0,849)

2,0 1,5

Componente Principal 2

1,0 ,5 0,0 -,5 -1,0 45 -1,5 -2,0 -2,0 -1,5 -1,0 -,5 0,0 ,5 1,0 1,5 2,0 2,5 150 15

Tiempo (d)
90

Componente Principal 1
Figura 4.31: Representacin en el plano definido por los dos Componentes Principales obtenidos del ACP del contenido en aminocidos libres, de las muestras de quesos Manchegos de 15, 45, 90 y 150 das elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes

259

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

Distancia Tiempo (d)

15 45 45 15 45 15 90 150 150 90 150 150 0 5 10 15 20 25 +---------+---------+---------+---------+---------+

Figura 4.32: Dendrograma obtenido del Anlisis de Conglomerados del contenido en aminocidos libres de las muestras de quesos Manchegos de 15, 45, 90 y 150 das elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes: lotes 1, 2 y 3.

las muestras del lote 3 para prolina, glicina, leucina y tirosina. Los menores coeficientes de correlacin se obtuvieron para la arginina. Esto ltimo est de acuerdo con lo encontrado por otros autores en otros tipos de quesos, como el Appenzeller, Emmmental, Gruyre, Raclette, Sbrinz y Tilsiter (Btikofer y Fuchs, 1997) y es importante que este aminocido no aumente con la maduracin, ya que es responsable de sabores amargos (Kirimura et al., 1969; Lemieux y Simard, 1992).

Otros autores obtuvieron tambin buenas correlaciones de los aminocidos libres con el tiempo de maduracin. As, en queso Idiazbal, los coeficientes de correlacin fueron superiores a 0,9 para los aminocidos glutmico, valina, leucina, fenilalalina y lisina 0,982, 0,935, 0.980, 0,968, 0,984, respectivamente, Barcina et al. (1995). Tambin Garca-Palmer et al. (1997) y Btikofer y Fuchs (1997) encontraron una alta correlacin de la mayora de los aminocidos libres con el tiempo en quesos Mahn y Emmental, respectivamente.

Grierson (1985) utiliz las concentraciones de aminocidos libres para predecir el tiempo de maduracin del queso Cheddar, obteniendo buenos coeficientes de correlacin

260

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

TABLA 4.11: Coeficientes de correlacin de los aminocidos libres con el tiempo de maduracin para los quesos Manchegos elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes (lotes 1, 2 y 3).

aminocido Asp Thr Ser Glu Pro Gly Ala Cys Val Met Ile Leu Tyr Phe His Lys NH3 Arg

LOTE 1
0,980 0,996 0,988 0,971 0,939 0,963 0,954 0,923 0,994 0,965 0,938 0,992 0,988 0,997 0,977 0,954 0,974 -0,678

LOTE 2 0,244 0,089 0,710 0,882 0,909 0,919 0,472 0,817 0,954 0,665 0,496 0,939 0,413 0,897 0,814 0,779 0,819 -0,245

LOTE 3 0,011 0,449 0,811 0,661 0,964 0,905 0,748 0,805 0,880 0,680 0,760 0,921 0,911 0,833 0,880 0,748 0,419 0,051

para los cidos glutmico (0,90), fenilalanina (0,94) y prolina (0,91). En este estudio se observ que la concentracin de aminocidos era un buen indicador de la maduracin del queso Cheddar, aunque no pudo predecirse con precisin el tiempo de maduracin de las muestras.

261

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

4.3.7. Anlisis sensorial

En las Tablas 4.12 (A)y 4.12 (B) se presentan los resultados obtenidos de aplicar el anlisis estadstico de comparacin de medias a las puntuaciones dadas por los catadores o jueces a las muestras de queso evaluadas, considerando como factor el lote y el tiempo de maduracin, respectivamente.

A la vista de estos resultados se puede decir que desde el punto de vista sensorial, apenas existieron diferencias significativas entre las muestras de los diferentes lotes de quesos entre s (Tabla 4.12 (A)) a excepcin de los atributos de fragilidad y de elasticidad, para los cuales las muestras de quesos elaborados con el cultivo iniciador 1 fueron significativamente diferentes al resto (ms frgiles y menos elsticas). Tambin hubo diferencias significativas entre los tres lotes para el atributo salado a los 120 y a los 150 das. Cabe decir que, en general, los quesos que recibieron una mayor puntuacin para la calidad y la intensidad del olor y para la impresin global fueron los quesos de los lotes 1 y 2, y especialmente los del lote 1. Aunque las diferencias para la impresin global no fueron significativas para las fechas de maduracin intermedias, s lo fueron al principio (60 das) y al final de la maduracin (150 das).

En cuanto al estudio realizado considerando las muestras con distintos tiempos de maduracin (Tabla 4.12(B)) fueron las muestras de queso del lote 3 las que presentaron diferencias significativas en un mayor nmero de atributos.

Al comparar las puntuaciones otorgadas por los jueces para las muestras de diferentes tiempos de maduracin, dentro de cada lote, se observ que tanto la intensidad del olor como la calidad del olor, aumentaron progresivamente conforme avanzaba el tiempo de maduracin, en los tres lotes de quesos. Sin embargo, slo se encontraron diferencias significativas en el casode la intensidad del olor, en las muestras de quesos del lote 1.

En cuanto a los atributos de textura evaluados (dureza, fragilidad y elasticidad), cabe destacar que las muestras con un mayor tiempo de maduracin presentaron

262

abla 4.12 (A): Puntuaciones medias de los atributos sensoriales de las muestras de quesos Manchegos elaborados con tres cultivos iniciadores

distintos (lotes 1, 2 y 3), evaluadas a los 60, 90, 120 y 150 das de maduracin.

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

263

TRIBUTO int. Olor alid. Olor dureza ragilidad lasticidad dherencia pastoso grasiento con agua picante cido salado amargo mp. global

1 4,7 5,4 4,6 4,4a 2,0a 4,6 5,1 4,4 2,7 2,2 4,5 5,0 3,5 5,9a

60 d Lote 2 4,6 5,5 3,9 3,1b 2,6b 5,4 4,8 3,9 3,6 1,4 4,4 6,9 2,6 4,9a,b 3 3,7 3,9 3,6 2,7b 2,7b 5,2 4,8 3,7 4,5 1,3 6,1 5,8 5,5 2,6b 1 5,5 5,3 5,1 3,7 1,7 4,8 5,3 4,0 2,8 3,1 5,0 5,4 3,5 4,8 3 4,3 4,6 3,6 2,1 2,6 4,9 4,0 3,6 3,7 1,5 5,3 4,9 4,2 4,5 1 6,2 6,0 5,2 3,5 1,7 4,7 5,0 5,2 1,7 2,7 4,7 5,8a 4,9 5,9 3 4,3 5,5 4,9 2,9 1,3 4,9 4,8 5,5 1,6 1,7 4,6 5,5c 4,3 5,2 1 7,2a 6,5 5,4 5,4 1,1 4,9 5,2 5,7 2,0 2,8 4,9 6,1a 4,1 6,0a

90 d Lote 2 4,9 5,0 4,5 3,5 1,4 5,0 5,3 4,1 2,6 1,7 5,0 7,0 2,9 4,4

120 d Lote 2 5,9 6,0 5,8 4,5 1,8 6,1 5,4 5,0 2,3 2,7 4,2 7,1b 3,7 5,6

150 d Lote 2 6,2b 6,0 5,7 5,2 0,8 4,4 5,2 4,9 3,1 2,1 4,9 7,4a,b 4,8 5,3,b

3 5,7b 5,9 6,8 6,3 0,6 4,6 5,9 4,7 2,1 2,9 6,5 8,4b 5,0 4,0b

Resultados y Discusin

a, b

: Cada valor corresponde a la media del anlisis por duplicado. : Medias en la misma fila con superndices distintos, para cada tiempo de maduracin, son significativamente diferentes entre s segn el test de Student-NewmanKeuls (p<0,05).

bla 4.12 (B): Puntuaciones medias de los atributos sensoriales de las muestras de quesos Manchegos evaluadas a los 60, 90, 120 y 150 das de

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

maduracin, elaborados con tres cultivos iniciadores distintos (lotes 1, 2 y 3)

264

ATRIBUTO int. Olor calid. Olor dureza fragilidad elasticidad adherencia pastoso grasiento con agua picante cido salado amargo Imp. global

LOTE 1 tiempo de maduracin(d) 60 90 120 a a,b 4,7 5,5 6,2a,b 5,4 5,3 6,0 4,6 5,1 5,2 4,4a,b 3,7a 3,5a 2,0a 1,7a,b 1,7a,b 4,6 4,8 4,7 5,1 5,3 5,0 4,4 4,0 5,2 2,7 2,8 1,7 2,2 3,1 2,7 4,5 5,0 4,7 5,0 5,4 5,8 3,5 3,5 4,9 5,9 4,8 5,9 150 7,2b 6,5 5,4 5,4b 1,1b 4,9 5,2 5,7 2,0 2,8 4,9 6,1 4,1 6,0

LOTE 2 tiempo de maduracin(d) 60 90 120 150 4,6 4,9 5,9 6,2 5,5 5,0 6,0 6,0 3,9 4,5 5,8 5,7 3,1a 3,5a,b 4,5a,b 5,2b 2,6 1,4 1,8 0,8 5,4 5,0 6,1 4,4 4,8 5,3 5,4 5,2 3,9 4,1 5,0 4,9 3,6 2,6 2,3 3,1 1,4 1,7 2,7 2,1 4,4 5,0 4,2 4,9 6,9 7,0 7,1 7,4 2,6 2,9 3,7 4,8 4,9 4,4 5,6 5,3

LOTE 3 tiempo de maduracin(d) 60 90 120 150 3,7 4,3 4,3 5,7 3,9 4,6 5,5 5,9 3,6a 3,6a 4,9a 6,8b 2,7a 2,1a 2,9a 6,3b 2,7 2,6 1,3 0,6 5,2 4,9 4,9 4,6 a b a 4,8 4,0 4,8 5,9c 3,7a 3,6a 5,5b 4,7c 4,5 3,7 1,6 2,1 1,3 1,5 1,7 2,9 6,1a 5,3a,b 4,6b 6,5a 5,8 4,9 5,5 8,4 5,5 4,2 4,3 5,0 2,6 4,5 5,2 4,0

a, b

: Cada valor corresponde a la media del anlisis por duplicado. : Medias en la misma fila con superndices distintos, dentro de cada lote, son significativamente diferentes entre s segn el test de Student-Newman-Keuls (p<0,05).

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

puntuaciones ms elevadas para la dureza y la fragilidad, respecto a las muestras con un menor tiempo de maduracin. Las muestras de 150 das de maduracin correspondientes al lote 3, fueron las ms duras, segn evaluaron los jueces. De forma inversa, la elasticidad present una tendencia a disminuir conforme avanzaba la maduracin, existiendo diferencias significativas entre los distintos tiempos slo para los quesos del lote 1. Los atributos pastoso, grasiento, cido y salado aumentaron desde el principio hasta el final de la maduracin.

Se aplic el ACP a las puntuaciones medias dadas por los catadores a las distintas muestras de quesos. En la Tabla 4.13 se muestran los resultados de este anlisis.

Los tres primeros CP explicaron un 77,20% de la varianza total. Las variables ms correlacionadas con el CP 1 fueron el carcter grasiento, la calidad del olor, la presencia de agua y la intensidad del olor. Por otro lado el CP 2 estuvo ms correlacionado con el atributo salado.

En la Figura 4.33 se muestra la distribucin de las muestras obtenida al representar el eje CP 1 frente al CP 2. En lneas generales se puede destacar, que a lo largo del eje CP 1 las muestras se distribuyeron segn su tiempo de maduracin. As, las muestras de 60 y 90 das se encuentran en la parte negativa del eje, mientras que las muestras de 120 y 150 das estn situadas en la parte positiva del mismo. Esto quiere decir que, las muestras menos maduras poseen una menor calidad del olor, y son menos grasientas para los catadores que las ms maduras, y tambin poseen un mayor contenido en agua. Por otro lado, las muestras se distribuyeron a lo largo del CP 2 fundamentalmente segn su sabor salado.

A la vista de los resultados obtenidos del anlisis sensorial se puede decir, que si bien las diferencias entre lotes obtenidas tras aplicar el ANOVA slo fueron significativas en algunos casos, se observ que las puntuaciones para la intensidad del olor, la calidad del olor y la impresin global fueron mayores para los quesos del lote 1, seguidos de los del lote 2 (Tabla 4.12), ambos elaborados con los cultivos iniciadores definidos, obteniendo las muestras del lote 3 (elaboradas con el cultivo mixto comercial) las

265

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

TABLA 4.13: Resultados del Anlisis de Componentes Principales de las puntuaciones otorgadas por los catadores a los quesos Manchegos de 15, 45, 90 y 150 das de maduracin elaborados con tres cultivos iniciadores diferentes.

Componente Principal

Varianza explicada (%)

Varianza total (%)

Variables altamente correlacionadas con los CP y sus coeficientes Grasiento (0,929) Calidad olor (0,901) Con agua (-0,895) Intens. olor (0,838) Salado Amargo cido (0,894) (0,871) (0,804)

48,29

48,29

2 3

17,16 11,74

65,45 77,20

3 3

150 150
2

Componente Principal 2 Componente Principal 2

1 1

60 60

90 90

150 120 150 120 90 60 90 60 150 150 120 120 120 120

60 60 90 90

-1 -1

-2 -2 -2,0 -1,5 -1,0 -2,0 -1,5 -1,0 -,5 -,5 0,0 0,0 ,5 ,5 1,0 1,0 1,5 1,5 2,0

LOTE LOTE 1 1 2 2 3 3
2,0

Componente principal 1 Componente principal 1

Figura 4.33: Representacin de las muestras en el plano definido por los dos primeros Componentes Principales obtenidos del ACP segn los resultados del Anlisis Sensorial
266

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Resultados y Discusin

puntuaciones ms bajas. Lo mismo sucedi al aplicar el ACP, el cual diferenci poco a las muestras por lotes (Figura 4.33). De estos resultados se podra concluir que, en las fechas de maduracin estudiadas los jueces no fueron capaces de apreciar grandes diferencias entre los quesos elaborados con los distintos cultivos iniciadores, y que quizs los mayores cambios empezaran a apreciarse desde el punto de vista sensorial a partir de los 5 meses de maduracin.

Gonzlez-Vias et al. (2001b), en un estudio realizado sobre los cambios experimentados en las caractersticas sensoriales del queso Manchego a lo largo de la maduracin, comprobaron que para poder detectar cambios aparentes en el queso, se necesitaba un tiempo mnimo de 4 5 meses de maduracin.

267

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Conclusiones

4.4. CONCLUSIONES
1. Los recuentos microbianos del gnero Lactobacillus en los lotes de queso 1 y 3 (en los que no formaban parte del cultivo iniciador) slo fueron nulos al principio de la maduracin, alcanzando niveles de 106-107 a los 90 das, manteniendose ms o menos estables hasta el final de la maduracin (150 das). Los recuentos de Lactobacillus en los quesos del lote 2 (en los cuales haban sido aadidos expresamente como parte del cultivo iniciador) fueron superiores a los de los otros dos lotes en todas las fechas de maduracin estudiadas.

2. En general, se encontraron pocas diferencias significativas en los parmetros fsicoqumicos y en las fracciones nitrogenadas entre los tres lotes de quesos elaborados con los distintos cultivos iniciadores. S hubo diferencias significativas entre las muestras de queso con distintos tiempos de maduracin, sobre todo para el extracto seco, el pH y la actividad del agua, as como para las fracciones nitrogenadas.

3. El anlisis estadstico multivariante del anlisis de pptidos por RP-HPLC, basado en el reconocimiento de los picos utilizando como variables la altura de los picos, result ser un mtodo eficaz para evaluar el efecto de los diferentes starters en la proteolisis del queso Manchego.

4. Las muestras de queso con un mismo tiempo de maduracin (90 das) presentaron un perfil de pptidos de la fraccin de NS insoluble en etanol al 70% diferente segn el cultivo iniciador empleado en su fabricacin. As, al aplicar el Anlisis de Componentes Principales, las muestras se separaron en tres grupos, que coincidan con los tres lotes de quesos elaborados cada uno con un cultivo iniciador diferente. Estos resultados fueron corroborados por el anlisis de Conglomerados.

5. Lo mismo sucedi en el caso de los pptidos de la fraccin de NS soluble en etanol al 70% de las muestras de 90 das, clasificndose las muestras de nuevo en los tres grupos correspondientes a los tres cultivos iniciadores diferentes, tanto en el Anlisis de Componentes Principales como en el Anlisis de Conglomerados.

269

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

6. Al aplicar el Anlisis de Componentes Principales a los perfiles peptdicos de la fraccin de NS soluble en etanol al 70% de las muestras con distintos tiempos de maduracin, stas se agruparon en muestras de bajo, medio y largo tiempo de maduracin. Tambin se observ un agrupamiento similar en el caso del Anlisis de Conglomerados.

7. Los aminocidos libres mayoritarios encontrados en el queso Manchego fueron glutmico, leucina, valina, isoleucina, lisina y fenilalanina. En general, los aminocidos aumentaron a medida que lo haca el tiempo de maduracin de los quesos.

8. Las muestras de los quesos Manchegos elaborados con tres cultivos iniciadores distintos se diferenciaron significativamente entre lotes en cuanto a su contenido en los aminocidos asprtico, glutmico, cistena, tirosina y arginina.

9. El Anlisis de Componentes Principales aplicado a la concentracin de aminocidos libres individuales de los quesos de 90 das de maduracin clasific a las muestras en los tres grupos correspondientes a los tres lotes de quesos elaborados con cultivos iniciadores diferentes. Por otro lado, el Anlisis de Componentes Principales aplicado a las muestras de distintos tiempos de maduracin, tambin separ las muestras de queso en 4 grupos, correspondientes a cada una de las fechas de maduracin estudiadas.

10. En los tres lotes de quesos analizados se obtuvieron buenos coeficientes de correlacin con el tiempo de maduracin para los aminocidos prolina, glicina, valina, leucina, fenilalanina e histidina.

11. El Anlisis de Componentes Principales aplicado a las puntuaciones otorgadas por los catadores a los quesos Manchegos de los distintos tiempos de maduracin y elaborados con los tres cultivos iniciadores diferentes puso de manifiesto que los atributos que ms contribuyeron a separar las muestras fueron el carcter grasiento, la calidad del olor y la intensidad del olor, siendo las muestras con mayor tiempo de

270

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Conclusiones

maduracin las que presentaron las puntuaciones ms altas para dichos atributos. En todas las fechas de maduracin consideradas, la impresin global result ser mejor para los quesos de los lotes 1 y 2, elaborados con los cultivos iniciadores definidos, que contenan las especies Lactococcus lactis subsp. lactis, Leuconostoc
mesenteroides subsp. dextranicum y Lactobacillus plantarum, las cuales haban sido

aisladas de quesos Manchegos artesanales.

271

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Bibliografa

4.5. BIBLIOGRAFA

-Accolas, J. P., Heme, D., Desmazeaud, M. J., Vasssal, L., Bouillanne, C. y Veaux, M. (1980). Le Lait 60, 487-524. -Ali, L. A. M. (1960). The amino acid content of Edam cheese. Meded. Landbouwhogesch.
Wageningen 60, 1.

-Andrews, A. T. (1983). Proteinases in normal bovine milk and their action on caseins.
Journal of Dairy Research 50, 45-55.

-AOAC: Official Methods of Analysis. (1995). 13th edition. Washington D. C. -APHA (1976). Recomended Methods for the Microbiological Examination of Foods. American Public Association, Washington, USA. -Barcina, Y., Ibez, F. C. y Ordez, A. I. (1995). Evolution of free amino acids during Idiazbal cheese ripening. Food Control 6, 161-164. -Bartels, H. J., Jonhson, M. E. y Olson, M. F. (1987). Accelerated ripening of Gouda cheese. 2. Effect of freeze-shocked Lactobacillus helveticus on proteolysis and flavour development. Milchwissenschaft 42, 83-88. -Beresford, T., Pelez, C. y Jimeno, J. (1998). Nature and growth of non starter flora.
Proceedings COST Action 95. Improvement of the quality of the production of raw milk cheeses, 225-238.

-Blakesley, R. W. y Boezi, J. A. (1977). A new staining technique for proteins in polyacrilamide gels using Coomassie Brilliant Blue G 250. Analytical Biochemistry 82, 580-581. -Bouton, Y. y Grappin, R. (1995). Comparaison de la qualit de fromages pte prese cuite fabriqus partir de lait cru ou microfiltr. Lait 75, 31-44. -Btikofer, U. y Fuchs, D. (1997). Development of free amino acids in Appenzeller, Emmentaller, Gruyre, Raclette, Sbrinz and Tilsiter cheese. Lait 77, 91-100.

273

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

-Cogan, T. M., Barbosa, M., Beuvier, E., Bianchi-Salvadori, B., Cocconcelli, P., Fernndez, I., Gmez, J., Kalantzopoulos, G., Ledda, A., Medina, M., Rea, M. y Rodrguez, E. (1997). Characterization of the lactic acid bacteria in artisanal dairy products.
Journal of Dairy Research 64, 409-421.

-COST 95 (1999). A guide for the sensory evaluation of the texture of hard and semi-hard ewes milk cheeses. Ed. Cresson. European Commission, B-1049. Brussels. -Desmazeaud, M. J.y Gripon, J. C. (1977). General mechanisms of protein breakdown during cheese ripening. Michwissenschaft 32, 731-734. -Devoyod, J. J. y Muller, M. (1969). Le flore microbienne du fromage de Roquefort. III. Les streptocoques lactiques et les Leuconostoc. Influence de diffrents microorganismes de contamination. Le Lait 49, 369-399. -Devoyod, J. J. y Poullain, F. (1988). The Leuconostocs. Characteristics: their role in dairy technology. Le Lait 68, 249-280. -Dilanian, Z. C. (1980). Cheese manufacturing by intensified lactic fermentation of the milk and melting of the curd. Milchwissenschaft 35, 614-616. -El Soda, M. y Desmazeaud, M. J. (1982). Les peptide-hydrolases des Lactobacillus du grupe
Thermobacterium . I. Mise en evidence des ces activits chez Lactobacillus helveticus , L. acidophilus, L. lactis et L. bulgaricus. Can Microbiol. 28, 1181-1188.

-El Soda, M., Desmazeaud, M. J. y Bergre, J. L. (1978). Peptide hydrolases of Lactobacillus

casei: isolation and general properties of various peptidases activities. Journal of Dairy Research 45, 445-455.

-El Soda, M., Fathallah, S., Ezzat, N., Desmazeaud, M. J. y Abou Donia, S. (1986). The esterolytic and lipolytic activities of Lactobacilli . Detection of the esterase systems of Lactobacillus casei, Lactob. plantarum, Lactob. brevis and Lactob. fermentum.
Science des Aliments 6, 545-557.

274

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Bibliografa

-El Soda, M., Said, H., Desmazeaud, M. J., Mashaly, R. y Ismail, A. (1983). The intracellular peptide-hydrolases of Lactobacillus plantarum. Comparison with Lactobacillus
casei. Le Lait 63, 1-14.

-Fontecha J., Pelez, C. y Jurez, M. (1994). Biochemical characteristics of a semi-hard ewes milk cheese. Zeitschift Lebensmittel Untersuchung Forschung 198, 24-28. -Fox, P. F., McSweeney, P. L. H. y Lynch, C, M, (1998). Significance of non-starter lactic acid bacteria in Cheddar cheese. Australian Journal of Dairy Technology 53, 83-89. -Frau, M, Massanet, J., Rossell, C., Simal, S. y Caellas, J. (1997). Evolution of free amino acid content during ripening of Mahn cheese. Food Chemistry 60, 651-657. -Garca, A., Palop, M. L. y Cabezas, L. (1997). Properties of lactic acid bacteria isolated from Manchego cheeses suitable for industrial applications. Microbiologie-AlimentsNutrition 15, 237-240.

-Garca, A., Cabezas, L. y Palop, M. L. (1995). Identificacin de la flora lctica en quesos de Denominacin de Origen Manchego. Microbiologie-Aliments-Nutrition 13, 275280. -Garca-Palmer, J., Serra, N., Palou, A. y Gianotti, M. (1997). Free amino acids as indices of Mahn cheese ripening. Journal of Dairy Science 80, 1908-1917. -Garca-Ruiz, A., Cabezas, L., Martn-lvarez, P. J. y Cabezudo, M. D. (1998). Prediction of the ripening times of Manchego cheese using multivariate statistical analyse: a preliminary study. Zeitschift Lebensmittel Untersuchung Forschung A 206, 382-386. -Gaya, P., Medina, M., Rodrguez-Marn, M. A. y Nez, M. (1990). Accelerated ripening of ewes milk Manchego cheese: the effect of elevated ripening temperatures. Journal
of Dairy Science 73, 26-32.

-Gmez, M. J., Rodrguez, E., Gaya, P., Nez, M. y Medina, M. (1999). Characteristics of Manchego cheese manufactured from raw and pasteurized ovine milk and with defined-strain or commercial mixed-strain starter cultures. Journal of Dairy Science 82, 2300-2307.

275

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

-Gmez, M. J., Gaya, P., Nez, M. y Medina, M. (1996a). Effect of Lactobacillus plantarum as adjunct starter on the flavour and texture of a semi-hard cheese made from pasteurized cows milk. Lait 76, 461-472. -Gmez, M. J., Gaya, P., Nez, M. y Medina, M. (1996b). Debittering activity of peptidases from selected lactobacilli strains in model cheeses. Milchwissenschaft 51, 315-319. -Gonzlez-Vias, M. A., Poveda, J. M. y Cabezas, L. (2001 a). Sensory and chemical evaluation of Manchego cheese and other cheese varieties available in the Spanish market. Journal of Food Quality 24, 157-165. -Gonzlez-Vias, M. A., Poveda, J. M., Garca-Ruiz, A. y Cabezas, L. (2001 b). Changes in chemical, sensory and rheological characteristics of Manchego cheeses during ripening. Journal of Sensory Studies 16, 361-371. -Grierson, G. R. (1985). The liberation of water soluble nitrogen during cheese ripening. South African Journal of Dairy Technology 17, 71. -Hickey, M. W., Van Leeuwen, H., Hilier, A. J. y Jago, G. R. (1983). Amino acid accumulation in Cheddar cheese masnufactured from normal and ultrafiltred milk.
Australian Journal of Dairy Technology 9, 110.

-Hintz, P. C., Slater, W. C. y Harper, W. J. (1956). A survey of various free amino and fatty acids in domestic Swiss cheese. Journal of Dairy Science 39, 235. -ISO 11036 (1994). Sensory Analysis. Methodology. Texture profile. -ISO 6564 (1985). Sensory Analysis. Methodology. Flavour profile methods. -ISO 8589 (1988). Sensory Analysis. Guide for the installation of a chamber for sensory analysis. -Johansen, E. y Kibenich, A. (1992). Characterization of Leuconostoc isolates from commercial mixed strain mesophilic starter cultures. Journal of Dairy Science 75, 1186-1191.

276

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Bibliografa

-Khalid, N. M. y Marth, E. H. (1990). Lactobacilli-Their enzymes and role in ripening and spoilage of cheese: A review. Journal of Dairy Science 73, 2669-2684. -Kirimura, J., Shimizu, A., Kimizuka, A., Ninomiya, T. y Katsuya, N. (1969). The contribution of peptides and amino acids to the taste of food-stuffs. Journal of
Agricultural and Food Chemistry 17, 689-695.

-Lane, C. N. y Fox, P. F. (1996). Contribution of starter and adjunct lactobacilli to proteolysis in Cheddar cheese during ripening. International Dairy Journal 6, 715-728. -Lau, K. Y., Barbano, D. M. y Rasmussen, R. R. (1991). Influence of pasteurization of milk on protein breakdown in Cheddar cheese during aging. Journal of Dairy Science 74, 727-740. -Lavanchy, P. y Sieber, R. (1993). Proteolisis in different hard and semihard cheeses. I. Free amino acids. Schweizerische Milchwirtschaftliche Forschung 22, 59-64. -Law, B. A., Castanon, M. J. y Sharpe, M. E. (1976). The contribution of starter streptococci to flavour development in cheddar cheese. Journal of Dairy Research 43, 301-311. -Lemieux, L. y Simard, E. R. (1992). Bitter flavour in dairy products. II. A review of bitter peptides from caseins: their formation, isolation and identification, structure masking and inhibition. Le Lait 72, 335-382. -Lemieux, L., Puchades, R. y Simard, E. R. (1989). Size-exclusion HPLC separation of bitter and astringent fractions from Cheddar cheese made with added Lactobacillus strains to accelerate ripening. Journal of Food Science 54, 1234-1237. -Lynch, C. M., McSweeney, P. L. H., Fox, P. F., Cogan, T. M. y Drinan, F. D. (1996). Manufacture of Cheddar cheese with and without adjunct lactobacilli under controlled microbiological conditions. International Dairy Journal 6, 851-867. -Lynch, C. M., McSweeney, P. L. H., Fox, P. F., Cogan, T. M. y Drinan, F. D. (1997). Contribution of starter lactococci and non-starter lactobacilli to proteolysis in Cheddar cheese with a controlled microflora. Lait 77, 441-459.

277

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

-Marcos, A., Fernndez-Salguero, J. y Esteban, M. A. (1978). Hidrlisis relativa de las casenas del queso tipo Manchego maduro y primeros productos de su degradacin proteoltica. Archivos de Zootecnia 27, 341-350. -Martley, F. G. y Lawrence, R. C. (1972). Cheddar cheese flavour. II: characteristics of single strain starters associated with good or poor flavour development. New Zealand
Journal of Dairy Science and Technology 7, 38-50.

-McSweeney, P. L. H., Fox, P. F., Lucey, J. A., Jordan, K. N. y Cogan, T. M. (1993). Contribution of the indigenous microflora to the maturation of Cheddar cheese.
International Dairy Journal 3, 613-634.

-McSweeney, P. L. H., Walsh, E. M., Fox, P. F., Cogan, T. M., Drinan, F. D. y CasteloGonzlez, M. (1994). A procedure for the manufacture of Cheddar cheese under controlled bacteriological conditions and the effect of adjunct lactobacilli on cheese quality. Irish Journal of Agricultural and Food Research 33,183-192. -Menda, C., Ibez, F. J.; Torre, P. y Barcina, Y. (2000). Effect of pasteurization and use of a native starter culture on proteolysis in a ewesmilk cheese. Food Control 11, 195200. -Monnet, V.; Chapot-Chartier, M. P. y Gripon, J. C. (1993). Les peptidases des lactocoques. Lait 73, 97-108. -Muir, D. D., Banks, J. M. y Hunter, E. A. (1996). Sensory properties of Cheddar cheese: Effect of starter type and adjunct. International Dairy Journal 6, 407-423. -Mundt, J. O. (1986). Lactic acid Streptococci. In Bergeys Manual of Systematic Bacteriology. Vol. II, PHA. Sneath. N. S. Mair, M. E. Sharpe y J.G. Holt. (eds). 1065-1066. Williams and Wilkins. Co. Baltimore. USA. -Nez, M. (1976). Flora microbiana del queso Manchego: IV. Leuconostoc. Anales del INIA, Serie General 4, 67-74. -Nez, M., Medina, M. y Gaya, P. (1989). Ewes milk cheese: technology, microbiology and chemistry. Journal of Dairy Research 56, 303-321.

278

Utilizacin de distintos cultivos iniciadores en queso Manchego

Bibliografa

-Ordez, J. A. y Burgos, J. (1977). tude de la varit de fromage Ulloa. III. Acides amins libers pendant la maduration. Lait 567, 416. -Ordez, J. A. y Burgos, J. (1980). Free amino acids of Manchego cheese ripened in olive oil. Milchwissenschaft 35, 69-71. -Peterson, S. D. y Marshall, R. T. (1990). Non starter lactobacilli in Cheddar cheese: a review.
Journal of Dairy Science 73, 1395-1410.

-Picn, A., Gaya, M., Medina, M y Nez, M. (1995). The effect of liposome-encapsulated
Bacillus subtilis neutral proteinase on Manchego cheese during ripening. Journal of Dairy Science 78, 1238-1247.

-Polo, C., Ramos, M. y Snchez, R. (1985). Free amino acids by high performance liquid chromatography and peptides by gel electrophoresis in Mahn cheese during ripening. Food Chemistry 16, 85. -Pripp, A. H., Shakeel-Ur_Rehman, McSweeney, P. L. H. y Fox, P. F. (1999). Multivariate statistical analysis of peptide profiles and free amino acids to evaluate effects of single-strain starters on proteolysis in miniature Cheddar-type cheeses. International
Dairy Journal 9, 473-479.

-Pritchard, G. G. y Coolbear, T. (1993). FEMS Microbiology Reviews, 12, 179-206. -Puchades, R., Lemieux, L. y Simard, R. E. (1989). Evolution of free amino acids during the ripening of Cheddar cheese containing added lactobacilli strains. Journal of Food
Science 54, 885-888, 946.

-Ramos, M., Barneto, R. y Ordez, J. A. (1981). Evaluation of a specific starter for Manchego cheese production. Milchwissenschaft 36, 528-531. -Sala-Trepat y Burgos, F. J. y Burgos, J. (1972). Maduracin del queso de Cabrales: evolucin de los aminocidos libres durante la maduracin. Anales de Bromatologa 24, 61.

279

Tesis Doctoral de JUSTA M POVEDA COLADO

-Shalabi, S. I. y Fox, P. F. (1987). Electrophoretic analysis of cheese: comparison of methods.

Irish Journal of Food Science and Technology 11, 135-151.

-SPSS Program for Windows (1999). Version 9.0.1. -Terzaghi, B. E. y Sandine, W. E. (1975). Improved media for lactic streptococci and their bacteriophages. Applied Microbiology 29, 807-813. -Visser, F. M. W. (1977). Contribution of enzymes from rennet, starter bacteria and milk to proteolysis and flavour development in Gouda cheese. 3. Protein breakdown: analysis of the soluble nitrogen and amino acid nitrogen fractions. Netherland Milk
Dairy Journal 31, 210-239.

-Wallace, J. M. y Fox, P: F. (1997). Effect of adding free amino acids to Cheddar cheese curd on proteolysis, flavour and texture development. International Dairy Journal 7, 157167. -Weaver, J. C. y Kroger, M. (1978). Free amino acid and rheological measurements on hydrolized lactose Cheddar cheese during ripening. Journal of Food Science 43, 579. -Wilkinson, M. G. (1993). Acceleration of cheese ripening. Cheese: Chemistry, Physics and
Microbiology, ed. P. F. Fox, Vol. 1. Elsevier Applied Science, London.

280