Universidad Nacional Experimental

“Francisco de Miranda”
Dpto. Estudios Morfofuncionales
Ciencias de la Salud
Medicina
U.C. Microbiología II

Prof. Ricardo Alonso Silva MSc.

Coordinador U.C. Microbiología II
 Movilidad Flagelos

Disposición Esporas
espacial bacterianas
Morfología Cápsulas
M.O. Procariota
Observación un
paso muy
Importante
Tamaño 0,2-5.0um
Existen 2 BACTERIAS
métodos para la
observación de
M.O.

Estado Estado
viviente fijo Observables solo
al microscopio
Prof. Ricardo Alonso Silva/Tomado de: Guía Práctica de Microbiología II, 2006
 Estado Viviente Estado Fijo

Observar las Bact. en edo. vivo. Índice de refracción

de las Bact. es similar a los medios de
Estudia su morfología. suspensión acuosa.

Particularmente su movilidad. Las células bacterianas no se ven con

facilidad a menos que estén teñidas.
Índice de refracción y medio de
suspensión.  M.O. ya no están vivos ( ).

 Bact. observadas con dificultad. Se emplean diferentes tipos de

colorantes

Montajes para edo. Viviente En bacteriología se clasifican

Colorantes Colorantes
Montaje Gota naturales artificiales
húmedo colgante
Extraídos de Básicos Neutros
Animales o Plantas Ácidos
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 Azul de metileno.
BASICOS Con afinidad por el núcleo Violeta de genciana.
Safranina.

Ácidos Con afinidad por el citoplasma Eosina.

Ácido pícrico

Eosinato de
Neutros Con afinidad por el núcleo-citoplasma azul de metileno

En bacteriología se recurre con mayor frecuencia a los colorantes básicos

Tiñen bien las bacterias (núcleo y RNA difundido en todo el cuerpo bact).

Mordientes = coloración más rápida/intensa y duradera

Coloración (+) = colorante penetra y se Coloración (-) = colorante no penetra,
combina con los componentes celulares (fuera de la célula)
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 Coloración (+)

Se usa un solo colorante. Se basa en diferenciar la composición química

de algunas estructuras de la célula bact.
Las bacterias toman el color del colorante.
Se emplean dos colorantes (primario y
De utilidad cuando se requiere determinar secundario).
presencia de bacterias en una muestra.
Las mas empleadas son: Gram, Alcohol-Ácido-
Determina morfología y disposición espacial. Resistente y la de Esporas.

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La siembra se M.O. no están
hace con dos aislados en la Aislamiento u obtención
objetivos naturaleza de un cultivo puro

Para aislarla es necesario

sembrarla en un medio de
Separar gérmenes cultivo
A. Aislamiento presentes en muestra o
producto contaminado

Trasladar una especie

B. Repique o bacteriana de un
pase medio a otro (obtener
cultivo puro) Desarrollo-multiplicación
Técnica más Clasificación Identificación
empleada (estría Evitar contaminación del material
# de bact. por los M.O. del ambiente
o agotamiento)
en muestra

Prof. Ricardo Alonso Silva/Tomado de: Guía Práctica de Microbiología II, 2006
 Inhibir el desarrollo de aquellas que
no son de interés.

Selección de medios apropiados

Nutrientes básicos para el Caldo nutritivo (infusión de carne y

1. Medios BÁSICOS
desarrollo microbiano petona (2%) y 0,5% NaCl)

2. Medios ESPECIALES

2.1. Enriquecidos o
2.2. Electivos
mejorados

Líquidos o sólidos con aumento de

propiedades nutritivas agregando Exclusivo para algunas cepas bacterianas
sustancias albuminoides, Todd Hewit = S. pyogenes.
carbohidratos o vitaminas
 2. Medios ESPECIALES

Contienen sustancias que inhiben o retardan crecimiento

2.3. Selectivos
de flora bacteriana asociada (Patógenos que interesan aislar)

Wilson-Blair/Salmonella-Shiguella/Salt manitol
S. aureus

2.4. Medios Son siempre medios líquidos, utilizado cuando la especie bacteriana
enriquecimiento Crece lentamente o con dificultad. Tetrationato/Agua peptonada alcalina

2.5. Medios
diferenciales o Contiene indicador de pH (cambia de color las colonias o el medio)
diferenciadores Agar MacConkey y Levine, diferencia colonias lactofermentadoras
 2. Medios ESPECIALES

Medios de constitución y formula química

2.6. Químicos o
bien definida (Medio Sauton
sintéticos para el Bacilo tuberculoso)

2.7.Conservación y Garantizan la supervivencia de la

Transporte especie patógena
Cary-Blair, Stuart y Amies

Conservación de cepas bacterianas

2.7. Conservación
en colección
 IDENTIFICACION DE
ESPECIES

Determina incluso Ubicacion de una

subespecie bact. en
o serotipos genro/especie

Toda identificación bacteriana involucra

Pruebas secundarias
Obtención de un
(especie)
Cultivo puro.

Frotis teñido (forma, Pruebas primarias

disposición espacial) (género, grupos)

Características nutricionales
(fotoautótrofos, fotoheterótrofos,
Quimioautótrofos, quimioheterótrofos)
 Antisueros Cuando las pruebas
Bioquímicas no son concluyentes

Los antígenos bacterianos pueden ser

Antígenos O Correspondiente al (LPS) de la M.E. de la pared cel. en Bact. G(-)

Antígenos H De naturaleza proteíca, presente en bacterias flagelares

(flagelar)

Externos en relación al antígenos O, algunos son polisacaridos

Antígenos K (E. coli, Klebsiella).
 Objetivos

1. Frente a cultivo bacteriano:

• Realizar un examen al fresco entre lamina y laminilla.

• Realizar un extendido frente al procedimiento indicado.

2. Realizar coloración simple frente a extendidos

preparados a partir de un cultivo solido.

3. Coloracion de Gram.

4. Observaciones al microscopio.
 1. Realizar un examen al fresco entre lamina y
laminilla

Con pipeta Pasteur, colocar Observar crecimiento Encender mechero

gota de agua en la lamina Bacteriano

Abrir medio de cultivo frente al mechero

De manera suave tomar
Tomar asa de siembra y esterilizarla en muestra bacteriana y
la llama del mechero colocarla en la lamina
Dejar que se enfrie el asa, y proceder a la porta-objeto
apertura del medio de cultivo
2 Preparación del extendido (coloración
Simple)

3 Coloracion del Gram

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Ciencias de la Salud
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U.C. Microbiología II

Prof. Ricardo Alonso Silva MSc.

Coordinador U.C. Microbiología II
 I. OBSERVACION Y COMPLETACION DE LOS
RESULTADOS

CALDO PLASMA CITRATO

LACTOSADO

CALDO TSI
GLUCOSADO

MEDIO OF AGAR SIM

AGAR SIMON’S
CITRATO
 PRUEBA DEL ROJO DE METILO

1. 2.
RM V/P

PIPETA ESTERIL Viértalo

(2,5mL de Añada gotas de CAMBIO DE
en tubo de
cultivo) indicador RM COLOR
ensayo estéril

Añadir 0,5mL Slcn Esperar minutos

TUBO CON (mL)
A y Slcn B de y observar
RESTANTES
Barritt’s (agite) cambios
 PRODUCCION DE INDOL

Dejar reposar
10-12 GOTAS Sobre la unos minutos y
DEL REACTIVO superficie del observar
DE KOVAC’S Agar SIM (Agitar) cambios
 PRUEBA DE LA CATALASA

TOMAR AGREGAR
MUESTRA DEL COLOCAR SOBRE PEROXIDO DE
CULTIVO UNA LAMINA P.O. HIDROGENO
 INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

FERMENTACION DE LOS
CARBOHIDRATOS

Los medios empleados

consisten de C.N.; 1%
de azúcar, 0,01gr de
azul de bromotimol

Importancia biomédica esencial para

el desarrollo vital de organismos
Si el medio mantiene su color original Glucosa como fuente de energía
no hubo crecimiento bacteriano
Si el medio se pone azul = crecimiento
Lactosa utilizada por enterobacterias
sin fermentación. pH neutro a alcalino con producción de acido y gas en
Presencia de sales biliares.
Amarillo= prueba positiva para el azúcar
Evaluado.
amarillo + Producción de gas = medio
Acido + para el azúcar mas
Producción de gas en el medio
 INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

OXIDACION- Medio agar con peptona y azul

FERMENTACION (OF) de bromotimol

Determinar si un organismo tiene

metabolismo oxidativo, Frente a un carbohidrato
fermentativo o inactivo

Bacterias anaerobias Fermentan el carbohidrato

Bacterias Facultativas Pueden fermentarlo o degradarlo oxidativamente

Bacterias Aerobias estrictas Solo pueden oxidarlos

Proceso químico en el cual el O2 se usa para producir energía

Metabolismo oxidativo
Esto a partir de carbohidratos.
La mayoría de los organismos anaerobios utilizan
Metabolismo fermentativo
la fermentación para obtener energía química
O/F INTERPRETACION
+/+ Degradación fermentativa
(Anaerobio facultativo)
+/- Degradación oxidativa. (Aerobio)
-/+ Degradación fermentativa
(anaerobia estricta)
-/- No degrada el azúcar evaluado
(inactiva frente al carbohidrato)
 INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

ROJO DE METILO (RM)

Prueba que determina los productos

finales del metabolismo de la glucosa

E. Coli
FERMENTACION llevada a cabo por Proteus spp.
Miembros de la familia Enterobacteriacea Salmonella
Shiguella

En esta via se forman: acido acético, láctico,

Succinct y formic
(LAS BACT. CON ESTA FERMENTACION SON +)

Dentro de este grupo hay bact. los ácidos en productos alcalinos:

ACETOINA O ACETIL-METILCARBINOL
 ROJO METILO Y VOGES
PROSKAUER
RELACIONADOS?

Una bacteria produce ácidos o acetoína

Produce ácidos al queda rojo cuando Formación de un anillo color rojo-anaranjado

se agrega RM (+)
(+)
Si cambia de color no produce Verde cobrizo (-)
Ácidos (-) La RX ocurre en presencia de O2
 CITRATO

Citrato de sodio como única fuente de carbono

Azul de bromotimol (indicador de pH)

Prueba bastante útil en la

Bacterias que no metabolicen no crecen
identificación de Enterobacterias.
 PRODUCCION DE
SULFURO DE
HIDROGENO

Géneros bacterianos capaces de producir TSI y SIM

Sulfuro de hidrogeno (medios útiles para detectarlo)

H2S (producción) se observa como un precipitado negro

Precipitado negro = producción de H2S a

partir de los aminoácidos sulfurados que
reaccionan con el sulfato de hierro.
Bacterias producen sulfuro de hierro.
 PRODUCCION DE INDOL

Indol presente en el medio

Las bact. que presente enzima triptofanasa. Sintetizada por Bact. del
Escinde la molécula de trip. en piruvato y NH4 grupo entérico

Cuando se añade reactivo Kovac’s

anillo rojo indica que el indol esta
presente

Rx entre el indol y el
P-aminobenzaldehido

Capa de color verde o amarilla si el

Indol esta ausente.
 TSI

Tres azucares
Indicador Rojo de fenol
(glucosa, lactosa y sacarosa)

Adicionalmente contiene sulfato de hierro

Producción de sulfuro de hidrogeno

Bacterias que metabolicen glucosa = AMARILLO

No es posible diferenciar la fermentación LAC/SA

Bisel rojo/taco amarillo= Fermentación de la GLU

 TSI

Tres azucares
Indicador Rojo de fenol
(glucosa, lactosa y sacarosa)

Adicionalmente contiene sulfato de hierro

Producción de sulfuro de hidrogeno

Bisel rojo/taco rojo= No hubo fermentación de

ninguno de los (3) azucares.

Y que pasa en aquellos casos donde el bisel es rojo

y el fondo es negro???
 PRUEBA DE LA
CATALASA

El H2O se produce cuando la bact. utiliza el azúcar

por la vía oxidativa

Compuesto muy oxidante, las bact. lo eliminan mediante la producción

de la enzima CATALASA.
 PRUEBA DE LA
COAGULASA

Se utiliza para diferenciar a S. aureus (capacidad coagulante del plasma)

de S. epidermidis.
 PRUEBA DE LA
MOTILIDAD

Agar SIM

Si el crecimiento se extiende hacia las paredes del tubo y

hacia la superficie del medio indica motilidad (+)
 PRUEBA DE LA DNAsa

En el medio la tripteína es la fuente de El ácido desoxirribonucleico (ADN), se encuentra en

nitrógeno, aminoácidos, y aporta los nutrientes grado altamente polimerizado, y es el sustrato de la
necesarios para el adecuado desarrollo enzima desoxirribonucleasa (DNAsa), la cual lo
bacteriano. hidroliza.

Medio de cultivo utilizado para la detección de

enzimas desoxirribonucleasas.
 Usar sus teléfonos celulares
http://www.microrao.com/entero_ident.htm
Colocar Basic identification
Indole test +
Methy Red test +
Voges Proskauer Test -
Citrate -
Hydrogen Sulphide -
Urea hydrolysis +
Phenylalanine deaminase -
Lysine +
Ornithine +
Arginine -
Motility +
Gas From glucose +
Lactose fermentation +
Sucrose fermentation +
Mannitol unknown
ONPG test unknown