TEMA 1: NATURALEZA, ESTRUCTURA Y ORGANIZACIÓN

DEL GENOMA Y LA CROMATINA

1.1 NATURALEZA Y ESTRUCTURA DE ADN Y ARN

El material hereditario debe cumplir una serie de características:

1. Debe almacenar la información para constituir los seres vivos, tanto a nivel celular como a nivel del
organismo entero, en forma de A C T y U. Dará los rasgos y funciones de los organismo.
2. Debe poder transmitir la información genética de una
generación a otra (debe ser transmisible). El material
hereditario contiene información que se pasa de una célula a
sus células hijas, y también cuando se reproducen
transmiten su información a la descendencia.
3. Para que haya transmisión, debe haber antes una replicación
de dicha información ya que, si transmitiera la información a
la generación siguiente y no hay copia no serviría de nada. El
material hereditario debe copiarse para poder luego
transmitir la información a la descendencia.
4. Durante el proceso de replicación, en ocasiones, ocurren fallos que genera variación en el material
hereditario, lo que se conoce como mutaciones. Esta variación en ocasiones da ventaja a algunas
especies para que se adapte, y explica que todos nosotros seamos distintos a pesar de poseer las
mismas moléculas y el mismo código.

Descubrimiento del ADN y obtención de la fórmula química de los nucleótidos

1869: Miescher desarrolló un método para extraer el contenido de los núcleos celulares. Esa sustancia (el
pus) era muy rica en leucocitos, que tienen los núcleos muy grandes, lo que era una ventaja para poder
estudiar esta célula. Denominó a la sustancia que estaba dentro de las núcleos nucleína (contenido del
núcleo celular), que estaba compuesta por un componente proteico, era ácida y contenía mucho fosfato. Los
ácidos nucleicos están formados por bases nitrogenadas, azúcares y fosfatos.

1910: Levene determina la estructura química de los nucleótidos y

propone la teoría de la tétrada (cuatro bases nitrogenadas unidas
mediante enlace fosfodiéster formando una estructura ciclada). Se
equivocó en un átomo de H, lo que hizo que se descartara que los
ácidos nucleicos formaran parte de la nucleína y que fueran las
proteínas (error).
Los ácidos nucleicos (ADN y ARN) son macromoléculas, grandes polímeros formados por la repetición de
monómeros denominados nucleótidos (unión covalente entre azúcares, bases nitrogenadas y grupos
fosfato), unidos mediante enlaces fosfodiéster.

Componentes estructurales de los nucleótidos

Grupo fosfato: consta de un átomo de fósforo central unido a 4 oxígenos, tres de ellos mediante enlace
simple y el otro mediante uno doble. Los grupos fosfato tienen carga negativa, lo cual es importante porque
las moléculas de ADN y ARN tienen carga negativa debido a estos grupos fosfato (es decir, le otorgan a los
ácidos nucleicos esa carga negativa).

Azúcares: los azúcares que forman parte de los nucleótidos son pentosas, formadas por 5 carbonos (C),
denominados desde el 1 al 5 en sentido de las agujas del
podamos distinguir los carbonos de los azúcares y de los de las bases nitrogenadas.

Las pentosas pueden ser ribosa (ARN) o desoxirribosa (ADN). La diferencia entre ambas es que:

ay un hidrógeno (-H).
-OH); este hidroxilo es muy reactivo, lo que hace que
el ARN sea una molécula muy reactiva, menos estable que el ADN y fácilmente degradable por las
proteínas.

un grupo hidroxilo muy importante para muchos de los procedimientos que

veremos más adelante.

Bases nitrogenadas: son Adenina (A), Citosina (C), Guanina (G), Timina (T, sólo en el caso del ADN) y Uracilo
(U, sólo en el caso del ARN). Entre ellas, se distinguen 2 grupo principalmente:

o Purinas: con 2 anillos (nombre más corto= estructura más compleja).

o Pirimidinas: con sólo 1 anillo (nombre más largo= estructura más simple).

La diferencia más importante entre C y U es que la citosina posee un grupo amino (-NH2) y el uracilo tiene un
grupo cetona (=O) pero aun así (por su alto parecido), en el ADN es muy usual que se produzcan
desaminaciones oxidativas (C se convierte en U). Por esta razón, una de las explicaciones por las que el ADN
no tiene uracilo es porque si lo tuviera, en muchos casos, el organismo no sabría distinguir si son uracilos
reales o citocinas que han sido desaminadas. La diferencia más importante entre T y U es que la timina
posee un grupo metilo (-CH3) y el uracilo no. También puede ocurrir que la C sea metilada, posteriormente
de desamine y luego de lugar a T.
Desoxirribonucleotidos (dNTPs) y ribonucleótidos (NTPs) trifosfato

Los nucleótidos son las unidades estructurales básicas de los ácidos nucleicos.
En su forma libre, se componen de 1 pentosa, 1 base nitrogenada y 3 grupos fosfato.

Se combinan con una pentosa central que en el ARN

es ribosa y en el ADN es desoxirribosa. En el caso de
la imagen se trata de una ribosa (ARN), a la que se
une:

o La base nitrogenada en el
o El fosfato en el

nitrogenada por su grupo amino, y por el C

grupo fosfato. Cuando unimos el azúcar con la base
nitrogenada, en este caso ribosa con adenina, se
forma una adenosina que tiene 3 fosfatos (en su
forma libre), sería una adenosina trifosfato.

La unión entre nucleótidos da lugar a las cadenas de ADN y ARN

o Macromoléculas: cadenas o polímeros de dNTPs (ADN) o NTPs (ARN).

siguiente, formando así un enlace fosfodiéster (con la formación de este enlace se desprenden dos fosfatos).

Se pierden esos dos pirofosfatos inorgánicos y se forma el enlace fosfodiéster, así sucesivamente hasta que
la cadena alcance su tamaño adecuado.
Distintos nucleótidos se unen entre sí por el grupo -OH del

con un extremo inferior libre

Las cadenas de ADN y ARN presentan dos diferencias

principales:

Cadena ADN (dNTPs) Cadena ARN (NTPs)

tiene desoxirribosa tiene ribosa

tiene Timina tiene Uracilo

Principio transformante y reglas de Chargaff

1928: Griffith demuestra el principio transformante, el experimento trataba de introducir en un ratón dos de
las cepas que obtuvo (cepa R: el ratón vivía y cepa S: causaba la muerte del ratón). El objetivo del
experimento era averiguar qué era el causante de la transmisión, las proteínas o el ADN. Para ello, introdujo
la cepa R en la cepa S y lo que ocurrió es que el animal moría.

1944: Avery, McLeod y McCarty demuestran que el principio transformante es el ADN, ya que prepararon
dos muestras: una era añadir cepa R + la cepa S con proteínas (no causaba la muerte del ratón) y la otra era
añadir cepa R + la cepa S con ADN (veían como la enfermedad se transmitía y causaba la muerte). En
conclusión, el ADN es el que tiene la información genética hereditaria ya que cuando hay sólo proteínas la
información no se transmite.

1948: Chargaff midió el contenido de bases nitrogenadas en diferentes organismos. Lo primero que observó
fue que el contenido de las bases difería entre las distintas especies. Pero también observó que el contenido
de Adenina al compararlo con el de la Timina en distintas spp., se parecía siempre. Con el contenido de las
otras dos bases (Citosina y Guanina) había también bastante similitud. Entonces, se le ocurrió dividir un valor
entre otro (A/T y C/G), y el resultado era siempre cercano a 1. Se establece así la regla de Chargaff, que
indica que en el ADN la cantidad de T es igual a la cantidad de A, y la cantidad de G igual a la de C. Definiendo
la complementariedad de bases. La composición de
bases es distinta entre organismos, sin embargo en
cada organismo se cumplía que [A]=[T] y [G]=[C]
Hacia el descubrimiento de la doble hélice

1952: se estaban obteniendo cristales de ADN muy puros. Cuando los rayos X incidían entre los cristales
purificados, hacía que los rayos X se difractaran (se desviaran). Esa desviación de la trayectoria de los rayos
X es específica de la disposición que ocupan los átomos dentro de la molécula.

Fotografía 51:

o Estructura helicoidal
o Diámetro más ancho que el de una hebra de ADN
o Posición detallada de las bases (dentro de la cadena) y las desoxirribosas (fuera de la cadena)

Rosalind Franklin logró purificar muy bien el ADN, separó finos haces y realizó una fotografía de difracción
del ADN, gracias a la cual, pudo decir que la molécula de ADN tiene una estructura helicoidal y que el
diámetro debía ser más grande. Una sola cadena sería muy poca para explicar ese patrón de bases, por lo
que debía tener mínimo dos cadenas de ADN.

Modelo de doble hélice

1953: ¿Cómo podrían interactuar dos hebras de ADN?

Watson y Crick llegaron a determinar que entre las bases se formaban puentes de hidrógeno, siguiendo las
reglas de Chargaff. La Adenina forma dos puentes de hidrógeno con la Timina y la Guanina establece tres
puentes de hidrógeno con la Cito

Características del modelo de doble hélice

1. Cada cadena de nucleótidos presenta , y los fosfatos (P) y los azúcares (S) forman el
esqueleto.
2. Para que las bases puedan interaccionar, la segunda cadena se coloca en orientación antiparalela

3. Las bases en hebras opuestas miran al interior y forman puentes de hidrógeno de acuerdo con las
reglas de Chargaff ( pares de bases (pb).
4. El ancho de la doble hélice es homogéneo (2 nm), siempre hay 3 anillos internos.
3
Guanina Citocine enlace

Adenina Tinina 2 enlace

 5. En cada escalón (1 pb), el giro es de 36º, y se avanza 0,34 nm. Por
tanto, para una vuelta completa (360º), se requieren 10 pb, y se avanza
3,4 nm.
6. La doble hélice gira a la derecha (dextrógira). Aguja del reloj
7. La molécula mantiene la estabilidad gracias a los puentes de hidrógeno

-
y se refuerza mediante fuerzas de apilamiento entre las bases. Existe
también hidrofobicidad en la superficie del esqueleto externo,
generando un surco mayor (de unos 2.2nm=22A) y un surco menor (de
1.2nm=12A) alternados. Por lo tanto, la doble hélice está estabilizada I
por:
Puentes de H: fuerzas entre las bases nitrogenadas.
Hidrofob
Apilamiento de bases: fuerzas de Van der Waals que actúan
entre una base y la que está debajo.
↓
L
Las fuerzas de Van der Waals incluyen atracciones entre átomos, moléculas y superficies. Difieren del enlace covalente y del enlace iónico
en que están causados por correlaciones en las polarizaciones fluctuantes de partículas cercanas (una consecuencia de la dinámica cuántica).

Podemos imaginar las bases como placas planas que se apilan una
sobre la otra en la estructura del ADN bicatenario. Se trata de una
interacción favorable, ya que las bases son relativamente no polares
y pueden interactuar con las demás. Por lo tanto, la base del
apilamiento es una característica estructural que estabiliza la doble
hélice al excluir a las moléculas de agua, que son polares.

Aparece en la transcrición
Distintas estructuras del ADN: formas B y Z ADN-ARNm
#

↑
Forma más commun

FORMA B FORMA Z
doble hélice dextrógira doble hélice levógira
10pb por giro de 360º 12pb por giro de 360º
las bases tienden a estar centradas y los enlaces los enlaces entre los pares de bases no son
de hidrógeno entre pb se producen relativamente perpendiculares al eje central, sino inclinados
perpendicular al eje central
enlaces entre los grupos fosfato y los azúcares con
patrón de zigzag
se especula que puede actuar como factor de
transcripción, ya que hay proteínas que reconocen
específicamente la forma Z
 Estructuras del ARN
El ARN también puede portar la información genética. Durante la
transcripción, el ADN se utiliza como una plantilla para hacer una copia de
ARN monocatenario. En la mayoría de los casos, sólo uno de los dos

I
filamentos de ADN se utiliza como plantilla, por lo que solo se sintetiza una
hebra complementaria de ARN. Cadenas de ARN son complejas

Solo una Sin embargo, secuencias relativamente cortas dentro de una molécula de ARN
Cadena
o entre dos moléculas de ARN diferentes pueden formar regiones de doble
cadena. Las dobles hélices de ARN son antiparalelas y dextrógiras, con 11-
12pb por vuelta.

En general, consta de una sola hebra pero pueden contener regiones

ARN bicateriarios
son de los vinus de doble cadena complementarias. Formando así, estructuras como
cadenas tallos-lazo o lazos internos.
ARN bicatenarios: cadenas antiparalelas y dextrógiras, suelen tener
11-12pb por giro (ej: virus, aunque también hay virus
monocatenarios).
Pueden presentarse como moléculas con estructuras muy complejas.

Clases de ARN
Las moléculas de ARN cumplen diversas funciones en la célula.

o El ARN ribosómico (rRNA) y las subunidades proteicas ribosómicas constituyen el ribosoma, el sitio
de ensamblaje de proteínas.
o El ARN mensajero (mRNA) transporta las instrucciones de codificación para las cadenas
polipeptídicas del ADN a un ribosoma. Después de unirse al ribosoma, una molécula de mRNA
especifica la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica y proporciona un molde para su
unión.
o Las moléculas precursoras grandes, que se denominan RNA premensajeros (pre-mRNA), son los
productos inmediatos de la transcripción en las células eucariotas. Las moléculas de pre-mRNA son
modificadas de manera extensa antes de transformarse a mRNA y salir del núcleo para ser
traducidos a proteínas.
o El ARN de transferencia (tRNA) sirve como enlace entre la secuencia de codificación de nucleótidos
del mRNA y la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica. Cada tRNA se une a un tipo
particular de aminoácido y ayuda a incorporar el aminoácido a una cadena polipeptídica.
 o En los núcleo de las células eucariotas se encuentran otras clases de moléculas de RNA, los RNA
nucleares pequeños (snRNA), se combinan con pequeñas subunidades proteicas para formar

procesamiento del ARN y convierten pre-mRNA en mRNA. Los ARN nucleolares pequeños (snoRNA)
intervienen en el procesamiento del ARN.
o En las células eucariotas, hay una clase de moléculas muy pequeñas y abundantes de ARN,
denominadas micro-RNA (miRNA), y RNA de transferencia pequeños (siRNA). Llevan a cabo la
interferencia por ARN, un proceso en el que estas moléculas de RNA pequeñas ayudan a
desencadenar la degradación del mRNA o a inhibir su traducción a proteína.
o Investigaciones recientes han revelado otra clase de moléculas pequeñas de ARN, llamadas RNA de
interacción con Piwi (piRNA, nombradas así por las proteínas Piwi con las que interaccionan). Estas
moléculas de RNA fueron halladas en los testículos de mamíferos, son similares a los mRNA y a los
siRNA, se considera que intervienen en la supresión de la expresión de los elementos transponibles
en células reproductoras.
o Y, recientemente, se ha descubierto un sistema similar a la interferencia por ARN en procariotas, en
los que pequeños RNA de CRISPR (crRNA) ayudan a destruir moléculas de ADN extraño.

1.2 ORGANIZACIÓN DEL GENOMA EN EUCARIOTAS

 Cromatina y nivelas de compactación
La cromatina es una estructura muy compleja y dinámica, está formada por muchísimos componentes y
tiene varios niveles de compactación (lo cual permite empaquetar todo el ADN).

1. Sus componentes son:

- ADN
- Proteínas (histonas y no histonas)
- ARN que se encuentra unido a proteínas
(ribonucleoproteínas).

2. Es dinámica: presenta diferentes niveles de compactación, que cambian durante el ciclo celular.
3. El grado de compactación permite controlar la expresión del material genético de manera muy
precisa. Los genes no se expresan en las zonas empaquetadas, permitiendo así que la información se
utilice cuando se deba y sea más difícil el acceso a ella.

La cromatina relajada es la doble

hélice, no toda la cromatina se
relaja, simplemente a medida que se
va necesitando. Los cromosomas se
forman solo en el momento de la
división celular.

Tipos de cromatina según su

capacidad de compactación

Existen 2 tipos de cromatina según como

cambie su nivel de compactación, ambos
tipos permiten el control de la expresión
del material genético de manera muy
precisa.

1) El 92% de nuestra cromatina está presente en forma de EUCROMATINA:

- Puede variar su estructura, pasando de una forma relajada a una forma condensada, y viceversa,
según lo requerido (por lo que sufre procesos de empaquetado y desempaquetado en la célula)
- Puede relajarse expresión (transcripción)
- Puede condensarse represión

2) El otro 8% de la cromatina está presente en forma de HETEROCROMATINA:

- Se encuentra siempre en forma condensada (menos para replicarse), por lo que no sufre
procesos de desempaquetado.
o Condensada represión
- Se diferencian otras 2 formas:
a) Heterocromatina constitutiva: compactada en los dos cromosomas, la copia materna y
Telomero secuencias
la paterna (ej. telómeros y centrómeros).
especiales

de ADN
que se encuentra b) Heterocromatina facultativa: compactada sólo en uno de los dos cromosomas (ej.
en los

extremos de los cromosomas

cromosoma X en mujeres).
Función los extremos de
:
molegen
para evitar
se
Los cromosomas que
desgasten
Centromero la celule
ayuda a

dividir el ADN durante la

b division
 1er nivel de organización GRADO DE COMPACTACIÓN 6 veces

Fibra de 11nm: nucleosomas formados por histonas y ADN

El ancho de los nucleosomas (ADN linker + 8 histonas) es de 11nm, y están formados por un núcleo central
de 8 histonas (octámero de histonas), sobre el cual el ADN se enrolla. El octámero está formado por: 2
histonas H2a, 2 histonas H2b, 2 histonas H3 y dos histonas H4.

collar de cuentas

Proteinas arvaendamental
a

muy noca

Esencial *
Arenas ninguna
mutación

Existen muchos tipos de histonas, pero los 5 tipos principales son: H1 (nucleosoma completo), H2A, H2B, H3
y H4 (nucleosoma basal).
Se compacta 6 veces

La estructura de las histonas está formada por una serie de hélices alfa y
una colas (15-30 aa), ricas en lisina (Lys) y arginina (Arg), que son
aminoácidos básicos con cargas positivas (+), que permiten que las histonas
puedan unirse al ADN (carga por su grupo fosfato). La proporción de estos
dos aminoácidos es bastante alta.

Sobre el octámero de histonas, el núcleo central del nucleosoma se enrolla

hacia la izquierda 1 vuelta (sentido levógiro con mayor tensión y
condensación) y ¾ de ADN, lo cual le lleva 146pb y forma el nucleosoma
basal. Por lo tanto, el nucleosoma basal está formado por:

- El octámero de histonas (2xH2a, 2xH2b, 2xH3 y 2xH4)

- Las 146pb de ADN

En cambio, la histona H1 se une por fuera al nucleosoma basal

(actuando como una grapa), haciendo que este se comprima y
consiguiendo empaquetar 20pb más. De esta manera, se forma el
nucleosoma completo, que estaría compuesto por:

- El octámero de histonas
- Las 166pb de ADN (146 + 20)
- La histona H1
Entonces, en medio de los nucleosomas se encuentra ADN de
enlace o ADN linker, con una longitud variable de entre 8 y
114 pb dependiendo de la especie de la que se trate (en
humanos 40pb) y que, junto con los nucleosomas conforman
la fibra de 11nm. Sabiendo esto, en humanos sabemos que
hay 206pb (166 + 40pb) entre un nucleosoma y otro.

2o nivel de organización GRADO DE COMPACTACIÓN 50 veces

Fibra de 30nm: modelo de solenoide y zigzag

No se conoce exactamente cómo se forma esta estructura, pero lo que sí se sabe es que:

1. La histona H1 cumple un papel clave al favorecer la interacción entre diferentes nucleosomas.

2. El tamaño del ADN linker es decisivo para que se coloquen los nucleosomas.
3. La fibra de 30nm responde a la suma de 3 nucleosomas (de 10-11nm).

Compactación mayor

enrolla la
fibra de /

nanometro y crea una

estructura
14 nanometros

Se han propuesto 2 modelos capaces de formar esta fibra de

30nm de ancho: orden may ordenada
a
a) Modelo de solenoide, es una estructura bastante
ordenada y regular. En cada cara hay 3 nucleosomas
expuestos.
b) Modelo de zigzag, es una estructura más abierta.
menos compactación ,
más abierta

Realmente, se cree que ambos modelos coexisten en la célula y

se van alternando según las necesidades del ciclo celular.
-

3er nivel de organización GRADO DE COMPACTACIÓN 35.000 veces

Fibra de 300nm y anclaje a la matriz nuclear

Como el ADN ya no puede seguir enrollándose llega un momento en el que empieza a formar bucles, que
tienen un ancho de 300nm. Pero hay un problema, los bucles no se pueden mantener solos porque se
soltarían, razón por la cual esta fibra necesita anclarse a la matriz nuclear.

ADN
↓ ayuda condensarle
a

la condensina
 Matriz nuclear: estructura compleja de soporte de la fibra de 300nm. Está constituida por:

- Proteínas no histonas, tales como proteínas del armazón (Scaffold proteins).

- Proteínas reguladoras como Sc1 (topoisomerasa II, que ayuda a relajar) y Sc2 (condensina,
ayuda a mantener empaquetada la estructura).
- Ribonucleoproteínas (formadas por ARN + proteínas) que ayudan también a que la estructura se
mantenga; aunque también cumplen funciones importantes en la maduración del ARN.

Además, los bucles no se forman en cualquier

región al azar del ADN, sino que ocurre en unas
regiones determinadas, concretamente en las
secuencias MARs o SARs (matrix/Scaffold Anchor
Regions). Son secuencias de ADN ricas en A y T
mediante las cuales el ADN se une al armazón de
la matriz nuclear (puntos de anclaje).

Niveles superiores de compactación: cromosomas GRADO DE COMPACTACIÓN 70.000 veces

Los cromosomas (700nm) son organizados y están anclados al núcleo, son el resultado de empaquetar aún
más la fibra de 300nm. A partir de los cromosomas, se formarán 2 cromátidas hermanas (copias idénticas
1.400nm) después de la replicación del ADN (que ocurre justo antes de la división celular o lo que es lo
mismo antes de repartir el material genético a las células hijas).

Aun así, estando el cromosoma replicado o no, hay unas estructuras que destacan:

Telómeros: otorgan protección de los extremos de los cromosomas frente a la degradación de

las nucleasas.
Centrómero: permite el movimiento de los cromosomas hacia las células hijas. Es donde se ancla
el cinetocoro y son secuencias altamente repetitivas (ADN satélite). Presenta histona CeH3
(humanos CENP-A), en lugar de H3. Dicha histona permite que esa región quede compactada.

-Cromosomas circulares: cell procariota

-Cromosomas lineales: cell eucariota

Los centrómeros y
telómeros son
heterocromatina
constitutiva, ya que
siempre están en estado
condensado.

Secuencia SMC Proteina

Estructura de los telómeros
Proporcionan estabilidad a los cromosomas,
impiden su degradación y la fusión de los
-OH libre reactivo). Se suelen
comparar con el herrete de los cordones.
Están formados por secuencias teloméricas (de
unas 10-15pb) y por secuencias repetitivas

asociadas a los telómeros (de unas 100-300kb).

Una secuencia que se repite bastante en
humanos es la TTAGGG (ADN satélite, del cual
hay unas 30 repeticiones).
Las secuencias teloméricas están muy
conservadas entre especies.

monocatenario, generando ADN de cadena simple.

Se produce unión del complejo de protección del
telómero (POT o Shelterin) de hasta 6 proteínas,
que se va a impedir que el telómero se degrade
(ya que crea un bucle).
Además, se forma un bucle (T-loop) en el
extremo, gracias a la complementariedad de
bases permitiendo así proteger al telómero de la
degradación. El bucle consigue formar una zona
del ADN en estado bicatenario.
La secuencias asociadas a los telómeros
proporcionan protección adicional.
La transcripción de unos genes que codifican para el InRNA TERRA (telomeric repeat-containing
RNA) desde una región subtelomérica ayuda a mantener el estado de heterocromatina (se permite
cierta expresión génica).
o InRNA= long non-coding RNA (ARN largo no codificante), miden más de 200 nucleótidos (la
media está en unos 600 nucleótidos) lo que proporciona mucha más estabilidad en los
telómeros y se implica en la regulación de la actividad de las telomerasas es muy
importante en la regulación de expresión génica y muchos otros procesos.

1.3 COMPOSICIÓN DEL GENOMA: GENOMA NUCLEAR Y MITOCONDRIAL

Debemos tener en cuenta que las células eucariotas contienen 2 genomas: un genoma nuclear (dentro del
núcleo celular) y un genoma mitocondrial (en las mitocondrias). Características de ambos genomas en
humanos:
 1. Genoma nuclear:
- 3.200 Mb. ( millones de naves debase)
- El ADN es lineal: 23 pares de cromosomas (diploides).
- Nuestro genoma codifica para unos 20-25.000 genes codificantes (codifican proteínas, es decir,
se traducen a proteínas).
- Entorno a unos 20.000 genes no codificantes (no codifican proteínas, sino que se encargan de
otras funciones como la regulación). Ej. los InRNA, tRNA, rRNA, etc.

2. Genoma mitocondrial:
- Pares de base

- ADN circular (como el de las bacterias) de doble cadena.

- Codifica sólo para 37 genes (codificantes esenciales).

Cada célula expresa sólo una parte del genoma en cada momento, aunque a partir de la MISMA
información genética.

GENOMA MITOCONDRIAL

Las mitocondrias tienen su origen en la incorporación de una bacteria, según la teoría de la endosimbiosis
(Lynn Margulis).

El genoma mitocondrial consiste en ADN circular bicatenario, con genes que codifican tRNA, genes que
codifican proteínas y genes que codifican rRNA. en e
Prácticamente no contiene ADN extragénico, sino que
so se

transcribe
estragenico
casi todo el ADN es codificante (excepto el D-loop, que es
donde se inicia la replicación).
O
Sus genes codifican funciones relacionadas con: la
fosforilación oxidativa, la respiración celular y la
traducción.
Las mitocondrias no son autosuficientes, ya que el
genoma mitocondrial no codifica todo lo que la
mitocondria requiere, por lo que muchos productos
génicos nucleares son esenciales para la mitocondria:
replicación (ADN-polimerasa), traducción y constitución
de ribosomas.
Su tamaño varía entre organismos:
- 15-18Kb en animales.
- Hasta 100-2.500Kb en plantas.
Dependencia de funciones entre genomas (ADN-
mitocondrial: genes maternos y Genoma mitocondrial: codifica
nara ADN
herencia materna).
nibourel .

Kb - kilos de bases SS

ADN mitoccondria Algunos aminoácidos

son bacterias
 Mb >
- millones de naves de bases

GENOMA NUCLEAR: tipos de secuencias que forman el genoma

Los genes y secuencias relacionadas, que es lo que en principio más nos interesa del genoma, abarcan un
region
del genomena
26% del genoma humano. El 74% restante comprende el ADN extragénico.
quefinaliza
de
ARNM

11 sMD

Secuencia
relacionale

3.200Mb (genoma haploide)

- 37 %
-
35 , 5 %.

Gb x 2 (genoma diploide)
I.
/
3
D
no se transcriba

Dentro de los genes y secuencias relacionadas, encontramos:

ADN codificante (2%): el único que se puede secuenciar, ya que contiene la información de los
exones (EXOMAS) para codificar las proteínas.
ADN no codificante (24%): está relacionado con los genes pero no se traduce a proteínas. Está
comprendido por los intrones (las regiones reguladoras), RNAs y pseudogenes (que son copias de
genes no funcionales).

Dentro del ADN extragénico o intermedio, podemos tener secuencias:

Secuencias que están solo en un lugar del genoma o en un bajo número de copias (15%).
Repeticiones consecutivas (en tándem), están repetidas moderada o altamente; y repeticiones
dispersas (59%).

Genes y secuencias relacionadas: exones, intrones y regiones reguladoras

Tenemos representado un cromosoma determinado, en el que aparece en una región el gen A y en otra el
gen B. Entre ambos genes se encuentra ADN extragénico, que al estar situado entre 2 genes también se le
conoce como ADN intermedio.

nomator
indicara
como empezar

ADn termina
ARNmaduro
secuen
de como
En el proceso
neguladoras maduración sera la cadena
eliminado

En el esquema, el gen A vemos que está formado por: exones (azul oscuro), son la parte del que gen que
más interesa ya que codifica proteínas y contiene información sobre si el gen es de ARN; e intrones (azul
claro), localizados entre los exones.
Función de los intrones >
-
son espaciadores

b su función no es dar

Trozos ADN no
se desnnes
degrada
codificante de la transcripción
en regulan
dice que

la transcrincion genetica
Pero los genes, sólo con exones e intrones, no son funcionales. Necesitan una secuencia que le indique a la
maquinaria de la transcripción que es un gen. Dicha secuencia es el promotor, que señaliza la posición o
inicio del gen. Otra secuencia necesaria es el terminador, que indica dónde finaliza el gen.

Por lo tanto, los genes están formados por:

- Exones: son los que contienen la información para la función que realice el gen (traducirse a
proteínas, dar lugar a algún ARN funcional, etc).
- Intrones: posteriormente son eliminados.
- Promotor y terminador: le indican a la maquinaria de la transcripción donde empieza y acaba el
gen.

Cuando se transcribe, se copian los intrones y los exones, pero el promotor no. En el promotor es donde se
cesaria para poder llevar a cabo la transcripción y, por tanto, es el lugar del cual
empieza a copiar los exones y los intrones. Este proceso da lugar a un ARN inmaduro (pre-ARN), llamada así
porque aún contiene los intrones (genoma bacteriano sin intrones). El 95% del genoma humano se trascribe,
un gen transcribe varias proteínas con diferente funcionalidad.

Luego, ese ARN inmaduro va a sufrir un proceso de splicing (corte y empalme), mediante el cual se van a
eliminar los intrones y unirse los exones, obteniendo así un ARN maduro (todo este proceso ocurre en el
núcleo).

Lo siguiente que ocurre para tener una función determinada en la célula es la traducción (ocurre en la
membrana plasmática); en el caso de que el ARN sea un ARNm codificante que codifique proteínas. En este
caso, el ARN maduro es codificante porque se va a traducir a proteínas de la célula, por lo que se trata de un
ARNm (mensajero).

Pero puede haber genes que, en lugar de ser un ARNm, sean un ARN maduro no codificante, de los cuales
hay muchos tipos:

- ARN que participa en regular la expresión génica, regulando así si la transcripción se lleva a cabo
o no, y cuanto de eficiente será miRNA (21-25pb) y IncRNA (>200pb).
- ARN que regulan la maduración del ARN; no solo splicing, sino otros procesos que son necesarios
también para que el ARN madure snoRNA y snRNA.
- ARN que están implicados en la síntesis de proteínas tRNA y rRNA.
- ARN que participan en la defensa del genoma siRNA (interfiere en ADN o ARN exógeno) y
piRNA (implicados en c
Por lo tanto:

1. Cromosomas: genes (26%) + ADN extragénico (74%).

2. Genes: regiones reguladoras o unidad de ADN CON promotor, terminador, intrones y exones.
3. Pre-RNA: intrones + exones (transcripción).
4. RNA maduro: solo exones (splicing).
5. RNA maduro: poder ser codificante (mRNA) o no codificante (mi/IncRNA, sno/snRNA, t/rRNA,
si/piRNA).

Caracteísticas generales de los genes

1) En total existen 20.000-25.000 genes que codifican 100.000-200.000 proteínas.
- Un gen forma una proteína, una enzima o un polipéptido, también puede formar varias
proteínas y polipéptidos.
- splicing alternativo: a partir de un mismo ARN inmaduro, combinando los exones de distintas
maneras se obtienen ARN maduro diferentes, que se traducirán y darán lugar a distintas
proteínas.

2) Como promedio, de manera general en todo el genoma:

- Tamaño genes: 64Kb (media), 26Kb (mediana).
- N.º promedio exones: 9.
- Tamaño exones: 268pb (media), 129pb (mediana).

3) Sin embargo, los genes pueden ser muy diferentes:

- Beta-globina:
- Factor VIII: 150Kb.
- NF1: 350Kb.
- Distrofina, DMD: 89 exones y mide 2.220Kb.
- CNTNAP2: 25 exones y mide 2.305Kb.

4) Los genes pueden estar presentes en copia única (e un

cromosoma determinado), o en varias copias (en varios
cromosomas), o incluso hay genes en familias
multigénicas (ocupando distintos sitios en uno o varios
cromosomas).

Familias multigénicas
o Están constituidos por genes que guardan una gran identidad y función similar.
o Derivan de un gen ancestral común que ha sufrido duplicaciones y mutaciones.

Este es el caso de la globina, una proteína que surgió de la evolución de un gen. Hace 800 millones de años
se copió en 2, dando lugar una de las copias a la mioglobina y la otra copia a la hemoglobina. Ambas
comparten la misma función: transportar oxígeno, pero la mioglobina en el músculo y la hemoglobina en la
sangre.

A su vez, la hemoglobina (hace 400 m.a) dio lugar a

otros 2 tipos de globinas: la -globina y la -globina,
una especializada en el transporte de O2 en individuos
adultos y la otra en fetos. A

del
Todas derivan

gen
ancestral
mismo
exam seme
Hay 3 tipos de familias multigénicas:

a) Agrupadas: están en el mismo

cromosoma.
- -globinas, agrupadas
en el cromosoma 16.
- -globinas, agrupadas
en el cromosoma 11.

b) Dispersas:
- Pero si consideramos junto, como que la familia está compuesta
por ambas, entonces se trata de una familia dispersa ya que están en distintos cromosomas.

c) Repetidas en tándem: histonas, tRNA, rRNA, etc.

- No son realmente genes que hayan ido acumulando mutaciones o que se hayan copiado, sino
que son un conjunto de genes (todos con la misma secuencia) que se van repitiendo uno tras
otro. Es decir, genes que están agrupados y que aparecen muchas copias de ellos.
- ej. en la imagen hay una serie de genes (H1, H2A, H2B, H3, H4) que corresponden a los de las
histonas.

Las histonas están codificadas en una determinada región del genoma y los 5 genes están
agrupados, pero además, el conjunto de los 5 genes se repite (se duplica). Jamás tenemos una
sola copia de ese conjunto de 5 genes necesarios para dar lugar al nucleosoma o cromatosoma
completo, sino que esos 5 genes se repiten entre 10 y 40 veces (dependiendo de la especie de la
que estemos hablando).
Esto se debe a que cuando vamos a replicar el ARN, hay que producir una gran cantidad de
histonas, por lo que si tenemos el gen copiado entre unas 10 y 40 veces, la maquinaria de la
transcripción va a empezar a sintetizar el ARNm por muchos lugares y en un mismo mensajero
tendremos para producir muchísimas réplicas de proteínas.

Cualquier gen humano tiene una distribución específica en el genoma.

Genoma duplicación.

Gen único duplicación 2 copias: 1 materna y otra paterna.

Pseudogenes
Son copias de genes con mutaciones (ya que sea porque son más de las debidas o porque están en lugares
que impiden que el gen se pueda transcribir) que hacen que esos genes NO sean funcionales.

Al ver sus secuencias, podemos ver que son muy parecidos a otro genes del genoma, pero que ya no
funcionan.
Hay unos 20.000 pseudogenes en el genoma formados a partir de 2.500 genes (no todos los genes del
genoma tienen un pseudogen, sólo unos 2.500)

Hay dos tipos de pseudogenes: multiplicación de mutación

a) Pseudogenes no procesados: originados por adquisición de mutaciones que anulan su función. Una
porción del ADN de un gen que se copia acumula mutaciones y deja de ser funcional (no se puede
transcribir.

Codón GTG no es funcional ya que procede de la duplicación de la globina y es un pseudogen. Por otro lado,
codón ATG es el de iniciación de la traducción. Si se transcribe el pseudogen pueden ocurrir dos situaciones,
que la proteína se traduzca y no funcione o que la proteína no se traduzca.

b) Pseudogenes procesados: reintegración de ADN complementario (cDNA) en otra región del genoma.
no tienen promotor
Se originan tras haberse producido la transcripción de un gen: el gen se transcribe, da lugar al ARNm
correspondiente, que madura (carece de intrones y de la región promotora) y en lugar de traducirse a una
proteína, se sintetiza ADN complementario a partir de ARN.

La enzima que hace esto es una retrotranscriptasa, que sintetiza ADN complementario a partir de ARN
molde = paso inverso que puede ocurrir, llamado retrotranscripción (paso de ARN ADN).

El ARN es transcrito a partir de un gen que no tienen promotor, por lo que este cDNA que se ha originado
por retrotranscripción de ese ARN y pasa a bicatenario. Posteriormente, se reintegra en otro sitio del

transcribirlo ya que no es funcional (pseudogen).

¿Cómo podemos distinguir una secuencia de un

pseudogen no procesado de uno procesado?

Los pseudogenes procesados no tienen

promotor ni intrones, ya que han sido
procesados mediante un proceso de
retrotranscripción.
 Secuencias no
codificantes
parte de las regiones
y que no forma
17% reguladoras
m
ADN extragénico: único o bajo número de copias (15%)
Al igual que los genes, el ADN extragénico puede estar también en una sola copia.

o Regiones extragénicas de copia única: poseen una única localización en el genoma de una especie.
La secuencia en rojo es ADN extragénico que no está en ningún otro lugar del genoma.

o Duplicaciones segmentarias (bloques de ADN duplicado): fragmentos >1Kb que se repiten varias
veces (pero no muchas) en el genoma.
- Representan el 5% de genoma humano.
- Al menos un 90% de la secuencia debe ser igual para que se considere una duplicación
segmentaria (identidad en la secuencia).
- No varían entre individuos (secuencia monomórfica), pero en las 2 copias del cromosoma son un
poco diferentes.
- Cerca de los centrómeros y telómeros.
- Hay 2 tipos:
a) Intracromosómicas (100Kb): b) Intercromosómicas (10-50Kb):
copias localizadas en un mismo copias localizadas en 2
cromosoma. cromosomas diferentes.

ADN extragénico: moderado o altamente repetido y DISPERSO

También se conocen como elementos móviles o transponibles. Hay miles de copias dispersas (separadas) en
diferentes sitios del genoma (constituyen el 45% del genoma). Son secuencias dispersas porque no están
una a continuación de la otra, sino repartidas por todo el genoma.

Hay dos tipos principales:

1. Transposones de ADN (elementos móviles con alto número de copias):

En los transposones de ADN lo que existe es una secuencia de, generalmente unas 1-3Kb limitada por
repeticiones invertidas (flechas rojas pequeñas). Es decir, son dos secuencias iguales pero aparecen
invertidas en un extremo con respecto al otro. En medio, estos elementos móviles codifican para una
proteína (enzima) llamada transposasa, que es la responsable de que estos elementos puedan movilizarse

En algunos casos, puede haber una delección y perderse la transposasa. Por tanto, los elementos que no
presentan las transposasa no pueden movilizarse. Los transposones se abrevian como Tn y hay muchos
tipos, siendo los más abundantes los de las familias MER1 y MER2.

La mayoría de los genes han eliminado la secuencia de ADN que les hace móviles. Es decir, tienen
limitaciones y están apagados en condiciones normales, si causan alteraciones puede haber mutaciones
cancerígenas. Los transposones de ADN representan entre el 3-5% del genoma, habiendo unas 300.000
copias de estos elementos dispersas.
La enzima transposasa guía la inserción del transposón en diferentes sitios del genoma, mediante dos
mecanismos:

a. Transposición simple: Si el elemento está en una localización

determinada del genoma y pasa a otra distinta sin dejar una
copia. El sitio original del transposón deja de tener la misma
secuencia, ya que se ha movido hacia otro sitio, lo cual es
posible gracias a la transposasa mecanismo de corta y
pega.
b. Transposición replicativa: En este caso, el transposón antes
de insertarse en otro lugar del genoma se copia. Pasa de
estar en un solo lugar del genoma a movilizarse y estar en
dos. Este mecanismo es más frecuente que el de
transposición simple mecanismo copia y pega.

2. Retrotransposones (origen vírico retrovirus):

Antes de insertarse en un lugar del genoma, pasa por un

intermediario de ARN. Así, tenemos una secuencia, que
es el retrotransposón, que se transcribe a ARN y
mediante una transcriptasa inversa el ARN pasa a ADN
que se inserta en otro lugar del genoma. En este caso,
también se deja una copia de la secuencia de ADN
original que simplemente se transcribe a ARN y luego
continúa el mecanismo del principio.

Hay tres tipos de retrotransposones:

LINE: long interspersed nuclear elements.

- Tienen un tamaño medio de 7Kb y existen 850.000 copias, por lo tanto está representado por un
20% en el genoma.
- En cuanto a su estructura, las pautas de lectura abiertas (ORF) indican que pueden codificar para
alguna proteína. Hay dos de estos elementos, ORF1 y ORF2(pol) que codifican para dos
proteínas.
- Es de interés ORF2(pol), ya que tiene una enzima que es capaz de copiar ese elemento = una
retrotranscriptasa, que es la que convierte el ARN en ADN (también tiene actividad
endonucleasa).
- (A)n es la cola poli-A, típico encontrarlo en los ARNm.
- Su estructura es similar a la de un gen, ya que tiene incluso un promotor (p). Ej: L1 (imagen).

SINE: short interspersed nuclear elements

- Hay un millón y medio de copias en nuestro genoma, son el elemento móvil más abundante de
nuestro genoma. Han perdido el gen y no actúan de manera autónoma, se mueven gracias a los
L1.
- Tienen un tamaño medio de 300pb, aunque sea el que más copias tiene es el de menor tamaño.
Abarca sólo el 10% del genoma.

exam
 - Su estructura son dos secuencias que se repiten (2 monómeros) y una cola poli-A, pero no
codifican para ninguna enzima que sea capaz de movilizar esos elementos. Por lo tanto,
dependen de los LINE para movilizarse, ya que pueden movilizar por sí mismos gracias a la
polimerasa que tienen. Ej.: Alu (imagen).

LTR: long terminal repeat

- Tienen unas repeticiones terminales a los lados del elemento que son largas, de entre 6-11Kb o
más pequeñas (1.5-3Kb).
- Es el tipo que menor número de copias tiene (450.000) y representa un 8% del genoma.
- Con respecto a su estructura, podemos ver que codifica para una proteína llamada gag, otra pol
y otra (env) proteínas víricas que se encuentran en nuestro genoma (todo lo que se genera es
vírico).
- Algunos LTR han perdido la retrotranscriptasa (la pol), por lo que no se pueden mover solos, y
necesitarán que otro elemento exprese la retrotranscriptasa para poder moverse.
- Los pseudogenes procesados (los que no tienen intrones), para insertarse en algún sitio del
los LINE) convierta a ese ARN en ADN
antes de insertarse. Ej.: HERV (retrovirus endógenos humanos).

Realmente los retrotransposones, que son ADN extragénico, eran genes de virus que se han insertado en
nuestro genoma. Es por ello, que tenemos una gran proporción de nuestro genoma que son retrovirus que
se han insertado a lo largo de la evolución.

ADN extragénico: moderado o altamente repetido EN TÁNDEM exem

Son las copias que aparecen una a continuación de la anterior, con una secuencia repetida definida.

Hay 3 tipos principales (de bandas satélites):

1) ADN satélite: 5-250pb 10Mb

Se llama satélite ya que en procesos de centrifugación en gradiente de

densidad, se observaba que en la mayor parte del ADN aparecía una banda
principal y luego otras bandas accesorias (en distintas localizaciones), que se
llamaron bandas satélites (repeticiones).
Principalmente, forma parte de las secuencias del centrómero por lo tanto,
en la heterocromatina constitutiva que forma parte de los centrómeros
tenemos 3 tipos de ADN satélite que constituyen las secuencias CEN del
centrómero (a las que se une la histona H3).
 - ADN satélite : formado por la repetición de 151pb
(1.500-30.000 copias). Es el más abundante y se
encuentra en todos los centrómeros del genoma
humano).
- ADN satélite : formado por la repetición de 68pb.
- ADN satélite formado por la repetición de 220pb.

2) ADN minisatélite:

Está formado por secuencias mucho menores, de entre

6-25pb, que se repiten hasta abarcar unas 100-
20.000pb.
Ej. de minisatélite: la secuencia (TTAGGG)n de los
telómeros humanos.

3) ADN microsatélite:

La unidad de repetición mide sólo entre 2-6pb, abarcando

como máximo un total de 150pb.
Generalmente, son muy polimórficos las ADN
polimerasas cuando lo están copiando
y no saben cuántas copias han hecho. Por lo tanto, ocurren
procesos de deslizamiento, errores,
autocomplementariedad de bases, etc.
Se pueden encontrar en ADN codificante también e incluso en vez de sintetizar proteínas, también
-CACACACACACACACA-
Polimórficos: identificación humana, estudios de poblaciones animales y vegetales.

Variación genética en las poblaciones humanas

- Proyecto 1.000 Genomas: catálogo de la variación genética humana en 26 poblaciones el
proyecto descubrió 84 millones de variantes genéticas.
- Existen 4-5 millones (en un individuo) de sitios diferentes respecto al genoma de referencia:

1. Variantes de pequeña escala (<50pb): 99,9%

Estas son las más abundantes, las que afectan a pocas pares de bases.

Variantes de un único nucleótido (SNV):

o Mutaciones (puntuales): aparecen en la población con una frecuencia de menos de un 1% de los
individuos.
o Polimorfismos de un único nucleótido: SNP
de más de un 1% de los individuos.
 Pequeñas inserciones/deleciones (indel):
o Deleciones: pérdida de material genético
respecto al genoma de referencia (ej. se
pierde una G).
o Inserciones: adición de una base que en el
genoma de referencia no estaba (ej. se añade
una T).
o Inserción/deleción: elementos que se pierden
y que además son sustituidos por otras bases
(ej. se pierden GGTTC y son sustituidos por
CA).

2. Variantes estructurales ( 50pb): 0,1%

Variantes estructurales balanceadas: no existe pérdida ni ganancia de material genético.
Variantes estructurales no balanceadas: existe pérdida o ganancia de material genético.

1) Balanceada: hay variación entre los individuos, pero no hay pérdida ni ganancia de material
genético, sino que se invierte o transloca.
a. Inversión: una secuencia se invierte y se coloca en otro lugar del genoma.
b. Translocación: intercambio de material de un cromosoma con otro cromosoma.

2) No balanceada: hay una pérdida o ganancia de material genético.

a. Deleción:
b. Duplicación en tándem: una secuencia copiada que se repite una pegada a la otra.
c. Duplicación dispersa: un elemento se copia y es colocado en otro lugar del genoma.
d. Inserción de novo: material genético que se inserta y que antes no estaba.
e. Inserción de repetición: se insertan elementos que ya estaban repetidos.
f. Variación en el número de copia (CNV): ej. antes había 2 copias, luego aparece 1 más, luego
El tipo de variación en el número de copias (CNV) no tiene por qué determinar ninguna enfermedad; eso
dependerá de que afecte a regiones codificantes o no
relacionada con alguna enfermedad o no. Se ha visto que hay sitios en el genoma donde es más frecuente
que se produzcan estas variaciones en el número de copias por ejemplo en genes relacionados con la
inmunidad y el neurodesarrollo. Esto tiene sentido, ya que así la población puede tener una gran variabilidad
por si, por ejemplo, llega un virus al menos parte de la población tenga la variación genética necesaria para
poder llevar a cabo una respuesta inmunitaria y así sobrevivir.

Variación en el número de copias (CNV)

o Es la variación estructural más frecuente en el genoma.
o Existen más de 8.000 abarca un 4% del genoma.
o Son polimórficas, es decir, que hay un distinto número de copias en distintas personas.
o En general, están flanqueadas por duplicaciones segmentarias (reordenación cerca de los centrómeros
y telómeros).
o Se cree que muchas CNV se originan por la reordenación de sus elementos.
o Ejemplo: gen AMY1, que codifica para la amilasa y se encuentra en el cromosoma 1.

Todos tenemos el gen de la amilasa (AMY1) en el cromosoma 1, pero si analizamos el ADN de una parte de la

La amilasa se encarga de degradar el almidón y el

glucógeno, a partir de los cuales se liberan azúcares
simples. Como hay personas que sólo tienen una
copia del gen, se ha visto que degradan el almidón
y el glucógeno con menor eficiencia. Por el
contrario, las personas que tienen más copias del
gen producirán más amilasa y, por lo tanto,
degradarán dichas moléculas más eficientemente.

Esto está relacionado con el peso de las personas:

muchas de las personas que tienen muchas copias
(por mucho que coman) son más delgadas que a lo
mejor una persona que come menos, pero tiene
una sola copia del gen. Esto se debe a que tienen
distintos tipos de metabolismos, siendo el primero
más eficiente que el segundo con una sola copia
del gen. La personas con pocas copias tienen mayor
predisposición a tener obesidad al degradar el
almidón y la glucosa peor (poco efectivo).
 TEMA 2: PROPIEDADES DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS Y
TÉCNICAS DE ANÁLISIS
2.1 PROPIEDADES DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Absorbancia

Es la capacidad que tienen los ácidos nucleicos de

absorber luz ultravioleta por las bases nitrogenadas, a una
longitud de onda concreta: =260nm (mientras que las
proteínas la absorben a una de 280nm por los anillos
aromáticos).

Esto nos permite cuantificar el ADN y saber, después de

haber extraído el ADN, si es puro o contaminado con
proteínas u otras moléculas presentes en la extracción del
ADN, sabiendo que:

A280 = contaminación por proteínas

A230 = contaminación por restos de reactivos de extracción:
la turbidez de la solución.

De esta manera, se pueden evaluar 2 ratios:

o A260/A280: como a nosotros lo que nos interesa es el ADN, queremos que el ratio A260/A280 sea grande
(un nº alto), ya que esto significa que hay más ADN o ARN que proteínas. Es imposible deshacerse de
todas las proteínas al extraer ADN, por lo que siempre habrá algo de A 260, pero cuanto menor sea
este número, mejor.
o A260/A230: nos indica si hay contaminación por otros compuestos, por lo que debería dar siempre un
valor mayor que 1 8 (si es menor está contaminado).

Valores deseados de absorbancia para los distintos ratios:

Hipercromicidad de los ácidos nucleicos:

Absorbancia nucleótidos libres > moléculas monocatenarias > moléculas bicatenarias

Los nucleótidos libres en solución tienen mayor absorbancia ya que, al poder moverse libremente,
absorben más luz UV.
Las moléculas monocatenarias ya tienen los enlaces fosfodiéster, por lo que hay mayor rigidez en la
molécula que hace que no pueda moverse tan libremente.
Las moléculas bicatenarias, además de los enlaces fosfodiéster, presentan ya también los puentes de
H, lo que hace que la molécula sea aún más rígida y con menor libertad de movimiento.
Esta propiedad se puede emplear para medir la concentración de ADN o ARN de una muestra. Ya se sabe
que:

A260 equivale a 50µg/ml dsDNA (ADN bicatenario).

A260 equivale a 40µg/ml de ARN.

A260 equivale a 33µg/ml ssDNA (AND monocatenario).

Esto se cumple en valores de rango lineal de entre 2 a 15.000ng/µl no puede extrapolarse a valores más
altos o bajos (estimaciones no precisas), por lo que si tenemos una muestra muy concentrada habrá que
diluirla, y si está muy diluida no va a servir.

Carga eléctrica

La carga eléctrica es de signo negativo debido a los grupos fosfato. Los ácidos nucleicos se mueven en un
campo eléctrico en función de su tamaño y conformación.

el ADN de menor tamaño va a moverse más fácilmente, por lo que migrarán más rápido.
al final de la electroforesis (5), obtenemos un patrón de bandas.

Desnaturalización

Es la pérdida de la estructura nativa debido

al desdoblamiento y la separación de las
hebras, al romperse los enlaces de H.
La desnaturalización puede producirse
mediante:
- Agentes físicos (temperatura):
aumentando la Tª de la solución donde

- y/o químicos (NaOH): el NaOH se

desdobla en grupos -OH y Na+; y los
grupos -OH van a secuestrar -H de los
puentes de H, por lo que se separarán
las cadenas. Depurinación (se eliminan

poder aumentarlo.
Es un proceso reversible .
 Podemos valorar si el ADN se está desnaturalizando mediante el estudio de la absorbancia de la
solución según se aumenta la temperatura, gracias a la hipercromicidad de los ácidos nucleicos.
Temperatura de fusión (Tm, melting): a la que el 50% de las moléculas de ADN se hallan en forma
monocatenaria; depende del:
o Contenido GC (%) .
+ -
o Concentración de iones con carga positiva + Cl ).

La línea roja tiene mayor contenido GC que la azul, ya que su Tm es más

alta, y la amarilla más que la roja (mayor Tm mayor contenido GC).

Cuantos más iones con carga positiva (Na+)

haya, más estabilizadas van a estar las dos
cadenas de ADN, por lo que va a costar
más disociarlas y la Tm será más alta
(puentes de H estabilizados).

2.1 PROPIEDADES DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

(A) PCR CONVENCIONAL:

Técnica que permite obtener un gran número de copias de la región de interés a partir de una
muestra de ADN molde (amplificación).
Componentes necesarios:
o ADN molde.
o Pareja de oligonucleótidos específicos (o cebadores, que son secuencias de entre 18-25pb, cuya
secuencia específica nosotros escogemos y compramos, de manera que sea complementaria y pueda
flanquear una región del genoma que nosotros queramos amplificar).
o ADN polimerasa termorresistente.
o Desoxirribonucleótidos trifostato (dNTPs).
o MgCl2 (ya que la polimerasa usa como cofactor el Mg).
Consiste en un paso inicial de desnaturalización (a veces denominado iniciación) + la repetición de 3
pasos de manera cíclica:
I. Desnaturalización (del ADN que queremos copiar).
II. Anillado (los cebadores se unen por complementariedad de bases a la región que queremos
amplificar).
III. Extensión (la polimerasa extiende los cebadores y copia el fragmento que estamos analizando).

Para hacer una PCR necesitamos un termociclador, y el proceso es el siguiente:

1. Tenemos nuestro ADN molde.

2. Lo desnaturalizamos (94-98ºC).
3. Se rompen los puentes de H, por lo que pasamos a tener las 2 cadenas en estado monocatenario.
4. -70ºC) se sabe que los cebadores van a poder anillar con
otro ADN molde.
5. Los cebadores se van a unir a la región de interés que queremos amplificar.
 6. Luego, la polimerasa que está en el tubo añadirá los nucleótidos complementarios a la secuencia que
estamos copiando.
7. Finalmente, a partir de una sola copia, obtendremos 2. Y a partir de esas 2 podríamos obtener 4, a
partir de esas 4 podríamos obtener 8, etc. (aumentando así el nº de copias de manera exponencial).

(7) (1)
(2)

(6) (3)

(4)

(5)

Cuando terminamos la PCR y sacamos el tubo del termociclador, miramos el tubo y seguimos sin saber qué
ha ocurrido en el proceso, tanto si se ha amplificado como si no, ya que no se produce ningún cambio que
nos indique si, efectivamente, el ADN ha sido amplificado (ej. el color es el mismo), si la región que nos
interesa amplificar está presente o no, ni podremos ver su secuencia, ... Por lo tanto, tras realizar una PCR,
hay que llevar a cabo también una electroforesis.

(B) PCR EN TIEMPO REAL (qPCR): la que se emplea en el diagnóstico del coronavirus.

Es una variante de la PCR convencional en la que el proceso de amplificación se visualiza en tiempo

real (en el tubo).
Los componentes que se emplean son los mismos que en los de la PCR convencional, pero, además
se añade un compuesto que produce fluorescencia (generalmente, agentes intercalantes, como el
SYBR green*, o fluoróforos
dichos compuestos fluorescentes que se visualizan según transcurre la reacción.

* el SYBR green es una molécula que se une al ADN de doble cadena y, cuanto mayor cantidad de ADN haya,
mayor es la señal de fluorescencia que emite.

Es un ensayo homogéneo, ya que la amplificación y el análisis de

datos ocurre de manera simultánea en el tubo de reacción (no
requiere análisis mediante electroforesis a posteriori).

En este caso, también es necesario un termociclador, pero también

tendremos un sistema óptico acoplado que emitirá una luz que excite al
compuesto fluorescente (SYBR green) que hemos añadido en el tubo.
solo
fluoresencia
con ADN doble Cadena

se intercala entre las

más doble
base ,
entre
-
Cadena hay más
fluoresencia
Así, el SYBR green (gracias a una lámpara excitadora) emitirá fluorescencia que detectaremos con un
analizador. Además, la señal de fluorescencia debe ser registrada por un ordenador con un programa
informático que generará unas gráficas con unas curvas de amplificación, como la siguiente donde se
muestra la longitud de onda del fluorósforo:

La curva es proporcional a la cantidad de ARN que

hemos utilizado. Nuestra muestra (en azul) y el
control negativo (en verde).

-EJE X: representa cada uno de los ciclos a los que

hemos sometido la reacción.
-EJE Y: variación de la señal de fluorescencia a lo
largo del proceso.
Al principio, el SYBR green emite una fluorescencia
basal. Pero, medida que transcurre la amplificación
la fluorescencia aumenta de manera exponencial,
hasta llegar a una fase de Plateau en las que los
reactivos de la PCR se han agotado.

Hibridación fluorescente in situ [FISH]

Esta técnica nos permite detectar y localizar una secuencia de ADN específica (un gen) en un cromosoma, y
se basa en la desnaturalización del ADN.

Por un lado tenemos los cromosomas que queremos analizar. Y por otro lado, vamos a diseñar una sonda, es
decir, un fragmento de ADN monocatenario artificial (complementario al fragmento de interés) con la
secuencia que queramos (20-25 nucleótidos) y que además, va a estar marcada con un compuesto
fluorescente.

Así tendremos una porción de ADN sintético

marcado con fluorescencia que tiene la
misma secuencia que la porción del genoma
que queremos detectar.

Entonces, calentamos los cromosomas (en

metafase), se desnaturalizan, y al volver a
bajar la Tª, como hay complementariedad
de bases entre la secuencia de la sonda y la
del cromosoma, se van a unir. De esta
manera, vuelve a haber una doble cadena,
pero que ahora emite fluorescencia en la
secuencia que nos interesa.

EJEMPLOS DE FISH

-Visualización de telómeros: mediante la técnica FISH podemos visualizar, por ejemplo, donde se encuentra
la secuencia TTAGGG del minisatélite que forma parte de los telómeros. Si nosotros diseñamos una sonda
que reconozca esa secuencia y emita fluorescencia, cuando se hibride, podremos observar dónde se
localizan los telómeros.
-Visualización de centrómeros: los centrómeros están formados sobre todo por un ADN satélite de tipo
(151pb repetidas en tándem). Por lo tanto, podemos diseñar una sonda que vaya dirigida a ese ADN satélite.
Si marcamos con un compuesto fluorescente la histona CENP-
localiza en el mismo sitio que el ADN satélite (marcaje de la proteína). Podemos realizar experimentos de
colocalización para saber la secuencia que se une a una proteína determinada.

-Pintado de cromosomas: podemos diseñar sondas que liguen con cada uno de los cromosomas y que el
compuesto fluorescente sea distinto para cada uno, marcándose cada pareja de cromosomas de un color
distinto. En metafase, podemos ver el color que adquiere cada cromosoma donde posteriormente, en
interfase distinguiremos los territorios cromosómicos dentro de l núcleo celular (ya que en forma de
cromatina cada uno tiene un lugar específico). Esta técnica sirve para el:

Diagnóstico de la leucemia linfoblástica aguda (genes RUNX1 [rojo] y TERT [verde]):

RUNX1 es un factor de transcripción que

interviene en la división celular de las líneas
hematopoyéticas. En la leucemia
linfoblástica se sabe que el gen RUNX1
aparece copiado muchas veces (elevado
número de copias), y se puede comparar
con el número de copias que hay del gen de
la telomerasa, que es el gen TERT.

Paciente A): sólo hay una copia del gen de la telomerasa, por lo que ha perdido una copia. Y del gen RUNX1
hay muchas copias (9 en el cromosoma 21), ya que este tipo de cáncer lo que hace es tener muchísimas
copias de cromosomas que contienen este gen y entonces la división celular se descontrola.

Paciente B): sí tiene 2 copias del gen de la telomerasa, pero sigue teniendo también muchísimas copias del
gen RUNX1.

En los
acortando más los telómeros (hasta que la células acaba sufriendo apoptosis).

Hibridación genómica comparativa en array [aCGH]

Técnica citogenética molecular que permite la detección de variación estructural a nivel genómico
empleando arrays (detectar ganancia o pérdida de 50pb o más).

Tenemos el ADN de un paciente que queremos analizar para ver si tienen pérdida o ganancia del material
genético, es decir, variaciones estructurales en algún lugar de su genoma. Por lo tanto, vamos a hacer un
barrido de todo el genoma.

Este ADN del paciente lo marcamos con un fluoróforo rojo y un ADN de referencia, que tiene un
determinado número de copias de esas secuencias que queremos analizar el genoma, lo marcamos con un
fluoróforo verde.

Mezclamos los dos ADN y los hibridamos en un array, que es una supe
tiene una estructura muy ordenada, en la que pondremos sondas (fragmentos de ADN sintético) dirigidas a
hibridar con las regiones del genoma de interés.
Entonces desnaturalizamos la mezcla de ADN anterior junto con el de la sonda para que se hibriden en el
array (fragmentamos).

Los resultados que vamos a poder obtener, sabiendo que cada uno de esos puntos determina la variación
estructural en un punto en concreto del genoma, son que:

o si se obtiene una señal amarilla = el nº de copias en el ADN del paciente es igual al que tiene el ADN de
referencia, lo que significa que tiene el nº de copias normal.
o si se obtiene una señal roja = significa que en esa región hay más ADN del paciente que del de
referencia, lo que indica que el paciente tiene un mayor nº de copias de esa región del genoma (ADN del
paciente si, pero no en el ADN de referencia) Inserción
o si se obtiene una señal verde = indica que el paciente ha perdido esa región del genoma, y le falta
material genético (ADN referente si que tiene esa región) Deleción

Heterocigótico: en un cromosoma Homocigótico: en ambos cromosomas

(paterno o materno) (paterno y materno)

Por último, estos resultados se analizan de manera automática con un escáner que lee todos esos puntos
obtenidos y los transforma en unas gráficas, que representan cada uno de los puntos analizados del genoma
y la señal de fluorescencia que hayan emitido.

Pero si lo que queremos estudiar son cambios puntuales (snips = polimorfismos de un solo nucleótido),
emplearemos la siguiente técnica con micromatrices de ADN.

Micromatrices de ADN (DNA microarrays)

genotipado)
Técnica de detección simultánea de cientos de miles o unos pocos millones de SNPs (snips), empleando
sondas de ADN unidas a una superficie sólida.

Por lo tanto, al igual que en el caso anterior, se van a emplear sondas, es decir, ADN sintético
complementario a regiones que nos interesa estudiar porque se sabe que en dichas regiones hay variación
genética (gracias a proyectos como Mil Genomas), pero en este caso las sondas no van dirigidas a sitios del
genoma donde hay ganancia/ pérdida de ADN, sino a donde hay polimorfismos, en los que una base se ha
cambiado por otra.

Nor/In- > Reso Nor/Nor

Irs/Ins- > Rojo Nor/Del-Verde Claro

Del/Det
Oscuro
-
Verde Ozeuro
En este caso, la superficie del microarray mide también unos pocos cm, pero a pesar de su pequeño tamaño,
en el podemos analizar cientos de miles de polimorfismos. Además, el microarray está dividido en pequeños
sectores, y en cada uno de ellos hay ADN sintético que tiene secuencias complementarias a la región
adyacente a un polimorfismo de un solo nucleótido. Si se sabe que hay un polimorfismo de un solo
nucleótido en la posición marcada en rojo, donde vamos a poner la sonda no es sólo en esa base, sino que
hay que ponerla en un contexto genómico, rodeando la C (citosina) marcada por ambos lados. Así,
construimos nuestra sonda, conteniendo en una posición preferiblemente central el cambio de nucleótido
que se observa en la población.

(1) Entonces, en este sector, vamos a poner muchas copias de la misma sonda (podemos ver que todas
tienen la misma secuencia).

(2) Extraemos ADN del paciente, lo fragmentamos (desnaturalizamos) y copiamos (amplificamos) ya que, si
ponemos directamente el ADN genómico a hibridar, no tendremos suficiente señal, por lo que hay que
amplificarlo. Se le añade también una marca de biotina, que como tiene un tamaño muy pequeño, no va a
interferir con la hibridación que va a producirse entre el ADN del paciente y la sonda que está anclada a la
matriz.

(3) Seguidamente lo ponemos a hibridar. De esta manera, la región del genoma de ese individuo que
contiene una secuencia complementaria a la sonda se va a unir, por lo tanto, a dicha sonda por
complementariedad de bases. Y esto va a ocurrir en todo el sector, puesto que hemos copiado muchas veces
el ADN del individuo que estamos analizando y tenemos también muchas copias de la sonda.
(4) Con lo cual, en ese sector vamos a tener todas las sondas hibridadas con el ADN del paciente. Y en la

paciente.

(5) Pero la biotina no podemos verla directamente. Para verla, hay que añadir estreptavidina, que tiene una
gran afinidad por la biotina, y esa estraptavidina es la que vamos a marcar con un fluoróforo. Así, todo el
sector que estaba marcado con la biotina se vuelve fluorescente.

(6) Ahora ya podemos detectar esa señal de fluorescencia. ¿Pero qué ocurre con los otros 3 sectores
adyacentes? En realidad, éstos tienen exactamente la misma secuencia que la sonda, pero en la posición
donde se sabe que hay un polimorfismo, están las otras 3 bases alternativas (G, A y T). Así, en 4 sectores
adyacente, formando un cuadrante, se encuentran las sondas para las 4 secuencias posibles de cada SNP y,
en función de qué sector se ilumine, podremos saber el genotipo del individuo.

En este caso, se ha iluminado el sector de la izquierda (cuya sonda contiene un C y, por lo tanto, el ADN del
individuo una G) y el de la derecha (cuya sonda contiene una T y, por lo tanto, el ADN del individuo una A).

Pero esto es sólo un SNP, y como se mencionó anteriormente, en un sólo microarray podemos analizar
cientos de miles de polimorfismos (hasta 5 millones). Por lo tanto, en estos cuadrantes va a haber millones
de ellos, simultáneamente detectando señales de fluorescencia del genotipo. Y hay un escáner que toma
esas señales de fluorescencia y, con un programa informático, dichas señales son transformadas a un
genotipo.

Este tipo de técnica se emplea mucho en la determinación de variantes que pueden estar asociadas o
relacionadas con enfermedades complejas.

Hasta ahora hemos visto cómo copiar el ADN, cómo detectar variaciones en el número de copias de sitios
específicos del genoma, gracias a que ya tenemos información previa que nos indica que en ese sitio hay
variación, o los SNPs, que ya sabemos que existen por distintos proyectos, etc.

Pero si lo que queremos es tener toda la información, es decir, cada una de las bases que componen un
segmento de ADN, tendremos que secuenciar, que es leer el contenido en bases de un fragmento de ADN.
Y hay distintos tipos de secuenciación:

Secuenciación de Sanger

Surgió en los años 70, y es un proceso de síntesis de ADN que permite determinar la secuencia de
un fragmento de ADN de hasta 800 pb (incluso de 1.000pb). Es la primera técnica que se utilizó para
secuenciar ADN.
Se basa en la combinación de desoxinucleótidos normales (dNTP) con didesoxinucleótidos (ddNTP).

El punto de partida es una PCR, ya que tenemos que amplificar el ADN para poder luego leer su secuencia.
Otra de las diferencias fundamentales es que, además de los desoxinucleótidos normales (dNTP) que
añadimos en la PCR, en este caso añadimos también didesoxinucleótidos (ddNTP).

Lo que va a ocurrir es que a veces, por azar, se va a incorporar un desoxinucleótido, y otras veces, un
didesoxinucleótido. Y cuando se incorpora un ddNTP, lo que ocurre es que se para la secuenciación de ADN
- -H).

Si tenemos un fragmento de ADN, del cual queremos leer su secuencia, también tenemos que poner un
cebador que nos aporte el 3´ y a partir del cual se copie la secuencia. Entonces, por azar, habrá veces que:
 000
o L si se

se para
incompone
la reación de la cadena

o Si el primer nucleótido que se incorpora es un ddNTP, vamos a tener un fragmento de ADN que se para
inuar.
o Si se puede incorporar la primera A correspondiente del nucleótido normal (complementaria a la T),
pero la siguiente A va a ser de tipo ddNTP -OH libre y se para de leer la
secuencia.

Y así sucesivamente, por lo que vamos a tener fragmentos que se han parado en distintas posiciones. Una
cosa muy importante de los didesoxinucleótido (ddNTP) es que los vamos a poner en la reacción marcados
distinto, de manera que cada uno de esos fragmentos que
hemos obtenido tendrá un tamaño diferente y emitirá una señal de fluorescencia distinta.

En los comienzos de esta técnica, no se empleaba fluorescencia, se empleaba marcaje radiactivo y se corrían
las electroforesis en geles enormes, etc. Pero hoy en día tenemos secuenciadores automáticos, y en los
secuenciadores automáticos lo que ocurre es una electroforesis en unos capilares muy finos que hacen que
las bases se vayan moviendo, dependiendo de su tamaño, atravesando los fragmentos ese capilar de uno en
uno. Las posiciones las vamos a ir viendo pasar de una en una.

Hay una ventana en el capilar donde incide la luz de un láser para así excitar al compuesto fluorescente, y
dependiendo de la base que sea, va a emitirse fluorescencia o un color, ya que los didesoxinucleótido están
marcados con fluorescencia y los 4 tipos de desoxinucleótidos normales están marcados cada uno con un
color diferente. Entonces, dependiendo de la base que contenga cada fragmento en su extremo, dará una
señal u otra.

Por último, las señales obtenidas se analizan con un programa informático, dando como resultado un
electroferograma con una serie de picos de señal de fluorescencia correspondiendo a cada uno de esos
fragmentos: adeninas (A) reflejadas como picos de color verde, guaninas (G) de color negro, timina (T) de
color rojo y citosina (C) de color azul.

IMPORTANTE: las lecturas de bases en secuenciación Sanger son de una cadena en una cadena. Se lee una
de las cadenas con uno de los cebadores y, en general, para aumentar la fiabilidad se lee también la otra. Se
una cadena y luego un cebador para un lado y posteriormente para el otro.

o Se pone en el tubo el producto de la PCR que se quiera secuenciar y el cebador forward, y se lee; y luego
se coge más producto de la PCR, pero en este caso se añade el cebador reverse, y se lee también. Es
decir, en una reacción se coge uno de los cebadores y se lee, y en otra reacción se hace lo mismo, pero
con el otro cebador. Se secuencia por separado (no se ponen ambos cebadores juntos en una misma
reacción).

nolo positive
Para saber la
frecuencia necesitamos una
electroforens capilar , emigran al

nor un camilar muy fino por un

diagoticoi ti
se
 Secuenciación masiva de ADN [NGS]

Esta tecnología ha surgido en los últimos

años, es una secuenciación de Sanger
masiva.
Esta secuenciación de ADN permite
obtener millones de secuencias de forma
paralela con bajos costes (en Sanger hay
que secuenciar de cada secuencia de una
en una).
Permite secuenciar varios genes
simultáneamente o incluso genomas
completos (en Sanger sólo se pueden
secuenciar fragmentos de ADN de un
máximo de 800pb).

PROCESO DE SECUENCIACIÓN MASIVA DE 2ª GENERACIÓN:

Los pasos que vamos a seguir para secuenciar varios genes a la vez, o genomas completos, son los siguientes:

Lo primero que hay que hacer es construir una librería, es decir, a los fragmentos del genoma (de los genes
que nos interesen o del genoma completo) hay que unirles unos adaptadores de secuenciación. Esos
adaptadores de secuenciación son secuencias que nosotros conocemos, que se han diseñado y son
específicas de cada marca de secuenciación, y los vamos a añadir a los extremos de los fragmentos de ADN
que hemos generado rompiendo el genoma, para que así todos estén flanqueados por la misma secuencia.
De esta manera, como todos los fragmentos están flanqueados por la misma secuencia, con un mismo
cebador podemos leer todo el genoma.

Por lo tanto, las secuencias conocidas de los

adaptadores se usan para que luego pueda
anillarse a ellas un cebador que lea todo el
fragmento. Y por otro lado, los adaptadores
también sirven para inmovilizar esas moléculas a
una superficie.

Después de haber fragmentado el genoma y

haber unido los adaptadores en los extremos, lo
que hay que hacer es amplificar esas regiones,
mediante un proceso de amplificación clonal.

Tras la amplificación, se pasa a leer las bases que

componen esos fragmentos (secuenciación).
Finalmente, se analizan los datos, ya que vamos a
tener lecturas que provienen de cualquier parte
del genoma en una misma reacción.

Por lo tanto, el análisis de datos se lleva a cabo para poder distinguir qué partes vienen de un lado u otro del
genoma.
 1) Ejemplo de cómo construir una librería de ADN genómico:

Lo primero que hay que hacer es fragmentar el ADN genómico mediante métodos físicos, como la
sonicación (ultrasonido), o mediante métodos químicos o enzimáticos.

Entonces, una vez fragmentado el ADN, lo que suele ocurrir es que NO nos queden los fragmentos con las 2
cadenas
antes de poder continuar con el proceso.

Cuando hay un extremo 3´libre se le pueden añadir nucleótidos y, para ello, se añade una polimerasa que
completará los extremos 3´ para igualarlos a la cadena complementaria.

Pero no sólo basta con tener el extremo 3´libre, tiene que estar la cadena complementaria para ir guiando a
la polimerasa y que esta sepa que bases debe ir añadiendo. Si esto ocurriera, los extremos que hay libres y
que no tienen una cadena molde, son degradados por una exonucleasa. La exonucleasa
misma altura de la cadena complementaria.

De esta manera, se consigue tener

todos los fragmentos con los extremos
romos (extremos con la misma
longitud).

El siguiente paso es la fosforilación de

los extremos, ya que la exonucleasa ha
dejado con anterioridad a los
fragmentos sin grupos fosfato. Por lo
tanto, hay que fosforilarlos de nuevo,
añadiéndole grupos fosfato en los
extremos.

Luego, se añaden los adaptadores, es

decir, las secuencias conocidas que nos
vana facilitar el proceso de
secuenciación. Se añaden 2 tipos de
adaptadores (cebadores).

Al final de la preparación de la librería,

se obtienen fragmentos pequeños del
genoma con 2 tipos de adaptadores
unidos en los extremos.

2) Amplificación clonal de la muestra y anclaje (Illumina):

Primero, los fragmentos ligados a los adaptadores son inmovilizados a una superficie sólida, gracias a< que
en dicha superficie sólida vamos a tener secuencias que son complementarias a las de los adaptadores.
Luego, los fragmentos son sometidos a amplificación clonal.
1. Entonces, tenemos los fragmentos que hemos generados (1, 2, 3 y 4), que corresponden a distintas
regiones del genoma, y que están flanqueados por los adaptadores. Y vemos que el adaptador de uno de los
extremos de los 4 fragmentos es de color naranja y que, al lado, en la superficie sólida (llamada célula de
flujo), hay uno de color rojo, lo que indica que su secuencia es complementaria a la del adaptador del
fragmento de ADN. Como son complementarias, al añadir los fragmentos, cuando encuentren
complementariedad de bases, se unirán mediante puentes de H a la secuencia de la célula de flujo. Sin
embargo, el adaptador azul claro del otro extremo no se va a unir por complementariedad de bases, ya que
el otro tipo de secuencia que hay en la célula de flujo es de color azul claro también, lo que significa que
tiene la misma secuencia (no la complementaria).

2. Añadimos una polimerasa y a partir de la secuencia de la célula de flujo que es complementaria a la del
adaptador, se sintetiza y se copia una nueva cadena, complementaria a la del fragmento de ADN que había
hibridado gracias al adaptador. De esta manera, hemos obtenido una copia de la molécula original.

3. Vemos que el extremo superior de la nueva cadena es de color azul oscuro, por lo que va a ser
complementario al otro tipo de secuencia que hay en la célula de flujo de color azul claro. Esto va a hacer
que la molécula (la nueva cadena) se doble como un puente para que así el extremo azul oscuro pueda
unirse por complementariedad de bases a la secuencia azul clara.

4. Ahora se podrá producir otra copia (nueva cadena) a partir de la secuencia azul clara.

5. Esos fragmentos, vuelven a soltarse. Vemos que los extremos rojos y azul claro están anclados (tienen un
palito), pero los naranja y azul oscuro no. Por lo tanto, vuelven a elongarse y, por complementariedad de
bases, pueden encontrar otra secuencia de la célula de flujo a la que volver a unirse, por lo que vuelven a
doblarse y se produce otra amplificación en puente.

6. De esta manera, lo que estamos logrando es que a partir de cada uno de esos fragmentos de distintas
regiones del genoma, estamos obteniendo muchas copias de una sola molécula. Se dice que son clones, y de
ahí que se denomine amplificación clonal.

7. Y hemos explicado el proceso de lo que ocurre sólo con el fragmento 1, pero la realidad es que esto ocurre
simultáneamente en millones de posiciones de la célula de flujo para todos los fragmentos de las distintas
regiones del genoma. Por lo que se están copiando todas, simultáneamente, basándose en la
complementariedad de bases.
Y ahora, ¿cómo vamos a leer esos fragmentos que hemos copiado millones de veces y que corresponden a
distintas regiones del genoma?

Recordemos que en Sanger usábamos los nucleótidos normales (desoxinucleótidos dNTP) y los
didesoxinucleótidos (ddNTP). Los normales podían continuar la síntesis de la manera habitual, pero los
ddNTP, cuando se incorporaban, frenaban la reacción de amplificación, ya que carecían del extremos 3´.
Pues en este caso (secuenciación masiva), se usa algo ligeramente distinto, y son los terminadores
reversibles.

3) Secuenciación masiva de 2ª generación con Illumina:

o Secuenciación de segunda generación, empleando
TERMINANDORES REVERSIBLES.
o Los fragmentos secuenciados tienen una longitud máxima de
350pb.

Los terminadores reversibles son nucleótidos modificados, y tienen

en el extremo 3´ un grupo unido (O-N3), de manera que el extremo
3´se encuentra bloqueado, aunque esto es reversible. Para
desbloquearlo, se puede volver a añadir el -H al -O en el momento
que nos interese (para acidificar el medio), para así formar de nuevo
el grupo -OH. En el otro extremo hay un fluoróforo unido que nos
permitirá saber qué base estamos leyendo según el color que se
emita.

Entonces, tenemos cada uno de nuestros fragmentos de distintas regiones del genoma inmovilizados a la
superficie de la célula de flujo, y lo que vamos a hacer es ir copiándolos por complementariedad de bases. Si
en la secuencia original había una G, se incorpora una C, si había una C se incorpora una G, si había una A se
incorpora una T, y así sucesivamente, ya que cada fragmento corresponde a una región distinta del genoma,
por lo que no tienen la misma secuencia. Y luego, a su vez, en el dibujo aparece simplificado poniendo sólo 1
copia de cada fragmento, pero en realidad de cada fragmento habría muchas copias clonales para así tener
una intensidad de señal suficiente. Por lo tanto, se incorporan las bases y, como son fluorescentes y de
distintos colores, leyendo la fluorescencia se sabe cuál es la primera base de cada fragmento.

Pero el extremo 3´ está bloqueado, por lo que lo primero que hay que hacer
después de medir la fluorescencia, es cortar aquí (circulo naranja de la
imagen anterior) y eliminar el fluoróforo. Así, cuando incorporemos otro
nucleótido, podremos leer la fluorescencia sin confundirnos con la anterior.

Pero hay otro problema, y es que, si queremos continuar con la síntesis, no

podemos debido al bloqueo del extremo 3´. Para ello, ese enlace (círculo
rojo de la imagen anterior) también se puede escindir y reconstruir el grupo
-OH para así desbloquear dicho extremo. Así podemos continuar con la
síntesis y repetir el proceso: añadir nucleótidos fluorescentes, cada uno se
incorpora en la posición que le corresponde por complementariedad de
bases, leemos la fluorescencia, lavamos, volvemos a desbloquear el
extremos 3´, y así sucesivamente repetimos el ciclo muchas veces, hasta
alcanzar el máximo de 350 pb, que es el límite de la secuenciación con
Illumina.

Illumina es el método de secuenciación que más se emplea. Aunque existen otras técnicas que también se
utilizan, esta es la que más fiabilidad da en los resultados.
 4) Análisis de datos:

Tenemos en la superficie millones de puntos que nos van dando a una determinada escala de tiempo (s/ms)
señales de fluorescencia, que se registran, se les toma una foto, se lava la señal de fluorescencia, se toma
otra foto, etc. Y un ejemplo del resultado que se obtiene es este:

Puntos que van cambiando de color para cada uno de los clúster. Y realmente cada punto corresponde a
muchas moléculas de la amplificación clonal que se ha hecho anteriormente para tener una intensidad de
señal suficiente. Vamos a fijarnos en 2 de los clones (en los círculos más grandes):

o En el de abajo, podemos ver en todas las fotos que se han tomado, que tiene el nucleótido citosina (C),
ya que es siempre de color verde. [BOTTOM]
o En el de arriba, sin embargo, primero tiene una C (verde), luego una A (azul), luego una T (rojo), luego
otra C (verde), una G (amarillo) y, por último, otra T (rojo). [TOP]

¿Qué es lo siguiente que hay que hacer?

Se puede tomar el genoma de referencia (que es público) y, mediante un programa informático, ver dónde
encajan las millones de lecturas que hemos obtenido de la secuen
manera podemos ir distinguiendo qué secuencias corresponden al cromosoma 1, cuáles al 2, etc.

Incluso, imaginando que esto es el genoma de un paciente, podremos ver respecto al genoma de referencia,
si presenta alguna base diferente o alguna mutación.

Como hemos observado, en la secuenciación masiva de 2ª generación hay un proceso de amplificación

implicado, por lo tanto vamos a pasar a ver la secuenciación masiva de 3ª generación que ha surgido muy
recientemente.
SECUENCIACIÓN MASIVA DE 3ª GENERACIÓN CON NANOPOROS:
Es una tecnología basada en el uso de nanoporos, anclados a una membrana,
por donde se hace pasar el ADN en estado monocatenario, y al hacerlo, va a
producir un cambio de voltaje específico de cada base: cuando pasa la C hay
una determinada señal de voltaje, con la G hay otra, etc.

Por lo tanto, la lectura de la secuencia se obtiene directamente de la cadena

original de ADN (no es necesario estar llevando a cabo una amplificación
clonal) por medición de cambios de voltaje.

Permite leer más de 1Mb en una sola lectura de una molécula:

o Pese a que las lecturas pueden presentar errores, ya que son larguísimas.
Una de las aplicaciones principales de esta técnica es que dichas lecturas
sirvan de andamiaje como referencia para luego alinear las secuencias.

Obtenemos varias escalas: desde equipos que pueden conectarse a un móvil

y permiten secuenciar genomas pequeños (MinION), hasta equipos de mayor
tamaño con los que se pueden secuenciar genomas humanos (PromethION).

APLICACIONES DE LA SECUENCIACIÓN MASIVA

o Análisis filogenético (de especies animales, vegetales, bacterianas, ...).
o Metagenómica (ej. secuenciar el ADN de una muestra de un paciente y poder determinar los
microorganismos que están ahí presentes sin necesidad de cultivos).
o Paleogenómica (ej. secuenciar el ADN de individuos guanches para conocer sus características, ver si
tenían las mismas spp. vegetales, agrícolas y ganaderas, etc).
o Secuenciación de novo (ej. secuenciación masiva que se le hizo al Sars-coV-2 para poder conocer su

hacer PCR en tiempo real para su diagnóstico).

o Diagnóstico de enfermedades de base genética (enfermedades monogenéticas, análisis biopsias

o Diagnóstico de enfermedades infecciosas.

o Descubrimiento de variabilidad genética.
o
 TEMA 3: REPLICACIÓN DEL ADN EN EUCARIOTAS
La división celular implica que el material genético sea copiado (duplicado) por completo.

El ciclo celular consiste en distintas fases:

Fase M (mitosis): en la que produce la división celular.

Fase G1: las células nuevas generadas están en este estadío preparándose para el momento en el que se
tenga que dividir.
Fase S: en la que se produce la síntesis, que debe tener lugar antes de la división.
Fase G2: fase preparativa para que pueda tener lugar de nuevo la división (fase M).

Antes de que una célula pueda dividirse debe replicar de manera exitosa su ADN, de manera que cada célula
hija reciba una copia exacta del material genético. Los puntos de control del ciclo celular garantizan que no
se produzca la división celular si la replicación del ADN está inhibida o es defectuosa (lo veremos más
adelante). La replicación del ADN es un proceso complejo que requiere una gran cantidad de componentes,
cuyas acciones deben estar intrincadamente coordinadas para asegurar que el ADN sea copiado con
exactitud.

La replicación de ADN tiene lugar en la fase S:

o Al principio de la fase S (early S phase), nuestro ADN está constituido por una sola doble hélice de
ADN, realmente dividida entre los distintos cromosomas. Pero tenemos una copia materna y otra
paterna (2n), pero cada uno de esos cromosomas contiene una sola molécula.
o Más adelante, aún en la fase S (late S phase), los cromosomas duplican su información genética, por
lo que ahora, en vez de tener una sola doble hélice, tenemos 2 dobles hélices de ADN unidas por el
centrómero. Y cada una de estas moléculas es una cromátida hermana.
Por lo tanto, el resultado de duplicar el material genético da lugar a las cromátidas hermanas, que
serán separadas y repartidas a cada una de las células hijas en la fase M.
ADN polimerasas y síntesis de ADN:
Las ADN polimerasas son las enzima que polimerizan ADN mediante formación de enlaces fosfodiéster.
La dirección de este proceso de síntesis SIEMPRE tiene lugar en .
Para que pueda tener lugar la síntesis, es necesario:
- Un ADN que copiar, que tiene que estar en estado monocatenario para que la replicación pueda ocurrir
(ADN molde).
- Un cebador (un pequeño fragmento que tenga el extremo -OH libre).
- Los dNTPs que se incorporen a la cadena.

En la figura vemos como en la replicación se

incorpora un nucleótido nuevo por un ataque
nucleofílico del carbono 5´sobre el carbono 3´ con
el grupo -OH libre de, en este caso, un cebador.
Entonces se incorpora el nucleótido, se forma un
enlace fosfodiéster y se libera un pirofosfato.

Estas reacciones podrían ocurrir de manera natural

en las células, pero para que ocurran de una
manera rápida para poder copiar el material
genético dentro de nuestro período de vida, tienen
que participar las polimerasas, que son las
enzimas que catalizan esa formación de los enlaces
fosfodiéster con la liberación de pirofosfato.

Tipos y propiedades de las ADN polimerasas:

Hay 3 tipos de ADN polimerasas que participan en la replicación:

El cebador inicial está formado por una parte de 5-10 nucleótidos de ARN y otra de 5-10 nucleótidos de
ADN (es un híbrido de ADN-ARN).
Procesividad: nº de nucleótidos es capaz de incorporar la polimerasa a la hebra antes de separarse del
molde (depende de la funcionalidad):
- La ADN polime -10 de ADN (en total, no
más de 20 nucleótidos).
-

: consiste en que si la polimerasa incorpora un nucleótido erróneo (la base

no es complementaria y se forma un enlace erróneo), es capaz de identificarlo, eliminarlo y continuar
con la síntesis. Esta actividad retrasa un poco la síntesis de ADN, pero asegura que el material genético
que reciben las células hijas es el mismo que el que presenta la célula inicial.
No hay proteínas que se unan covalentemente al ADN, la proteína se une específicamente pero se puede
revertir a un lugar del cromosoma.

3.1 REGULACIÓN DE LA INICIACIÓN

¿Cómo sabe la célula que tiene que pasar de una fase a otra del ciclo celular? ¿Cómo sabe que tiene que
empezar a dividirse?

Ciclinas, kinasas y fosforilación:

1) Determinadas señales externas (factores de crecimiento, hormonas, etc) activan la síntesis de las
ciclinas D y E (ciclinas de la fase G1). Interactúan con proteínas kinasas dependientes de ciclinas
(promueven cuando están activas).

Cada una de las fases del ciclo celular (G1, S, G2 y M) están reguladas por una hormona distinta, llamadas
ciclinas. Y las ciclinas se producen en distintos niveles en las diferentes fases del ciclo celular:

o En la fase G1, se produce un gran aumento de la ciclina D y de la ciclina E; y cuando se llega al pico
de ambas ciclinas, la célula sabe que tiene que entrar en la fase S (¡¡¡que es la que nos interesa, ya
que es en la que se produce la replicación del ADN!!!).
o A su vez, la célula sabe que debe aumentar sus niveles de ciclina D y E por factores externos que
regulan esas ciclinas.
2) Luego, las ciclinas D y E (ciclinas G1) activan a kinasas dependientes de ciclinas (CDK), que se encargan
de fosforilar otras proteínas: a la kinasa dependiente de ciclina C (ciclina C-CDK) Y a la kinasa
dependiente de ciclina E (ciclina E-CDK).
3) Por último, las CDKs fosforilan a RB (proteína de
retinoblastoma), desencadenando una cascada
de activación para expresar todos los factores
necesarios en la replicación del ADN.

En nuestras células existe un factor de transcripción,

llamado E2F, cuya situación basal es que su actividad
está inactivada por su unión a la proteína RB.

Ahí es cuando intervienen las CDK, fosforilando a la

proteína RB, lo que hace que se separe y deje libre el
factor de transcripción E2F.

Por lo tanto, E2F se activa y puede llevar a cabo su

función, que es unirse al promotor de determinados
genes, activando así la transcripción de los genes
que codifican las proteínas implicadas en la
replicación y que, por lo tanto, son necesarios para
que la replicación del ADN pueda llevarse a cabo.

3.2 INICIACIÓN

Múltiples orígenes de replicación:

A lo largo del cromosoma hay muchos orígenes de replicación: de esta manera, se aumenta la rapidez del
proceso, pero al tener que coordinarse muchos procesos simultáneamente, también pueden ocurrir más
errores.

¿Cómo sabe la maquinaria de la célula lo que es un origen de replicación?

Por la secuencia que presentan, los orígenes de replicación tienen una secuencia consenso, lo que significa
que cuando comparas qué composición tiene una región determinada en unos organismos (de la misma sp.
o de distintas spp.), se observa un patrón de repetitividad, unos determinados nucleótidos que siempre
están presentes en unas determinadas posiciones.

Además, cada origen de replicación presenta 2 horquillas de replicación que avanzan simultáneamente en
sentidos opuestos, es decir, de manera bidireccional. La bidireccionalidad implica una mayor rapidez para
replicar la molécula completa. El origen de replicación solo se usa una vez antes de que la célula se replique,
sino habría aneuploidía.
Estructura del origen de replicación en Saccharomyces cerevisiae

Por ejemplo, para decir que esto es un

origen de replicación y que la célula lo
reconozca como tal, las primeras 4
posiciones de la secuencia de ADN tienen
que ser, en este caso, TTTT, AAAA o alguna
combinación de estas bases.

El tamaño de las letras en el esquema

indica qué base es la más probable que esté
en la secuencia consenso, y se conoce que
son regiones ricas en timinas y adeninas
(más fácil romper los puentes de hidrógeno).

as que el ADN no está

empaquetado en nucleosomas, denominadas NFR (nucleosome free region). Y esas regiones son
precisamente los orígenes de replicación, es decir, regiones de ADN que no están formando parte de los
nucleosomas y que están conformadas por secuencias ricas en A y T. Por lo que los orígenes de replicación
son regiones que no están protegidas por las histonas.

Y luego, ¿quién se une a los orígenes de replicación para poder comenzar la replicación propiamente dicha?

Formación del complejo de pre-replicación (pre-RC):

1. El origen de replicación (replicador) es reconocido por
proteínas del complejo de reconocimiento del origen
(ORC, origin recognition complex), que está unido a
ATP.
2. Luego, Cdc6 junto a una molécula de ATP es atraído por
el ORC y se une a él.
3. Cdt1 también es atraído por el ORC, y a su vez, conduce
a la helicasa Mcm2-7 también hasta el ORC al estar
unido a ella.
Cdc6 y Cdt1 actúan como proteínas cargadoras de la
helicasa, conduciendo a 2 copias de esta proteína hacia
el ORC.
4. Entonces, Cdc6 hidroliza el ATP, lo que hace que las
proteínas cargadoras de la helicasa (Cdc6 y Cdt1)
abandonen el complejo. De esta manera, las 2 unidades
de la helicasa pueden interaccionar directamente con la
doble hélice para así, cuando estén activas, poder abrir/
separar (desnaturalizar) las 2 cadenas de ADN para que
las polimerasas puedan actuar sobre ellas.
5. Por último, la hidrólisis del ATP del ORC permite que la
helicasa Mcm2-7 se disocie del complejo ORC.

Pero mediante este proceso, lo único que se ha hecho es

situar a la helicasa, pero aún no está llevando a cabo
ninguna función; está esperando una señal para activarse.
Regulación a lo largo del ciclo celular:

En la fase G1 los niveles de CDK son bajos

(se forman complejos ORC).

Por lo tanto, SOLO se produce la carga de la

helicasa en esta fase.

La helicasa permanece inactiva.

En las fases S, G2 y M los niveles de CDK son

altos.

La helicasa que estaba cargada se activa en

fase S, y ya podrá desnaturalizar el ADN.

Pero, NO se produce más cargas de la

helicasa para evitar que se produzcan
errores. Esto asegura que por cada ciclo
celular haya una sola replicación.

Si la señal de activación de la helicasa proviene de las CDK, lo que ocurre es que la helicasa se fosforila.

Activación del complejo de pre-replicación:

6. Los altos niveles de ciclinas de la fase S
provocan el reclutamiento:
- de 2 tipos de kinasas (CDK y DDK).
- de la ADN polimerasa .
- de proteínas accesorias (GINS y Cdc45).
7. CDK y DDK fosforilan a varias proteínas
unidas al origen de replicación, incluida la
helicasa y las proteínas accesorias. Esto causa
la activación de la helicasa, desnaturalizando abrir la
el ADN, y la disociación de varias proteínas doble helice
del complejo. Aunque las proteínas
accesorias, GINS y Cdc45, no abandonan el
sistema, sino que pasan a formar el complejo
CMG.
8. Entonces, la presencia de ADN
monocatenario atrae rápidamente a: 6
en
- la (primasa). sintetisa
- y a la .
9. La (primasa) comenzará la
síntesis del cebador.

10-12 ribonucletidos
Síntesis del cebador:
Aquí vemos que la sólo se une
cuando las 2 cadenas de ADN ya han sido separadas
por la helicasa.

Entonces, va a incorporar entre 5-10 nucleótidos de

ARN y luego, otros 5-10 nucleótidos de ADN.

Así, a partir de ese extremo 3´ ya van a poder venir

las a copiar el resto del ADN.

3.3 ELONGACIÓN

-20 nucleótidos en total

(de ADN y ARN), y abandona el sistema, dejando un hueco que va a pasar a ser ocupado por las polimerasas

:
10.
demás vienen con una proteína unida a ellas, llamada abrazadera
deslizante, que interacciona con las ADN polimerasas y se une al ADN. La función de la abrazadera
ando
antes de completar su función, y es la razón por la cual estas polimerasas tienen una alta
procesividad.
11. Entonces, la doble hélice está abierta y hay 2 cadenas que copiar, por lo que la primasa ha dejado
colocado un cebador en cada una de ellas. Y la horquilla avanza en ambos sentidos, pero:
- la cadena que avanza en la misma dirección en la
que se abre la doble hélice (que va a favor de la a

La volimeras abrder
abraadete
comienza la síntesis de ADN de Elitante a se

intera
manera CONTINUA en la cadena líder, ya que
avanza en el mismo sentido que la horquilla de
replicación.
- la cadena que es replicada en contra del avance de
la horquilla (cadena retrasada), forma un bucle
para poder realizar la síntesis de ADN en sentido
s SÓLO tiene lugar en este
sentido. En este proceso, participa principalmente
la . En esta cadena, la síntesis ocurre
de manera DISCONTINUA, formando los
fragmentos de Okazaki.

Solo 5'-3
Fragmentos de Okazaki:
La primasa genera cebadores en ambas cadenas: la cadena líder se extiende en la misma dirección
del avance de la horquilla, y la cadena retrasada va en dirección opuesta.
Un segundo fragmento de Okazaki es generado gracias a un nuevo cebador sintetizado por la
primasa. Mientras, la cadena líder se sigue extendiendo.
El tercer fragmento de Okazaki es generado, mientras el primer y segundo fragmento se fusionan.

En la imagen a la derecha está representada la horquilla de replicación abierta en el sentido contrario a la de

la imagen anterior (en esta imagen avanza hacia la izquierda y en la anterior avanzaba hacia la derecha),
aunque esto no debe confundirnos y así, podremos comprobar que realmente lo hemos entendido.

Entonces, en la parte superior, podemos ver que la

primasa sintetiza un cebador, que comienza a

continua, ya que lo hace en el mismo sentido que la

horquilla (hacia la izquierda), por lo que se trata de
la cadena líder.

En la parte inferior, en la cadena retrasada, la

dirección contraria al avance de la horquilla. Por

esta razón, al ir al contrario de la apertura de la
horquilla, la cadena retrasada va por detrás de
donde ha copiado, lo que hace que sea necesario
que la primasa vaya sintetizando nuevos cebadores.
Así, hay un cebador que copia un fragmento (primer
fragmento de Okazaki) hasta que llegue al siguiente,
donde ya se habrá agotado su molde. Entonces, se
sigue abriendo la horquilla para que haya más
material que copiar, se sintetiza un nuevo cebador y
se copia otro fragmento (segundo fragmento de
Okazaki). En la 3ª figura, vemos que vuelve a ocurrir
lo mismo, formándose así el tercer fragmento de
Okazaki, y también vemos que los 2 fragmentos
anteriores se fusionan y se elimina la parte de ARN
y de ADN mal emparejada.

Superenrollamiento y topoisomerasas:
La replicación requiere de la separación de las dos cadenas de ADN. ELONGACIÓN: superenrollamiento y
topoisomerasas El avance de la horquilla de replicación genera tensión por delante de la separación. La
tensión se compensa retorciendo la doble hélice (superenrollamiento), impidiendo la continuidad de la
replicación.

Las topoisomerasas o girasas se encargan de eliminar el superenrollamiento. El mecanismo consiste en

cortar una (topoisomerasa tipo I) o ambas hebras (topoisomerasa tipo II) y girar una alrededor de la otra.

Irinotecán: Inhibidor de la topoisomerasa I Inhibe la replicación causando muerte celular Quimioterapia.

3.4 TERMINACIÓN

El propósito de la terminación es eliminar la parte de ARN que ha incorporado la primasa en el cebador y

unir los fragmentos de Okazaki, ya que la cadena retrasada no puede contener ARN y estar a trozos.

Para cumplir este propósito hay 2 modelos propuestos, ya que hay organismos en los que se observa la
existencia de una enzima llamada RNasa H (nucleasa de ARN), y otros en los que dicha enzima no está
presente. Aunque en la terminación, también tienen lugar la replicación de los telómeros (lo veremos más
adelante).

Modelo de la RNasa H:
o Requiere eliminar cebadores de ARN y unir los fragmentos de Okazaki.
o PROBLEMA: ninguna polimerasa eucariótica tiene actividad exonucleasa (de corrección de errores)
, sino que las polimerasas tienen actividad exonucleasa pero en sentido .

retrasada) es eliminar enlaces fosfodiéster (actividad exonucleasa) que se encuentran por delante (en

produciendo los fragmentos de Okazaki, la polimerasa iría eliminando sobre la marcha los cebadores de ARN
y fusionando los fragmentos, pero esto no ocurre así.

Por esta razón, debe intervenir otra enzima que sí sea capaz, que es la RNasa H que, aunque los humanos no
la tengamos, hay otros organismos que sí la poseen. Esta enzima se va a incorporar a la nueva cadena y
comenzará a degradar el ARN, concretamente aquellos 5-10 nucleótidos de ARN que había añadido la ADN

una unión de ADN con ARN (un híbrido), es decir, no es capaz de degradar el enlace fosfodiéster que hay
establecido entre un ribonucleótido y un desoxirribonucleótido. Y en rosado está representado el siguiente
fragmento de Okazaki que hay en la molécula.

si incorpora un nucleótido erróneo, éste no será corregido y se

quedará en la cadena. Por lo tanto, la primasa, además de
haber introducido una parte de ARN, también ha introducido
posiblemente nucleótidos con un emparejamiento erróneo.
Esto hace que la doble hélice no esté perfectamente unida y
que, en algunos puntos, esté un poco separada.

De esta manera, tanto la pequeña separación entre las

cadenas de ADN como la unión que existe entre el fragmento
de ARN con el ADN, son los hechos que reclutan a la enzima
FEN1 (flap endonuclease 1 = endonucleasa de solapa 1). Y esta
enzima sí va a ser capaz de digerir el enlace que la RNasa no
pudo eliminar, que es el enlace fosfodiéster que había entre el
último nucleótido de ARN que quedaba con el nucleótido de la
cadena de ADN. Además, la FEN1 continúa también
degradando los nucleótidos de ADN que habían sido
incorporados erróneamente por la primasa, por lo que la doble
cadena de ADN queda ahora perfectamente emparejada.
Cuando la FEN1 completa sus funciones, lo que queda es que falta un enlace fosfodiéster (enlace entre la
cadena roja y la rosa). Pero entonces actúa otra enzima, una ADN ligasa, que es capaz de sintetizar este tipo
de enlaces.

Pero no hubiese sido posible que la FEN1 eliminase

directamente desde el principio todos los
nucleótidos de ARN + el último nucleótido de ARN
que estaba unido a otro de ADN, ya que el primer
ribonucleótido tiene un extremo 5´ con 3 grupo
fosfato, mientras que cada uno de los siguientes
ribonucleótidos presentan ya solo 1 grupo fosfato.

La FEN1 es incapaz de actuar si hay 3 grupos

fosfatos (un grupo trifosfato), lo que hace que sea
necesario que primero intervenga la RNasa H y
luego ya, que continúe la FEN1.

Modelo de solapa (the flap model):

Este es el modelo que actúa en humanos, ya que no tenemos la enzima RNasa H.

Aquí se representa de nuevo un fragmento de Okazaki ya sintetizado con su cebador de ARN, y el siguiente
fragmento que está llegando y que queremos unir con el ya sintetizado. El anillo azul representa a la ADN
(no es la abrazadera deslizante, ¡¡¡no confundirnos!!!). Entonces, la ADN
está sintetizando el fragmento nuevo de ADN hasta llegar al cebador de ARN, que no lo puede

Por lo tanto, lo que propone este modelo es que a esa ADN polimerasa le acompañe la helicasa, que va
abriendo el ADN que se encuentra por delante. Esto es posible ya que, debido a las bases mal apareadas y a
que hay una parte de ARN, la unión entre ambas hebras no es tan fuerte. Así, la helicasa lo que hace es
desplazar la parte que corresponde al cebador, con los nucleótidos de ARN y con los emparejamientos
erróneos de ADN, y se forma una solapa. Pero también hay una endonucleasa de solapas (FEN1), es decir,
una enzima que es capaz de cortar dentro del ADN cuando encuentra solapas. Entonces, FEN1 reconoce la
solapa (el punto de inflexión) y realiza un corte, de manera que la polimerasa puede seguir sintetizando la
cadena y también rellena la parte que se ha cortado. Pero, al igual que en el modelo de la RNasa H, falta un
enlace fosfodiéster que una ADN ligasa va a sintetizar para así unir los 2 fragmentos.

Por último, para terminar la replicación, hay que solucionar el problema del acortamiento de los telómeros
que sufrimos a lo largo de nuestra vida, y la solución es copiar dichos extremos, es decir, los telómeros.

Replicación en los telómeros:

Los telómeros están formados por un minisatélite, constituido por la repetición de 6 nucleótidos (TTAGGG).
Además, su extremo 3´ es protuberante, y forma un lazo por complementariedad de bases internas,
denominado bucle T (o T-loop), al que se le unen las proteínas de shelterin. Y antes de terminar la
replicación, el bucle tiene que extenderse, de manera que el telómero quede en forma lineal y extendido, ya
que en forma de bucle y con todas las proteínas unidas, sería imposible que se copiase.
necesita un espacio con el que interaccionar, lo que hace que se vaya perdiendo informacion genética poco
a poco. Esto, hasta cierto punto no es tan grave porque, como vimos, el extremo está constituido por
secuencias repetitivas, por lo que si se pierde una parte de ellas no afecta, pero llega un punto en el que se
encuentran los genes (lo que no se puede permitir).

En células fetales, embrionarias, en la línea germinal, en células hematopoyéticas, etc. no se puede producir
el acortamiento de los telómeros. Y para que esto no ocurra, existe la enzima telomerasa, que se encarga de
copiar/ replicar los telómeros. Por lo tanto, la telomerasa está activa en algunos tejidos fundamentales que
se están dividiendo continuamente formados por células madre y, en embriones en la línea germinal,
mientras que el resto de las células si van envejeciendo, puesto que los telómeros se van acortando.

1) La telomerasa se va a unir a ese extremo, en esa región en la que la primasa no tiene sitio suficiente
para producir la copia de ADN. Y se une gracias a que tiene 2 componentes:
o un componente proteico (de color lila), que es una transcriptasa inversa de la telomerasa
(TERT: Telomerase Reverse Transcriptase), y lo que hace es producir ADN a partir de ARN.
o y un componente de ARN (de color verde), llamado componente de ARN de la telomerasa
(TERC: Telomerase RNA Component), pero que además tiene en la parte central una
secuencia de ARN de 9 bases (AAUCCC), que es la complementaria a la del telómero
(TTAGGG).
2) La telomerasa se une al final del
extremo del telómero, donde la AAU
del TERC es complementaria a la TTA
de la cadena de ADN. Entonces, la
telomerasa se ancla ahí por
complementariedad de bases en esos
3 nucleótidos y así hay un molde de
ARN (de la TERC) que la propia
telomerasa copia a ADN, produciendo
así ADN a partir de ARN, ya que tiene
el componente proteico de
transcriptasa inversa. Entonces, según
los siguientes nucleótidos de la
secuencia de la telomerasa (CCCAAU),
se sigue sintetizando la cadena de
ADN con una GGGTTA, de manera que
se ha extendido un poco la secuencia
del telómero.
3) Entonces la telomerasa se transloca,
se mueve de nuevo a los últimos 3
nucleótidos que forman parte del
telómero, se une a ellos por
complementariedad de bases y así, de
nuevo, tiene un molde disponible a
partir del cual seguir sintetizando la
cadena de ADN.
 4) Esto se repite X veces, hasta alcanzar
un tamaño determinado y suficiente
que permita que la primasa pueda
sintetizar el cebador. Lo único que ha
hecho la telomeras

de nucleótidos suficiente para que la

primasa ahora pueda interaccionar y
tenga espacio suficiente para así
producir el cebador de ARN y rellenar/
copiar la otra cadena de ADN. Por lo
tanto, la telomerasa sólo se encarga de
extender el extremo protuberante y así
hacerlo más largo para la primasa.
5) Por último, ya se puede unir la primasa,
se sintetiza el cebador y copia el
extremo. El cebador, en este caso,
tendrá luego que ser eliminado por una
RNasa H y no podrá haber ninguna
enzima que luego copie ese extremo,
pero no se habrá eliminado material
genético gracias a la extensión llevada a
cabo por la telomerasa.

Uno de los muchos mecanismos de las células tumorales es activar a la telomerasa en tejidos donde no
debería estar activa, ya que estas células se están dividiendo constantemente para formar el tumor, y si en
ellas, los telómeros se acortasen con cada división, con los rápido que se dividen llegarían a un colapso
rápidamente.

Propiedades de la replicación de ADN:

La síntesis del ADN es bidireccional: a partir de una burbuja, las horquillas de replicación (replication
fork) avanzan en ambos sentidos. Cada burbuja de replicación tiene 2 sentidos de avance.
También es semidiscontinua: puesto que hay una cadena líder (continúa), que va a favor del avance
de la horquilla de replicación, y otra cadena retardada (discontinúa) que va en contra de dicho
avance.
Y semiconservativa: cada cadena preexistente (molde) se combina con una de nueva síntesis y así se
mantienen, de manera que la nueva molécula tendrá una cadena original y otra de nueva síntesis;
no se juntan luego la cadena molde con otra molde ni las cadenas nuevas con otras nuevas.
EPIGENÉTICA:
Mecanismo de regulación de la expresión génica que no implica modificación de la secuencia del ADN
(no se altera). El orden de las bases va a seguir siendo el mismo, pero se le van a realizar modificaciones
químicas a ese ADN que indiquen qué genes deben estar reprimidos y cuáles deben expresarse; en cada
momento del ciclo celular, regula la epigenética el funcionamiento de esos genes.
Aunque sí incluye:
o Modificación química de las histonas.
o Metilación del ADN.
o Regulación por ARN no codificantes.

Las marcas epigenéticas indican a las células qué genes deben

expresar y cuáles deben reprimir para así diferenciarse en un
tipo celular u otro, ya que todas nuestras células, a pesar de
tener el mismo material genético, se especializan en
diferentes funciones.

Los nucleosomas están constituidos por el octámero de histonas, y las

histonas interaccionan con el ADN a través de sus colas, que son ricas
en lisina y arginina y tienen carga positiva, lo que hace que tenga una
fuerza de atracción electrostática con el ADN, que tiene carga negativa.

Entonces, la modificación que tiene lugar en las histonas consiste en

añadir grupos con carga negativa a esas colas de las histonas, que
neutralizarán las cargas positivas de las colas y, por lo tanto, harán que
éstas dejen de interaccionar con el ADN, ya que si la carga positiva está
neutralizada, ya no habrá atracción electroestática.

Veremos que, como modificaciones de las histonas, existen acetilaciones, metilaciones y fosforilaciones.
Pero también puede modificarse el ADN añadiéndole grupos metilo, lo que se conoce como metilación del
ADN. Todo esto lo estudiaremos un poco más adelante en detalle.

Entonces, la cromatina puede estar abierta o cerrada. Si no se quiere expresar un gen en un tejido, estará
cerrada, mientras que si se necesita que un gen se exprese, estará abierta.

Para que la cromatina esté abierta, se ha observado que las colas de las histonas tienen que estar
acetiladas, es decir, haberse unido a un grupo acetilo. Y esto hace que los nucleosomas pasen de estar
empaquetando el ADN fuertemente a que las colas se suelten y el ADN se libere, y la cromatina aparece
abierta. Y lo que se observa en la secuencia del ADN al estudiarse si tiene alguna modificación química es
que cuando la cromatina está abierta, no existe metilación del ADN. Por lo tanto, que la cromatina esté
abierta implica que:

el ADN no esté metilado.

las colas de las histonas estén acetiladas.

En cambio, cuando la cromatina está cerrada:

el ADN está metilado.

las colas de las histonas no están acetiladas, por lo
que su carga positiva no está neutralizada y pueden
unirse fuertemente con el ADN y empaquetarlo.
METILACIÓN DEL ADN:
Este proceso implica la incorporación de grupos metilo en las citosinas del ADN por medio de enzimas
llamadas metiltransferasas, convirtiendo las citosinas en 5-metilcitosinas, puesto que las citosinas no se
pueden metilar en cualquiera de sus C, sino que la metilación tiene lugar concretamente en el C5, que pasa
de tener un -H a tener un grupo metilo -CH3.

Pero esto es un proceso reversible,

por lo que hay otra enzima, la
demetilasa, que puede eliminar el
grupo metilo de la 5-metilcitosina.

Hay otros tipos de metilaciones del ADN, pero la mayor parte de ellas ocurren en el C5 de las citosinas.

Además, las citosinas metiladas normalmente van seguidas de una guanina. Y esos sitios del genoma, en los
que una citosina tiene la capacidad de metilarse y va seguida de una guanina, se denominan dinucleótidos
CpG, llamados así porque es un poco confuso que la base complementaria a la C sea la G, por lo que con ese
nombre se pretendía dejar claro que es una misma cadena de ADN en la que en la que se encuentran las 2

que C y G sean complementarias. Así, cuando en una cadena tenemos un dinucleótido CpG, en la cadena
complementaria tendremos una GC. Y hay regiones en nuestro genoma, denominadas Islas CpG, de unas
500-5000 pb (0,5 a 5,5 kb) que tienen un alto contenido (> 55%) en dinucleótidos CpG, generalmente

cuales se puede activar/ desactivar la expresión génica, según se añada/elimine un grupo metilo en los
dinucleótidos CpG.

Existen también unas regiones promotoras o promotor (banda amarilla) que indica el lugar en el que
comienza un gen. Y regiones del genoma (en naranja) a las que se tienen que unir proteínas activadoras para
que el inicio de la transcripción del gen se produzca de manera eficiente. Esto ocurre cuando esas regiones,
que suelen corresponder con islas CpG, no están metiladas, ya que si no hay metilación la proteína
activadora, que es la que permite el inicio de la transcripción, se puede unir. Por lo tanto:

- los bajos niveles de metilación en las islas CpG permiten la activación de la expresión génica.
- los altos niveles de metilación se asocian con el silenciamiento de la expresión génica, ya que los grupos
metilo impiden que las proteínas activadoras reconozcan la señal y puedan unirse al sistema.

6'
Secuencias metiladas

Sie
no

z
la citosinas

city CG
Metilación del ADN tras la replicación:
1. Las regiones del ADN que presentan metilación de los
dinucleótidos CpG también serán replicadas.
2. Sin embargo, las cadenas de nueva síntesis carecerán de los
grupos metilos, no estarán metiladas.
3. Como resultado, tras la replicación, cada nueva molécula
tendrá metilación en una cadena (en la molde), pero no en la
otra, de nueva síntesis. Por lo tanto, se dice que el ADN está -
hemimetilado.
4. Los grupos metilos atraerán a la enzima ADN citosina5-
metiltransferasa 1 (DNMT1), que añadirá grupos metilo a la
cadena no metilada.
5. El resultado será la metilación completa de las nuevas
moléculas, siguiendo el mismo patrón que la molécula eni-metilado
la ceue
original. ya
es de
hija no
Lo que
Lo que ocurre es que cuando una región metilada se replica, se copian e

sus bases (y los nucleótidos), pero no las metilaciones, por lo que las
cadenas de nueva síntesis van a carecer de ellas. Esto no se puede
dejar así ya que, por ejemplo, si una célula epitelial se está dividiendo,
y queremos luego seguir teniendo células epiteliales y no otro tipo
celular, van a tener que copiarse las bandas de metilación que
presentaba la célula original.

Por lo tanto, justo tras terminar la replicación, vemos que esas marcas
epigenéticas (las metilaciones) no están incorporadas. Pero lo que
ocurre es que esas metilaciones, que sí están presentes en las cadenas
parentales, van a reclutar a una metiltransferasa (DNMT1), que
estancia
Determinacion de
copiará los patrones de metilación exactamente iguales a los de la
es
cadena molde en la cadena de nueva síntesis.

↑ No con
namo boros disulfitos

MODIFICACIÓN QUÍMICA DE LAS HISTONAS: secuencian

Modificación de las colas de histonas: son cambios en la

disposición de los nucleosomas, que afectan a la expresión
génica.

Si se añaden grupos acetilo, metilo o fosfato en las colas de las

histonas, que tienen cargas negativas, neutralizarán las cargas
positivas de las colas de las histonas, y el ADN estará más
accesible.
 Faltaba en el documento

La determinación de los niveles de metilación del ADN es una técnica crucial en la epigenética para estudiar cómo
las modificaciones químicas en el ADN influyen en la expresión génica sin alterar la secuencia de bases. La metilación
del ADN se refiere a la adición de grupos metilo a los nucleótidos, comúnmente en las citosinas dentro de las
secuencias CpG, y está asociada con la regulación génica, la diferenciación celular, y procesos patológicos como el
cáncer.

Métodos principales para medir la metilación del ADN:

1. Bisulfito de sodio:
• Es el método más común. El ADN se trata con bisulfito de sodio, lo que convierte las citosinas no metiladas en
uracilo, mientras que las citosinas metiladas permanecen sin cambios.
• Posteriormente, el ADN se puede analizar mediante secuenciación o PCR.
• Secuenciación por bisulfito (BS-seq): Proporciona un mapa detallado de los sitios de metilación en todo el
genoma.
• PCR específica de metilación: Usa primers específicos para las citosinas convertidas o no convertidas.
2. Immunoprecipitación del ADN metilado (MeDIP):
• Utiliza anticuerpos específicos para el ADN metilado.
• Posteriormente, el ADN inmunoprecipitado se puede analizar mediante secuenciación o microarreglos para
identificar regiones metiladas.
3. Secuenciación de enriquecimiento por metilación:
• Métodos como Methyl-Capture Sequencing (MethylCap-seq) usan proteínas que reconocen el ADN metilado
para enriquecer las regiones metiladas, que luego se secuencian.
4. Arrays de metilación:
• Usan microarreglos de oligonucleótidos que cubren sitios CpG específicos.
• Ejemplo: Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip, que mide la metilación en alrededor de 450,000
sitios CpG en todo el genoma.
5. HPLC o Espectrometría de masas:
• Cuantifican de manera directa la proporción de nucleótidos metilados en muestras de ADN.
6. Pirosecuenciación:
• Secuenciación breve que mide las proporciones de citosinas metiladas en sitios CpG específicos.

Aplicaciones:

• Investigación del cáncer: Los patrones anormales de metilación están asociados con la inactivación de genes
supresores de tumores.
• Diagnóstico y pronóstico: Biomarcadores epigenéticos para diversas enfermedades.
• Estudio de desarrollo: Evaluación de cómo los patrones de metilación cambian durante la diferenciación celular y el
desarrollo embrionario.

Este análisis es esencial para entender cómo factores ambientales, dietéticos o farmacológicos pueden influir en la
epigenética y afectar la salud humana.
a) Las acetilaciones son la incorporación de un grupo acetilo por una enzima, llamada histona acetil
transferasa (HAT), mientras que la enzima que elimina esos mismos grupos acetilo es la histona desacetilasa
(HDAC), por lo que se trata de un proceso reversible. Las acetilaciones tienen lugar en los residuos de lisina
(K) de las colas de las histonas.

b) Las metilaciones son la incorporación de un grupo metilo. El ADN se puede metilar, pero también pueden
metilarse las histonas, y son procesos que no tienen que ocurrir de manera simultánea, es decir, puede estar
por un lado metilándose el ADN sin que se estén metilando las histonas. Los grupos metilo son incorporados
por la enzima histona metil transferasa (HMT) y eliminados por las enzimas histona demetilasa (HMD). Y las
metilaciones tienen lugar tanto en las lisinas (K) como en las argininas (R) de las colas de las histonas.

c) Las fosforilaciones son la incorporación de grupos fosfato (un átomo central de P unido a oxígenos, uno
de ellos con doble enlace y los demás con una carga negativa), que son incorporados mediante la enzima
histona kinasa (HK) y eliminados por medio de la enzima histona fosfatasa (HP). Y en este caso, las
fosforilaciones pueden ocurrir en las serinas (S) y treoninas (T).

Código de las histonas:

Igual que existe un código genético, con el cual cada 3 pares de bases codifican para un aminoácido, también
se ha descrito un código de las histonas, que alude a las distintas modificaciones que pueden sufrir las colas
de las histonas y que, dependiendo de qué patrón presenten, van a suponer la estimulación o represión de la
expresión génica.

Por lo tanto, el código de las histonas son diferentes patrones de modificación en las colas de las histonas
que pueden estimular o reprimir la transcripción, al resultar en una mayor condensación o descondensación
de la cromatina:

la condensación reprime la transcripción

la descondensación estimula la transcripción

En la siguiente imagen están representados los 4 tipos de histona que forman parte del octámero de
histonas del nucleosoma basal: en amarillo la histona H2A, en rojo la H2B, en azul la H3 y en verde la H4. Las
histonas tienen:

una estructura de hélice, que es el dominio donde se enrolla el ADN, y viene representada por los
cilindros a la derecha de cada figura, cerca del extremo carboxilo.
las colas, que están situadas en el lado izquierdo, hacia el dominio N-terminal

Vemos que en cada histona

se han resaltado una serie
de posiciones, que son las
posiciones que ocupan los
aminoácidos (K, R, S y T) en
la cola de la histona, desde
el extremo N-terminal
hacia el extremo carboxilo.
Por ejemplo, en la posición
1 de la histona H2A hay
una serina (S), y en las
posiciones 4 y 5 una lisina
(K).
Estos residuos de aminoácidos, cuyas posiciones han sido resaltadas, son los que son susceptibles a sufrir
modificaciones, que vienen representadas por distintas figuras: circulo amarillo (fosforilación), hexágono
rojo (metilación), triángulo azul (acetilación) y círculo violeta (ubiquitinización, aunque estas las veremos
otro día). Por ejemplo, en la posición 4 de la histona H3, pueden producirse metilaciones y acetilaciones.
Además, las histonas son proteínas muy conservadas, por lo que esas posiciones que ocupan los
determinados aminoácidos se mantienen en distintas especies. Y según el código de histonas, cada
aminoácido puede sufrir una modificación distinta:

Las metilaciones: pueden tanto estimular como reprimir la transcripción (esto es lo que se
ha visto experimentalmente).
o H3K4me3 (+): marca epigenética que hace referencia a la lisina en la posición 4 (K4) de la histona
H3 (H3), que puede ser metilada 3 veces, ya que puede incorporar 3 metilos (me3). Entonces,
cuando esto ocurre, que se incorporan 3 metilos a la lisina en posición 4 de la histona H3, sí que
se estimula la expresión génica.
o H3K27me (-): marca epigenética que hace referencia a la lisina en la posición 27 (K27) de la
misma histona, la H3 (H3), pero que sólo puede incorporar 1 metilo (me). Por el contrario,
cuando esto ocurre, se reprime la expresión génica, ya que 1 sólo grupo metilo no puede hacer
que la cola de la histona se suelte.

de la posición de cada aminoácido (de cada lisina o arginina) y del nº de metilaciones que experimenten.

Las acetilaciones: normalmente (por lo descubierto hasta ahora, al menos) estimulan la

transcripción.
o H4K16ac (+): es una de las marcas más conocidas de acetilación, que hace referencia a una
acetilación (incorporación de un grupo acetilo) en la lisina 16 de la histona H4, y que estimula la
expresión génica.

Modificación química de las histonas tras la replicación:

Inmediatamente después de la replicación, se ensamblan nuevos nucleosomas permitiendo

empaquetar las cadenas de nueva síntesis según se va produciendo el nuevo material genético, este
debe ser empaquetado.
Las modificaciones químicas de las histonas deben transmitirse
no se va a poder empaquetar el doble de ADN con la misma cantidad de histonas, por lo que deben
producirse histonas nuevas.

¿Y cómo se combinan esas histonas nuevas con las viejas?

¿La cadena que corresponde al ADN original se empaqueta
con las histonas que ya existían? ¿o se mezcla con las nuevas
histonas? Esto ha sido durante muchos años un enigma. Se
sabe que el ADN según se está replicando, se va
empaquetando, pero no se conocía cómo se heredan las
modificaciones epigenéticas de las histonas y cuál es la
combinación de histonas.

¿Cómo es compatible la desorganización de la cromatina durante la replicación con la herencia epigenética

a las células hijas? ¿Qué ocurre con los nucleosomas después de la replicación? ¿Estarán formados por
histonas nuevas? ¿Estarán formados por histonas viejas? ¿Constarán de una mezcla de ambas?
- Secuenciación de ocupación de la cromatina tras la replicación = Chromatin occupancy after replication
(ChOR-seq) (basada en la técnica ChIP-Seq).

Ensayos de inmunoprecipitación de cromatina:

La combinación de la ChIP-Seq con la ChOR-Seq nos permite distinguir cómo se están transmitiendo las
marcas epigenéticas.

Con la ChIP-Seq lo que vamos a hacer es estudiar la cromatina parental antes de que se produzca la
histonas antes de que se
produzca la replicación, y conoceremos tanto el patrón que tenía originalmente ese genoma, como en qué
regiones del genoma se estaban uniendo las histonas con esas modificaciones. En el ejemplo de la figura
inferior se están estudiando 2 marcas:

1) una represora: H3K27me3 (en naranja).

2) otra estimuladora: H3K4me3 (en rosa)

Con el ChOR-Seq, vamos a retener las cadenas de nueva síntesis y podremos ver cómo se están
incorporando las histonas con esas marcas en las nuevas cadenas. En la figura podemos ver cómo, justo
después de que se haya producido la síntesis de la nueva cadena de ADN, el patrón de la marca represora
es igual al que presentaba en la cromatina parental. Aunque al principio su señal si que es más baja, pero
luego, según va transcurriendo el ciclo celular, en la fase G1 su señal ya se ha reestablecido, siendo entonces
igual a la de la cromatina parental.

¿Y qué significa esto? ¿Se está

produciendo el reciclaje de todas
las histonas con sus marcas?
Significa justamente eso: primero
se copian las histonas sin las
marcas epigenéticas, por lo que el
patrón es el mismo pero la señal es
más baja que la de la cromatina
parental, y luego, según se van
copiando las marcas a lo largo del
ciclo celular, la señal va
aumentando hasta reestablecerse
por completo.

Resumen del artículo de Nazaret

Hay un reciclado importante de las histonas parentales, es decir, se analizaron las marcas epigenéticas de
activación e inactivación, entonces se vieron unas marcas determinadas en los cromosomas de unas células
antes de replicarse y luego añadieron ese análogo de timina y realizaron el procedimiento. Se dieron cuenta
que una vez se ha sintetizado la cadena de nueva síntesis, las histonas viejas en las regiones donde se
encontraban en la cadena vieja, se hayan en las hebras nuevas también, y a medida que avanzaba el ciclo
celular esas marcas epigenéticas (la maquinaria) va provocando las metilaciones necesarias para llegar a
tener la intensidad final una vez que la célula se ha dividido similar a la intensidad o al pico de intensidad de
las marcas de histona antes de la replicación. De alguna manera las histonas viejas se combinan con las
histonas nuevas, la marca vieja indica que hay que metilar y la maquinaria de metilación viene y provoca
todas las metilaciones en las células hijas (en las histonas nuevas), las mismas que teníamos en la célula de
origen. El que haya un preciso reciclado de histonas parentales es lo que permite que regiones que estaban
abiertas sigan abiertas y que regiones que estaban cerradas sigan cerradas.

TEMA 4: TRANSCRIPCIÓN EN EUCARIOTAS Y

PROCESADO DEL ARN

La transcripción es la síntesis de ARN a partir de regiones específicas del ADN

Todos los RNA celulares son sintetizados a partir de moldes de DNA mediante el proceso de transcripción. En
muchos aspectos, la transcripción es similar al proceso de replicación, pero hay una diferencia fundamental
relacionada con la longitud del molde utilizado. En la replicación, se copian todos los nucleótidos del molde
de DNA, pero en la transcripción, sólo se transcriben a RNA pequeños segmentos de la molécula de DNA, en
general un solo gen o, como máximo, algunos genes. Como no se necesitan todos los productos génicos al
mismo tiempo ni en la misma célula, la transcripción constante de todos los genes de una célula seria
altamente ineficiente. Más aún, gran parte del DNA no codifica un producto funcional, por lo que la
transcripción de estas secuencias sería inútil. De hecho, la transcripción es un proceso altamente selectivo:
cada gen se transcribe solamente cuando se requieren sus productos. Sin embargo, esta selectividad plantea
un problema fundamental para la célula, ¿cómo reconocer genes individuales y transcribirlos en el lugar y
momento adecuados?

Al igual que la replicación, la transcripción requiere 3 componentes principales:

- un molde de DNA
- las materias primas (ribonucleótidos trifosfato) necesarias para crear una nueva molécula de RNA
- el aparato de transcripción, que consiste en las proteínas necesarias para catalizar la síntesis de RNA

En la transcripción se copian regiones específicas del genoma (al contrario que en la replicación, en la que se
copia el ADN por completo), pero se copian tanto los intrones como los exones. Se produce un transcrito
primario, que es un ARNm inmaduro.
Este ARNm inmaduro va a tener que sufrir 3 modificaciones principales para que madure:

1) Una modificación química, que es la adición de una caperuza en el extremo 5´, que hace que el ARN
sea menos susceptible a ser degradado.
2) La eliminación de los intrones y unión de los exones.
3) La adición de una cola poli-A para proteger el extremo 3.

DIFERENCIAS CON LA REPLICACIÓN

SEMEJANZAS CON LA REPLICACIÓN 1) Síntesis de novo (no requiere cebadores).

1) El molde es ADN. 2) Menor fidelidad (se cometen más errores).

2) 3) Polimerasas de ARN (en vez de ADNpol).

3) Inicio en punto específico del ADN. 4) rNTPs (en vez de dNTPs).

5) No todo el ADN es trancrito.

6) Se puede generar muchas copias de cada ARN.

Conceptos básicos:
La transcripción de un gen concreto
tiene lugar solamente desde una de
las 2 cadenas de ADN.
Siempre ocurre en .
La localización del promotor,
determina que cadena se transcribirá:
la cadena molde.
En lugar de T, se añade U (uracilo).
La cadena NO transcrita es la cadena no molde: misma secuencia que el ARN.
Genes FORWARD o con sentido (Gen A) y genes REVERSE o antisentido (Gen B).

LA CADENA TRANSCRITA. El molde para la síntesis de RNA, al igual que para la síntesis de DNA, es una
cadena simple de la doble hélice de DNA. Sin embargo, a diferencia de la replicación, la transcripción de un
gen tiene lugar solo en una de las dos cadenas nucelotídicas del DNA. La cadena nucelotídica usada para la
transcripción se denomina la cadena molde. La otra cadena, llamada cadena no molde, en general no se
transcribe. Así, dentro de un gen sólo suele transcribirse a RNA una de las cadenas nucleotídicas (hay algunas
excepciones a esta regla).

Durante la transcripción, se sintetiza una molécula de RNA que es complementaria y antiparalela a la cadena
molde de DNA. El transcrito de RNA tiene la misma polaridad y secuencia de bases que la cadena no molde,
con la excepción de que el RNA contiene U en lugar de T. En la mayoría de los organismos, cada gen se
transcribe a partir de una sola cadena, pero diferentes genes pueden transcribirse a partir de distintas
cadenas.
Tipos de ARN polimerasas:
Las ARN polimerasas son complejos multiproteicos: reconocen la región promotora del gen a transcribir y
llevan a cabo la transcripción. En humanos existen 3 tipos de ARN polimerasas (RNA-pol I, II y III), y cada una
se encarga de transcribir una clase de ARN diferente:

1) RNA polimerasa I transcribe rRNA.

2) RNA polimerasa II transcribe pre-mRNA, snoRNA, algunos miRNA y algunos snRNA.
3) RNA polimerasa III transcribe otras moléculas pequeñas: tRNA, rRNA pequeño, y algunos miRNA y
snRNA.

Transcripción de los genes estructurales:

Definición: genes que son transcritos por la ARN polimerasa II, generando ARN mensajeros que se traducen
a proteínas.

Etapas: iniciación, elongación y terminación de la transcripción.

Estructura:

- Posición +1: donde se inicia la transcripción, el primer nucleótido que va a ser transcrito.
- Unidad transcripcional: secuencia de ADN copiada a ARN, incluyendo exones e intrones.
- Promotor núcleo: secuencias reconocidas por la maquinaria de transcripción (se suele encontrar
corriente abajo).
- Región reguladora: incluye un promotor regulador y otras secuencias distanciadas respecto al gen
(intensificadores, silenciadores).
- También existe un promotor regulador (delante del promotor núcleo, corriente arriba) y reguladores
distales (se pueden encontrar en cualquier lugar, corriente arriba o abajo).
- Terminador: secuencia que indica dónde finaliza la transcripción (ARNpol se suelta).
El 0 no existe. Y si nos movemos de la , las numeraciones son coordenadas
positivas y se dice que estamos corriente abajo. Mientras que si nos movemos de la
5´, las coordenadas son negativas y se dice que estamos corriente arriba.

Una unidad de transcripción es un segmento de DNA que codifica una molécula de RNA y las secuencias
necesarias para su transcripción. ¿Cómo reconoce el complejo de enzimas y proteínas que lleva a cabo la
transcripción - el aparato de transcripción - una unidad de transcripción? ¿Cómo sabe que hebra de DNA leer
y cuándo leer y cuándo detenerse? Esta información es codificada por la secuencia de DNA.

Dentro de una unidad de transcripción, hay 3 regiones críticas: un promotor, una secuencia codificante de
RNA y un terminador. El promotor es una secuencia de DNA que el aparato de transcripción reconoce y a la
que se une. Indica cuál de las 2 cadenas de DNA debe ser leída como molde y la dirección de la transcripción.
Asimismo, el promotor determina el sitio de iniciación de la transcripción, el primer nucleótido que será
transcrito a RNA. En muchas unidades de transcripción, el promotor está localizado cerca del sitio de inicio
de la transcripción, pero él mismo no es transcrito. La segunda región crítica de la unidad de transcripción es
la región codificante de RNA, una secuencia de nucleótidos de DNA que es copiada a una molécula de RNA.
El tercer componente de la unidad de transcripción es el terminador, una secuencia de nucleótidos que
señala dónde debe finalizar la transcripción. Por lo general, los terminadores forman parte de la secuencia
codificante de RNA; la transcripción se detiene solo después de que el terminador ha sido copiado a RNA.
Cuando se escriben las secuencias de DNA, a menudo sólo se indica la secuencia de una de las 2 cadenas. Los
biólogos moleculares suelen escribir la secuencia de la cadena no molde, ya que tendrá la misma secuencia
que el RNA transcrito a partir de la cadena molde (exceptuando que, en el RNA, habrá U en lugar de T).

Promotor núcleo o central (core promoter):

Promotor núcleo: secuencia de ADN que es reconocida por la maquinaria de transcripción basal. Suele estar
situado entre la posición -50, +40. Se encuentran en el surco mayor del ADN nunca en los extremos de la
doble hélice. Cumple 2 funciones principales:

1. Indica cuál de las cadenas actúa como molde (sentido de la transcripción).

2. Contiene el sitio de iniciación de la transcripción (sitio +1).

Secuencias que aparecen en el promotor núcleo de la mayoría de los genes:

- BRE (TFIIB recognition element)

rica en GC
TFIIB: factor de transcripción 2B, que es un factor de transcripción que colabora con la ARN
polimerasa II.
- TATA (TATA box): es fundamental para que se pueda producir el reconocimiento del promotor y, por lo
tanto, es lo que permite que comience la transcripción. Tiene como secuencia consenso TATA y ya luego

quien va a indicar a la ARN polimerasa II que debe unirse al promotor y comenzar la transcripción, es el
elemento iniciador (Inr).
- Inr (initiator element): el elemento iniciador puede aparecer en los genes que poseen la caja TATA, pero
en los genes que no la poseen, es el elemento encargado de indicar el comienzo de la transcripción.
- DCE (downstream core element): elemento núcleo corriente abajo.
- DPE (downstream promoter element): elemento promotor corriente abajo. DCE y DPE participan en el
reconocimiento del promotor por parte de la maquinaria de la transcripción.

Promotor débil es aquel que se encuentra más aleado de la secuencia consenso, mientras que un promotor
fuerte se transcribe más al estar cercano a dicha secuencia consenso y debido a la interacción proteína-ADN.

No todos los genes tienen la misma tasa de transcripción, además nos podemos encontrar cualquier
combinación de estos elementos. Todas estas secuencias funcionan gracias a que a ellas se unen proteínas,
que son los factores de transcripción. Por lo tanto, las secuencias del promotor son reconocidas por factores
de transcripción, cuya función es atraer y guiar a la ARN polimerasa, para que comience la síntesis de ARN a
partir de ADN, regulando así la transcripción.

al elemento BRE se une el factor de transcripción 2B (TFIIB).

al resto de secuencias se une el factor de transcripción 2D (TFIID).

Promotor regulador (regulatory promoter):

El promotor regulador posee distintos elementos que
ayudan a fijar la ADNpol al promotor núcleo:

o Caja OCT: se le une el factor activador OCT-1.

o Caja GC: se le une el factor activador SP1.
o Caja CAAT: se le une el factor activador CTF.
Todos estos elementos aparecen entre las posiciones -200,-50 que son las posiciones que abarca el
promotor regulador. Estos elementos se unen factores activadores, que se encargan de regular el
ensamblado y la estabilidad de la maquinaria de transcripción.

En los distintos genes, aparecen distintas combinaciones de estos elementos, y no todos los elementos

a) Virus del simio 40 (SV40): únicamente tiene 6

copias de cajas GC. Por lo tanto, si hubiera sólo
un factor activador CTF, éste no podría activar la
transcripción del gen, ya que al elemento que se
une este factor es a la caja CAAT, y no a la caja
GC. Además, vemos que el promotor núcleo no
tiene caja TATA, por lo que el elemento iniciador
será el que lleve a cabo sus funciones.
 b) Gen de la timidina kinasa: presenta los 3 tipos de elementos, por lo que la transcripción de este gen
podría ser activada por los 3 tipos de factores activadores.
c) Histona H2B: presenta 2 copias, tanto de la caja OCT como de la caja CAAT.

En conclusión, cada promotor regulador presenta:

- Distintas combinaciones de estos 3 elementos.

- La unión de distintas combinaciones de los 3 factores activadores.
- Lo que permite que se puedan activar distintos genes en respuesta a dife
a una regulación precisa y diferencial de la expresión de cada gen.

Pero ¿cómo la acción de unas proteínas que se están uniendo en las posiciones -200,-50 (promotor
regulador) afecta a los que ocurre en el promotor núcleo (-50, +40)? Esto es posible gracias a que hay un
complejo, denominado mediador.

Complejo mediador:
Es un complejo proteico (formado por unos 20 péptidos distintos en humanos) que permite la comunicación
entre el aparato de la transcripción basal, unido al promotor núcleo (-5, +40), y las proteínas activadoras o
represoras que se vayan a unir a los promotores reguladores (-200, -50), o incluso a los reguladores distales
(-n, -200). En algunos casos, requiere además un coactivador para establecer la comunicación.

Para que se una al promotor regulador

una proteína activadora, y así la señal de
activación haga efecto sobre el promotor
núcleo, va a tener que intervenir un
complejo proteico, que es el complejo
mediador, y en ocasiones, si la distancia
es muy grande, también intervendrá un
coactivador. Es decir, las señales del
promotor regulador son transmitidas
hacia la maquinaria de la transcripción,
que está unida al promotor núcleo,
gracias al complejo mediador y, en
ocasiones, también al coactivador.

En la imagen se muestra el ejemplo más

complejo, en el que el mediador no puede
transmitir la señal del activador
directamente al promotor núcleo, por lo
que se requiere el coactivador.

El aparato de transcripción basal se ancla en el promotor núcleo

y en el promotor regulador se une una proteína activadora, que
va a activar la transcripción del gen.

Esta es la estructura del complejo mediador en el caso de

humanos, que no es una proteína, sino un complejo multiproteico
que está formado por muchas unidades.
También, en el caso de los reguladores distales, aquellos que pueden estar hasta kilobases (kb) corriente
arriba o corriente abajo de los genes, pueden actuar gracias a que se forman estructuras en lazo en el ADN y
las señales de las proteínas que se unan a esos reguladores distales son transmitidas a la maquinaria de la
transcripción basal gracias al mediador. En definitiva, el mediador transmite la señal del promotor regulador
hacia la maquinaria de la transcripción basal y también, de los reguladores distales y los factores que se
unan a ellos, hacia la maquinaria de la transcripción basal.

Reguladores distales (silenciadores e intensificadores):

Los reguladores distales pueden aparecer tanto corriente arriba (-n, -200) como corriente abajo (desde que
termine la secuencia del gen, es decir, del terminador). Existen 2 tipos de reguladores distales:

1) Silenciadores (silencers): Secuencias de ADN reconocidas por proteínas represoras que

disminuyen la tasa de transcripción.
Mientras la secuencia silenciadora no sea
reconocida por una proteína, no ejercerá
ningún efecto sobre el promotor
regulador.
Por lo tanto, para que las secuencias de
ADN del silenciador puedan ejercer una
función sobre el promotor núcleo, tiene
que unirse a ellas una proteína represora.
2) Intensificadores (enhancers): secuencias de ADN reconocidas por proteínas activadoras que
aumentan la tasa de transcripción.
Ya vimos que el promotor núcleo tiene que
ser reconocido por la maquinaria de la
transcripción para que comience ese
proceso, que es activado por las secuencias
del promotor regulador. Pero luego, lejos,
tenemos reguladores distales que hacen
que la transcripción sea más o menos
fuerte, modulando así la intensidad con la
que se produce la transcripción.

Por lo tanto, no tenemos que estar expresando en todo momento los mismos genes y la expresión no es
igual cuando, por ejemplo, estamos despiertos o dormidos, ya que las tasas de metabolismo serán distintas y
las funciones que estén activadas en cada caso también serán distintas.

El mecanismo de acción implica la formación de un lazo en el ADN que pone en contacto a la proteína
activadora/ represora unida a las secuencias distales (intensificadoras/ silenciadoras) con el aparato de
transcripción basal por acción del mediador.
Secuencias aisladoras:
Los intensificadores (enhancers) pueden ejercer su función sobre todos los genes a su alcance, por lo que,
en este ejemplo, podrían estar activando tanto al promotor del gen A como el del gen B. Estos genes puede
que estén implicados en vías de señalización totalmente opuestas, por lo que se requiere que exista un
mecanismo que bloquee la acción de los intensificadores sobre los genes que tiene a su alrededor. Para eso
existen las secuencias aisladoras.

Los aisladores (insulators) son secuencias de ADN que delimitan el área de acción de los intensificadores, ya
que a ellas se unen proteínas que sirven de pantalla (proteínas de apantallamiento). Dichas proteínas son
necesarias para que los aisladores puedan ejercer su función.

Mediante este mecanismo, los genes localizados a ambos lados de un intensificador pueden tener distintos
patrones de expresión.

Por lo tanto, los aisladores se sitúan entre un intensificador y el promotor de un gen sobre el cual no se
quiere que exista activación, es decir, que no esté regulado por parte de ese intensificador.

Este proceso, de forma detallada se puede dividir en 3 etapas:

1) INICIACIÓN: el aparato de transcripción se ensambla con el promotor y comienza la síntesis de ARN.

2) ELONGACIÓN: el ADN pasa a través de la ARN polimerasa, esta lo desenrolla y añade nuevos
nucleótidos (uno por vez)
3) TERMINACIÓN: el reconocimiento del final de la unidad de transcripción y la separación de la
molécula de ARN del molde de ADN.

INICIACIÓN: INTERACCIÓN DE LA ARN POLIMERASA II CON EL PROMOTOR NÚCLEO

La iniciación en eucariontes se inicia mediante el ensamblaje de la maquinaria de transcripción en el

promotor. Esta maquinaria está compuesta por la RNA polimerasa II y una serie de factores de transcripción
que forman un complejo gigante de 50 o más polipéptidos. El ensamblaje de la maquinaria de transcripción
comienza cuando las proteínas reguladoras se unen al DNA cerca del promotor y modifican la estructura de
la cromatina, de manera que pueda tener lugar la transcripción.

Entonces, lo primero que va a ocurrir es que la cromatina se tiene que abrir, lo cual veremos en el tema de la
regulación de la expresión génica.
Pero tenemos que acordarnos de que nuestro ADN está empaquetado, por lo que para que un gen pueda

tendrán que desestabilizar los nucleosomas y abrirse el ADN para que esté en forma de doble hélice y sea
accesible, momento a partir del cual comienzan a unirse factores de transcripción.

Lo primero que se reconoce es la caja TATA:

1) La caja TATA (del molde de DNA) es

reconocida por el factor de transcripción TFIID,
a través de un polipéptido, que es la
subunidad TBP (TATA binding protein), y se
une a ella.
Es decir, el factor de transcripción TFIID es un
polipéptido, y uno de los péptidos que lo
componen es la subunidad TBP.
2) Dicha unión hace que se recluten otros
factores de transcripción general:
TFIIA
TFIIB
3) El factor TFIIF atrae a la ARN polimerasa II
hacia el complejo de transcripción, hacia el
promotor núcleo donde se está ensamblando
la maquinaria de la transcripción. La ARN
polimerasa tiene:
en la parte central (de la forma de
mano) el dominio en el que se produce
la reacción de polimerización de
ribonucleótidos trifosfato (rNTP,
nucleótidos de ARN).
una cola, que es el dominio C-terminal
(CTD), que está formada por un
heptapéptido, es decir, por la
repetición de 7 aminoácidos que, en el
caso de humanos, se repiten en
tándem, a su vez, 52 veces.
4) Luego, la unión de la ARN polimerasa atrae y
hace que se unan otras proteínas activadoras
de la transcripción:
TFIIE
TFIIH: es una helicasa, por lo que se encarga de desnaturalizar el ADN rompiendo los
puentes de H lo cual estimula la desnaturalización del ADN del promotor, ya que para
que pueda copiarse, tiene que estar en estado monocatenario; y se copia una sola cadena, la
cadena molde.
5) Por último, se fosforila el dominio carboxilo terminal (CTD) de la ARN polimerasa II, lo que permite
el inicio de la transcripción, indicando a la ARN polimerasa que debe empezar a sintetizarse el ARN.
Los factores se quedan y facilitan a otras ARN pol su funcionamiento. La ARN pol II escapa del
promotor cuando se fosforila y logra enhebrar el ARN.
 ELONGACIÓN: FOSFORILACIONES DEL CTD

Esa señal de fosforilación del dominio C-terminal hace que la ARN polimerasa abandone a los factores de
transcripción que están anclados en el promotor núcleo, y que comience con la síntesis de ARN.

En la etapa de elongación, simplemente van a ocurrir distintas fosforilaciones y desfosforilaciones del

dominio C-terminal (CTD) y, según qué aminoácidos presenten esas fosforilaciones, se van a ir uniendo
distintos factores al CTD. Con lo cual, la cola de la ARN polimerasa, es decir, el CTD, va a ir cambiando de
patrón de fosforilación, por ejemplo: se va a fosforilar el 1er residuo y el 5o, y eso atraerá a un complejo
proteico específico, después, se fosforilará el 2o, el 4o y el 6o, lo que atraerá a un complejo proteico distinto,
etc.

6) La ARN polimerasa abandona el promotor

núcleo y comienza la elongación, dejando atrás
a los factores de transcripción.
7) El dominio C-terminal (CTD) cambia el patrón de
fosforilación y atrae al primer complejo
proteico, que es la guanilil transferasa (capping
enzyme), ya que se está produciendo un ARN
con un extremo 5´sin proteger, por lo que esta
enzima se encarga de
del mRNA, añadiéndole una caperuza. Si esto no
fuera así, las RNasa de otras células podrían
degradar el ARN que se está sintetizando.
8) Entonces, cambia de nuevo el patrón de
fosforilación del CTD, lo que hace que se le unan
más proteínas de la maquinaria de procesado,
que serán las que participen en el splicing, es
decir, en la eliminación de los intrones y, por lo
tanto, son necesarias para la maduración del
mRNA. Estas proteínas se unen al CTD y, cuando
vayan apareciendo los intrones, la maquinaria
de la transcripción saltará ese ARN, eliminará el
intrón y unirá los exones. Y, simultáneamente a
la producción de ese mRNA, se está
produciendo ese procesamiento.
9) Cambia de nuevo el patrón de fosforilación del
CTD y se reclutan los factores de corte y
poliadenilación, que no actuarán hasta llegada
la terminación. Pero, llegado el momento,
cortarán el ARN que se está produciendo, se
liberará y se protegerá el extremo 3´con la cola
poli-A (puede cometer errores).

Por lo tanto, los pasos 7 (adición de la caperuza) y 8 (splicing) ocurren simultáneamente durante la
elongación, mientras que el paso 9 no se produce hasta que tenga lugar la terminación, y una vez terminada
la terminación, ya puede protegerse el extremo 3´ con la cola poli-A por parte de los factores de corte y de
poliadenilación. Estimula capacidad exonucleasa para quitar nucleótido nulo (error) que a puesto la ARN
polimerasa II.
 TERMINACIÓN: LIBERACIÓN DE ARN MENSAJERO PRIMARIO

En la terminación se transcribe la señal polyA, marcando el punto de corte del mRNA. Cuando la ARN
polimerasa está copiando el ARN y llega a la señal de polyA, la copia al ARN y, además, copia también unos
30 nucleótidos más. Esto va a indicar que la síntesis debe finalizar y se produce un corte en los nucleótidos
posteriores a la señal de polyA.

Por lo tanto, el ARN es escindido, liberando una molécula de mRNA prematuro (pre-RNA), mientras la ARN
polimerasa sigue transcribiendo. Entonces, ¿cómo se le indica a la polimerasa que debe abandonar el
complejo una vez ya se escinde el ARN?

Hay 2 modelos de liberación de la ARN polimerasa II:

(1) Modelo torpedo:

- Los extremos 5´ desprotegidos son muy susceptibles de ser degradados por RNasas, y el corte que se ha
producido tras la señal de polyA ha dejado un extremo 5´ desprotegido.
- Por lo tanto, una RNasa (Rat1 en la mayoría de las especies, Xrn2 en humanos) degrada el RNA que
hasta alcanzar a la ARN polimerasa II, provocando así
su liberación y cesando la transcripción.

(2) Modelo alostérico:

- En organismos en los que no se ha encontrado esa RNasa.
-
factores de elongación o
por unión de factores de terminación.

PROCESAMIENTO DEL mRNA (I)

1. -CAP ocurre durante la
elongación:
Tenemos el ARN que se está sintetizando y en su
extremo 5´presenta un ribonucleótido (A, U, C o G) con
sus 3 grupos fosfato (pppN*) * está reflejado con una N
porque podría ser cualquier nucleótido, pero
generalmente, en la mayoría de los casos, el ARN suele
comenzar con una adenina (A)].
Entonces, a ese nucleótido en la posición
5´ se le añade una guanosina trifosfato
(Gppp), pero no se une mediante un
enlace fosfodiéster normal, sino mediante
un , lo que ya hace que la
estructura del ARN sea diferente.

o La enzima guanilil transferasa

mRNA, mediante .
o La enzima guanina
metiltransferasa introduce un
grupo metilo: 7-metilguanosina.
Además, se metilarán otras bases

-CAP protección y transporte del mRNA.

Los (*
metiltransferasa.

PROCESAMIENTO DEL mRNA (II): eliminación de intrones (splicing).

2. Maduración o splicing: proceso de eliminación de intrones y unión de exones.

¿Cómo sabe la maquinaria celular dónde empieza y donde acaba un intrón?

s
intrones de los genes poseen secuencias consenso necesarias para el splicing:
o Sitio de splicing 5´(donador): abarca los 2 últimos nucleótidos (C/A, G) del exón y los 6
primeros (G, U .
o Sitio de ramificación (branch site): secuencia más cercana al sitio del aceptor que del
donador, y su secuencia consenso es YNYURAY.
o Sitio de splicing 3´(aceptor): abarca los 3 últimos nucleótidos del intrón (C, A, G), por lo que
vemos que, tanto el primer como el ultimo nucleótido del intrón es una G, y el primer
.
Estas secuencias abarcan tanto parte del final de un exón como el principio del intrón. Vemos que,
tanto los intrones como los exones, están delimitados por guaninas (G).
Y= pirimidinas (C/U)
R= purinas (A/G)

La eliminación de intrones del mRNA

ocurre mediante reacciones de
transesterificación, es decir, enlaces
éster que van cambiando de una
posición a otra:
1) La A localizada en el punto de
ramificación (branching point)
ataca a la frontera del exón con
el intrón, atacando a la primera G

2) Entonces, se forma un nuevo

enlace con la A G (mediante el
-OH libre), quedando 3
nucleótidos unidos a la A y
generándose una estructura en
lazo.
3) La última base del exón anterior
queda con un - OH libre y ataca
al enlace fosfodiéster del último
nucleótido del intrón.
4) Así, se libera el intrón en forma de lazo y quedan los 2 exones unidos.

Spliceosoma o madurosoma: es un complejo formado por snRNA (small nuclear ARN) ricos en uracilo
(snuRNA) + proteínas, es decir, por ribonucleoproteínas o snuRNPs.

Y los snuRNA son complementarios a las secuencias

consenso del sitio donador, aceptor y de ramificación. De
esta manera, se sabe qué A es la que tiene que comenzar el
ataque, a qué G debe dirigirlo y luego, hacia que otra G debe
dirigir la 2a reacción de transesterificación (o 2o ataque).
 1. El snurp U1
es complementaria (lo podemos ver en la fig. superior), y el complejo U2AF-BBP (Branchpoint
Binding Protein) se une al sitio A gracias a
A
2. Se recluta el snurp U2, que sustituye a BBP en el sitio de ramificación, provocando así que:
La A quede extruida, es decir,
posicionada fuera del plano del
resto de la molécula de ARN (se
queda desapareada, sin
complementariedad para que
quede dispuesta para atacar).
E -OH quede
expuesto.
3. Se reclutan los snurps U4, U5 y U6, que
causan la salida de U1 y U2AF. Y se
reorganiza el spliceosoma para acercar
los 3 sitios de splicing, de manera que la
A quede más cerca del sitio de splicing 5´
(o donador).
4. Entonces, la salida del snurp U4 permite
la interacción entre U2 y U6, que
desencadena:
La 1ª reacción de
transesterificación que, a su vez,
...
...da lugar a la formación del
lazo.
5. El snurp U5 cataliza la 2ª reacción de
transesterificación:
E
2 exones (la G del final del exón
ataca a la 1a G del siguiente
exón).
Se libera el complejo unido al
intrón en forma de lazo.

El siguiente es el último paso, que consiste en la adición de la cola poli-A, para que el ARN esté maduro,
pueda ser transportado hacia el citoplasma y ser traducido.

PROCESAMIENTO DEL mRNA (III):

3. Adición de cola poli-A:
- Protección del extremo del mRNA.
- .
- Permite que el mRNA esté en forma de círculo, incrementando así las rondas de traducción del
mRNA.
Tenemos a la ARN polimerasa II produciendo el mRNA y, en un determinado punto, aparece en el gen la
señal de poli-A, que es transcrita a la secuencia AAUAAA (muy condensada):

1) Las señales poli-A (AAUAAA) son reconocidas

por los factores:
o CstF (Cleavage stimulation factor):
factor estimulante del corte.
o CPSF (Cleavage and polyadenylation
specificity factor): factor específico de corte y
poliadenilación.
2) El factor CstF estimula el corte del mRNA por
parte del factor CPSF, y abandona el complejo,
liberando así el ARN inmaduro.
3) CPSF recluta a la polimerasa PAP (Poly-A
polymerase), que se sitúa en el extremo 3´del ARN, y es
capaz de añadir adeninas (hasta 200*) sin necesidad de
molde.
*cuanto más larga es la cola poli-A, más estable es el
mRNA d de
proteínas, la cola poli-A será más larga en ese ARN.
4) A medida que PAP extiende la cola poli-A, se
van uniendo .
5) Tras añadir unas 200 adeninas, PAP y CPSF
abandonan el mRNA.

RESUMEN PROCESAMIENTO DEL mRNA:

Tenemos un gen que va a comenzar a transcribirse por la posición +1, ya que el promotor núcleo es
reconocido por distintos factores de transcripción que reclutan a la ARN polimerasa II. Este proceso o
ensamblaje es regulado gracias al promotor regulador.

Cuando se produce el mRNA inmaduro (pre-mRNA), vamos a tener tanto intrones como exones. Y la señal de
corte y poliadenilación (AAUAAA) también forma parte del último exón (exón 4). Todo se copia desde la
posición +1 hasta unos pocos nucleótidos posteriores a dicha señal de corte y poliadenilación.

Siguiente modificación: se eliminan los intrones y se unen los exones. Luego, se añade la protección del
extremo 5´, que es la caperuza. Y, finalmente, se añade la cola de poli-A.
Pero este ARN maduro que hemos obtenido no se traduce totalmente. De todo el ARN maduro, sólo se
traduce la región codificante, que es desde el codón de inicio (AUG) hasta los codones de parada, que
pueden ser UAA, UAG o UGA.

Las otras 2 regiones que quedan por fuera de la región codificante son las regiones 5´UTR (región no
traducida en 5´) y 3´UTR (región no traducida en 3´)

Ejemplo secuencia de un gen eucariota:

Tenemos un gen con una región promotora en azul claro, los exones marcados de color rojo, los intrones de
color verde y, después de la cola poli-A (señal de terminación), hay unos pocos nucleótidos que son
copiados.

En las 2 secuencias de arriba se muestra el ADN, en la secuencia de abajo el mRNA (de color morado) y, más
abajo, el polipéptido o proteína codificada (en negro).

El promotor, de color azul, vemos que está en el ADN, y no en el ARN, ya que el promotor sirve de lugar de
anclaje de la ARN polimerasa. La ARN polimerasa se ancla y empieza a copiar a partir de la posición +1.

Por lo tanto, a partir de esa posición si empieza a producirse mRNA inmaduro, con la misma secuencia que la
de la cadena no molde, pero con U en vez de T.

MIRAR POWER-POINT

Finalmente, después de la región AAUAAA, hay en el RNA maduro una serie de nucleótidos extra y la cola de
poli-A al final (AAAAA...).
 TEMA 5: CÓDIGO GENÉTICO Y TRADUCCIÓN
La información genética, generalmente, fluye del DNA a través de un proceso de transcripción, en el que
dicha información genética se transmite a una molécula que hace de mensajero, el mRNA. Este mRNA lleva
la información genética que debe ser descodificada de alguna manera para convertirse en proteínas.
Estamos hablando, claro, de genes estructurales, que son los genes que codifican para proteínas.

Una cosa importante que no hay que confundir es que no es lo mismo el inicio de la transcripción que el
inicio de la traducción. En el mRNA tenemos la región 5´-UTR (untranslated region) y la 3´-UTR (untranslated
region), que es información que no forma parte de las proteínas, ya que, como vemos en la figura, el codón
de inicio empieza en el AUG, que es el lugar que indica la colocación del primer aminoácido, que siempre es
la metionina (Met) con su tRNA correspondiente. Estas secuencias 5´ y 3´-UTR, aunque no lleven información
que se descodifique para formar parte de la proteína, son secuencias MUY IMPORTANTES, ya que están
involucradas en la regulación de la expresión génica.

Particularidades del código genético:

o 64 tripletes posibles (combinando 3 bases nitrogenadas
de distintas maneras, habiendo 4 codones.
61 de los 64 tripletes codifican o llevan
información para un aá. en concreto.
3 de los 64 tripletes son codones de parada
(UAA, UAG y UGA).
o Codón de inicio (AUG en el 99% de los casos, que
codifica para la metionina).
o No solapado, es decir, que cada base que forma parte
de cada triplete es leída una sola vez.
o No .
o Es degenerado (más de un triplete o codón codifican
para un mismo aá.), pero NO ambiguo (sí es verdad que
distintos codones codifican un mismo aá., pero siempre
van a ser esos determinados codones, y no otros).
o Es ordenado (codones que dan el mismo aá. o
químicamente similar tienen una secuencia similar).
o Es universal (mínimas excepciones; hay algunas
excepciones muy específicas en arqueas y mitocondrias.
Por lo tanto, los investigadores, sabiendo ya que el proceso de traducción está formado por un gen que
codifica para un tRNA, que se coloca en el codón correspondiente para iniciar la síntesis de la proteína...
esperaban, al descubrir el código genético, que esos 61 tripletes correspondieran con 61 moléculas distintas
de tRNA para que vengan con la información genética, es decir, con su anticodón que aparee con el codón y
traigan el aa correspondiente.

Pero esto no fue así, más tarde se vio que:

- En bacterias, generalmente, sólo hay entre 30 y 40 tRNA.

- En animales y plantas hay 50 tRNA.

Es decir, que no hay 61 moléculas distintas de tRNA que vengan con su anticodón a leer los 61 tripletes.
Entonces surgió la siguiente duda, ¿si no hay 61 tRNA cómo pueden leerse los 61 tripletes?

30-40 tRNA en bacterias y 50 en células animales y de plantas, ¿cómo se leen los tripletes
restantes?:
Crick (el de Watson & Crick) planteó una hipótesis, conocida como hipótesis de tambaleo de Crick, que
luego se demostró que era cierta.

La cadena de ARN mensajero está ilustrada en

verde y Hipótesis del tambaleo de Crick: en ella,
se muestra un triplete con las bases AGA que se
tiene que decodificar. En azul se representa
parte de la molecula de tRNA, y su orientación
es muy importante: siempre que estamos
hablando de hibridación y unión de una
molécula de RNA (en este caso tRNA) con una
molécula de mRNA, tiene que haber
complementariedad de bases y cumplirse la
regla del antiparalelismo (extremo 5´ de una
molécula complementario al extremo 3´de la
otra molécula).

En la figura de la derecha se muestra la misma

molécula de tRNA, pero que va a emparejarse
con un triplete (AGG), que es distinto al
anterior. Al acabar en G el codón, el anticodón
debería tener una C, pero lo que Crick propuso
como hipótesis fue que:

Cuando se leen los codones, las 2 primeras bases del tRNA en su anticodón han de ser perfectas, es decir,
complementarias, y sólo la tercera base puede tambalear. Así, por ejemplo, el U en su tercera posición
puede tambalear y aparearse con una G.

Este tambaleo permite que una misma molécula de tRNA reconozca 2 codones que son similares, con las
primeras 2 bases iguales, pero la tercera no (AGA // AGG). Por lo tanto, un mismo tRNA es capaz de leer 2

codones que hay que leer.

Esta tabla refleja las reglas de emparejamiento codón-anticodón, que nos dicen lo siguiente:

Cuando la base en la 1ª posición del anticodón

del tRNA (la que está en el extremo 5´) es una A,
las reglas del tambaleo nos indican que sólo se
puede aparear con un U en el extremo 3´ (como
base en 3ª posición) del codón del mRNA, por lo
que no hay tambaleo posible.
Lo mismo ocurre si la base en la 1ª posición del
anticodón del tRNA es una C, ya que sólo podría
emparejarse con una G del codón.
Sin embargo, si la 1ª base es una G, esta podría emparejarse con una C (lo normal), pero también
podría tambalearse y unirse con un U.
Esto mismo ocurre con el U como 1ª base del extremo 5´del anticodón, que puede unirse tanto con
una A como con una G, como vimos en el ejemplo de la figura anterior.
En el último caso, tenemos una I (inosina) como base en la 1ª posición del anticodón del tRNA.

Es que cuando las moléculas de tRNA se sintetizan, lo

normal es que sufran modificaciones postanscripcionales,
es decir, que se transcriben y luego una serie de enzimas,
en unas determinadas posiciones, llevan a cabo una serie
de cambios químicos.

Uno de los cambios químicos que se producen en ALGUNAS

moléculas de tRNA es la desaminación de la adenina, llevada a
cabo por una enzima llamada adenina desaminasa (ADAR =
Adenina Desaminasa de Actuación en el RNA), convirtiéndose así
la adenina en un nucleótido diferente, que es la inosina.

La inosina, como nos indican las reglas del tambaleo, puede

emparejarse tanto con una A, como con una C o un U.
 TRADUCCIÓN

Una vez vistas las características del código genético, sus peculiaridades y cómo ocurre la lectura mediante el
tambaleo, vamos a ver el proceso de la traducción desde el punto de vista genético y por qué las secuencias
que hay en el mRNA y también en los mensajeros que forman parte de los ribosomas, son importantes.

La traducción es el proceso en el que se descodifica la información contenida en el DNA, y que ya se ha

transcrito en ese mRNA, que tendrá un codón de inicio y un codón de parada, y se le unirá un tRNA iniciador
(la metionina, o formilmetionina en el caso de los procariotas).

Una vez que se une al mRNA la subunidad pequeña y el tRNA iniciador, se acopla al mRNA también la
subunidad grande
genético). Y la cadena polipeptídica se va leyendo en función de la información genética contenida en el
mRNA para, finalmente, descodificarlo por completo hasta llegar al codón de parada, momento en el cual se
produce la entrada de una serie de factores que van a hacer que se desensamble todo el sistema, se libere el
mRNA y se libere la cadena polipeptídica con su proteína para que pueda llevar a cabo su función en la
célula.

La cantidad de mRNA que hay en el interior de las células es muy escasa en comparación con la que hay en
el exterior. Esto es así porque una única molécula de mRNA puede leerse por muchos ribosomas, por lo que
de una sola molécula de mRNA se pueden generar una multitud de proteínas. Y a estas moléculas de mRNA
unidas a muchos ribosomas, se les denomina polisomas o polirribosomas.
 INICIACIÓN

EN PROCARIOTAS

Vamos a ver el inicio y las que son las

secuencias importantes del inicio de la
traducción en procariotas. Esta es una región
promotora (inicio de la transcripción) típica de
procariotas, en la que nos encontramos:

- una caja TATA (-10, situada 10 pb corriente

arriba respecto al sitio de inicio de la
TRANSCRIPCIÓN, que es el +1).
- una caja CAP (-35, 35 pb corriente arriba).
- entre ambas cajas, en las regiones
promotoras de procariotas, suelen haber
unas 16-18pb.

Entonces, la transcripción, que no debemos confundir con el inicio de la traducción, comienza en la posición
+1 (círculo rojo) y de ahí hacia la derecha, se encuentra la región 5´ UTR, que es una región que no se
transcribe, y comienza el tránscrito (banda roja).

En procariotas, hay una secuencia MUY IMPORTANTE, que es la secuencia RBS (Ribosome Binding Site),
cuyas bases van a ser fundamentales para que el ribosoma se una al mRNA. Esta secuencia fue descubierta
por Shine-Dalgarno, por lo que también se le denomina en algunos libros secuencia Shine-Dalgarno.

Las bases GGAGG (de la secuencia RBS) van a aparear muy bien con la molécula 16S rRNA, que es una
molécula de RNA que forma parte de la subunidad pequeña de los ribosomas de procariotas. A continuación,
se encontrarían unos 3 - 9 nucleótidos y luego, el ATG, que en el mRNA sería el AUG del INICIO DE LA
TRADUCCIÓN.

Unión RNA-RNA:
En la banda turquesa del recuadro, que hace referencia al mRNA, tenemos la secuencia RBS, seguida de una
serie de NNNNNNNN, que son los 3 - 9 nucleótidos de los que hablamos en la figura anterior y, a partir de
los cuales comienza la secuencia AUG.

Entonces, el sitio de unión al ribosoma, que es la secuencia RBS, se empareja perfectamente con la
secuencia de la molécula 16S rRNA, que pertenece a la subunidad pequeña del ribosoma. Y esta
complementariedad sirve para posicionar perfectamente el mRNA con la subunidad pequeña del ribosoma.
Gracias a que luego hay unos 3 - 9 nucleótidos, el AUG cuadra justo en el sitio P, que es por donde tiene que
entrar el primer tRNA, que en el caso de procariotas es la formilmetionina.

Todos los anticodones entran al sitio aminoacil tRNA, salvo el primero, que es el que lleva la
formilmetionina, y va directamente al sitio P (gracias a las interacciones que vimos antes), en vez de al sitio
A, como el resto de los aminoácidos. Además, hay una serie de factores del inicio de la traducción (1, 2 y 3),
que se van a colocar en la subunidad pequeña del ribosoma para taponar, y hacer, que sólo esté disponible
la entrada del tRNA al sitio P, ya que el factor iniciador 1 se coloca en el sitio A y el factor iniciador 3 se
coloca en el sitio E, quedando así ambos sitios bloqueados. Y el factor iniciador 2 va unido a un GTP, va a
interaccionar con el factor 1, y también interacciona muy bien con el tRNA iniciador, que es el de la
formilmetionina, ya que sus bases son complementarias a la secuencia AUG.

Una vez que entra perfectamente el tRNA e interacciona con el factor 2, se produce la hidrolisis de este

también de los factores 1 y 3. Al salir el factor 3, que es el que estaba bloqueando el sitio E para que no se
uniese a él la subunidad grande, el sitio E queda libre, por lo que se une a él la subunidad grande del
ribosoma, formándose así ya el complejo de iniciación 70S, ya preparado y en el lugar correcto para que
vengan el resto de codones. Y los tRNA del resto de codones sí que van a entrar por el sitio aminoacil tRNA
para leer y traer el aminoácido en función del triplete que tengamos a continuación del codón de inicio.

ARNm monocistrónico o policistrónico:

A diferencia de eucariotas, en procariotas es muy frecuente que los mRNA sean policistrónicos. Nos los
podemos encontrar de los 2 tipos, monocistrónico (un solo cistrón) o policistrónico (con varios cistrones o
varias secuencias correspondientes a genes distintos o varios ORF, Open Reading Frame).

Esto tiene su razón de ser porque los genes que se transcriben en la misma molécula de mRNA participan en
la misma ruta metabólica. Luego tiene su lógica que se transcriban, los 3 en este caso, conjuntamente en la
misma molécula de mRNA.

¿Y cómo se traduce esa molécula de mRNA?

En la siguiente imagen se muestran 3 genes, cada uno con su codón de inicio, su codón de parada y su RBS.
Podemos ver que el codón de inicio está muy próximo al final, de manera que al eliminarse o disociarse la
región RBS, rápidamente se puede volver a ensamblar todo el complejo para poder seguir traduciendo la
siguiente secuencia codificante que se encuentre corriente abajo.
Cuando los genes se organizan de tal manera que haya una regulación coordinada y simultánea para todos
ellos, es lo que recibe el nombre de operón.

Estos genes codifican para proteínas

que participan en una misma ruta
metabólica. Por ejemplo, en la
utilización de un azúcar como
fuente de carbono, o en la síntesis
de un aminoácido, etc. Los genes así
organizados permiten una
regulación coordinada y simultánea
de todos ellos y reciben el nombre
de operón.

EN EUCARIOTAS

¿Y cómo es el inicio del proceso de la traducción en eucariotas? ¿Es igual? ¿Nuestros genes tienen RBS?

Pues resulta que no. En procariotas todo es simple y en eucariotas es todo igual, pero bastante más
complejo, ya que hay más factores y más elementos que intervienen, y que permiten regular la expresión
génica a más niveles. Aunque en el fondo es lo mismo, puesto que la finalidad es la misma.

Vamos a diferenciar 2 procesos, el de la parte izquierda de la figura y el de la parte derecha, y ambos se

tienen que producir coordinadamente para que comience la traducción de este gen en concreto, de este
mRNA, que lleva una información genética en concreto.

En procariotas teníamos 3 factores de iniciación, mientras que

en eucariotas hay un montón, aunque en el fondo hagan lo
mismo. Todos los eIF de la figura hacen referencia a esos
factores de iniciación (eukaryotic Initiation Factor). Y lo que
ocurre es que entran hasta 5 factores de iniciación.

o Tanto el eIF1 como el eIF1A, se colocan en el sitio

donde NO debe entrar el primer tRNA, que es una
metionina con un tRNA iniciador, que no es el del resto
de las metioninas que hay corriente abajo, sino que es
un tRNA iniciador que se coloca inicialmente en el sitio
P, al igual que en procariotas (pero sin la formilación de
la metionina). Por lo tanto, el factor 1 bloquea.
o El factor 5 es un factor enorme que lo que hace es
evitar que se una la subunidad grande del ribosoma.
o Una vez que los factores 1, 5, y el 3 también, se han
colocado en la subunidad pequeña del ribosoma, e
impiden que se una la subunidad grande, viene el tRNA
junto con el eIF2, unido a GTP, y se coloca
perfectamente en el sitio P, ya que el resto está
bloqueado y, además, el tRNA tiene interacciones
perfectas RNA-proteínas con estos factores.
Como conclusión, en eucariotas, primero cargo la subunidad pequeña, cargo el tRNA en la subunidad
pequeña, gracias a todos los factores de iniciación impido que se una la subunidad grande, se tapa el sitio A y
el sitio E, y se coloca el tRNA iniciador en el sitio P. Y la estructura que se forma, se denomina complejo de
preiniciación 43S.

En esta parte vemos que hay que trabajar el RNA, ya que no

es tan fácil como en procariotas, que se transcribe y a la vez
se traduce. En eucariotas sabemos que el RNA sufre 3
modificaciones a medida que se está transcribiendo: se

que acabamos de ver, la caperuza que se encuentra en el

extremo 5´es fundamental para que el mRNA pueda ser
reconocido por el ribosoma. Entonces, lo que ocurre es que el
factor eIF4E, que es un factor fundamental de unión a la
caperuza, reconoce a la caperuza y se une a ella. Luego, todos
los mRNA que salen del núcleo con la caperuza, van a ser
reconocidos por el factor 4E. Y a su vez, este factor atrae a
otro, que es el eIF4G. El factor 4G va a interaccionar con:

- El factor 4E, que está pegado a la caperuza

- El RNA, a través de la unión proteína-RNA
- Con otro factor, que es el eIF4A

A su vez, el factor eIF4A atrae a otro, que es el eIF4B y,

cuando ambos se unen, se activa la actividad helicasa que
tiene el factor 4A.

De hecho, la estructura tallo-lazo (o tallo-bucle) que se ve en la parte superior, es una estructura muy
frecuente en los RNA, aunque sean monocatenarios, ya que pueden establecer zonas bicatenarias por
uniones complementarias de bases. Estas estructuras también son muy importantes para las funciones del
RNA; las estructuras terciarias del RNA son brutales, con muchos enlaces y muchas estructuras tallos-lazo.
Pero estas estructuras, para el inicio de la traducción, no interesan, ya que lo que interesa es dejar el camino

actividad helicasa del factor 4ª es fundamental para romper los puentes de H de la estructura tallo-lazo,
dando lugar a un mRNA que en su extremo 5´esté desestructurado, es decir, libre de estructuras
secundarias.

Pues bien, una vez está todo preparado por ambos lados (figura de la parte izquierda y de la parte derecha),
faltaría que se juntaran ambos.

En la siguiente figura vemos que, gracias al factor de iniciación que se ha colocado en el mRNA, se establece
una interacción muy importante con el otro elemento que hemos visto que se produce en los mRNA de
eucariotas, que es la cola poly-A; esta es fundamental para proteger al mRNA de la degradación y para
FAVORECER la traducción.
La cola poly-A se coloca después de que la RNA
polimerasa haya transcrito la secuencia de corte
y poliadenilación y, uniéndose a la cola poly-A,
hay una serie de proteínas (en verde), llamadas
proteínas de unión a la cola poly-A (poly-A
binding proteins). Estas proteínas interaccionan
con la proteína G y, esta interacción favorece la
propia interacción entre el complejo de
preiniciación 43S y el factor eIF4E, que está
unido a la caperuza. Así, una vez formada esta
unión, pueden ir entrado subunidades
(ribosomas) y ser traducidas. Por lo tanto, se
favorece que entren varios ribosomas a traducir
esa única molécula de mRNA. Por eso, de muy
pocas moléculas de mRNA pueden hacerse
muchas proteínas.

Además, la interacción de principio con el final en esta estructura circular provoca que cuando el ribosoma
llegue al final de la traducción y se disocie, esté la subunidad pequeña cerca del sitio de iniciación, ya que
físicamente quedan más cerca en este tipo de estructura circular, para que así se vuelva a cargar y vuelva a
entrar, favoreciéndose una nueva ronda de síntesis.

Por lo tanto, el complejo de preiniciación 43S, gracias al factor eIF4E, interacciona con elementos de los
factores iniciadores, concretamente el 3, de la subunidad pequeña del ribosoma, y comienza un proceso de
escaneo o de scanning, que lo que va a hacer es moverse en dirección corriente abajo hasta que se
encuentre el primer AUG (codón de inicio)
ribosómico (rRNA) y el sitio de unión al RNA para que quede del todo encajado, sino que hay un
desplazamiento de la subunidad pequeña que ya tiene el tRNA cargado para así buscar dónde está esa
secuencia AUG (se gasta ATP).

Pero ¿cómo de difícil es encontrar ese codón de inicio? Una investigadora, llamada Marilyn Kozak, se puso a
comparar las secuencias del extremo 5´ de mRNAs de eucariotas y se dio cuenta de que había un consenso.
En honor a ella, se le denominó a esta secuencia consenso, la secuencia Kozak (al igual que la secuencia
Shine-Dalgarno en procariotas). No la tienen todos los genes, pero si se ha visto que aquellos que la tienen,
se traducen mejor, ya que parece ser que el tRNA iniciador establece enlaces proteína-RNA con las bases de
esta secuencia.

Esta secuencia es muy sencilla:

- Está el AUG y, corriente arriba, hay 2 nucleótidos

cualquiera (NN), y luego siempre hay una G o una A
(purinas, R).
- Por otro lado, corriente abajo respecto al codón de inicio
(AUG), siempre hay una G y a continuación otros 2 nucleótidos cualquiera (NN).

Una vez que el RNA se ha desestructurado, el complejo de

preiniciación 43S se une y empieza a escanear, cuando llega al sitio
de inicio (AUG) se establecen las uniones RNA-proteína (AUG-UAC)
y se queda el tRNA posicionado perfectamente, lo que hace que la
subunidad pequeña sufra un (al igual que en procariotas).
Caracteristicas Importantes

Este cambio de conformación provoca la liberación de

factores:

El factor eIF2, al hidrolizarse el GTP al que

estaba unido dicho factor.
Los factores eIF3 y eIF5, lo que permite que la
subunidad grande pueda colocarse sobre la
pequeña, formando así el complejo de
iniciación 80S y, quedando todo
perfectamente preparado para que continúe la
traducción con el primer tRNA en el sitio P. Y
ya queda el sitio A libre para que entre el
siguiente aminoacil tRNA.

ELONGACIÓN

Del proceso de elongación no va a hablarnos prácticamente nada, sólo recordarnos

que la primera parte de la figura (círculo rojo) correspondería con el siguiente tRNA Elongaciesn,
vion

que entraría; y no entra uno al azar, sino que entra uno en función del código
genético, que viene especificado por el gen que se transcribió.

Por ejemplo, aquí tenemos el triplete ACA, que atrae al tRNA de la treonina (Thr),
ya que tiene un anticodón (UGU) que aparea perfectamente.

Así tendríamos ya el siguiente tRNA con su aminoácido pegado y ahora, lo que

habría que hacer es unir ambos aminoácidos.

¿Cómo se hace esto? Con la actividad peptidil-transferasa, que cataliza el enlace

peptídico. Esta actividad enzimática reside en la región 23S (la subunidad grande)
del rRNA (ribozima). nibozima !

[Los ribosomas tienen proteínas y RNA; y en la subunidad grande hay un RNA que
tiene un coeficiente de sedimentación de 23S, razón por la cual esta subunidad se
llama 23S del rRNA]

No se cree que haya una enzima que tenga actividad peptidiltransferasa que
provoque la formación del enlace peptídico, sino que se cree que estos 2
aminoácidos que se tienen que unir, encajan perfectamente en un hueco de ese
23S rRNA (RNA ribosómico), y que se favorece el ataque nucleofílico de elementos
que están en el extremo carboxilo del primer aminoácido y de elementos del
extremo amino del segundo aminoácido, produciéndose la formación del enlace
peptídico.

Lo que viene a continuación es la translocación del ribosoma; el ribosoma se

mueve corriente arriba, por lo que el primer aminoacil tRNA de la metionina pasa al
sitio E, de salida, para que así salga del ribosoma. Entonces, el otro tRNA que estaba
en el sitio A pasa al sitio P, quedándose libre el sitio A para que vuelva a entrar un
nuevo aminoacil tRNA en función del código genético, basándose en el triplete que
haya en el RNA.
 Como acaba
3 codores
la traducción
de narcen ↑

TERMINACIÓN

¿Y cómo acaba la traducción? Examen no tra >

-
es una

naturaleza
moteina
proteica muede
,

Al principio se pensaba que había tRNAs específicos para identificar los codones de parada, pero hoy en día actuar
IRNA

se sabe que esto no es así. Realese factor 3

La traducción acaba cuando el ribosoma alcanza un codón

de parada o de terminación, como puede ser el UAG, ya que
no hay ningún tRNA con un anticodón que aparee con el
codón en el sitio A.

Entonces, lo que va a ocurrir es que el UAG va a atraer a los

factores de liberación (RF), de los cuales hay 2 tipos (I y II):

1) Los de factores de clase I son los que reconocen los

codones de parada en el sitio A y se unen al sitio A,
de forma que ocupan ese sitio y provocan la
hidrólisis del polipéptido del tRNA del sitio P.

En procariotas hay 2 de estos factores, según el codón

de parada: tripletes de
narada

o RF1, que reconoce UAA y UAG

o RF2, que reconoce UAA y UGA

Mientras que en eucariotas hay 1 solo factor de terminación

de esta clase que reconoce a los 3 codones (UAA, UAG,
UGA): eRF1.

2) Los factores de la clase II permiten la liberación de

los factores del tipo I del ribosoma.
o RF3 en procariotas
o eRF3 en eucariotas

Cuando el polipéptido se libera del tRNA en el sitio P, se

provoca un cambio de conformación que hace que el GTP
del RF3 pase a GDP, lo que hace que este factor deje de
tener afinidad por la subunidad grande del ribosoma y así se
favorezca la unión de todo el complejo.
 TEMA 6: REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN
PROCARIOTAS
En este tema vamos a ver cómo se regulan y a qué niveles se puede regular el que un gen se exprese en
mayor o menor medida, lo cual se puede hacer a varios niveles.

Primer nivel: regulación transcripcional.

proteínas reguladores se unen al ADN y controlan la tasa de

transcripción, ya sea aumentándola o disminuyéndola.

Segundo nivel: regulación post-transcripcional.

Riboswitches producen un cambio en la conformación del

ARNm y evitan la traducción desde el inicio.
ARN antisentido se une al ARNm, bloqueándolo y evitando su
traducción desde el inicio.

Tercer nivel: regulación post-traduccional.

Inhibición mediada por feedback

metabólica inhibe la primera enzima de la ruta.
Modificación covalente en la estructura de la proteína altera su
función (ej. está la proteína preparada, se fosforila y se activa = proceso
inmediato de apenas segundos.

¿Por qué me va a interesar a mi regular la expresión génica a nivel post-transcripcional y no a nivel de la

transcripción directamente? Porque es mucho más rápido, ya que todo está ya transcrito y preparado para,
una vez la célula (por ejemplo) recibe el estímulo que sea, se traduzca el mRNA rápidamente y de lugar a la
proteína necesaria. Mientras que otros procesos que no necesitan esa inmediatez, se regulan muy bien a
nivel de la transcripción.

Pero, además, no todos los genes se expresan por igual, algunos son muy importantes, y necesitan tener una
expresión continua, otros tienen una expresión inducible, etc

Generalidades:
o Gen regulable (regulado): aquel cuya expresión es controlada en respuesta a necesidades de una
célula o un organismo.
o Gen constitutivo: aquel que siempre permanece activo (abierto) independientemente de las
condiciones ambientales. Siempre se está transcribiendp.
o Genes reguladores: la proteína resultante se une a elementos reguladores (= secuencias), regulado
así la expresión de otros genes:
- Mecanismo de control positivo: un activador promueve la expresión génica.
- Mecanismo de control negativo: un represor se encarga de cerrar la expresión del gen.
- Moléculas efectoras: pequeñas moléculas que juegan un papel fundamental en el control de la
activador o al represor.

A continuación, veremos los 4 tipos de regulación génica A NIVEL DE LA TRANSCRIPCIÓN.

Inducible: se expresa en presencia del inductor
Hay 2 mecanismos de regulación de la expresión génica INDUCIBLE. En este caso, el gen inicialmente está
inactivo y yo, por el motivo que sea, lo quiero inducir para que se exprese, ya que la célula lo tiene

a) Regulación Positiva (Activador):

La proteína activadora, que se

encarga de activar la transcripción
de este gen está inactiva, ya que
tiene un sitio de unión al DNA, pero
en la conformación en la que se
encuentra, no lo reconoce.

Sólo consigue reconocerlo una vez entra un inductor en la célula, que se une a la proteína activadora y le
cambia su conformación. Así, consigue que el sitio de unión al DNA de la proteína activadora reconozca la
secuencia reguladora en el DNA y se une a ella, promoviendo que la RNA polimerasa se una también, y
active la transcripción del gen.

b) Regulación Negativa (Represor):

Aquí también se quiere inducir la expresión de un gen, pero, en este caso, el gen está inactivo porque hay
una proteína represora que se une a la secuencia reguladora del gen e impide que se una la RNA polimerasa,
bloqueando así la transcripción.

Entonces, entra un inductor, que se une

a la proteína represora y le cambia su
conformación, haciendo que ya no
pueda estar unida a la secuencia
reguladora, por lo que se suelta,
quedando así libre dicha secuencia para
que pueda unirse a ella la RNA
polimerasa y así transcribir el gen.

Reprimible: se reprime en presencia de la molécula efectora

inactivarlo.

a. Regulación Positiva (Activador):

Hay una proteína activadora con la conformación adecuada para unirse al DNA y, está promoviendo que la
RNA polimerasa esté transcribiendo el gen.

Entonces, entra un inhibidor, que se une a

la proteína activadora, provocando que
esta cambie de conformación y que ya no
pueda reconocer sus elementos
reguladores en las regiones promotoras
del gen, por lo que se suelta y deja de
promover la unión de la RNA polimerasa,
.
b. Regulación Negativa (Represor):

Tenemos las mismas circunstancias que en el caso anterior, un gen que se está expresando. Pero, en este
caso, tenemos una proteína represora que no es capaz de unirse a su elemento en el gen al no tener la
conformación adecuada.

Entonces, aparece un correpresor,

que se une a la proteína represora,
le cambia la conformación y así, el
dominio de unión al DNA ya tendría
la conformación adecuada para
reconocer la secuencia reguladora y
poder unirse a ella. Y esto hace que
la RNA polimerasa tenga que dejar
de transcribir el gen.

Operón lactosa: ejemplo de regulación negativa inducible control a nivel transcripcional

Este operón, en condiciones normales, está cerrado y sólo, cuando llega el inductor, que es la lactosa, se
activa el operón, ya que este codifica una serie de enzimas que se encargan de catabolizar la lactosa. Esto
tiene lógica, puesto que ¿para qué van a estar activos los genes que se encargan de catabolizar la lactosa.

Entonces, el operón lactosa funciona de la

siguiente manera: Por fuera de la célula,
tenemos el disacárido lactosa que, para
que pueda entrar en el interior celular,
necesita una enzima, la permeasa.
Entonces, esta permeasa introduce la
lactosa a través del poro celular. Una vez
dentro, la lactosa, es degradada por una
enzima, la -galactosidasa, que corta a la
lactosa en 2 monosacáridos, la galactosa y
la glucosa, que pueden ser ya utilizadas en
el metabolismo como fuente de C.
-galactosidasa
que corta la lactosa, también provoca que
la lactosa se isomerice a la alolactosa.

Luego, en este sistema, para que se expresen las enzimas implicadas en el metabolismo de la lactosa

1) Tiene que haber lactosa en el medio (sino no tendría sentido que se abriera el operón para
metabolizar la lactosa).
2) Ausencia de glucosa (ya que siempre que haya glucosa, que es una molécula que no necesita
romperse ni nada, se metaboliza rápidamente para que la célula pueda usarla como fuente de C o de
energía, lo cual hace que la glucosa sea la fuente preferida, por lo que las bacterias, si tuvieran que
elegir entre metabolizar la lactosa o la glucosa, optarían fácilmente por la glucosa).

Operón: conjunto de genes con funciones relacionadas (ej. degradar o metabolizar la lactosa) que
constituyen una unidad de transcripción y que se encuentran coordinadamente regulados.
 Al constituir una unidad transcripcional, decimos que el mRNA que se sintetiza del operón lactosa es
policistrónico, ya que lleva la información de, concretamente, 3 genes.

Un operón consta de:

- un conjunto de genes estructurales.

- un promotor.
- un elemento regulador (habitualmente llamado operador).

A la derecha podemos ver el operón lactosa, constituido por:

el conjunto de genes estructurales (lacZ, lacY, lacA):

o el gen lacZ es que sintetiza para la -galactosidasa.
o el gen lacY es el que sintetiza para la permeasa, que se encarga de transportar la lactosa al
interior de la bacteria.
o el gen lacA es una transacetilasa que, por lo visto, se encarga de transacetilar subproductos
de la lactosa que pueden ser tóxicos para las células, de manera que los modifica para que no
perjudiquen a la bacteria.
un promotor (lacP), que es el sitio al que se debe unir la RNA polimerasa.
un elemento regulador u operador (lacO operator) que, en parte, solapa con el sitio de unión
sitio al que se va a
unir el represor del operón lactosa (en rojo)

El represor no forma parte del operón, se sintetiza en otra parte del genoma, y es un gen regulador con
expresión constitutiva. Este gen tiene su propio promotor y, a partir de su promotor, se sintetiza esa
proteína represora, que sería el producto del gen regulador (lac I).

Vamos a ver 2 situaciones, de las cuales una no tiene lactosa en el medio y la otra sí:

a) Si no hay lactosa en el medio, el represor tiene una conformación o un dominio de unión al ADN
perfecto para que se una a la secuencia reguladora. Así, se une por su sitio de unión al ADN a esa
secuencia reguladora que llamamos operador.

En la parte baja de la figura, el operador, que es la secuencia de color naranja, solapa o comparte la región a
la que debe unirse la RNA polimerasa. Esto es así para que, si el represor se une a su secuencia operadora, la

RNA polimerasa no puede unirse al operón, ya que, si no hay lactosa, para qué se va a querer transcribir el
operón lactosa.
b) Si la bacteria pasa a un medio en el que si hay lactosa:

-galactosidasa, la permeasa y la
transacetilasa. El represor tiene un sitio de unión al ADN y un sitio de unión al inductor, que es la alolactosa,
obtenida a partir de la isomerización de la la -galactosidasa.

Por lo tanto, el inductor (la alolactosa) se une al represor, de manera que se produce una regulación
alostérica, que hace que cambie la conformación del represor, lo que provoca que su sitio de unión al ADN
deje de estar visible, por lo que deja de ser capaz de unirse al ADN. De esta manera, se ha eliminado al
represor del operador, quedando éste libre para que se una a él la RNA polimerasa y transcriba el gen.

¿Qué ocurre si hay lactosa, pero también glucosa al mismo tiempo?

1. La unión de la RNA polimerasa al promotor LacP no es eficiente:
Es decir, el hecho de que se quite el represor y la RNA polimerasa pueda unirse al promotor, no es
suficiente para que el promotor esté activo, por lo que se necesitan otros elementos reguladores (en
eucariotas los llamamos promotor regulativo). Y estos nuevos elementos reguladores sí que están
relacionados con la glucosa.

Este es otro esquema de la región que controla la expresión del operón:

- la flecha negra marca la base +1, a partir de la cual comienza la transcripción.

- también se muestra la caja TATA, en la posición -10.
- otra caja, que forma parte de la región promotora de procariotas
- ambas cajas son esenciales para que el factor sigma (un factor iniciador) de la RNA polimerasa de
procariotas reconozca sus secuencias y se acople la RNA polimerasa a esa región.
- en verde, corriente arriba, se muestra un nuevo elemento regulador, que es la proteína CAP.
 2. La proteína CAP (proteína activadora de catabolito) tiene un sitio de unión ligeramente corriente
arriba respecto al promotor.
3. Una vez que la proteína CAP se une su secuencia
reguladora, interactúa con una de las subunidades
de la RNA polimerasa, permitiendo que la RNA
polimerasa pueda unirse al promotor (CTD =
extremo C-terminal; NTD = extremo N-terminal,
-
.

4. Por otro lado, para que CAP se pueda unir a su sitio,

debe unirse previamente a AMPc. Entonces, sólo una
vez se ha unido al AMPc, se produce ese cambio
alostérico que permite que su dominio de unión al
ADN se una. Así es como se establece la relación con
la glucosa...
5. Ya que los niveles de AMPc son dependientes de los niveles de glucosa:
cuando los niveles de glucosa son muy altos, los niveles de AMPc bajan.
cuando los niveles de glucosa son muy bajos, los niveles de AMPc aumentan.

Vamos a ver cómo funciona el operón lactosa en presencia/ ausencia de glucosa:

Regulación inducible negativa y represión por catabolito:

a) Si los niveles de glucosa son muy bajos (y tenemos lactosa en el medio):

En este caso hay una enzima, la adenilato ciclasa (Ac), que cicla el ATP, convirtiéndolo en AMPc y
obteniéndose, por lo tanto, numerosas moléculas de AMPc. Todas estas moléculas de AMPc se unen a la
proteína CAP, haciendo que cambie su conformación y así pueda unirse a su sitio de unión en la región
reguladora. Luego, el CAP unido al AMPc interacciona con la RNA polimerasa y la fija al promotor,
promoviendo así la transcripción del operón.

De esta manera, aumenta la transcripción del gen 50 veces, lo que significa que hay muchas permeasas
acudiendo a la membrana para introducir toda la lactosa posible en la célula. Así luego puede actuar
-galactosidasa, tanto dividiendo el disacárido de la lactosa, como convirtiendo la lactosa en
alolactosa. Estamos en una situación en la que hay lactosa, pero no glucosa, por lo que no hay represor y la
secuencia del operador está libre. Esto es porque hay lactosa, que se está convirtiendo en alolactosa, la cual
se está uniendo al represor, y lo está quitando para que el promotor esté libre.
 b) Si los niveles de glucosa son altos (y tenemos lactosa en el medio):

Si la glucosa es alta, inhibe a la adenilato ciclasa (Ac), por lo que apenas podrá ciclar el ATP y, por lo tanto, lo
normal es que apenas vayamos a tener moléculas de AMPc que puedan unirse a la proteína CAP, por lo que
no tendrá lugar ese cambio alostérico que le permita que su dominio de unión encuentre la secuencia
reguladora, así que la proteína CAP no se unirá a ella, lo que dará lugar a una muy baja tasa de transcripción
por la RNA polimerasa.

Como se ha quitado el represor, la RNA polimerasa eventualmente podría unirse y transcribir, pero como no
es un promotor fuerte, lo hará muy de vez en cuando.

Concluyendo, el sistema del operón lactosa es un ejemplo de regulación negativa inducible:

- inducible porque cuando está la lactosa presente, se induce.

- de regulación negativa porque es mediada por un represor.
- pero, además, se le añade la represión por catabolito, refiriéndose a que está reprimida por la presencia
de glucosa, ya que siempre es más fácil metabolizar glucosa que lactosa.

Por lo tanto, este es un ejemplo de cómo las bacterias regulan a nivel de la transcripción la expresión de un
gen que les interesa en un determinado momento.

Operón triptófano: ejemplo de regulación negativa reprimible control a nivel transcripcional

Este ejemplo es todo lo contrario. El gen (trpL

bacteria le interesa inactivarlo para que deje de transcribirse.

Este es un modelo de regulación muy frecuente para proteínas o para enzimas que están involucradas en el
anabolismo, es decir, en fabricar elementos constituyentes de la célula (mientras que el modelo inducible
generalmente está involucrado con el catabolismo). Este caso, por ejemplo, trata de la fabricación del
aminoácido triptófano, que es un componente fundamental de las proteínas.

El operón triptófano tiene además otro elemento de regulación que es mediante atenuación, pero que no
nos lo va a explicar.

a) Se muestra el operón con todos los genes (en azul) que forman el mRNA (cinta rojo), que es
policistrónico, ya que porta la información de muchos genes (trpE, trpD, trpC, trpB, trpA), que son las
regiones codificantes de enzimas que se necesitan para sintetizar el triptófano.
Nuevamente, hay:

- una región operadora u operador (amarillo)

- una región promotora o promotor
gen están corriente arriba.
- en otra región del genoma, está el represor triptófano (trpR) (en violeta)

Este represor está también con su

región promotora, transcribiéndose
de una manera constitutiva.

En condiciones en las que los niveles

de triptófano son bajos, la RNA
polimerasa puede unirse
perfectamente al promotor e inducir
la transcripción de las enzimas
necesarias para la biosíntesis del
triptófano

b) Pero si los niveles de triptófano son altos, la bacteria ya tiene suficiente triptófano y lo que quiere es
dejar de sintetizarlo.

En este caso, el triptófano actúa como un correpresor: 2

moléculas de triptófano encuentran sitios de unión en el
represor, produciéndose una regulación alostérica, ya
que se unen los correpresores y cambian la
conformación del represor, por lo que ahora su sitio de
unión al ADN también cambia, lo que hace que, en este
caso, sí sea capaz de unirse a su secuencia operadora en
el ADN, evitando que la RNA polimerasa pueda entrar y,
por lo tanto, bloqueando así la transcripción.

Cascada de factores sigma control a nivel transcripcional

Este es un mecanismo que tiene un fago (o bacteriófago), el SPO1, que infecta a Bacillus subtilis, una
bacteria.

Hace 4500 millones de años, cuando empezó la evolución de la vida en la tierra, los fagos comenzaron
también a evolucionar conforme a todos los organismos. Por lo que, a la vez que evolucionan los organismos
para defenderse, también evolucionan ellos para poder atacar mejor.

Este es un mecanismo que utiliza el fago SPO1 para poder desarrollar la vía lítica dentro de la bacteria B.
subtilis
que es reproducirse en las células hospedadoras.
Las secuencias que se muestran en la figura (barras grises) son del ADN bicatenario del fago que ha
infectado a la bacteria, con una serie de genes que se van a expresar de manera coordinada según le
convenga al fago. Por ejemplo, nada más infectar a la bacteria, para desarrollar ese ciclo lítico y generar
viriones, se transcriben los genes tempranos (early genes) del genoma del fago.

Los fagos suelen tener genomas muy pequeños y no portan prácticamente información sino para las
proteínas de sus cápsides o de los elementos que necesitan para replicar su genoma. Por ello, utilizan la
maquinaria de la bacteria a la que han infectado para poder replicarse, utilizándola así no sólo como
hospedadora sino también como fuente de elementos para que trabajen para su propio genoma.

El promotor de los genes tempranos de este fago está muy bien reconocido por la RNA polimerasa (en
violeta) de la bacteria. Para ello, el fago ha evolucionado para tener en sus genes tempranos una secuencia
De esta manera,

ya esté trabajando para él, sintetizando sus genes tempranos.

Además, uno de sus genes tempranos, el 28, codifica para un nuevo fact
bien sus genes intermedios (middle genes

polimerasa, pero en este caso para que reconozca los elementos reguladores, los promotores, de los genes
intermedios, que son los que le interesan en este momento de la infección.

Finalmente, dentro de esos genes intermedios, hay de nuevo un gen, el 34, que sintetiza un nuev

promotora de sus genes tardíos (late genes), pasando a sintetizar entonces los genes tardíos.

Con esto, hemos visto 3 ejemplos de regulación génica a nivel transcripcional: el operón lactosa, el operón
triptófano y el ejemplo de un fago que controla la transcripción de sus genes (la cascada de factores sigma).

Ahora veremos, un ejemplo en el que la regulación génica es A NIVEL POST-TRANSCRIPCIONAL, una vez que
ya se ha fabricado el mRNA, mediante un mecanismo llamado ARN antisentido.
ARN antisentido control a nivel post-transcripcional (traducción)
Este es un mecanismo en el que se regulan genes importantes en la bacteria, como pueden ser los
implicados en la osmolaridad, ya que las bacterias, al ser organismos unicelulares, deben tener mecanismos
de respuesta muy rápidos a una situación cambiante de osmolaridad en el medio.

a) El gen ompF produce la proteína OmpF, que es un canal

de iones y agua.

Esta proteína se coloca en la membrana de la bacteria y

permite una difusión pasiva tanto de iones como de agua. Y es
un gen que se transcribe, generalmente, a una tasa de
transcripción determinada (ni muy baja ni muy alta).

Tenemos también ilustrado el mRNA, que se traduce y da

lugar a la proteína OmpF, que se coloca en la membrana y
permite esa difusión pasiva de iones y agua.

Pero ¿qué pasaría si la bacteria pasa a una condición en la

que se encuentra a una alta osmolaridad?

En el caso anterior tenemos un montón de receptores (o

canales) en la membrana que están dejando entrar mucha
agua e iones, lo cual tendría consecuencias fatales para la
célula si la osmolaridad aumentara.

b) En condiciones de alta osmolaridad, hay que silenciar o inactivar rápidamente el gen ompF.

Para ello, hay una serie de proteínas en la

membrana que sienten que la osmolaridad ha
cambiado (aumentado) y rápidamente activan la
transcripción de otro gen, el gen micF (mRNA
interferentig coding).

Por lo tanto, el gen micF es inducido cuando la

osmolaridad es alta. Este gen es un ARN
antisentido, por lo que es un gen que no va a dar
lugar a ninguna proteína, sino que se va a quedar
en forma de molécula de RNA. Se llama antisentido
porque su extremo 5´ se une por
complementariedad de bases al extremo 5´del gen
ompF, bloqueándolo e impidiendo que se pueda
traducir.

De esta manera, ya que estamos en condiciones de

alta osmolaridad, se impide que puedan ponerse
más porinas, las responsables de la continua
permeabilización de agua e iones en la membrana
celular.

Estructura de ambos genes: del gen ompF y del gen micF, con todos sus bucles o lazos en el extremo 5´.
También se muestra cómo se une el gen micF, por complementariedad de bases en muchas regiones, con el
mRNA del ompF, lo cual inhibe la traducción, ya que no puede entrar el ribosoma para traducir al gen ompF.
Regulación por ribointerruptores (riboswitchers) control a nivel post-transcripcional
(traducción)
Este es otro mecanismo de control de la expresión génica post-transcripcional, puesto que ya se tiene un
mRNA, que tiene:

o la secuencia Shine-Dalgarno (RBS) (en verde oscuro).

o corriente abajo, tiene la región codificante para el gen (en violeta).
o también tiene la región 5´-UTR (zona verde clara con tallos y lazos).
o y la región 3´-UTR (zona verde clara del extremo 3´)

En el caso del operón, ya veíamos que la molécula inductora o represora podía unirse a una proteína. Pues
bien, aquí tenemos una molécula inductora que puede unirse a una zona del mRNA que está muy reticulada
y que tiene una estructura secundaria muy potente, que es la región 5´UTR (que es una zona que no se va a
traducir, pero que sí forma parte del mRNA). Y esta estructura tridimensional complicada de la región 5´UTR
del mRNA es lo que llamamos ribointerruptor.

En este ejemplo, este gen codifica para enzimas de la

biosíntesis de la vitamina B12, que es fundamental para
las células. Entonces, en condiciones en las que la forma
activa de esta vitamina, que es la coenzima B12, está en
poca cantidad, el mRNA se encuentra en la
conformación que vemos en la figura superior, en la que
el sitio de unión (la secuencia RBS) está disponible para
que se una a ella el ribosoma, y empiece a traducir el
gen. Luego, en condiciones en las que la célula tiene una
baja cantidad de la vitamina, ésta se estará
produciendo.

Y ¿qué pasa si, por el contrario, la concentración

de la coenzima B12 es alta?

En este caso, estaría presente la proteína

reguladora (un represor en este caso), que es la
coenzima B12 sintetizada a partir de los genes
(rectángulo naranja). Y, si aumenta su cantidad,
es capaz de unirse al ribointerruptor del extremo
5´del mRNA y cambiarle su conformación, de tal
manera que ahora el sitio de unión para el
ribosoma (la secuencia RBS) no estará
disponible, por lo que no podrá entrar el
ribosoma y traducir el gen, evitando así una
acumulación de coenzima B12 innecesaria.

Estos ribointerruptores se descubrieron a principios de este siglo (2001-2002). Varios investigadores los
encontraron y luego vieron que era un fenómeno relativamente poco frecuente, pero que sí tiene lugar en
bastantes genes de las bacterias, y también de las plantas y de los hongos.
Ribozimas control a nivel post-transcripcional (traducción)
Este es otro mecanismo interesante de regulación a nivel post- trancripcional, mediado por ribozimas. Esta
palabra es una mezcla entre RNA y enzimas.

Con este caso vamos a ver cómo se regula otro gen, que es el gen glmS. Este gen, cuando se transcribe, da
lugar al mRNA glmS que, posteriormente se traduce y da lugar a una proteína (una enzima), llamada
glutamina-6- fosfato amidotransferasa.

Esta enzima lo que hace es coger una molécula, un precursor, y lo desdobla en glucosamina-6-fosfato
(GlcN6P), que es un nutriente importante para la bacteria.

Nuevamente, tras la transcripción, tenemos una molécula

de mRNA que, al principio de la molécula (cerca del extremo
5´), tiene una estructura secundaria de tallo-lazo, por
complementariedad de bases entre sus secuencias. Aunque,
en el caso anterior, a esas estructuras las llamamos
ribointerruptores y, en este caso, constituyen la ribozima, ya
que se ha visto que tiene cierta capacidad enzimática.

a) Cuando la cantidad de GlcN6P es baja, el gen glmS

se está transcribiendo, por lo que se está
produciendo la enzima que se encarga de desdoblar
un precursor para dar lugar a la GlcN6P, y aumentar
su concentración.
b) Pero, entonces, una vez aumenta la concentración, y
hay suficiente cantidad de este producto final
(GlcN6P), se establece una interacción mRNA-
inductor, tratándose en este caso del glmS mRNA (la
ribozima) y del inductor, que es la GlcN6P.

Al igual que en el caso anterior, cuando esta interacción

ocurre, se produce un cambio de conformación, que lo que
va a hacer es estimular la actividad catalítica de rotura del
mRNA. Por lo tanto, se produce la rotura del mRNA por la
propia actividad ribozima de la molécula de mRNA que es
estimulada sólo cuando se une a ella la GlcN6P.

Por lo tanto, cuando hay suficiente cantidad de GlcN6P y no se quiere producir más, ésta se une a la
ribozima, provoca un cambio de conformación y se estimula la actividad catalítica que rompe el mRNA. De
esta manera, el mRNA no podría seguir traduciéndose para dar lugar a la enzima glutamina-6-fosfato
amidotransferasa, que es la encargada de dar lugar a la GlcN6P a partir de un precursor.

Esta actividad catalítica (el hecho de romper el mRNA) parece que está mediada porque cuando se une la
GlcN6P a la ribozima, y se produce un cambio de conformación que, acerca y pone juntos, a nivel
intramolecular, los -OH de las cadenas de RNA, que provocan ataques nucleofílicos que terminan en la rotura
de la propia molécula de mRNA. Por esta razón se dice que es una ribozima.

[Recordemos que el RNA es una molécula muy reactiva, que tiene en la posición 2´un -OH, a diferencia del
En este gen no hay un mecanismo de regulación a nivel transcripcional, por lo que se expresa de manera
constitutiva y, la manera de regular su expresión es a nivel del sustrato final. Con lo cual, hay una fabricación
continua de su mRNA y, cuando este mRNA actúa como ribozima, es cuando evita que se traduzca.

molécula de mRNA se recicla y puede servir una vez ha sido inhibida, mientras que en este sistema
(ribozima) no.

Inhibición mediada por feedback control a nivel post-traduccional

Este es un mecanismo de control mediado por inhibición mediada por
feedback. En este sistema tenemos una enzima que tiene regulación
alostérica. Tiene un sitio alostérico o regulador, que llamamos de
unión a un sustrato (en naranja), y un sitio catalítico (en azul). Esto nos
recuerdo a, por ejemplo, el represor lac, salvo que el represor lac no es
una enzima, pero sí tiene también una regulación alostérica, un sitio
de unión al sustrato y un sitio de unión al ADN.

Entonces, realmente, participa una cascada de enzimas (enzima 1, 2 y

3) para desdoblar un sustrato (sea cual sea, ya que éste es un modelo
genérico).

1. El sustrato se une a la enzima 1; ésta lleva a cabo la reacción que

sea necesaria según cual sea su función, y convierte el sustrato en
un intermediario 1.
2. Este intermediario 1 se une a la enzima 2, se lleva a cabo una
nueva reacción y se forma el intermediario 2.
3. El intermediario 2 es cogido por la enzima 3, que lo desdobla y da
lugar al producto final.

Ese producto final es la molécula con capacidad de unirse al sitio regulador de la enzima 1.

Así, cuando la concentración del producto final aumenta y se hace demasiado alta, el propio producto se une
a la enzima 1 e inhibe su capacidad de seguir convirtiendo más sustrato en intermediario 1, de manera que
se bloquea la síntesis de más producto final. Por lo tanto, en este caso ya no se está regulando a nivel de
mRNA, sino a nivel de proteína o post-traduccional.

Sistemas reguladores de 2 componentes (TCRS): EnvZ/OmpR control a nivel post-traduccional

Este es un mecanismo muy utilizado tanto por las bacterias como por cualquier eucariota (plantas, animales,
etc.). Se llama sistema regulador de 2 componentes (TCRS: Two Components Regulatory System) y los 2
componentes son:

1) Un producto del gen o la proteína EnyZ .

2) Un producto del gen o la proteína OmpR.

En cuanto a la figura, lo que vemos en la membrana plasmática son las porinas. La porina OmpF, que la
vimos también en el ejemplo de ARN antisentido, se coloca en la membrana y permite el flujo o la entrada
de agua, nutrientes, iones, ... ya que es un canal grande que, en condiciones de baja osmolaridad, es el que
predomina fundamentalmente.
Por otro lado, en condiciones de alta osmolaridad, el que predomina es el producto del gen OmpC, que es la
porina OmpC. Esta porina, a diferencia de la anterior, tiene una tasa de transición de nutrientes MUY baja,
siendo mucho más restrictiva. Por esta razón, esta porina es la que nos encontramos fundamentalmente en
las membranas plasmáticas de las bacterias en condiciones de alta osmolaridad.

¿Y cómo regula la bacteria el que en función de la osmolaridad haya más porinas de un tipo que de otro?

En la membrana interna tenemos el producto de la expresión del gen EnyZ, que es la proteína EnyZ, una
quinasa osmosensora, que tiene:

- sus extremos (tanto el amino como el carboxilo) en el citoplasma.

- 2 dominios transmembrana.
- un puente en el espacio periplasmático que une a los 2 dominios transmembrana.
- en la región de la proteína que mira al citoplasma, un aminoácido, que es la histidina 243 (His)

Haciendo distintos experimentos de mutagénesis, los investigadores descubrieron que hay un fragmento
próximo, de unos 17 aminoácidos, flanqueando a la histidina 243, que es osmosensible. Estos fragmentos
caen en una que:

a. En condiciones normales, cuando hay una baja osmolaridad

desorganizada, estado en el cual la histidina 243 no está accesible ni es fácilmente reconocible
para la actividad quinasa que tiene la proteína EnyZ.
b. Pero, cuando aumenta la concentración de iones y, por lo tanto, hay una alta osmolaridad, sólo
2 protones son capaces de interaccionar con los aminoácidos de esa región de 17 aá. y
. Una vez que la estabilizan, la histidina 243 sí que está accesible para que
la actividad autocatalítica de la quinasa la fosforile. De hecho, se ve que, en estas condiciones de
autofosforila
(su incremento de la autofosforilación aumenta 10 veces). Y este incremento de la fosforilación
de la histidina va a hacer ahora que le transfieran ese grupo fosfato al 2º componente, que es la
proteína OmpR y que, por lo tanto, se fosforila. Y ahora, la proteína OmpR fosforilada, es capaz
de reconocer elementos reguladores del gen micF y del gen ompC:

- el producto del gen micF,

como hemos visto
anteriormente, bloque al
mRNA ompF, que es el que
está bien en condiciones de
baja osmolaridad, pero no de

bloquea la traducción de
ompF.
- pero, como la proteína OmpR
fosforilada reconoce también
elementos reguladores del
gen ompC, se empiezan a
fabricar más porinas OmpC
que se colocan en la
membrana.
Por lo tanto, ¿cuál es la regulación post-traduccional aquí?

La adición de un grupo fosfato (-P) es el mecanismo que las bacterias y otros organismos han conseguido
para pasar de un sistema sensor de un componente a un sistema sensor, como este, de 2 componentes, que
es mucho más versátil y permite identificar cambios en la membrana.

Por ejemplo, el operón lactosa, es un sistema de un sólo componente: sólo cuando la lactosa está en el
interior de la bacteria es cuando puede unirse al represor LacI y provocar que se quite de la región
operadora para que se empiece a transcribir ese gen. Luego, en la mayoría de los sistemas de 1 componente,
el elemento inductor o represor tiene que llegar al citoplasma y ahí, desencadenar todo el proceso.

Mientras que, en este caso, de un sistema de 2 componentes, se puede tener un sensor en la membrana que
rápidamente, en cuanto haya cambios (ej. cambios en la osmolaridad), se modifica la conformación, se
autofosforila y ese fosfato se va transmitiendo en una cascada de señalización que, en este caso, conlleva a:

o reprimir la expresión del gen ompF mediante el ARN antisentido.

o promover a nivel transcripcional la transcripción de ompC para que se coloque en la membrana

Luego, estos sistemas de 2 componentes son lo que ha evolucionado, ya que:

Son más sensibles.

Permiten amplificar la señal.
Permiten detectar la señal en la membrana (no ya en el citosol) para que así puedan adaptarse
cuanto antes a las nuevas circunstancias

gases u otras sustancias que pueden ser perjudiciales para la célula, luz, etc.
 TEMA 7: REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN
EUCARIOTAS
Diferencias con respecto a la regulación de procariotas:
1. Los genes en eucariotas no están organizados en operones (mientras que
en procariotas es bastante frecuente, dando lugar a un RNA policistrónico
que lleva la información genética de más de un gen). Rara vez varios genes
se transcriben juntos, siendo lo normal que cada gen se transcriba
separadamente.
2. La estructura de la cromatina influye en la expresión génica (en
procariotas la cromatina no está organizada en nucleosomas que
compactan el DNA).
3. Si bien existen activadores y represores de la transcripción, los primeros
son más abundantes (el proceso de la regulación a nivel de la transcripción
es muy importante).
4. La membrana nuclear separa transcripción y traducción en el ESPACIO y en
el TIEMPO (esto hace que haya muchos más puntos de control) y supone
una dificultad más para el acceso al núcleo de proteínas activadoras y
represoras (en procariotas, según el mRNA empieza a salir del poro de la
RNA polimerasa, el ribosoma va traduciendo).

Existen más puntos en los que pueda llevarse a cabo la regulación:

o Regulación de la remodelación de la cromatina ue el
ADN esté enrollado alrededor de los nucleosomas ya supone un primer
grado de regulación).
o Regulación del splicing y del procesamiento
colocar una caperuza, una cola poly-A, se eliminan los intrones, etc.
(mientras que en procariotas no hay intrones y no se procesa el mRNA).
o Regulación del transporte del mRNA al citoplasma.

Una vez ya se encuentra el mRNA en el citoplasma (parte inferior de la figura), se encuentran los
mecanismos de regulación postranscripcionales:

Degradación del mRNA (para controlar el nivel de expresión de ese gen).

Regulación de la traducción.
Modificaciones cotraduccionales (al igual que vimos en procariotas con la fosforilación en el último
sistema)

Comenzamos considerando cómo influyen en la expresión génica los cambios en la estructura de la

cromatina, que puede ser modificada por varios mecanismos. En el núcleo, las histonas se asocian para
formar octámeros, alrededor de los cuales se enrolla estrechamente el DNA helicoidal para crear la
cromatina. En un sentido general, esta estructura de la cromatina reprime la expresión génica. Para que se
transcriba un gen, factores de transcripción, otras proteínas reguladoras y la RNA polimerasa deben unirse al
DNA. ¿Cómo pueden producirse estos eventos con el DNA estrechamente envuelto alrededor de las
histonas? La respuesta es que, antes de la transcripción, cambia la estructura de la cromatina y el DNA se
torna más accesible a la maquinaria de la transcripción.
 REGULACIÓN A NIVEL DE LA CROMATINA

Vamos a ver cómo desde el ADN se logra que la RNA polimerasa pueda entrar y transcribir los genes.

En la mayoría de los genes están los nucleosomas, alrededor del ADN

ADN
hay encima son las colas de las histonas, muy ricas en lisina y arginina.
La RNA polimerasa viene representada junto con sus factores de inicio
de la transcripción. Pero lo importante que viene a expresar este
esquema es que, en esas condiciones, si no se modifica la cromatina,
no va a estar accesible el ADN y la RNA polimerasa no podrá entrar
para transcribirlo.

Por lo tanto, ¿qué es lo que habrá ocurrido para abrir la cromatina?

Hay unos complejos multiproteicos, representado aquí en

verde con 4 subunidades (aunque realmente son muchas
más, ya que es un complejo enorme), llamado complejo
remodelador de la cromatina, que se une directamente a
sitios particulares del DNA y reposicionan los nucleosomas,
lo que permite que los factores de transcripción y la RNA
polimerasa se unan a los promotores e inicien la
transcripción.

Estos complejos siempre van a necesitar energía derivada de

la hidrólisis del ATP para poder remodelar la cromatina, para
lo cual tienen actividad ATPasa.

Las familias mostradas en la parte superior (familia ISWI,

familia IN080, familia Mi-2, etc.) son con las que se conocen
los remodeladores de la cromatina.

La familia ISWI es la más conocida, y los elementos SWI/SNF

son los que llevan la actividad ATPasa.

Una de las maneras en la que actúan los complejos

remodeladores es quitando uno o varios octámeros de
histonas del ADN. O también pueden desplazarlos hacia otro
lado.

Pero la finalidad es la misma: tener una región del ADN libre

de histonas para que la RNA polimerasa pueda unirse a ella
y transcribirlo.

Los complejos de remodelación de la cromatina son dirigidos a secuencias de DNA específicas por
activadores o represores de la transcripción, que se unen a un complejo de remodelación y después, a los
promotores de genes específicos.

Por lo tanto, los complejos remodeladores de la cromatina son uno de los componentes de la maquinaria
epigenética, ya que hacen cambios en la cromatina a nivel epigenético al desplazar o quitar octámeros de
histonas, haciéndola más accesible a los factores de transcripción.
Las modificaciones epigenéticas que se establecen durante el desarrollo embrionario son fundamentales
para cuando el grupo de células que vaya a dar lugar a, por ejemplo, las neuronas, ya sean y mantengan ese
patrón epigenético. Al igual que lo harán otras células con un patrón diferente, ya que darán lugar a otros
tipos celulares.

En la mitosis, a pesar de que se esté replicando el ADN, las células son capaces de mantener un patrón
genético determinado, ya que heredan las marcas epigenéticas de un determinado tipo celular.

Utilizando la técnica de ChOR-Seq se descubrió que cuando el ADN se replica y esas histonas tienen marcas,
cuando se vuelve a pasar esa horquilla de replicación, hay un reciclado de histonas viejas que se colocan en
los mismos genes, e histonas nuevas que rápidamente son modificadas para reestablecer la marca
epigenética original.

El siguiente modelo explica cómo actuarían todos estos factores de transcripción junto con factores
epigenéticos, como un MODELO estándar de cómo podría activarse un gen, y que admite un montón de
variaciones. Todavía no se conoce al 100% para cada gen cómo es posible su regulación epigenética para que
ese gen esté abierto y qué es lo que provoca que se transcriba, pero si se va generando un mecanismo
general, que es el propuesto a continuación:

Activadores inducen la apertura de la cromatina:

En las células donde determinados genes se están expresando o pueden, en un momento puntual,
expresarse, se encuentra la siguiente conformación: se observa una región libre de nucleosomas, llamada
NFR (Nucleosome Free Region). Esta región suele estar cerca del sitio de inicio de la transcripción y también
se suele observar una NFR cerca del sitio de terminación de la transcripción, lo cual se piensa que está muy
relacionado con dónde debe empezar y terminar de transcribir la RNA polimerasa. Aunque NO es condición
suficiente que la célula tenga una NFR al principio y al final de un gen para que éste se transcriba (hacen falta
más cosas).

-1 y -2 hacen referencia simplemente al primer y

2º nucleosoma por encima del sitio del inicio de la
transcripción, y +1 y +2 al primer y 2º nucleosoma.
Y son estos nucleosomas los que se marcan porque
suelen tener histonas modificadas (ej. en lugar de
ser H2A es H2AZ), que son histonas más fáciles de
quitar del ADN, ya que no tienen una interacción
tan fuerte.

Supongamos que, en esta célula, este gen necesita

general, habrá una secuencia particular del ADN,

en este caso llamada secuencia enhancer, que
atraerá a un activador que se unirá a ella. Este
activador (en verde) tiene unido un inductor (azul
muy pequeño); y hay alguna molécula que ha
entrado en la célula que le ha provocado un
cambio de conformación al activador, dejando
expuesto un dominio de unión para que se pueda
unir al ADN.
Entonces, el activador recluta a un complejo
remodelador de la cromatina (ej. SWI/ SNF) que,
en este caso, ha eliminado al nucleosoma de la
posición 1 con su actividad ATPasa. Además, es
frecuente que el remodelador tenga sitios de unión
para enzimas modificadoras de histonas (ej.
histonas acetiltransferasas; en naranja) que, en
este caso, ha acetilado a las primeras histonas del
gen, añadiéndole grupos acetilo.

Así, se logra abrir la cromatina (neutralizando las

argininas y las lisinas de las colas de las histonas),
haciendo que el DNA pierda afinidad por el
nucleosoma y así se descompacte y separe de él.

A continuación, una vez se ha preparado la NFR

(región libre de nucleosomas), se une al promotor
del DNA la RNA polimerasa II con todos sus
factores de transcripción, formando el complejo de
preiniciación. Entonces, comienza el proceso de la
transcripción, y la RNA polimerasa se va
encontrando con nucleosomas que se encuentran
corriente abajo, a medida que se va desplazando por el DNA. ¿Y qué pasa entonces con estos nucleosomas?

Se sabe que junto con la RNA polimerasa, en la misma maquinaria, viajan las enzimas histonas
acetiltransferasas e histonas desacetilasas, formando un complejo enorme (que no está representado en
esta figura).

De esta manera, las histonas que están por delante de la RNA polimerasa van siendo modificadas por
acetilación y desalojadas, lo cual permite que el complejo de la RNA polimerasa pueda ir pasando y
transcribiendo la información genética contenida en el DNA.

Luego, las histonas que han sido acetiladas y desalojadas, rápidamente, en un proceso no del todo conocido,
se unen a unas chaperonas de histonas; entonces, las histonas desacetilasas que viajan también junto con la
RNA polimerasa, se encargan de volver a desacetilar a esas histonas para que vuelvan a fusionarse con el
DNA por detrás de la RNA

- por delante, se acetila y se quitan los nucleosomas.

- por detrás, esos nucleosomas se vuelven a reposicionar

Se cree que esto es fundamental para que no haya una transcripción a lo largo de cualquier punto del gen,
sino que la transcripción sólo ocurra en el inicio, donde está la NFR.

transcripción, sino a muchos más elementos que interaccionan para, en definitiva, promover la transcripción
del gen.

Pero sí se sabe que el hecho de que en una célula haya una NFR en un gen que esa célula suela transcribir,
no es condición suficiente para que ese gen se transcriba. Tiene que haber una señal que le haga poner toda
la maquinaria en esa NFR y promover la transcripción.
E
desarrollo embrionario se conoce más en las células embrionarias al menos), ya que es el momento en el
que se deben establecer las marcas epigenéticas en las células para definir su identidad y definir que esta
célula se va a convertir, por ejemplo, en un hepatocito, mientras que otra célula se convertirá en una
neurona. Por lo tanto, esta célula que va a ser una neurona no necesita tener una serie de genes abiertos,
por lo que se van a heterocromatinizar (a cerrar).

El proceso general en el que se produce esa modificación epigenética en la cromatina para silenciar los
genes es el siguiente.

Represores inducen el cierre de la cromatina:

Aquí también tenemos un gen y también una región, como siempre, en la que existe un elemento regulador.
En este caso, la región verde dentro del DNA de la siguiente figura, se llama elemento de respuesta al
polycomb (PRE). El polycomb se encuentra frecuentemente asociado a un complejo proteico que,
frecuentemente, suele encontrarse asociado a la cromatina; es de esas proteínas no histonas que forman
parte de la cromatina. Y se cree que está ahí con la función de reprimir y mantener cerrada la cromatina.

Esta secuencia del ADN atrae inicialmente a una proteína de unión al elemento de respuesta al polycomb
(PRE-binding protein) y ésta a su vez, atrae al complejo Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2). Y este

marca H3K27me3 es una marca epigenética clara de cierre de cromatina.

Hay que tener en cuenta que, en algunos casos, el elemento de respuesta al polycomb (PRE) puede estar
muy lejos del gen que va a inhibir. Pero como el DNA tiene la capacidad de hacer bucles, haciendo un bucle
puede quedar a una distancia relativamente cerca del polycomb para provocar la metilación del gen.
También se cree que la propia marca epigenética H3K27me3 puede inhibir directamente la transcripción el
impedir que la RNA polimerasa se pueda unir. Y lo que sí se sabe es que esa marca, además, atrae al
complejo Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1). Y este complejo PRC1 puede inhibir la transcripción de 3
maneras diferentes:

1. Compactando la cromatina: el complejo PRC1 puede hacer que los nucleosomas del gen diana
formen una estructura tipo nudo, que es más compacta, de manera que la cromatina no puede
abrirse y así la expresión de este gen permanece apagada.
2. Modificando covalentemente las histonas: el complejo PRC1 puede modificar covalentemente la
histona H2A mediante la adición de moléculas de ubiquitina (modificación post-traduccional), que
cierran la cromatina (aunque no se conoce el mecanismo por el cual lo hacen).
3. Interaccionando directamente con un factor de transcripción: el complejo PRC1 puede
directamente inhibir a proteínas involucradas en la transcripción, como el factor de transcripción IID
(TFIID), impidiendo así que el gen pueda transcribirse.

Entonces, hemos visto:

- la remodelación de la cromatina.
- que las metilaciones y las acetilaciones son marcas epigenéticas de modificación de las histonas que,
dependiendo de dónde ocurran, abren o cierran la cromatina.
- la 3ª marca epigenética que sabemos que influye en la expresión de los genes es la metilación del DNA.
Metilación del ADN reprime la transcripción:
La estructura que tenemos aquí se encuentra en muchos
genes, donde cerca del promotor núcleo, suele haber unas
islas CpG, que son regiones del DNA que tienen una densidad
de dinucleótidos CG (CGCGCGCGCG...) mucho más alta que
en el resto del genoma. Hoy en día se conoce la función de
las islas CpG, y es que se sabe que son susceptibles de ser
metiladas. Y la metilación evita que los factores activadores
de la transcripción que, sin estar metilada la isla CpG podrían
unirse a ella, ya no pueden unirse.

Además, como podemos ver en la siguiente figura (b), la propia metilación de las islas CpG va a promover un
estado de heterocromatina (de cromatina cerrada), ya que se sabe que hay unas proteínas que tienen una
alta afinidad por esas citosinas metiladas (metilcitosinas) de las islas CpG, llamadas methyl-CpG-binding
protein.

Entonces, en cuanto se metila una isla CpG, estas

proteínas se unen con una alta afinidad a las
citosinas metiladas y favorecen, al interaccionar
con ellas, el reclutamiento de histonas
desacetilasas, que lo que van a hacer es
desacetilar la cromatina y cerrarla. Es decir, que el
mecanismo epigenético de metilar las citosinas del
DNA está íntimamente ligado con el mecanismo
epigenético de modificar la cola de las histonas
para poner la cromatina en un estado represivo.

¿Y, tras dividirse las células, como se logra

mantener esa marca epigenética de metilación de
las citosinas para que el gen siga estando inactivo?

En cuanto el DNA se replique (ya sabemos que la

replicación es semiconservativa) tendremos una
cadena vieja metilada y una cadena de nueva
síntesis sin metilar, por lo que estaremos en un
estado hemimetilado. Entonces, la DNA
metiltransferasa I va viajando detrás del DNA y, allí
donde ve marcas epigenéticas de metilación en
una de las cadenas, automáticamente, metila la
otra cadena. Y de esta manera es como se logra
que se mantengan las marcas epigenéticas de
metilación.
Modificación epigenética excepcional: impronta genómica parental
Esta es una característica que no es lo común en los genes pero que, gracias a los mecanismos epigenéticos
(en este caso la metilación de las citosinas) se consigue el que haya impronta genómica parental.

Pensemos: nosotros somos diploides, lo que quiere decir que, para cada gen, hemos recibido la copia de
nuestra madre y la de nuestro padre. En condiciones normales, en las células, para ese gen se expresan las 2
méticos XY), y mujeres (homogaméticas XX)
inactivamos mayoritariamente uno de los cromosomas X, por lo que para la mayoría de los genes sólo hay
una copia.
LIBRO: Un principio básico de la genética mendeliana es que el origen parental de un gen no incide en su expresión y,
por lo tanto, los cruzamientos recíprocos dan resultados idénticos. Hemos observado que hay algunas características
genéticas (las codificadas por genes ligados al cromosoma X y por genes citoplasmáticos) para las que los
cruzamientos recíprocos no dan los mismos resultados. En estos casos, machos y hembras NO aportan el mismo
material genético a la descendencia. Con respecto a los genes autosómicos, los machos y las hembras SÍ aportan la
misma cantidad de genes, y desde hace tiempo se ha asumido que los genes paternos y maternos ejercen efectos
iguales. Sin embargo, el origen parental influye de manera significativa en la expresión de algunos genes. Este
fenómeno, la expresión diferencial de material genético según se herede del padre o de la madre, se denomina
impronta genómica.

Tenemos unos 25000 genes que codifican para proteínas; pero hay unos cientos de genes que no siguen este
patrón.

IMPRONTA GENÓMICA PARENTAL: en un núcleo diploide, para un reducido número de genes, sólo una de
las copias (la de origen paterno o la de origen materno) se expresa, mientras que la otra es silenciada.

La diferente metilación en el cromosoma paterno y materno es responsable de la impronta

genómica parental
En la figura vemos que, tanto el cromosoma materno como en el cromosoma paterno, tienen:

o El gen Igf2 (Insuline growth factor 2), que es un gen que tiene una función similar a la de la insulina,
es decir, un gen encargado de promover el desarrollo de consumo de glucosa, actuando como factor
de crecimiento, de consumo, de crecer la célula, de dividirse, etc.
o El gen H19, que es un long noncoding RNA (lnRNA), lo que significa que es un RNA que no codifica
se le añade la caperuza y la
cola poly-A, y lleva a cabo una función muy importante, pero que no es la de codificar proteínas, sino
que su función parece ser que está relacionada con suprimir el crecimiento.

Ambos genes están en la misma

región cromosómica y, entre ellos,
hay una región llamada ICR
(Imprinting Control Region). Y aquí
es donde reside la diferencia entre
óvulos y espermatozoides:

- en los óvulos la región ICR no

está metilada
- en los espermatozoides la
región ICR si está metilada,
llegando la metilación hasta el
gen H19
a) Si no hay metilación (en el caso de las hembras), se coloca un factor, que es el CTCF, que es un aislador.
El factor CTCF tiene una zona de reconocimiento a la secuencia de la región ICR y se une a ella,
provocando que el enhancer no pueda actuar sobre el gen Igf2, por lo que este gen no se podrá expresar
en el cromosoma materno. Mientras que el gen H19 si podrá expresarse en el cromosoma materno al no
estar metilado.
b) En cambio, en el cromosoma paterno, tanto la ICR como el gen H19 están metilados, por lo que este gen
no va a poder expresarse, pero, en este caso, el enhancer si puede actuar sobre el gen Igf2,
promoviendo su transcripción.

Por lo tanto, de cada gen tendremos una sola copia: en el caso del gen H19, la copia viene de la madre y en
el caso del gen Igf2, la copia viene del padre.

¿Y por qué ocurre esto en este caso? Ya que lo normal en la mayoría de los genes es que se expresen en
ambos cromosomas, obteniendo así nosotros 2 copias (uno de la madre y otro del padre). Hay una hipótesis
que habla de por qué ya en el cromosoma materno viene expresándose el gen H19 y se ha cerrado el Igf2, y
de por qué en los espermatozoides el que está abierto es el Igf2 y se cierra el H19. Y es una hipótesis que
tiene que ver con la teoría del gen egoísta de Richard Dawkins, que lo que nos dice es que nosotros somos
meros vehículos mediante los cuales los genes se propagan. Y en esta situación, para un gen paterno sería
mejor propagarse si ese gen puede sacar los máximos recursos durante el desarrollo del embrión, incluso si
es acosta de la madre. Porque venimos de sociedades evolutivas en las que todos los individuos cuidaban
unos de otros (ahora somos todos individualistas), y entonces esta teoría dice que a un gen paterno le
importará menos que la madre no sobreviva si su futuro embrión es capaz de sacar todos los recursos de la
madre. Y, en la otra situación, desde el punto de vista de la madre, se pensará que los genes maternos se
propagan mejor si soy capaz de evitar la depredación de ese feto que está creciendo en mi interior porque
eso me permitirá, en un futuro, tener más embarazos y poder seguir transmitiendo mis genes a la
descendencia.

Por eso, el caso del gen Igf2, que está abierto y puede expresarse en el cromosoma paterno, es un gen que
se encarga de aumentar y promover el tamaño de la célula, el metabolismo y la división celular, mientras
que el H19 que es el que viene del cromosoma materno, lo que provoca es frenar y evitar que haya un
crecimiento excesivo que pueda tener consecuencias fatales para la madre que aloja el feto.

Pero esta hipótesis es aplicable SÓLO para este caso de genes imprintados (o improntados), que no es la
situación normal. No es normal que para un gen en concreto sólo expresemos una copia, ya sea la materna o
la paterna, sino que lo normal es que expresemos las 2 copias.

Impronta genómica parental: marcaje epigenético del genoma con respecto a su origen parental.

REGULACIÓN DEL INICIO DE LA TRANSCRIPCIÓN

(1) Interacción con moléculas señal:

Este ejemplo de regulación del inicio de la transcripción es extrapolable para todas aquellas moléculas que
pueden atravesar y difundir pasivamente a través de la membrana, como pueden ser muchas hormonas (ej.
glucocorticoides, progesterona), el ácido retinoico, la tirosina, la vitamina D, ... todos estos son elementos
cuya naturaleza química permite el que, si están en el entorno de la célula, puedan difundir a su interior.
Este es, generalmente, el mecanismo de inducción que se observa en muchas hormonas.
Este es un mecanismo para inducir la expresión de los genes. En este caso, por ejemplo, el que vamos a ver
es el del glucocorticoide. Sabemos que las glándulas suprarrenales son principalmente el lugar dónde se
sintetiza este gen, y que tienen un fuerte efecto la activación del metabolismo. Y, prácticamente todas las
células de nuestro organismo tienen la capacidad de responder al glucocorticoide. ¿Cómo lo hacen?

a) Interacción directa ligando-receptor:

La glándula suprarrenal sintetiza los corticoides, que se van al

torrente sanguíneo y, una vez ahí, llegan a los tejidos y entran al
interior celular.

Dentro de la célula, en el citosol (o a veces en el núcleo), hay un

receptor específico para esa hormon receptor
de glucocorticoides, que está inactivo y unido a unas proteínas
chaperonas (Hsp90; Heat Shock Protein), que ayudan a inactivar y
mantener la conformación del receptor.

Cuando el glucocorticoide entra pasivamente y difunde a través de

la membrana, se une al receptor (amarillo), que tiene unos sitios de
unión al ligando, por lo que, cuando el ligando (en este caso, el
glucocorticoide) está presente, puede unirse al receptor con
bastante buena afinidad, provocando un cambio conformacional
en el receptor, que:

- Resulta en la liberación de esas chaperonas.

- Deja al descubierto regiones NLS (Nuclear Localisation Sequence), que son secuencias de localización
nuclear.

Por lo tanto, ese cambio de conformación en el receptor permite que las regiones NLS ahora estén
disponibles, que el receptor se dimerice, formándose así homodímeros, es decir, 2 unidades del receptor,
cada una unida a un glucocorticoide. Y esto provoca que, gracias a la señal NLS, el homodímero se
transloque al núcleo.

En el núcleo, el receptor actúa como un factor de transcripción inducible, que se activa en presencia del
glucocorticoide; y lo que va a hacer es unirse a través de su dominio de unión al DNA, a secuencias
específicas en el DNA, que son los elementos respuesta (al grupo corticoide en este caso)

Elemento respuesta (RE): secuencia

de ADN a la que se unen factores
específicos que aparecen como
respuesta a un estímulo (que, en este
caso, es el glucocorticoide). Pueden
activar o reprimir la transcripción.

Hay elementos respuesta al receptor

de glucocorticoides (GR), de
estrógenos (ER), al del ácido retinoico
(RAR), al de la tirosina (TR), al de la
vitamina D (VDR), etc.
En cuanto a la figura anterior:

1) vemos en primer lugar el receptor nuclear de glucocorticoides (GR), con un dominio de unión al
DNA (DBD, DNA binding domain; en azul) y un dominio de unión al ligando (LBD, ligand binding
domain; en rojo). Por lo tanto, el receptor tiene un lugar específico al que se une el ligando (en este
caso, el glucocorticoide) y otro al que se une específicamente el DNA y, más concretamente, a la
secuencia GRE (Glucocorticoid Response Element) del DNA (se ve en la 1ª figura).
2) Cada receptor nuclear tiene un elemento respuesta con su secuencia particular, que suele ser una
secuencia formada por 2 unidades, que suelen estar invertidas, entre las que hay un espacio.
Podemos ver, además, que la secuencia del elemento respuesta al receptor de glucocorticoides en
esta figura es muy similar a la de la 1ª figura, que ilustra como ejemplo también el de los
glucocorticoides. Sólo que esta última refleja la secuencia consenso (AGRACA...TGTY
puede ser una d
mientras que la de la 2ª figura es ya una de las posibles secuencias (AGAACA nnn TGTTCT), siendo

Estas secuencias específicas son sólo reconocidas por el receptor de glucocorticoides cuando está
activo y unido a la hormona. Lo mismo ocurre con el resto de los elementos.

Cada receptor nuclear unido a su elemento respuesta particular es lo que va a hacer que se active
específicamente el gen diana.

El fenómeno de dimerizar es precisamente porque hay 2

secuencias que son capaces de ser reconocidas por el
dímero. Un monómero (o receptor) unido al
glucocorticoide reconoce una secuencia y el otro
monómero reconoce la otra secuencia, por lo que
realmente hay 2 secuencias que, generalmente, son
reconocidas por receptores que se dimerizan (o se unen)
cuando se unen a sus ligandos.

La célula tiene un montón de receptores de glucocorticoides y, en el momento en el que los glucocorticoides

difunden dentro, y se unen a todos esos receptores, todos ellos van a ser susceptibles a ser translocados al
núcleo e interaccionar con distintos genes que tengan elementos respuesta para los receptores de
glucocorticoides. Así, de una manera coordinada, el glucocorticoide puede activar la expresión de genes en
distintas partes del genoma.

En el caso de otros elementos como, por ejemplo: a las mujeres, cada mes, les tiene que crecer el
endometrio para la implantación del embrión durante la etapa de vida fértil, y eso ocurre porque cuando
hay una señal del cerebro, de la síntesis de la LH y la FH, estas hormonas llegan a los ovarios, empieza a
crecer un folículo, comienzan a sintetizarse estrógenos, ... y los estrógenos tienen receptores en el
endometrio que, por lo tanto, recibe a los estrógenos y activa la transcripción de genes involucrados en la
proliferación. Y así, comienza a crecer y proliferar el endometrio, esperando a la futura implantación.

Pero no todas las moléculas son capaces de atravesar la membrana. De hecho, generalmente, casi todas las
moléculas de naturaleza proteica son incapaces de atravesarla. Por lo tanto, muchas citoquinas, hormonas
peptídicas, neurotransmisores, etc. no pueden atravesar la membrana. ¿Y cómo señalizan entonces?

Hay mecanismos de activación de la transcripción a través de moléculas incapaces de atravesar la

membrana. Y a continuación, se muestra uno de los muchos ejemplos de ruta de señalización de este tipo:
 b) Moléculas señal que no atraviesan la membrana plasmática: ruta de transducción de señales

Hay un receptor en la membrana (en azul) y una molécula

señal (en lila) que podría ser, por ejemplo, un factor de
crecimiento de una célula epitelial. Y esta molécula señal no
es capaz de atravesar la membrana, pero sí que tiene un
receptor específico en la membrana de la célula, que es
capaz de reconocer, en este ejemplo, al factor de
crecimiento.

Entonces, la unión del factor de crecimiento al receptor

provoca un cambio de conformación del receptor que activa
una proteína G. La proteína G normalmente se encuentra
unida a ATP, pero cuando el cambio de conformación del
receptor la activa, como tiene actividad ATPasa, el ATP pasa
a ADP, lo que activa a su vez a la adenilato ciclasa.

Luego, la adenilato ciclasa cicla el ATP, generando así AMPc,

que es el 2º mensajero (siendo el 1º el factor de
crecimiento), ya que es capaz de unirse a una proteína
quinasa. De esta manera, la proteína quinasa junto con el
AMPc, pueden ser translocados al núcleo.

Una vez en el núcleo, tenemos, como siempre:

una secuencia, llamada en este caso elemento de respuesta al AMPc (CRE; cAMP response
element).
una proteína que reconoce dicha secuencia, que es la proteína de unión a los elementos de
respuesta al AMPc (CREB protein; cAMP response element-binding protein).

Entonces, la CREB protein reconoce específicamente la secuencia CRE, pero por sí sola no es capaz de
estimular la transcripción. Por ello, cuando la protein quinasa entra y aún está activa, fosforila a las 2
unidades de la CREB proteína (que es un dímero). Y sólo entonces, una vez la CREB protein se ha unido a la
secuencia CRE y ha sido fosforilada, se puede unir a ella la proteína CBP (proteína de unión a CREB), que es
un coactivador, activando así finalmente la transcripción.

Este es un ejemplo típico de inducción o regulación a nivel de la transcripción por una molécula que NO es
capaz de llegar y a travesar la membrana. En la mayoría de los casos, estas moléculas tienen receptores en la
membrana y actúan como primeros mensajeros, uniéndose a ese receptor y desencadenando una cascada
de activación que termina llegando al núcleo. Y la mayoría de las veces, la activación es mediada por
fosforilaciones, que serían modificaciones postraduccionales.

(2) Activación de un gen por diferentes señales:

Este es un ejemplo de lo complejo que puede ser la activación de un gen, y cuántas señales diferentes
pueden ser requeridas y activadas para ello. Este caso es el del gen de la metalotioneina IIA (gen hMTIIA).
Como elementos del promotor núcleo están:

Inr (en naranja) es uno de los elementos del promotor núcleo y, más específicamente, es una
secuencia en la que está embebida el inicio de la transcripción.
luego está la caja TATA, que es reconocida por la TATA binding protein, una subunidad del factor de
transcripción IID (TFIID), para promover la transcripción del gen.

Corriente arriba (-50, -100, -150, etc.), hay otros elementos del gen:

o MRE: elemento de respuesta al metal.

o GC: elemento del promotor regulador al que se une el factor de transcripción SP1.
o BLE: elemento de respuesta basal, al que se unen los factores de transcripción AP1 y AP4, y
promueven la transcripción basal del gen.
o ARE: elemento de respuesta al factor AP.
o GRE: elemento de respuesta al glucocorticoide.

Pero, con lo que quiere que nos quedemos es que un gen, gracias a la presencia de una gran variedad de
elementos de respuesta distintos y de pequeñas y diferentes secuencias repartidas a lo largo de su región
corriente arriba del promotor, puede responder a diversas señales, que pueden ser señales que se
requieran en un momento concreto del desarrollo o en determinadas células.

Por ejemplo, vamos a ver la respuesta de este gen a una de las funciones en las que sí se sabe que este gen
está involucrado, que es la detoxificación de metales pesados. Tenemos un mecanismo para librarnos o
neutralizar a los metales pesados que, en un momento dado, pueden entrar en nuestro cuerpo. Y uno de
estos mecanismos es llevado a cabo por este gen de la metalotioneina IIA.

Este gen, en condiciones normales, tiene una transcripción basal por la estimulación del elemento respuesta
BLE. Pero supongamos que en nuestras células entra una buena cantidad de metales pesados (ej. cadmio,
zinc, cobre, etc.). Dichos metales pesados son muy necesarios para determinadas enzimas de las células,
pero si su nivel aumenta y supera un límite establecido, también pueden ser muy perjudiciales para la salud.

Luego, si esto ocurre, se ha visto que el factor de transcripción MTF1 es un factor de transcripción de
respuesta a metales. Este factor de transcripción normalmente se encuentra en el citoplasma, pero cuando
la cantidad de metales pesados aumenta, cambia de conformación por la presencia de dichos metales, se
transloca al núcleo y tiene un dominio de unión al elemento de respuesta al metal (MRE). Este factor de
transcripción se une en este gen en diversos lugares, lo cual promueve que la transcripción del gen se
ción basal. E interesa que este gen se
transcriba en presencia de metales pesados porque la proteína metalotioneina IIA tiene sitios de unión a los
metales pesados, de manera que es capaz de secuestrarlos manteniéndolos unidos a ella y bajar así los
niveles celulares de metales pesados que son muy tóxicos para las células.

Además, este gen tiene también un elemento de respuesta al glucocorticoide (GRE), y se ha visto que,
durante el desarrollo embrionario, el gen responde al aumento de cortisol de la madre. En los últimos
estadios de desarrollo, la madre genera mucho cortisol, el cual entra a través del flujo sanguíneo en el bebé
y activa, a través del GRE en el bebé, la síntesis de la metalotioneina. Y esta proteína parece tener en el
desarrollo embrionario un papel muy importante secuestrando hierro que, al parecer, es muy bueno para
que cuando el bebé nazca, tenga reservas de hierro durante los primeros días de desarrollo.

De esta manera, hemos visto que se trata de un gen que puede ser regulado por multitud de señales, cada
una de ellas actuando en determinadas células o bien en determinados momentos del desarrollo.
Esta complejidad de promotores qu
pueda tener lugar, de manera que el gen pueda activarse por multitud de señales distintas.

Con esto hemos visto 2 ejemplos bonitos de cómo podemos regular a nivel de la transcripción la activación
de los genes en eucariotas.

Pero hay otro mecanismo, que no existe en procariotas, pero sí en eucariotas, ya que tenemos los exones
separados por intrones, y ya sabemos que, en el mecanismo normal de transcripción de un gen, el
spliceosoma se encarga de eliminar los intrones. Ahora bien, el mecanismo del splicing es muy frecuente en
los genes, siendo lo normal que un gen tenga incluso más de una variante de splicing. Y estas variantes se
pueden regular de la siguiente manera:

Existen secuencias consenso en el inicio y en el final de cada intrón. En el inicio hay una secuencia GU si
hablamos del RNA (GT si hablamos del DNA) y al final, el 90% de los intrones, acaban en AG. Y bien, como
siempre, hablamos de una secuencia y de lo bien que puede ser reconocida dicha secuencia por el
spliceosoma...

REGULACIÓN DEL MECANISMO DE SPLICING

Represión del splicing:

a. En el gen, donde pone 5´y 3´, son las secuencias (muy
conservadas) GU y AG del inicio y final de cada intrón. Y en este
gen esas secuencias son muy bien reconocidas por el
spliceosoma, por lo que se cortan y eliminan los intrones, dando
lugar a un transcrito formado por los 4 exones unidos (ARNm
codifica la proteína correspondiente a los 4 exones).

b. Pero la opción de esta célula en otra célula diferente, o en la

misma célula bajo un determinado estímulo, puede generar una
variante de splicing distinta, que sería la reflejada a la derecha de la figura inferior. Esto ocurre porque,
supongamos que esta es una célula de otro tejido, que está expresando a un represor del splicing (en
amarillo), que se reconoce y se puede unir a secuencias específicas, las cuales pueden estar tanto en los
intrones como en los exones; y por eso se les llama:
o ESS: secuencia silenciadora exónica del splicing (Exonic Splicing Silencer).
o ISS: secuencia silenciadora intrónica del splicing (Intronic Splicing Silencer).

Esto quiere decir que, o bien en los exones o bien en los intrones, existe una
secuencia a la que se unen estas proteínas represoras del splicing, que son
ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (hnRNPs). Y esta proteína
cuando se une a esa secuencia en concreto apantalla o bloquea, en este
caso, el sitio 3´de splicing, de tal manera que el spliceosoma no podrá
reconocerlo y tendrá que saltar hasta encontrar el siguiente sitio 3´de
splicing, que sería el que precede al exón 3, por lo que se salta el exón 2.

Entonces en esta célula, en la que se está expresando esta proteína

represora del splicing, se produce un splicing distinto, dando lugar a una
proteína con una isoforma diferente (con sólo los exones 1, 3 y 4) que
tendrá, a lo mejor, una función ligeramente diferente.
Activación del splicing:
Hay otra serie de proteínas que provocan, al contrario que en el caso anterior, provocan la activación del
splicing.

c. Estos activadores del splicing actuarían en casos de

genes como los de la figura inferior izquierda. En este
gen hay 4 exones, y 3 intrones, cada uno con su
secuencia consenso de inicio (GU) y final (AG). Pero, el
sitio 3´corriente arriba y 5´ corriente abajo del exón 3
son malos, es decir, que no son fácilmente reconocibles
por el spliceosoma, ya que sus secuencias se alejan de
las secuencias consenso de inicio y final los intrones.
Por lo tanto, el spliceosoma no los reconoce, dando
(salto) del exón 3 y obteniéndose
un transcrito de mRNA con sólo los exones 1, 2 y 4.

d. Este otro caso es de una célula en la que sí se expresan las proteínas potenciadoras del splicing,
llamadas proteínas SR serina y arginina, ya que son proteínas cuyo extremo carboxilo (C-
terminal) es rico en serina y arginina, mientras que su extremo amino (N-terminal) es de unión al DNA,
concretamente a las siguientes secuencias:
o ESE: secuencia intensificadora exónica del
splicing (Exonic Splicing Enhancer).
o ISE: secuencia intensificadora intrónica del
splicing (Intronic Splicing Enhancer).

Por lo tanto, las proteínas SR reconocen y se unen a

estas secuencias que, en este caso, ambas son ISE, ya
que se encuentran en el intrón. Y esta unión favorece
o ayudan al spliceosoma a que reconozca estos sitios
de splicing para que así pueda cortarlos. Así, en esta
célula que está expresando estas proteínas SR, se
obtiene un mRNA que incorpora la información
genética también del exón 3.

Por lo tanto, en la regulación del splicing hay:

- elementos en cis ya están en el DNA.

- factores en trans
que señalan los sitios de corte que deben tenerse en cuenta o ignorarse, activando o reprimiendo, la
acción del spliceosoma.

Transcritos alternativos posibles para un gen:

En esta figura se muestran todas las posibles opciones de splicing que hay para un gen, ya que el splicing es
la condición normal, siendo raros los genes que no tienen variantes de splicing. Las líneas discontinuas
reflejan las posibilidades de transcrito:
a. El exón 1 se une directamente al exón 3, saltándose el exón 2 (exon skipping). O bien, el exón 2 sí es

eucariotas superiores.
b. Este caso muestra la variante de splicing alternativa 3´, con 2 posibilidades diferentes:
- el exón 1 se une al exón 2 completo y este, a su vez, al exón 3.
- se coge un sitio aceptor 3´alternativo, por lo que se incorpora parte del intrón, dando lugar a un
transcrito con un exón 2 de mayor tamaño.
c. Caso similar al b, pero esta vez, se coge un sitio de splicing 5´ alternativo:
- el exón 1 completo se une al exón 2 y este, a su vez, al exón 3.
- o se coge un sitio de splicing 5´alternativo más abajo del exón 1, por lo que se obtiene un exón 1 de
mayor tamaño, unido al exón 2 y al 3.
d. Se obtiene un transcrito en el que se incorpora el intrón, junto con los exones 1 y 2, incorporándose así
también la información intrónica a la proteína.
e. Exón mutualmente exclusivo: son aquellas variantes de splicing donde sólo nos podemos encontrar 1 u
otro exón alternativo, es decir:
- opción de arriba: se produce la unión del exón 1 con el exón 3 y con el 4.
- opción de abajo: se produce la unión del exón 1 con el exón 2 y con el 4.
transcrito, siempre va a estar sólo uno u otro.

Tenemos epigenética a nivel del DNA, transcripción (todos los mecanismos que regulan que un gen se
transcriba) y ahora vamos a ver mecanismos de regulación una vez tenemos ya la molécula de mRNA, puesto
que, en EUCARIOTAS, los mRNA tienen que salir del núcleo citoplasma para ser
traducidos.

REGULACIÓN DEL MECANISMO DE SPLICING

El proceso durante el cual los mRNA a salen del núcleo para ser traducidos en el citoplasma puede ser
regulado por una serie de complejos proteicos que puedan influir y que, también estén sujetos a señales
exteriores, para promover la exportación del núcleo hacia el citoplasma de determinados mRNA. Este es un
proceso que se está empezando a conocer, pero del cual queda aún muchísimo por aprender y estudiar.
La siguiente figura está sacada de la revista Cell, la mejor revista de Biología Molecular, puesto que aún no se
encuentra en ningún libro. Y en esta revista se habla de la revisión de un proceso de exportación en un
sistema biológico en concreto.

(1) Toda la parte inferior izquierda de la figura debe sonarnos enormemente: se ve la RNA polimerasa II
que, a m
actúa para poner en el extremo 5´ la caperuza, en el proceso de capping o capado (que ya hemos
visto).
(2) A continuación, aparece también un proceso que ya conocemos, el de (2) splicing, en el cual se
eliminan los intrones y se unen los exones. Y veamos que en esa molécula de RNA de la figura se
quedan pegados unos complejos llamados complejos EJC, que son complejos de unión entre exones
(Exon Junction Complex), ya que suelen estar delimitando, no exactamente dónde se unen los
exones, pero sí unas cuantas pb más arriba de donde ha ocurrido el splicing. Estos complejos forman
parte del RNA y, por lo tanto, salen del núcleo junto a él.
(3) Hay un complejo proteico formado por distintas proteínas (no hay que saberse los nombres), que
es atraído por un complejo de unión a la caperuza (CBC; Cap Bingding Complex) para que se una a la
molécula de RNA de manera secuencia-específica.
(4) Esta unión secuencia-específica del complejo proteico al RNA, permite una exportación coordinada
de muchos transcritos que puedan llevar a cabo funciones similares y que, por el mismo complejo
proteico, puedan ser exportados del núcleo al citoplasma.
Este conjunto del complejo proteico formado por distintas proteínas, el complejo de unión a la
caperuza (CBC) y los complejos EJC, unidos al RNA, forman los complejos ribonucleoproteicos
mensajeros (RNPm).
(5) Docking: luego, estas proteínas que forman un complejo se van a unir a unas proteínas del poro
nuclear, de manera que el DNA pueda ser translocado hasta el citoplasma para que pueda ser
traducido por los ribosomas.

En el propio proceso de transporte hay un mecanismo que asegura que el mRNA que va a salir al citoplasma

puesto que se ha visto que se exportan sólo aquellos mRNA que tienen la caperuza, los complejos EJC y la
cola poly-A, ya que todo esto son elementos que de una manera u otra interaccionan e intervienen para que
el mRNA pueda ser exportado al citoplasma. De esta manera, este mecanismo de control permite que sólo
los mRNA correctos salgan y, además, regula las moléculas de mRNA que preferentemente pueden salir
hacia el citoplasma para ser traducidos, antes que otros mRNA que tengan otras secuencias en su extremo 5´
al que se unan otros factores y que, a lo mejor, tarden entonces más en ser exportados al citoplasma.
 CONTROL DE LA ESTABILIDAD DEL ARNm
(una vez ya se encuentra el mRNA en el citoplasma

Un ARNm puede degradarse siguiendo 3 posibles rutas generales:

1) En primer lugar, un ARNm puede ser elegido para degradación por enzimas que acortan la cola poli-
A. En los ARNm recién sintetizados, la cola poli-A tiene unos 200 nucleótidos de longitud y se une a
una proteína conocida con el nombre de proteína de unión a poli-A. La unión de esta proteína a la
cola poli-A ayuda a estabilizar el ARNm. Si se acorta la cola poli-A a menos de unos 30 nucleótidos, el
ARNm pasa a ser inestable y actúa como sustrato para exonucleasas que degradan el ARN en
dirección 5' a 3' o en dirección 3' a 5'.
2) En segundo lugar, las enzimas de decapación pueden eliminar la caperuza de 7-metilguanosina, lo
que también hace que el ARNm se vuelva inestable.
3) En tercer lugar, un ARNm también puede ser cortado internamente por una endonucleasa, lo que da
como resultado unos extremos no protegidos en los que puede producirse la degradación mediante
exonucleasas. Ejemplos de cortes endonucleolíticos serían aquellos que tienen lugar durante la
degradación mediada por proteínas sin sentido (NMD, nonsense-mediated decay) y los provocados
por la interferencia de ARN (de la que hablaremos en la Sección 17.9). La degradación del ARNm
mediada por proteínas sin sentido tiene lugar cuando la traducción termina en codones de parada
prematuros. Las endonucleasas atacan al ARNm próximo al codón de terminación, dejando unos
extremos no protegidos que luego son degradados por las exonucleasas. La degradación mediada
por proteínas sin sentido constituye un importante mecanismo para la eliminación de moléculas de
ARNm mutadas que podrían resultar, si se las tradujera de manera eficiente, en la acumulación de
productos proteicos aberrantes.

Nonsense-mediated decay (NMD):

Una vez que el mRNA sale al citoplasma, la caperuza atrae a un montón de factores (como vimos en el T5), lo
que permite que se forme el complejo de iniciación, que interaccione con el RNA, que ocurra el scanning y
que se traduzca. Existen genes cuyos mRNA pueden ser atenuados cuando tienen fallos y generan codones
nonsense (mutaciones nonsense son las que generan un codón de parada). Esto puede ocurrir si:

a) el mecanismo de splicing va mal, no siendo exacto en las regiones frontera exón-intrón y, por lo
tanto, haciendo que se generen codones de parada prematuros que no deberían estar en el mRNA.
b) una mutación en el gen genera un codón de parada, que desencadena el mecanismo llamado
nonsense-mediated mRNA decay (NMD), traducido al español como un atenuamiento o
disminución de mRNA mediado por codones de parada.

Éste es un mecanismo de vigilancia para asegurarnos de que el mRNA que va a traducirse sea correcto y no
tenga codones de parada prematuros, como consecuencia de un mal splicing o de alguna mutación.

a. En esta figura vemos un mRNA normal, que ha hecho el splicing

perfecto, y que no tiene codones de parada prematuros. En la
parte superior se ven los complejos de unión entre exones (EJC)
que vimos anteriormente, unidos al mRNA. Cuando vamos al
citoplasma, tenemos ya los complejos ribonucleoproteicos
mensajeros (RNPm), y cuando entra el primer ribosoma, lo que
suele ocurrir (si no hay codones de parada prematuros) es que
a medida que empieza a traducir, va a ir eliminando esos
complejos EJC y traduciendo la proteína en la longitud correcta.
b. Suponemos ahora que el gen ha sufrido un mal splicing que genera un codón de parada prematuro. Por
lo tanto, el primer ribosoma empieza a leer el mRNA y se para un momento al llegar al codón de parada
prematuro (UAG). Entonces, al pararse el ribosoma, atrae al release factor 3 y, además, el complejo EJC
atrae también a una serie de proteínas (1, 2 y 3) que se unen al ribosoma.

Luego, el release factor 3 junto con las proteínas (1, 2 y 3) van a atraer y activar distintas enzimas:

- enzima decapadora (amarilla), que hidroliza o

elimina la caperuza.
- enzima desadenilasa (naranja).

Por lo tanto, la enzima decapadora hace que el mRNA

se queda sin su caperuza de protección en el extremo
5´, siendo así susceptible a que haya una exonucleasa
torpedo, que actúa en sentido (lila)
degradando el mRNA. Pero también ha sido atraída al
sistema una enzima desadenilasa, que lo que hace es
eliminar hidrolizar las colas poli-A, lo que hace que el
mRNA se desestabilice. Y entonces, vienen otras
exonucleasas (en el exosoma, un complejo
multiproteico) con actividad .

De esta manera, el mRNA es atacado por los 2 flancos:

por el extremo 5´es atacado por la

exonucleasa torpedo.
por el extremo 3´es por otras exonucleasas

Esto nos interesa porque, recordemos, que este mRNA ha sufrido un proceso de splicing defectuoso que ha
e ha hecho es
actuar para así activar una cascada de señalización que termine degradando dicho mRNA defectuoso.

Luego, este mecanismo de vigilancia funciona en todos los eucariotas y está relativamente conservado, pero
¿hay otros mecanismos de control en el citoplasma

Control de la estabilidad del mRNA:

La abundancia relativa de una proteína dentro de una célula viene determinada por un equilibrio entre la
síntesis (la transcripción) y la degradación de esa proteína. Y también sabemos que no todas las proteínas
son igual de abundantes en las células, ya que no todos los mRNA tienen la misma estabilidad a lo largo del
tiempo. Hay mRNA que duran mucho, gracias a su alta estabilidad como, por ejemplo, genes fundamentales
para el metabolismo basal de las células o genes de las rutas metabólicas, suelen ser tránscritos que duran
bastante. Pero también hay genes que duran muy poco, ya que su mRNA es rápidamente degradado, como
por ejemplo la ciclina que, dentro del control del ciclo celular, se sintetiza sólo cuando viene el mitógeno.

Un mRNA de un procariota no presenta las maduraciones típicas que hay en eucariotas: no tiene la
caperuza, ni la cola poli-A, ni los intrones son eliminados. Y estos elementos son fundamentales para el
control de la estabilidad del mRNA.
Cuando el mRNA sale del núcleo al citoplasma, su finalidad es ser traducido. La caperuza es muy importante
porque atrae a los factores de inicio de la traducción que, entre otras cosas, van a quitar cualquier estructura
secundaria que haya, y también va a permitir que la subunidad pequeña interaccione con estos factores para
poder hacer el scanning hasta encontrar el AUG, a partir del cual se incorpora la subunidad grande y ya
comienza el proceso de traducción. En esa estabilidad del mRNA es muy importante la caperuza en el
extremo 5´, pero también las proteínas que se colocan en la cola poli-A, que interaccionan con proteínas de
unión a la caperuza.

Cuando el mRNA entra en el citoplasma, puede ser degradado como mecanismo de control de la estabilidad
de ese mRNA, de las siguientes maneras:

1. Lo primero que le puede ocurrir a ese mRNA es una desadenilación. Los mRNA suelen tener una cola
poli-A de entre 90 y 200 adeninas (A), que es susceptible a ser degradada por una poly(A) nucleasa, que
es una enzima desadenilasa.

2. Entonces, una vez esto ocurre, el mRNA ha perdido ya muchas adeninas, quedándose con
aproximadamente sólo unas 10. Y lo siguiente que puede ocurrir son 2 procesos diferentes:
2.1. Un (ruta de la izq.): la cola poli-A de ya sólo unas 10 A, atrae a
un complejo proteico enorme, llamado Lsm1-7, que a su vez es muy importante para atraer a la
enzima decapadora (Dcp), que tiene 2 subunidad. Una subunidad se encarga de romper el enlace de
la caperuza, dejando así el RNA desprotegido en su extremo 5´. Y luego viene la exonucleasa Xrn1
(en este caso Xrn1 porque es un modelo de levaduras) y
sería una de las maneras de degradar el mRNA que no interesa que se esté traduciendo
continuamente.
2.2. Un (ruta de la dcha.): en este caso, la cola poli-A de ya sólo
unas 10 A, atrae a un complejo multiproteico diferente, llamado exosoma de RNA, que tiene

mRNA.

Pero ¿qué es lo que hace que un mRNA dure más o menos?

Como siempre, hay secuencias en el mRNA, y proteínas que se ven atraídas hacia dichas secuencias.
Secuencias en cis en el ARNm influyen en su estabilidad:
Por ejemplo, en algunos mRNA, al analizarse su secuencia, se ha encontrado una región muy rica en
adenosinas y uracilos, a la que se le llamó secuencia rica en adenosina-uracilo (ARE), que es una secuencia
que se conoce muy bien y que se suele encontrar en la región 3´- UTR. Estas secuencias suelen estar
presentes en los mRNA que duran poco, es decir, de los cuales se necesita su proteína puntualmente y no
continuamente, ya que se trata de una secuencia desestabilizante.

Como siempre, las secuencias reclutan a proteínas. En este caso, la secuencia ARE atrae a una proteína RBP,
que son proteínas de unión al RNA (RNA Binding Protein), de las cuales hay una gran variedad. Y cada una de
las familias de proteínas RBP se unen a determinadas secuencias en el mRNA.

a) Elementos desestabilizantes:

Esta secuencia ARE, que es un ejemplo de secuencia desestabilizante (DE), atrae a una proteína RBP en
concreto que, a su vez, lo que hace es reclutar elementos que destruyen al mRNA. Puede atraer, por
ejemplo, a la decapadora Dcp y a la exonucleasa Xm1, qu
reclutar a factores que ataquen al mRNA desde el otro extremo, como la poly(A) nucleas, que termina
degradando la cola poli-
es lo que ocurre en los mRNA, cuya proteína no interesa que se esté sintetizando continuamente, sino sólo
puntualmente.

b) Elementos estabilizantes:

Pero también puede ocurrir lo contrario, es decir, que en el mRNA haya secuencias estabilizadoras (SE), que
nuevamente atraerán a proteínas RBP, pero en este caso son unas proteínas RBP diferentes que favorecen la
estabilidad del RNA, ya que atraen a la poli-A polimerasa para que alargue la cola poli-A, de manera que se
estabilice el mRNA.
Sitios Alternativos de Poliadenilación (APA):
Observamos el esquema de un gen formado por 2 exones, y el sitio de corte de poliadenilación donde se
corta y se coloca la poli-A. Si suponemos que ese gene en vez de sólo uno tiene 2 sitios de corte de
poliadenilación, da una sola proteína pero lo que si va a variar es la longitud del mRNA. Los mRNA son de
distinto tamaño, pero la coding sequence es la misma.

Ejemplos: gen donde combinamos sitios alternativos de poliadenilación en la región codificante.

Ejemplo donde el gen puede madurar de 2 maneras distintas. Tenemos 2 sitios de poliadenilación:

-
- otro en el intrón que separa el exón 1 y 2.

De este modo, el gen se puede regular de 2 maneras distintas: si existe splicing entre exón 1 y 2, se
transcribe toda la región y el mRNA utilizaría el sitio de corte y poliadenilación, y se colocaría cola poli-A. Si
madura de forma que coge parte del intrón 1, como consecuencia, formaría parte de la proteína y tendría la
UTR con una secuencia reguladora que provoca el corte donde se coloca la poli-A, por lo que se generarían 2
proteínas y tendríamos 2 isoformas (una proteína naranja y otra naranja y roja). En el otro ejemplo se
tendrían 3 isoformas de proteínas.

Lo más frecuente es UTR-APA. Se puede controlar el tiempo en el que el mRNA se traduce según se use una
u otra cantidad de proteína.

Ejemplo de regulación post-transcripcional: metabolismo del hierro.

Existen mecanismos en los que intervienen proteínas que se unen al
mRNA para estabilizarlo o desestabilizarlo. Por ejemplo, encontramos
genes implicados en el mecanismo del hierro, que es muy importante
como cofactor, aunque en exceso es tóxico. Para poder captar el hierro
que tomamos de la dieta, se une con una molécula en la sangre,
denominada transferrina. En la célula tenemos un receptor para la
transferrina, que es endocitado y liberado dentro de una vesícula
endocítica. El hierro se libera al citoplasma y una parte es utilizada como
coenzima, mientras que otra parte se compleja con la apoferritina para
evitar daños en la célula, formando ferritina.

La transferrina es reconocida por el receptor de la transferrina, que está

en la superficie celular. Al unirse, entra al citoplasma y se libera el hierro.
El hierro puede almacenarse en la ferritina y se consigue gracias al
control de la expresión posttranscripcional del receptor y de la ferritina.
Bajos niveles de hierro:

El elemento de respuesta al hierro (IRE) forma una estructura

elemento es reconocido por una proteína denominada

proteína reguladora del hierro (IRP), cuya afinidad al mRNA es
mayor en ausencia de hierro. Cuando la proteína se asocia a
este elemento, se inhibe la traducción del mRNA de la ferritina,
puesto que no se precisa de esta proteína para captar el poco
hierro que hay. El gen que codifica para el receptor de la
transferrina también tiene un IRE al que se une la IRP. Esto
produce la estabilización del mRNA, facilitando su traducción,
por lo que se induce su expresión. El elemento de respuesta al
hierro es reconocido por la proteína reguladora del hierro. En
condiciones de poco hierro, la proteína reguladora del hierro

ferritina e inhibe que se pueda traducir y bloquea el inicio de la

traducción. En cuanto al receptor de la transferrina, la proteína
reguladora de hierro también se encuentra, pero el elemento
-UTR al que se unirá
la proteína reguladora de hierro. Estabiliza el mRNA
permitiendo que el receptor de la transferrina se pueda
traducir sin problema, lo cual interesa al tener poco hierro y
me interesa poner muchos receptores de hierro.

Altos niveles de hierro:

Cuando hay demasiado hierro, este se acopla a la

proteína IRP, cambiando su conformación e
impidiéndole reconocer al IRE. En el caso del mRNA de la
dejando libertad al
ribosoma para traducir. Por otro lado, no estabiliza el
mRNA que codifica para los receptores de transferina,
por lo que las endonucleasas degradan el mRNA
rápidamente. En el caso de la transferrina, al unirse el
hierro, ésta se suelta y no atrae a adenilasas, se acorta la
cola y las exonucleasas degradan el DNA; y al tener
mucho hierro no interesa poner más receptor en las
células.
 EDICIÓN DEL mRNA

La regulación post-transcripcional comprende la edición de la secuencia nucleotídica del RNA después de

haber sido transcrito. En este caso, la proteína producida tras la traducción es diferente de la predicha a
partir de la secuencia del gen, puesto que durante la maduración las bases individuales se insertan, se
eliminan o se modifican. Es decir, la información de codificación en el RNA está alterada. El mecanismo de
edición en el que vamos a centrarnos es la desaminación específica de nucleótidos de citosina.

Según este mecanismo, un residuo específico de citosina del mRNA es transformado en uracilo por
desaminación. Para un determinado mRNA sometido a edición, este proceso solo ocurre en ciertos tejidos o
tipos de células y de manera regulada. Un caso de edición de este tipo se encuentra en la regulación de la
apolipoproteína B de mamíferos. Este gen cuenta con varios exones, uno de los cuales es un codón CAA
(exón 26) marcado para la edición, siendo la citosina la que se desamina. Esta desanimación, mediada por la
enzima citidina desaminasa, transforma citosina en uracilo. En este ejemplo, la desaminación ocurre de
manera específica dependiendo del tejido: el mRNA en cuestión se edita en células intestinales, pero no en
células hepáticas.

El codón CAA, que codifica para la glutamina en el mRNA no editado en el hígado, se convierte en UAA, un
codón de parada, en el intestino. El resultado es que la proteínas de longitud completa, de unos 4500
aminoácidos, se produce en el hígado, mientras que en el intestino se produce un polipéptido truncado de
solo 2100 aminoácidos.

Las 2 formas de apolipoproteína B están involucradas en el metabolismo de los lípidos. La forma más larga,
que se encuentra en el hígado, está involucrada en el transporte de colesterol y triglicéridos sintetizados
endógenamente. La versión más pequeña, que se encuentra en los intestinos, está involucrada en el
transporte de lípidos en la dieta a varios tejidos.

El triplete del exón 26 se edita en células del intestino. En el hígado no se edita. El gen, a nivel de mRNA en
el citoplasma se edita y la secuencia donde se mide el triplete del exón, atrae un complejo proteico dentro
del cual hay una enzima con actividad citidina-desaminasa, que desamina la citosina del triplete generando
una transformación en uracilo. Esto está ocurriendo a nivel de molécula de mRNA, no del gen, y en concreto
a nivel del intestino. UAA se convierte en un codón de parada, y cuando el ribosoma empiece a leer, se
formará una proteína con 2153 aa, es decir, bastante más pequeña que la proteína normal. En el intestino,
se necesita fabricar una proteína más corta que se encargue de transportar los lípidos que tomamos de la
dieta, a diferencia del hígado, que se necesita para el transporte del colesterol y triglicéridos endógenos, e
interesa que sea de mayor tamaño.
 TEMA 8: MUTACIÓN Y REPARACIÓN DEL ADN
MUTACIONES

La capacidad de las moléculas de ADN de almacenar, replicar, transmitir y decodificar información es la base
de la función genética. Pero igual de importantes son los cambios que tienen lugar en las secuencias del
ADN. Sin la variación que surge de los cambios en las secuencias de ADN, no habría variabilidad fenotípica, ni
adaptación a los cambios ambientales, ni evolución. Las mutaciones génicas son el origen de los alelos
nuevos y de la variación genética en las poblaciones. Sin embargo, también son el origen de cambios
genéticos que conducen a la muerte celular, las enfermedades genéticas y el cáncer.

Mutación: cambio heredable en la información genética.

o Dependiendo del tejido que afectan, se clasifican como:

a) Mutación somática: aquellas que se producen en cualquier célula del cuerpo excepto en las
germinales; por mitosis se generan clones en el individuo (no se transmiten a las sig. generaciones).
b) Mutación en la línea germinal: se transmiten a las generaciones siguientes.
transmir a otras generaciones

o Dependiendo del tamaño de la región afectada, se clasifican en:

a) Mutaciones génicas (puntuales): afectan a una o a muy pocas bases (en las que se va a centrar).
b) Mutaciones cromosómicas: afectan a amplias regiones cromosómicas, a cromosomas completos o
incluso a juegos cromosómicos.

Tipos de mutaciones génicas (puntuales): atendiendo a la causa de la mutación se clasifican en 2 tipos

a. SUSTITUCIÓN de base: se cambia una base por otra.
Las sustituciones según la naturaleza del cambio pueden
clasificarse en:
transiciones: cambia una base púrica por otra púrica o una
Esta mutacion -
>
pirimidínica por otra pirimidínica (¡¡¡siempre hay una mayor
es más comun
tasa de mutaciones de este tipo!!!)

Por provabilidad transversiones: se sustituye una base púrica por otra

esta mutaciones pirimidínica o, al revés.
Son mas comunes

vero no

Las sustituciones atendiendo al efecto que causan a nivel de la proteína se clasifican en:
silenciosas o sinónimas: cuando el triplete que se origina codifica el
mismo aa.

cambio de sentido: el nuevo codón especifica un nuevo aa. A su

vez se dividen en:
o conservadoras: si el aa es químicamente similar.
o no conservadoras: si el aa es químicamente diferente.

sin sentido: el codón que se origina es un codón de parada.

b. INSERCIÓN o DELECIÓN de bases: se incorporan o eliminan una o varias bases.

Si el nº de bases insertadas o delecionadas no es 3 o múltiplo de 3, la pauta de lectura de la proteína se verá

alterada (mutación de cambio de pauta de lectura) a partir del Indel (inserción/ deleción), ya que el código
se lee de 3 en 3. Mientras que, si las inserciones o deleciones son de 3, o de un múltiplo de 3 bases, se
producirá un cambio de aminoácido, pero no se cambiará el marco de la pauta de lectura.

Las mutaciones pueden clasificarse como espontáneas o inducidas, aunque estas dos categorías tienen un
cierto solapamiento.

MUTACIONES ESPONTÁNEAS

Las mutaciones espontáneas son cambios en la secuencia nucleotídica de los genes que no parecen tener
causa conocida. No hay ningún agente específico asociado a ellas y, generalmente, son accidentales. Muchas
de ellas surgen como resultado de procesos químicos/ biológicos normales del organismo que alteran la
estructura de las bases nitrogenadas. Y, a menudo, se producen durante el proceso enzimático de
replicación del ADN.

La tasa de mutación se define como la probabilidad de que un gen sufra una mutación en una única
generación o a la hora de formar un único gameto. Primero, la tasa de mutación espontánea es
extremadamente baja en todos los organismos. Segundo, la tasa varía entre los diferentes organismos.
Tercero, incluso dentro de una misma especie, la tasa de mutación espontánea varía de un gen a otro. Esta
tasa de mutación depende del tipo de célula, del organismo, etc. Pero hay un rango, que se estima que está
entre 10-6 y 10-11 por mitosis, es decir, por cada división nuclear se produce entorno a esa tasa de
mutación.

1. Errores durante el proceso de replicación del ADN y deslizamientos:

Ocasionalmente, las DNA polimerasas insertan nucleótidos incorrectos durante la replicación de una cadena
de ADN. Aunque existe un mecanismo intrínseco en las propias DNA polimerasas, llamado actividad
, que ayuda a corregir errores cuando la polimerasa coloca alguna base errónea que está
mal apareada, lo que aumenta la fidelidad de la replicación 100 veces (x100) al disminuir la tasa de
mutación. Aun así, es posible que la polimerasa no detecte todas las bases que coloca de manera errónea y
persistan nucleótidos erróneamente incorporados después de la replicación. Además, hay regiones que es
muy complicado que la DNA polimerasa pueda replicar sin cometer errores, que son las regiones en las que
hay repeticiones en tándem, como las mostradas en la siguiente figura:

A. Microsatélite formado por la repetición de un dinucleótido (CA, o GT en la hebra molde) repetido 12

veces. Y en estas regiones de dinucleótidos (o mononucleótidos), sobre todo cuando hay muchas
repeticiones de citosinas (C), hay una alta probabilidad de mutación. Cuando la DNA polimerasa está
sintetizando la nueva cadena (en azul) a partir de la molde (violeta), durante el proceso de
replicación, es normal que ambas cadenas se disocien o separen parcialmente y luego se vuelvan a
asociar. El problema es que, al volver a asociarse, la asociación no siempre es perfecta respecto al nº
de repeticiones, sobre todo en estas regiones de muchas secuencias repetidas, por lo que se puede
formar un loop o lazo en la cadena de nueva síntesis que esconde, en el caso de esta figura, 1
repetición. Por lo que al reasociarse mal nuevamente la cadena de nueva síntesis, como en este
caso, al reanudar la polimerasa la síntesis el resultado final es que vamos a tener un alelo nuevo con
una repetición de más, es decir, una duplicación. muchos de los
muy polimágico e

Se utiliza en

moceso forense
y pomebas de

haternic
 B. Por otro lado, tras el mismo proceso de disociación - reasociación, si el loop se genera en la cadena
molde, lo que va a ocurrir es que se va a producir una deleción, como en el caso de esta figura en la
que, en lugar de obtenerse un alelo con las 12 repeticiones, sólo tiene 11.

Cadena
Molde

En conclusión, el deslizamiento de una hebra con respecto a la otra en regiones con repeticiones durante la
replicación genera deleciones y/o duplicaciones en el DNA. Las secuencias repetidas son puntos calientes
para la mutación del ADN y en algunos casos contribuyen a enfermedades hereditarias, como la enfermedad
de Huntington.

2. Emparejamiento anómalo por formas tautoméricas:

Este es otro de los procesos espontáneos (menos frecuente, pero que también ocurre) que genera errores y,
por lo tanto, mutaciones en nuestro DNA.

Los tautómeros son estructuras químicas en las que ha habido modificaciones en la localización de
determinados electrones y de determinados elementos químicos. Pero el hecho que las bases puedan
adoptar diversas formas, conocidas como tautómeros, también incrementa la probabilidad de
emparejamientos erróneos durante la replicación del ADN (formas tautoméricas son menos estables y se
pueden revertir, no permanecen mucho en el tiempo).

A la izquierda de la siguiente figura tenemos las 4 bases

representadas en su forma normal y estable, que es como
normalmente se encuentran en el ADN. Pero en estas bases, en
determinados momentos, puede producirse un cambio de los
protones y los electrones, lo que hace que se establezcan nuevos
enlaces. Por ejemplo, la timina puede pasar de la forma común,
que se llama ceto, a una forma rara, llamada enol, ya que hay un
intercambio de protones entre el N y el O, produciéndose la rotura
del doble enlace C=O de la forma normal y formándose uno
diferente (C=N) en la forma rara. Lo mismo ocurre con la guanina,
que puede pasar también de la forma ceto (la común) a la forma
enol (la menos común).

En la adenina y la citosina también tiene lugar un cambio de

protones, sólo que la forma común se llama amino, en la que hay
un intercambio de un -H de un nitrógeno a otro, pasando así a la
forma menos común, llamada imino.

Es decir:

o
o
o
o
 El problema es que en el ADN, esas formas raras (enol e imino) de
las bases nitrogenadas, pueden hacer que se establezcan
emparejamientos anómalos, que no son los típicos de Watson y
Crick.

Sabemos que la C, en la forma estable, aparea con G; pero en la

figura de la derecha vemos que la forma rara de la citosina (imino)
con la base que se aparea es con A (la forma común, amino), en
lugar de con G. Por otro lado, la G también cuando está en su
forma rara (ceto), con la base que se aparea es con T, en lugar de
con C.

Por lo tanto, podrá producirse una mutación durante la replicación del ADN cuando un tautómero formado
transitoriamente en la cadena molde se empareja con una base no complementaria. En el siguiente ciclo de
replicación, se separan los miembros del par de bases «mal emparejado» y cada uno especifica su base
complementaria normal. El resultado final es una mutación puntual.

En esta figura se muestra el ejemplo de una célula que se va a dividir, y que tiene el par T = A. Entonces, esta
célula va a abrir su doble cadena y, justo ANTES de que pase la maquinaria de la replicación del DNA, se
produce ese cambio tautomérico en el que la timina pasa de su forma ceto (la normal) a su forma enol (la
rara). De esta manera, la T en su forma enol, va a poder aparearse con la G. Las cadenas azules en el 2º paso
son las de nueva síntesis.

Con lo cual, tras una primera ronda de replicación, vemos que la A aparea con una T, ya que no ha sufrido
ningún cambio tautomérico, pero la T aparea con G, por lo que hay un mismatch o un emparejamiento
erróneo.

Entonces, tiene lugar una segunda ronda de replicación del DNA y, si antes de que ocurra, el mismatch no
ha sido corregido, éste dará lugar ya a una mutación que ya queda fijada de manera permanente en el DNA.
Esto es así porque, aunque la T sí que vuelve a su forma ceto antes de la 2ª replicación y, por lo tanto, se
empareja con la A, la base correcta, queda la G con la que se había emparejado en la 1ª ronda de replicación,
que va a aparear con C. Y esto de lugar a una transición, puesto que el par original T = A se ha transformado
en esta célula en el par , es decir que la T se ha transformado en una C y la A en una G.
Reparación de emparejamiento erróneo (MMR):
Afortunadamente, la tasa de mutación es un equilibrio entre las mutaciones espontáneas que se generan y
los mecanismos de reparación que se crean para solucionarlas. Y existe, concretamente, un mecanismo que
se encarga de reparar los emparejamientos erróneos del DNA, llamado MMR (mismatch repair).

A. EN PROCARIOTAS:

En el siguiente esquema se ilustra la cadena molde en gris y la cadena de nueva síntesis en rojo, y vemos que
la T, por estar en su forma tautomérica, está apareando con una G, en lugar de con su base complementaria,
la A.

Pero existe un conjunto de genes del sistema MMR que codifican proteínas, como el gen mutS, que codifica
la proteína MutS homodímero con otra
subunidad que es exactamente igual, que acude rápidamente, una vez que el DNA se replica, y hace un
escaneo rápido para poder detectar pequeñas distorsiones en la estructura del ADN, que debería ser
perfectamente simétrica, debidas a emparejamientos erróneos de las bases.

distorsión, es decir, que se fija y provoca un cambio conformacional en la propia proteína MutS, que además
ayuda a todavía distorsionar más la doble cadena. Esto es un proceso ayudado por el ATP.

Esta mayor distorsión, tanto del cambio conformacional de MutS

como del aumento de la distorsión de la doble hélice, atrae
rápidamente a otra proteína del sistema MMR, que es la proteína
MutL, que interacciona con el ADN y con MutS.

A su vez, MutL atrae a la proteína MutH, que interaccionará con el

ADN y con MutL. Y podemos ver que MutH se coloca directamente
sobre la cadena roja, que es la de nueva síntesis.

Entonces, una vez ya ha sido reclutado todo el complejo y están las 3

proteínas perfectamente posicionadas en esa zona de la distorsión,
MutH corta la cadena de nueva síntesis, ya que tiene actividad
endonucleasa, haciendo un pequeño corte o nick muy selectivo.

A continuación, viene una helicasa (no está representado en la fig.),

que disocia la cadena molde de la cadena de nueva síntesis para que
una exonucleasa venga, se una, y elimine los nucleótidos que están
corriente abajo de la distorsión, y también unos cuantos nucleótidos
localizados después de la región del mal emparejamiento, incluyendo
los nucleótidos mal emparejados. De esta manera se genera un gap,
es decir, una zona que debe ser rellenada, de lo cual se encarga la
DNA polimerasa III

Finalmente, viene una ligasa que sella el enlace fosfodiéster, de tal

manera que se ha resintetizado un trocito de la cadena de nueva
síntesis, que nos hubiese dado un mal emparejamiento, para que
ahora sí frente a la T de la cadena molde se haya colocado
correctamente una A, evitando así que tenga lugar una mutación.
En resumen:

1) MutS reconoce el emparejamiento erróneo.

2) MutL interacciona con MutS y ayuda a reclutar a MutH.
3) MutH (endonucleasa) corta SELECTIVAMENTE en la secuencia de la cadena de nueva síntesis.
4) Helicasa separa ambas cadenas.
5) Exonucleasas eliminan la hebra recién cortada más allá del nucleótido mal apareado.
6) DNA polimerasa III rellena el hueco.
7) Ligasa sella.

¿Cómo se determina la base que se acaba de incorporar erróneamente en el ADN recién sintetizado?

Es decir, ¿cómo sabe MutH que tiene que cortar en la cadena de nueva síntesis y no en la molde? ¿Qué
mecanismo puede existir en algunos procariotas para saber cuál es la cadena de nueva síntesis?

Aparte de las secuencias del ADN, existen marcas epigenéticas, como las metilaciones de las citosinas que,
precisamente, son un mecanismo que permite en algunos procariotas diferenciar la cadena de nueva síntesis
de la molde.

En la figura, por ejemplo, la cadena superior, que tiene la metilación, es la cadena molde. Y la inferior es la
de nueva síntesis. Este es otro esquema en el que tenemos la proteína MutS, que ha hecho un escaneo, ha
encontrado una pequeña distorsión, ha aumentado dicha distorsión y ha atraído a MutL que, a su vez, atrae
a MutH. El sistema formado por MutS y MutL es el que determina o siente dónde están esas marcas de
metilación para que así MutH sepa cuál es la cadena de nueva síntesis en la que debe colocarse y hacer el
corte o nick.

Esto se consigue porque la MutS escanea

a la par que va actuando la maquinaria
de la replicación del ADN y actúa ANTES
de la metilación de las cadenas de nueva
síntesis para así poder diferenciarlas.

También podemos ver la diferencia

según se haga el corte a la izquierda
(corriente arriba) o a la derecha
(corriente abajo) del mismatch o mal
emparejamiento:

a. En este caso el corte o nick se hace corriente arriba (a la izquierda) del mal emparejamiento. La
MutH corta la cadena de nueva síntesis y hay una (la VII o la RecJ)
los nucleótidos que se encuentra antes del mal
emparejamiento y también unos cuantos que se encuentran después. Entonces la exonucleasa ya se
suelta y viene la DNA polimerasa III que sintetiza la cadena de nuevo y la ligasa que sella los nuevos
enlaces.
b. Si el corte o nick se hace corriente abajo (a la derecha) del sitio del mal emparejamiento, MutH, ya
activada por el reclutamiento y por su unión al ADN donde está MutL, hace el corte, y viene otra
exonucleasa, la , que se encarga de degradar también todo el
fragmento de nucleótidos hasta llegar al mal emparejamiento, incluyendo al propio mal
emparejamiento, y alguno más localizado después. Luego, al igual que en el ejemplo anterior, la
exonucleasa ya se suelta, viene la DNA polimerasa III a rellenar el hueco sintetizando la cadena
nueva y la ligasa lo sella.
Por lo tanto, este es el mecanismo que los organismos que metilan el ADN suelen utilizar para poder
diferenciar la cadena de nueva síntesis de la cadena molde.

Así, un grupo de productos génicos de E. coli, MutH, MutL y MutS, así como las exonucleasas, la ADN
polimerasa III y la ligasa, están implicados en la reparación de los emparejamientos erróneos, por lo que las
mutaciones en los genes MutH, MutL y MutS producen cepas bacterianas deficientes en la reparación de
emparejamientos erróneos. Y, aunque los mecanismos anteriores están basados en estudios realizados en E.
coli, en levaduras y en mamíferos existen mecanismos parecidos que implican proteínas homólogas.

B. EN EUCARIOTAS:

Pero entonces, ¿los organismos (eucariotas) que NO metilan el ADN cómo lo hacen?

Este es un proceso que todavía no se conoce muy bien, no se sabe cómo se genera, pero sí se sabe ya que el
hecho de poder diferenciar la cadena de nueva síntesis de la molde ocurre gracias a que la cadena de nueva
síntesis tiene mellas a lo largo de toda su longitud.

Es decir, cuando hay replicación tenemos fragmentos de Okazaki para la hebra discontinua y para la hebra
continua se sintetiza una cadena molde continua sin fragmentos. Pues bueno, en los fragmentos de Okazaki,
como van de manera discontinua, hay fragmentos/ trozos/ mellas. Pero en la cadena continua, lo que hoy
se sabe es que también hay mellas, es decir, que hay alguna enzima que se encarga de ir haciendo pequeños
cortes en la cadena de nueva síntesis para así ir dejándole pistas a la maquinaria de la reparación para que
pueda identificarla.

Por lo tanto, en eucariotas, el sistema MMR utiliza una nomenclatura similar a la de procariotas, con una
serie de proteínas homólogas:

o La homóloga de MutS es , que es un heterodímero formado, por

ejemplo, por las proteínas MSH2, que es la que escanea, y MSH6.
Esta proteína se encarga de reconocer las distorsiones por los malos
emparejamientos entre un único nucleótido y pequeñas inserciones y
deleciones de también un único nucleótido.
o Además, hay otra homóloga, la , formada por las subunidades
MSH2 y MSH3.
Esta se encarga de reconocer las distorsiones causadas por esas
pequeñas inserciones/ deleciones debidas a los deslizamientos del
ADN durante la replicación.
Por lo tanto, cada una está especializada en reconocer un tipo de
distorsión distinto.
o Por otro lado, el homólogo de la proteína MutL es el , un
heterodímero formado por MLH1 y PMS2.

Aunque el mecanismo sigue siendo similar: despues de la replicación ocurre

un emparejamiento erróneo entre las bases. Esta distorsión es detectada por
la , formada por las subunidades MSH2 y MSH6, que cambia de
conformación y aumenta aún más la distorsión.

Entonces, atrae al sistema MutL

que se llama un complejo ternario, en el que el sistema MutL interacciona
Se carga el PCNA y el RFC (la cargadora y la abrazadera de la replicación del ADN), lo cual estimula la
actividad endonucleasa del PMS2, por lo que corta la cadena azul corriente abajo respecto del mismatch,
que sabe que es la de nueva síntesis porque ya hay un corte preexistente.

A continuación, viene la exonucleasa I

Luego ya, en eucariotas, tenemos la , que sintetiza de nuevo la cadena de nueva síntesis,
incluyendo la zona del mal emparejamiento. Y la ligasa lo sella.

LESIONES ESPONTÁNEAS DE LAS BASES

Las lesiones espontáneas de las bases es otro de los mecanismos que pueden hacer que mute el ADN
espontáneamente, es decir, simplemente como consecuencia del proceso biológico normal que tiene lugar
en las células (mecanismo endógeno).

En el metabolismo de las células se produce lo que se llama especies reactivas de oxígeno (ROS), que se
producen como consecuencia de la fosforilación oxidativa que tienen lugar en la mitocondria. De hecho, se
cree que cada día, en condiciones normales, se producen alrededor de unas 20.000-100.000 lesiones en el
ADN de una célula nucleada. Y muchos de estos procesos van a venir determinados por las ROS.

La siguiente figura refleja todos los posibles ataques que pueden sufrir las bases en nuestro ADN. Como
consecuencia del metabolismo de la mitocondria, se producen esas moléculas terriblemente electrofílicas
anión superóxido (O2-), al peróxido de hidrógeno (H2O2) y a radicales hidroxilo (OH-);
no están representados), que se forman por esa reducción incompleta de un electrón del oxígeno.

Por lo tanto, las flechas azules representan los ataques oxidativos e indican los
sitios susceptibles a ser atacados por las ROS; y una de las cosas más importantes
a la hora de generar mutaciones es que las ROS pueden atacar a la base,
modificando o rompiendo el enlace del esqueleto azúcar-fosfato de las cadenas de
ADN, produciendo así roturas. Aunque no sólo se ve atacado el azúcar, también
pueden atacar a distintas partes de la estructura de los nucleótidos. Una de las
bases que se ve atacada más frecuentemente es la guanina (G), puesto que tiene
un bajo potencial redox; y este ataque genera una 8-oxoguanina, ya que se crea
un grupo carbonilo (=O) en la posición 8, lo que da lugar a mutaciones en el ADN.

Por otro lado, el ADN también es susceptible a roturas o ataques hidrolíticos por simplemente las células
estar en un ambiente acuoso:

las roturas hidrolíticas generalmente atacan al enlace

N-glucosídico que existe entre la base del ADN y el
azúcar, produciendo así una despirimidinación,
puesto que se eliminan las pirimidinas C y T.
aunque también pueden atacarse los enlaces N-
glucosídicos, que unen la pentosa o azúcar con las
purinas, dando lugar a una despurinación, puesto
que se eliminarían entonces las purinas G y A.
o se producen también ataques hidrolíticos a los
enlaces señalados mediante las flechas violetas, de
manera que se pierde el grupo amino tanto de las C
como de las A, dando lugar a desaminaciones, que
son potencialmente mutagénicas si no se repara.
ATAQUE OXIDATIVO:
Vamos a ver, por ejemplo, la generación de la base oxidada 8-oxoguanina, como consecuencia de esos
radicales libres, que pueden dar lugar a mutaciones:

o la primera estructura es la de la
G normal, en la que en la posición 8 no
hay oxidación.
o luego, los radicales libres de las
ROS reaccionan con la G y generan un
grupo carbonilo nuevo (=O), dando
lugar a la 8-oxoguanina.

Como sabemos, la G en condiciones normales aparea con C, pero cuando está oxidada, los nuevos enlaces
van a permitir que aparee también con la A, con la que no se aparearía en condiciones normales.

¿Y qué pasaría si esto no se repara?

replicación, la mutación queda fijada, es decir, que esa A va a aparear

por lo que pasaremos de tener un par GC a un par TA, lo que constituye una transversión.

¿Qué mecanismos o sistemas tenemos para evitar esta mutación en el ADN?

El primer mecanismo que tenemos es una enzima codificada por el gen Mth1, un gen descubierto en
levaduras pero que también tenemos los humanos. Y este gen tiene la capacidad de hidrolizar nucleósidos
trifosfatos oxidados, como por ejemplo la 8-oxoguanina.

Entonces, al hidrolizarlos, quitar el grupo fosfato y

formar el monofosfato, la 8-oxoguanina, aunque siga
oxidada, al no ser ya trifosfato, no puede ser incorporada
al ADN. Con lo cual, la DNA polimerasa no la puede coger
como molde y así se evita su incorporación.

DESPURINACIONES:
Imaginemos que tenemos la doble cadena de la figura, y ocurre una rotura hidrolítica que provoca una
despurinación, es decir, la pérdida de una purina (una G o una A), que es lo más frecuente (mucho más
frecuente que perder pirimidinas). Estas bases (en este caso, una G) pueden perderse si se rompe el enlace
glucosídico que une el 1'-C de la desoxirribosa y la posición número 9 del anillo de la purina, dejando un sitio
apurínico en una cadena del ADN.
Los genetistas estiman que diariamente se forman miles de estas lesiones espontáneas en el ADN de las

Pero, si los sitios apurínicos no se reparan y tiene lugar la siguiente ronda de replicación del ADN:

la C de la cadena normal apareará de nuevo con una G, ya que no ha sufrido ningún cambio.
pero enfrente de la hebra con el sitio apurínico, como no habrá ninguna base en esa posición que
actúe de molde, la DNA polimerasa colocará cualquier nucleótido al azar, con lo que existe la opción
de que se genere una mutación muy fácilmente.

DESAMINACIONES: es la pérdida de un grupo amino de una base.

En el proceso de desaminación, un grupo amino de la A o de la C se convierte en un grupo ceto. En estos

casos:

la citosina se convierte en uracilo

la adenina en hipoxantina

El efecto más importante es que, en algunas bases, las desaminaciones alteran las propiedades de
emparejamiento durante la replicación del ADN, como, por ejemplo:

a) N de su conversión en uracilo, que se

empareja con la A, el par G = C original se convertirá en un par A = U y, tras otro ciclo de replicación,
en un par A = T.
b) Cuando se desamina la adenina, el par A = T original se convierte en un par G = C debido a que la
hipoxantina se empareja de manera natural con la citosina. La desaminación se puede producir de
manera espontánea o como resultado de un tratamiento con mutágenos químicos como el ácido
nitroso (HNO2).

o Transiciones GC > AT:

Por ejemplo, si ocurre una desaminación de la citosina, se genera

uracilo en el ARN, que es una base que generalmente no forma
parte del ADN, pero que se podría generar en el ADN si es a causa
de una desaminación de la C (mutaciones).

Otra de las bases que es susceptible de sufrir una desaminación es

cuando la citosina está modificada epigenéticamente mediante una
metilación en la posición 5, generándose así la 5-metilcitosina, que
puede sufrir también una desaminación, dando lugar a una timina (difícil
de detectar esta alteración), que sí es una base que forma parte del ADN.
Si partimos de un par GC y se produce una desaminacion:

-metilcitosina para dar timina..... haciendo el esquema de

cualquiera de las 2 modificaciones, veremos que se generan transiciones en el ADN, pasando del par original
GC al par AT.

A nivel de ADN, las transversiones deberían ser mucho más frecuentes que las transiciones, ya que existen
el doble de transversiones posibles respecto a el nº de posibles transversiones. Sin embargo, ya vimos que
cuando se analiza la tasa de mutación de los organismos esto no es así. Y a continuación tenemos un
ejemplo:

o Hot-spots (puntos calientes de mutación) coinciden con 5-metilcitosinas:

Este es un experimento que se llevó

a cabo para analizar las mutaciones
que tienen lugar en el gen LacI de E.
coli, que es un gen forma parte del
operón lactosa, que da lugar al
represor y que se expresa
constitutivamente. En el
experimento se dejó crecer E. coli a
un tiempo final, pero partiendo de
distintas alícuotas y se dejó que
mutara espontáneamente.

Luego, tras crecer el cultivo, se analizaron las mutaciones que había acumulado. Y se vio que se acumulaban
en torno a 50 mutaciones espontáneamente y que la mayoría de ellas tenían lugar en los puntos en los que
el gen LacI está metilado en 5-metilcitosina (4 barras marcadas con *), generándose así las mutaciones de
transición del par GC al par AT. Con lo cual, esos 4 puntos son lo que se denomina en genética puntos
calientes, ya que son muy susceptibles a ser mutados espontáneamente. Luego, las desaminaciones de las 5-
metilcitosinas son puntos calientes que favorecen las transiciones. Mientras que los otros puntos (barras
pequeñas) reflejan mutaciones (desaminaciones) que ocurrían en las C.

PREVENCIÓN: ¿qué mecanismos tiene la célula para prevenir esa oxidación?

La siguiente figura representa el principal sistema de defensa enzimático que tienen todas las células
aeróbicas. Es muy importante para prevenir y neutralizar esos radicales de las ROS que se generan en las
mitocondrias, y está formado por 4 enzimas principalmente:

o la superóxido dismutasa (SOD).

o la catalasa (CAT).
o la glutatión peroxidasa (GPx).
o la glutatión reductasa (GR).

Es un sistema que sobre todo se encarga de dar protección, ya que lo que hacen es eliminar los radicales
superóxidos e hidroxilos que se generan, convirtiéndolos en especies mucho menos reactivas.

Por ejemplo, la SOD cataliza la dismutación entre el radical superóxido, convirtiéndolo en peróxido de
hidrógeno, que no es tan dañino pero que, aun así, parece ser que se convierte rápidamente en un radical
hidroxilo que sí que es muy reactivo. Este OH- es neutralizado por la GPx, que va a usar como sustrato al
tripéptido glutatión (GSH), formado por glutamina, glicina y cisteína, cogiéndole 2 moléculas para así donar
o tener -H que neutralicen esos radicales hidroxilo libres, y generar moléculas de H2O que no son reactivas.
Para ello, se cogen 2 moléculas de
glutatión, se forma un puente disulfuro
entre ellas, y se forma el glutatión oxidado
(GSSG), dando lugar así a los -H para
neutralizar los radicales libres y generar
agua. Este sistema se recupera gracias la
enzima GR, que con su poder reductor
genera de nuevo las 2 moléculas de
glutatión libres (se retroalimentan). Por
otro lado, la CAT se encarga de convertir
también el peróxido de hidrógeno en agua.

1. Dieta rica en antioxidantes:

Otras de las cosas que sabemos que ayuda en la

prevención son sin duda los componentes
antioxidantes que tomamos a través de nuestra
dieta. La siguiente figura es una representación
gráfica de la interacción entre el genoma
mitocondrial y el metabolismo llevado a cabo en
las mitocondrias, que genera esas ROS que pueden
generar oxidación también en el genoma
mitocondrial.

2. Enzimas específicas:

Este es otro sistema que se conoce que tenemos para prevenir las bases que se nos han oxidado. Para ello,
se ha descubierto que tenemos también la enzima O6-Metil-guanina DNA-metil transferasa, que es una
enzima capaz de revertir la modificación química de la base.

En la siguiente figura vemos a la O6-metil-guanina, oxidada como consecuencia de las ROS. Lo que ocurre es
que la metil transferasa recorre el ADN y cuando encuentra esa guanina con el grupo oxidado, rompe el
enlace entre el grupo metilo (-CH3) y la G, quedando el grupo metilo covalentemente unido al grupo
sulfhidrilo de la enzima, de manera que la enzima queda inactivada. Pero ha logrado quitar el grupo metilo
de la G, revirtíendola a su situación normal.

a la oxidación de la base 6 de la G, ya que

es la que es capaz de reconocer al recorrer el ADN. Y si hay demasiadas ROS, el sistema puede verse
saturado, puesto que no es una verdadera enzima, ya que una vez quita el grupo metilo, éste se queda unido
covalentemente a su centro activo y la enzima se inactiva, por lo que no puede seguir quitando otros grupos
metilo. Tendrían que venir nuevas enzimas.

Mutagénica, si no es reparada
aparea con T y genera transición:
GC > AT
La enzima no es catalítica, luego
el sistema se satura.
Existen sistemas de reparación del ADN independientes de la luz en todos los procariotas y eucariontes, que
son los de reparación por escisión, de los cuales hay 2 tipos:
la reparación por escisión de bases (BER), que es la que vamos a estudiar a continuación!!!
la reparación por escisión de nucleótidos (NER), que veremos más adelante!!

ESCISÓN ESPECÍFICA DE BASE (BER; reparación por escisión de bases):

Este es el mecanismo que mejor se encarga de la reparación de bases modificadas levemente por:
o desaminaciones espontáneas.
o oxidaciones de las bases (8-oxo-guanina)
o sitios abásicos, etc.
Fundamento:
1. Se reconoce la base alterada y es eliminada por una glucosilasa específica:
2.
8-Oxo-guanina DNA glucosilasa (OGG1), que reconoce específicamente a la 8-oxoguanina.
uracil-DNA glucosilasa (UNG), que reconoce la presencia de uracilo en el ADN, una base que
de manera normal no se encontraría en el ADN.
timina-DNA glucosilasa (TDG), que reconoce cuando la T está mal apareada con una G como
consecuencia de una tautomería, siendo capaz de eliminar a la timina del par GT.

3. La glucosilasa correspondiente (sea cual sea) rompe el enlace glucosídico entre el azúcar y la base,
dejando un sitio abásico (apirimidínico o apurínico).
4. Entonces, el azúcar abásico es eliminado.
5. Finalmente, una ADN polimerasa añade el nuevo nucleótido y la ligasa sella.
El primer paso de la ruta BER en E. coli implica el reconocimiento de la base alterada por la enzima ADN
glicosilasa: existen varias ADN glicosilasas, cada una de las cuales reconoce una base específica.

Las ADN glicosilasas primero cortan el enlace glucosídico que hay entre la base y el azúcar creando un sitio
apirimidínico o apurínico. Una enzima denominada endonucleasa AP reconoce el azúcar que no tiene su
correspondiente base. Entonces, la endonucleasa AP hace un corte en el esqueleto fosfodiéster en el sitio
apirimidínico o apurínico, eliminando así el azúcar dexosirribosa. Y el hueco es rellenado por la ADN
polimerasa y la ADN ligasa.
Aunque hemos aprendido mucho acerca de los mecanismos BER en E. coli, los sistemas BER se han detectado también
en los eucariotas, desde la levadura a la especie humana. Las pruebas experimentales muestran que las células tanto de
ratón como de seres humanos que son defectuosas en lo que respecta a la actividad BER, son también hipersensibles a
los efectos letales de los rayos gamma y de los agentes oxidantes.

(1) BER long-patch pathway: ruta larga

El primer paso es que actúa una glucosilasa específica del daño. Y en la figura inferior, por ejemplo, tenemos
representado que en el ADN se ha generado un uracilo como consecuencia de la desaminación de la citosina,
que normalmente no se encuentra en el ADN y que, por lo tanto, va a ser reconocido por la uracil-DNA
glucosilasa (UNG), que va a romper el enlace glucosídico entre el C1 del azúcar y la base. De esta manera, el
azúcar sigue existiendo, pero la base alterada ya ha sido eliminada.
Entonces, si la célula escoge la ruta larga, a continuación, actuará una
endonucleasa, la endonucleasa 1 de sitio abásico (APE1), que puede ser
tanto un sitio apurínico como uno apirimidínico. Por lo tanto, la
endonucleasa va a venir y hacer un corte hacia el extremo 5´ del sitio
abásico, dejando un grupo -OH libre en el extremo 3´.

Este -OH va a ser reconocido por la y comenzarán a

sintetizar el nuevo nucleótido, es decir, el correcto, y seguirán
sintetizando unos cuantos nucleótidos más, ya que la polimerasa puede
desplazar a ese fragmento que tiene delante, formándose como

reconocida por la flat endonucleasa (FEN1).

A continuación, la FEN1 corta y elimina todo ese extremo saliente donde

está contenida esa pentosa (azúcar) que ya no tiene el nucleótido y unos
4 nucleótidos más. Y, finalmente, la ligasa 1 se encarga de sellar.

Por lo tanto, se dice que es la ruta larga porque no sólo se coloca el

nucleótido que estaba dañado y ahora se coloca enfrente de la cadena
molde el correcto, sino que se colocan varios más.

(2) BER short-patch pathway: ruta corta

Esta es la ruta corta porque a diferencia de la larga, aquí sólo se va a poner el nucleótido que estaba dañado.
Es decir, sólo se va a eliminar el nucleótido dañado y, dependiendo de la cadena molde, se colocará el
nucleótido correcto. Dentro de las rutas cortas, hay 2 posibles opciones, y se seguirá una u otra
dependiendo del tipo de glucosilasa que haga el corte:

Opción 1:

En esta 1ª opción, la glucosilasa es la misma que la del ejemplo anterior, la uracil-DNA glucosilasa
(UNG), que rompe el enlace glucosídico entre el azúcar y el uracilo.

Luego viene la endonucleasa APE1 y hace un corte, dejando un sitio abásico y el extremo 3´-OH libre.
 Por lo tanto, si actúa esta glucosilasa, también cabe la posibilidad de que la célula siga esta ruta corta de
reparación, pero si sigue esta vía corta, al contrario que en la larga, a continuación no vendrá la ADN
ne otra ADN polimerasa que es la que más se utiliza en los sistemas de

Entonces, la reconoce
ese extremo -OH que se había generado, se
engancha y coloca justo enfrente de la base
de la cadena molde la citosina, que es la
base que le correspondía. Pero no sigue
sintetizando nucleótidos de más, como
ocurre en la ruta larga.

A continuación, hay que romper y eliminar

esa desoxirribosa 5´-fosfato (5´-dRP) que
se ha quedado para que pueda
establecerse el enlace entre este
nucleótido y el que acaba de incorporar

rotura también la lleva a cabo la ADN

, ya que también tiene
actividad desoxirribosa fosfatasa que
elimina el fosfato unido a el azúcar.

Ahora sí, la citosina recién incorporada por

la ADN polimerasa puede sellarse con el
grupo fosfato del siguiente nucleótido, que
lo hace la DNA ligasa III.

Opción 2:

La otra opción posible dentro de la ruta de reparación corta

es si actúa una glucosilasa diferente. Por ejemplo, en el
ejemplo de las siguientes figuras actúa una glucosilasa que
reconoce específicamente la timina glicol, la oxidación de la
timina, formando esos -OH al haberse atacado a los enlaces
de la timina.

Entonces, esta base oxidada, la timina glicol, que es una

base mutagénica (ya que puede dar lugar a incorporaciones
de bases erróneas en el ADN si este se replica), es
reconocida por una glucosilasa específica, que es la NTH1
DNA N-glucosilasa/ liasa, que es una glucosilasas con
actividad liasa, por lo que hace un corte distinto. La
actividad liasa ocurre en el extremo 3´ del sitio abásico.
.....¿?
Luego continúa el procedimiento igual que antes. Viene la
endonucleasa AP, que rompe en el enlace 5´, dejando un -OH libre.
Este -OH sirve
coloque la base adecuada, que sería la timina ya sin oxidar. Y,
finalmente, el sistema DNA ligasa III se encarga de sellar el enlace
fosfodiéster.

Por lo tanto, en las rutas cortas siempre va a actuar la DNA

, y se coge la opción 1 o la 2 dependiendo de la
glucosilasa que actúe:

1) La opción corta 1 si actúa la glucosilasa normal sin actividad

liasa.
2) La opción corta 2 si la glucosilasa tiene además actividad liasa.

Además, en la ruta larga actúa la ligasa 1, mientras que en todas las rutas cortas actúa la ligasa III unida al
sistema XRCC1.

MUTACIONES INDUCIDAS

En contraste con las mutaciones espontáneas, las mutaciones que se producen por la influencia de cualquier
factor o agente externo mutágeno, se consideran mutaciones inducidas, y pueden ser el resultado de:

o agentes naturales: por ejemplo, la mayoría de los organismos están expuestos a fuentes de energía
como las radiaciones cósmicas, las provenientes de minerales y la radiación ultravioleta del Sol, que
pueden ser factores que provoquen mutaciones inducidas.
o agentes artificiales: como, por ejemplo, los rayos X o el tabaco.

Ejemplo:

Radiaciones: luz ultravioleta.

Uno de los efectos que se conoce bien, en el ADN, es que origina fotodímeros entre pirimidinas adyacentes
y, fundamentalmente, se observa cuando hay 2 timinas adyacentes en la misma cadena. También ocurre
entre 2 citosinas y entre una C y una T, pero las que se forman con más facilidad en presencia de radiación
UV son entre 2 timinas.

Esto supone un problema porque

puede hacer que la ADN polimerasa se
quede atascada y no pueda replicar el
ADN cuando está en contacto con la luz
UV.

Además, sabemos que las bases

absorben bien la luz UV, ya que, entre
otras cosas, la luz UV se usa en los
laboratorios para medir
concentraciones de ADN en un
espectrofotómetro, por ejemplo.
¿Cómo se pueden reparar estos fotodímeros entre piridinas? Puesto que
es un problema importante, ya que la polimerasa, al haber un dímero de
pirimidinas, puede atascarse y no pasar, por lo que el ADN no se replicaría.

Este sistema que tienen algunas plantas, bacterias, hongos, pero que los
humanos NO lo tenemos, es un sistema de reparación basado en la energía
de la luz normal (la del rango visible). El proceso es el siguiente:

(1) la luz UV incide, por ejemplo, en una

bacteria, y genera en una de las cadenas un
dímero de timina.
(2) pero las bacterias tienen una enzima
llamada enzima fotorreactivadora (PRE,
photoreactivation enzyme), que tiene
actividad fotoliasa, es decir, si nosotros
ponemos a E. coli en un cultivo, le damos luz
UV, se producen dímeros de T y luego la

enzima PRE utilizará la energía de los fotones

de esta luz normal para romper los enlaces
entre ambas T (se ven en la fig. de la siguiente
hoja), que conforman el denominado anillo
de ciclobutano, dejando nuevamente las T
normal. No elimina ninguna base, sino que las
revierte a su condición normal.

ste sistema sólo existe en bacterias y eucariotas inferiores.

Sistema de reparación por escisión de nucleótidos (NER):

Pero nosotros también estamos expuestos a la luz UV, sobre todo en la piel, por lo que también debemos
tener un mecanismo que se encargue de reparar el sistema. Este sistema lo tenemos tanto los humanos,
como las bacterias y eucariotas inferiores.

La particularidad de este sistema es que actúa ante la aparición de grandes distorsiones de la doble cadena
de ADN:

- Como las causadas por los dímeros de timina que genera la luz UV.
- Otra de las cosas que detecta muy bien este sistema es el grupo químico (el de la imagen) que proviene
del ¿ganapo?, que tiene ciertos componentes tóxicos y potencialmente mutagénicos, ya que estas
grandes moléculas químicas generan grandes distorsiones en el ADN que este sistema puede detectar
fácilmente.

Este sistema puede actuar en 2 lugares del genoma: tanto en regiones del genoma que no se estén
transcribiendo como en regiones que sí se estén transcribiendo. Ambos mecanismos convergen al final, pero
comienzan de maneras distintas.
Este es el mecanismo que tiene lugar en regiones del genoma que NO se estén transcribiendo (GC-NER):

Como siempre, hay un fallo y alguna proteína que se encarga de detectarlo, actuando como andamio para la
colocación o el reclutamiento de multitud de otros elementos.

El primer compuesto que detecta fallos en el sistema NER es el XPC, que detecta los dímeros de pirimidinas
y, como siempre, recluta a otros elementos, como a XPA. Y XPC y XPA, juntos, ayudan a que se abra aún más
la doble hélice.

XPA, a su vez, recluta al factor TF2H, que está formada por 2 subunidades, XPB y XPD, y es un factor de inicio
de la transcripción, concretamente el H que, en su conjunto, tiene actividad helicasa. Y favorece también
que se abra la doble cadena.

Otro de los componentes reclutado es la proteína RPA, que es específica del ADN monocatenario, de manera
que, una vez que se abre la cadena, evita que se vuelvan a reasociar las 2 hebras, al igual que hace en este
sistema.

Los factores XPG y XPF, que tienen actividad endonucleasa y cortan ambos extremos de la horquilla,
eliminando así todo el complejo junto con la hebra del ADN que contiene el error. Entonces la cargadora de
la abrazadera (RFC) pone la abrazadera (PCNA) en el extremo 3´ y viene ya, o bien la pol

Restableciéndose así la doble hélice. Se llama sistema NER, de Nucleótidos, porque elimina una gran región
de nucleótidos, incluyendo la alteración o mutación que pueda estar dañando al ADN, mientras que el
sistema BER es específico de la base.

En cuanto al mecanismo del sistema NER en regiones del

genoma que SÍ se están transcribiendo (TC-NER):

La RNA polimerasa no es capaz de transcribir una región

en la que hay dímeros de timina o esos productos
químicos generados por el tabaco, etc. por lo que se para.
Esa parada de la RNA polimerasa, como siempre, va a
atraer a determinados componentes. Entre ellos, las 2
subunidades propias que se necesitan en el inicio, XPB y
XPD. Con lo cual, se activa nuevamente todo el sistema
para abrir aún más la horquilla gracias a la actividad
helicasa. Además, se atrae también a los factores CSA y
CSB, que se unen al sistema para formar todo el scaffold o
el andamio sobre el que se van a unir XPG.

También XPF que, al igual que en el caso anterior, son los

que van a cortar los extremos de la horquilla para así
eliminar todo el fragmento de ADN que contiene la base
alterada. El resto del mecanismo transcurre exactamente
igual que en las regiones en las que no hay transcripción.
Viene el RFC, coloca la abrazadera (PCNA), la polimerasa
sintetiza y la ligasa sella.

De esta manera, dentro de las siglas NER del sistema, está específicamente el GC-NER, que hace referencia a
la vía de reparación del genoma cuando no hay transcripción, y el TC-NER, que se refiere a la vía de
reparación acoplada a la transcripción.
Muchos de los nombres de los componentes mencionados anteriormente que intervienen en el sistema NER
(XPC, XPA, XPB, XPDXPG, XPF) vienen de la enfermedad, la xerodermia pigmentosa, en la que se
descubrieron estos genes y la importancia de este mecanismo de reparación para la viabilidad de las células.
Se pueden ver los efectos de esta enfermedad claramente en la piel de los que la padecen, tanto en edades
tempranas como adultas.

- A .
- Riesgo muy alto de cáncer de piel antes de los 20-30 años.

Por otro lado, en el caso del mecanismo de reparación asociado a la

transcripción, no da lugar a la xerodermia pigmentosa, sino al
síndrome de Cockayne, con unas patologías asociadas mucho más
duras, y del cual vienen las siglas de los genes que dan lugar a los
factores CSA y CSB.

- Fotosensibilidad.
- Estatura pequeña.
- Progeria (envejecimiento prematuro).
- Retraso en el crecimiento.

Todo esto era respecto a radiaciones que nos provocan dímeros de timina o cuando nos fumamos un
cigarro, que añade esas moléculas químicas enormes en las bases, pero hay muchos más agentes
mutagénicos con los que convivimos.

Hay 2 mecanismos que se encargan de reparar las dobles roturas del ADN:

i. recombinación homóloga (HR)

ii. unión de extremos no homólogos (NHEJ)

Reparación de dobles roturas: Recombinación Homóloga (HR)

Este mecanismo utiliza gran parte de la maquinaria de la célula para la recombinación normal.

En la recombinación homóloga, la meiosis es fundamental para la generación de la diversidad de los

gametos. Pero también, el proceso de recombinación homóloga puede ser utilizado por los mecanismos de
reparación para reparar las dobles roturas. Obviamente, este proceso de recombinación sólo es posible si la
rotura se produce después de haberse replicado, cuando la célula ya dispone de las cromátidas hermanas
(S, G2). En la fase G1, antes de que el ADN se replique, no puede actuar este mecanismo.

Este es un mecanismo enormemente complicado del que algunas cosas se conocen, pero muchas otras no.
Lo que sí se sabe es que cuando se produce la doble rotura, hay un sistema, el MRN, que se encarga de
reconocer y de sentir esa doble rotura en el ADN, sobre la cual se va a colocar y va a activar una cascada de
señalización que, como siempre, va a atraer a una serie de factores. Entre ellos, BRCA1, que es uno de los
genes que se sabe que está involucrado en el cáncer de mama, y juega un papel muy importante en la doble
rotura.
BRCA1 viene, a su vez, con otra enzima, la CtIP, que atrae a
otra exonucleasa, y lo que hacen es degradar o
.
Es decir, van a degradar una región importante del ADN,
dejando así una región igual de grande de una sola cadena
libre.

Rápidamente, la monocadena atraerá a la proteína RPA,

que es la proteína que se encarga de unirse a las
monocadenas para evitar la reasociación de las mismas.

Luego, se atrae a otro complejo enorme que está

formada por varias proteínas, como BRCA2 (que
también está implicado en el cáncer de mama), la
proteína RAD51, que está depositada sobre BRC2, y la
proteína PALB2, que también forma complejo con
BRCA2. Entonces, cuando se une todo este complejo, lo
que ocurrirá es que va a actuar RAD51, que es muy
importante, ya que se va a colocar en los
nucleofilamentos, es decir, en los extremos 3´ libres, y
va a buscar complementariedad de bases con el
cromosoma homólogo (en lila).

Luego, una vez se establece esa complementariedad de

bases, pueden venir ya las polimerasas normales y
polimerizar la nueva cadena, cogiendo ya como molde
la cadena normal del cromosoma homólogo.

Reparación de dobles roturas: unión de extremos no homólogos (NHEJ).

Este es el otro sistema que no queda otro remedio que usar cuando las células no están dividiéndose, es
decir, que no se encuentran ni en la fase S ni en la G2, por lo que no puede usarse el mecanismo de
reparación por recombinación homóloga (HR). Por lo tanto, este mecanismo es el llevado a cabo cuando la
célula se encuentra en la fase G1, en la que no existe aún una cromátida homóloga.

Muy brevemente, lo que ocurre en este proceso es lo siguiente: La doble rotura va a atraer a un
heterodímero, Ku70/80, que rápidamente se va a colocar en los extremos de la rotura en el ADN.

Esto, como siempre, va a servir de andamio para que venga otro complejo distinto, que es el formado por
una DNA protein kinasa (DNA-PKcs), que cuando se une al DNA, activa su actividad quinasa y, además,
activa también a otras exonucleasas que no aparecen representadas en esta figura.
Lo que hacen estas quinasas y
exonucleasas es pulir los
extremos, dejándolos romos
para que ambos estén a la
misma altura y con la misma
longitud para que luego puedan
ser sellados por un sistema
formado por la ligasa IV, que se
encarga de unir los 2 extremos,
sellando así la doble rotura
inicial que podría haber dado
lugar a inversiones,
translocaciones, deleciones, etc.

se eliminan bases (deleción), y otras veces se añaden bases (inserción) por otras polimerasas para que

secuencias originales que había, por lo que es frecuente que se produzcan inserciones o deleciones. Si
ocurren en regiones del ADN que no son importantes al no codificar nada ni tener secuencias reguladores,
no pasaría nada, pero si, por el contrario, ocurriese en regiones importantes, esto podría tener
consecuencias negativas para la célula.

RESPUESTA SOS:
Este sistema no actúa hasta que:

- El daño es elevado.
- O bien si previo a la replicación, ningún sistema de reparación ha podido corregir el error.

Por ejemplo, en condiciones normales, un dímero de T habría sido reparado por el sistema BER. Pero, si por
alguna razón el dímero de T se ha quedado sin reparar, la polimerasa no puede pasar, por lo que quedaría el
resto de la cadena de ADN sin replicar, dando lugar a mutaciones importantes.

Por lo tanto, en ese caso, cuando el ADN se está replicando y

se localiza un error (ej. un dímero de T) que no ha sido
reparado por ningún otro mecanismo, actuaría el sistema de
respuesta SOS, que no es un sistema de reparación como tal,

cadena pueda seguir replicándose y las células hijas puedan

recibir la misma cantidad de información que las parentales.

ror
en la cadena de ADN. Por ello, lo hacen unas polimerasas especiales, que son las polimerasas
translesionales, y en la siguiente tabla se muestran algunos de los genes que codifican para dichas
polimerasas.

S an las lesiones, siendo capaces de polimerizar incluso por donde

hay errores. Por lo tanto, las polimerasas translesionales,

¡¡¡La célula utiliza esta respuesta como último recurso pues el sistema es en sí una fuente de mutagénesis!!!
¿Y cómo se activa este sistema?

región del error, no es capaz de continuar y se atasca.

Esta parada provoca que se ubiquitine (marca Ub) la abrazadera (PCNA, Antígeno Nuclear de Proliferación
Celular), lo cual hace de señal para que entonces vengan determinadas proteínas y, entre ellas, las
polimerasas translesionales.

La marca de ubiquitina habrá hecho que la polimerasa

disocia del ADN, pasando a ocupar su lugar alguna de las

polimerasas translesionales.

Entonces, la polimerasa translesional, carente de

actividad correctora, coloca enfrente de, por ejemplo, un
dímero de T, 2 bases al azar. Por eso se dice que el
propio sistema es propenso a la mutagénesis, ya que
coloca 2 bases al azar.

Generalmente, si viene la ADN polimerasa k (Kappa), que

es una de las que se ha visto que suele encargarse de
sintetizar y hacer un bypass en la región en la que hay
dímeros de T, lo que suele hacer es colocar dos A
enfrente, por lo que se mantendría la secuencia original.
Pero si hubiese un dímero de C y colocara igualmente dos
A, sí tendría lugar una mutación.

Además, estas polimerasas translesionales son muy

malas replicando, ya que a la hora de sintetizar hacen
muy poquitas síntesis y, además, colocan bases
independientes del molde y enseguida se sueltan.

Con lo cual, vuelve el sistema replicativ

ADN.

DNA REPAIR MECHANISMS:

Esta imagen resume muy bien todos los
mecanismos que pueden provocar
daños en el ADN, todos los tipos de
daños que se producen en el ADN y
todos los mecanismos de reparación
que pueden llevarse a cabo al respecto.