Precipitación

Generalidades
 Es una operación convencional en la purificación de
proteínas y ácidos nucleicos.
 La precipitación para bioprocesos se basa en la
conversión selectiva de un componente específico
disuelto en una mezcla compleja, hacia una forma
insoluble usando métodos físicos o físico-químicos.
 La forma insoluble se obtiene como un precipitado
(generalmente fácilmente sedimentable) y se separa de
la mezcla por una técnica de separación sólido-líquido
(por ejemplo la centrifugación, la filtración).

Muestra Sobrenadante

Precipitado + Campo gravitacional

sobrenadante
Agente precipitante Precipitado
Precipitación: método simple y
directo
Principales usos:
 Obtención de un producto insoluble por
reacción con un agente precipitante.
Ejemplo: adición de sales de sodio y potasio
a una solución de penicilina.
 Precipitación por adición de solvente.
Ejemplo: precipitación de dextrana usando
acetona o etanol.
Objetivos

• Precipitación de un producto deseado.

• Precipitación de un producto no deseado

y retención del deseado en la solución.
Precipitación de proteínas
 La precipitación de proteínas es un método
común usado en la llamada precipitación
fraccionada para la separación de proteínas.
 En proteínas solubles la mayoría de los
grupos hidrofílicos (aminoácidos) están en la
superficie expuestos al solvente.
 Mientras, los centros hidrofóbicos están en el
interior de la molécula.
Factores usados para la precipitación
 Enfriamiento
 Ajuste de pH
 Adición de solventes como acetona y etanol
 Adición de sales no caotrópicas como el
sulfato de amonio y el de sodio. (Ayudan a
estabilizar la proteína)
 Adición de sales caotrópicas como la urea y
el hidrocloruro de guanidina. (Precipitan por
desnaturalización de la proteína)
 Adición de reactivos bioespecíficos como en
la inmunoprecipitación.
 En la estructura de la proteína están
presentes múltiples grupos ácido-base.
 Estos grupos determinan que la solubilidad
sea función de la concentración de sales
disueltas, de la polaridad del solvente, del pH
y de la temperatura.
 La solubilidad varía de una proteína a otra.
Algunas precipitan en condiciones que son
ideales para otras.
 Este efecto se utiliza para la separación de
proteínas.
 La solubilidad depende de T
 ¿Cuál de las dos proteínas es más sensible a los cambios
de T?
 La solubilidad de A es más sensible a la disminución de T.
 Puede precipitarse A disminuyendo T hasta un valor en que
la solubilidad de A se aleje de la de B
 No se usa solo pues no hay la fuerza directora suficiente
 Solubilidad en soluciones de (NH4)2SO4
S y S’ la solubilidad en la solución y en agua pura
1
Recordar que fuerza iónica es: I 
2
 c i Z i2
Solubilidad en carboxihemoglobina en el punto isoeléctrico
 0,02 mol/L

0,01 mol/L

0,005 mol/L
0,001 mol/L

Solubilidad de β- lactoglobulina en función del pH

Solubilidad mínima en el punto isoeléctrico
La precipitación usando aditivos se rige por el criterio de
equilibrio de fases:
µi (sólida) = µi (líquida)
Cuando un soluto se precipita desde una solución, el
precipitado es prácticamente soluto y su potencial químico
es constante a una T.
El potencial químico del componente en solución es función
de su concentración.
µi (líq) = µi (líq)o + RT ln(x)

Donde x es la fracción molar

µi (líq)o potencial químico del soluto en el estado estándar,
que puede aumentarse añadiendo sustancias como sales y
solventes.
En presencia de esos aditivos la concentración de soluto es
menor para mantener la igualdad de potenciales químicos.
Esta disminución de concentración se realiza por la
Precipitación de proteínas
 El agua está ligada como una capa de
hidratación y actúa como una barrera
estabilizadora impidiendo la formación de
agregados en condiciones normales.
 La purificación de la proteína es causada por
la alteración de la capa de hidratación y
depende de la concentración de la proteína
deseada y de la concentración total de
proteínas.
Precipitación de proteínas
 Las condiciones de operación deben
controlarse estrictamente (pH, temperatura,
fuerza iónica, composición)
 También el tamaño del precipitado formado y
su distribución son importantes,
especialmente si la precipitación va seguida
de una operación de separación sólido-
líquido.
Precipitación por cambio de pH

 Ajustando el pH a valores ácidos, las

proteínas indeseadas pueden precipitar.

 Ejemplo: Ajustar la lisis celular del Bacillus

stearothermophilus en tampón de fosfato de
potasio 50 mmol/L a pH 5,1 remueve el 70%
de proteínas indeseadas.
Precipitación por cambio de pH
 La solubilidad de las proteínas presenta un mínimo
cerca del punto isoeléctrico (pI).
 Como las proteínas no tiene carga al pI, las fuerzas
de repulsión electrostáticas entre las moléculas de
soluto son mínimas.
 Si pH > pI, las fuerzas electrostáticas que
promueven la agregación y precipitación aumentan.
 Para soluciones con moderadas concentraciones de
sal, la solubilidad es función del pH con un mínimo
en el pI de la proteína y la solubilidad aumenta a
mayores pH.
Si queremos separar las dos proteínas y se trabaja en el PIA
Cuando A está precipitado B está en solución.
Si se trabaja a PIB cuando A disuelto B está precipitado.
Por la poca fuerza directora se usa en combinación con otro
método por ejemplo con adición de sales.
Precipitación por cambio de pH
 Como las proteínas difieren en el contenido
de aminoácidos en su estructura, el pI difiere
de una a otra. Esto es fundamental para la
precipitación isoeléctrica.
 En este procedimiento el pH de la proteína
se ajusta al pI de la proteína a aislar. Su
solubilidad disminuye.
 La precipitación isoeléctrica y la precipitación
con sales se combinan y la proteína se
precipita por sales cerca de su pI.
 La precipitación isoeléctrica sugiere que la
precipitación fraccionada puede ser usada
para separar proteínas de diferentes pIs.
Valores de pI para diferentes proteínas

Pepsina <1,0
Albúmina sérica 4,9
Insulina 5,4
γ-globulina 6,6
Colágeno 6,6
Hemoglobina 7,1
Lisozima 11,0
Salmina 12,1
Precipitación por cambio de pH
 El método tiene como limitación, que cambios de
pH pueden desnaturalizar algunas proteínas
disueltas.
 El pI depende del número de grupos ácidos y
básicos en la proteína
 Carboxílicos libre (ácido aspártico y glutámico)
 Grupos alcalinos (histidina, arginina y lisina)

 Los extractos de bacterias contienen proteínas

principalmente cargadas negativamente (proteína
ácida)
 60 % tiene pI para pH 5-6
 80 % tiene pI para pH 4,5-6,7
Precipitación con sales
 Es el método más importante en la
precipitación selectiva.
 La precipitación de la proteína ocurre por
adición de una alta concentración de sales al
medio.
 ¿Cómo opera?
 A bajas concentraciones de sal al aumentar la
conc aumenta la solubilidad de la proteína.
“Salting in” (efecto salino)
 A altas concentraciones de sal al aumentar la
conc disminuye la solubilidad de la proteína.
“Salting out” (desalado)
 Es posible separar A de B ajustando la
concentración de sulfato de amonio hacia la
zona de la derecha del gráfico de modo que B
se pueda precipitar mientras A permanece en
solución.
Esta capa de agua se remueve
cuando hay mucha sal y la
solubilidad disminuye
Precipitación por adición
de sales (salting out)
 Cuando la concentración de sal es alta la
solubilidad de la proteína disminuye porque:
 los iones de la sal añadida y los solutos
disueltos compiten por las moléculas para
solvatarse.
 Cuando la concentración es alta el número
de iones solvatados es alto y el solvente es
insuficiente para solvatar otros solutos.
Precipitación por adición
de sales (salting out)
 Cuando la fuerza iónica es baja la solubilidad
aumenta con la concentración de sal ya que:
 los contraiones cubren fácilmente las cargas
iónicas de las moléculas de proteína a
medida que la concentración de sal aumenta
 y la atracción al solvente es menor.
 Termodinámicamente la actividad del
solvente disminuye.

 Las interacciones soluto - soluto son

mayores que las soluto - solvente y la
proteína precipita.
Precipitación con sales
(resumen)
 La adición de sal causa la deshidratación de la
proteína (por la competencia) e incrementa el efecto
hidrofóbico en la solución.
 La adición de sal promueve la agregación de
proteínas por asociación de las superficies
hidrofóbicas.
 La precipitación de proteínas a alta fuerza iónica
sigue la relación ln S = β - k I. Ecuación de Cohn.
 S: solubilidad g/L; I: fuerza iónica; β depende de la
proteína, pH y temperatura; k depende de la
proteína y la sal.
 Como la fuerza iónica es proporcional a la
concentración es posible plantear:
 ln S = β – k’ c (otra forma de la ecuación de
Cohn)
 Donde c es la concentración de la sal.
 k’ depende de la sal y la proteína pero no de
T o pH.
 β es el ln de la solubilidad teórica de la
proteína en agua libre de sales. Depende de
la proteína, T y pH.
 Válida solamente en la región del “salting
out.”
La solubilidad de la proteína
es el resultado de:
 Interacción polar con el solvente acuoso
 Interacción iónica con las sales presentes en
el medio.
 Fuerza electrostática entre moléculas
cargadas (atracción y repulsión)
 Aniones: PO43-, SO42-, CH3COO-, Cl-, Br-,
NO3-, ClO3-
 Cationes: NH4+, K+, Na+, guanidina
Sales más usadas
 La sal más usada es el sulfato de amonio.
 El sulfato de amonio (y el de sodio) expone los
grupos hidrofóbicos de las proteínas al remover
la capa de agua altamente estructurada que los
cubre en solución.
 Como resultado los residuos hidrofóbicos
pueden interactuar con otros, lo que lleva a
agregación y precipitación.
 Es la más efectiva para aumentar las
interacciones hidrofóbicas proteína- proteína.
 Tiene alta solubilidad (~ 4 mol/L solución
saturada).
 Tiene bajo calor de solución y por esta razón
cuando la sal se disuelve la T cambia poco.
 La solubilidad de la sal cambia poco con T
 La separación de la proteína de la solución se
realiza por centrifugación por lo que importa la
viscosidad del solvente y diferencia de
densidades entre el solvente y el precipitado.
 El sulfato de amonio puede contener trazas de
metales pesados (Fe). Pueden ser peligrosos
para algunas proteínas sensibles como las
enzimas. Se recomienda el uso de agentes
acomplejantes de los metales como el EDTA.
Algunos aspectos prácticos:
 El precipitado puede recogerse por
centrifugación a 8 000 – 10 000 g

 Cuando se resuspende con un mínimo de

tampón, el sulfato de amonio puede
removerse por gel filtración (desalinización) o
aplicarse directamente a una matriz de
interacción hidrofóbica.
Problema
Se usa sulfato de amonio para precipitar un anticuerpo
monoclonal humanizado desde 10 L de medio de cultivo . La
concentración inicial del anticuerpo en el líquido es 0,5
mg/mL. Se añade la sal de modo que la concentración
quede 1,5 kmol/m3 .El resultado de la precipitación es 90 %
de anticuerpo.
Cuando la concentración de sal se aumenta a 1,75 kmol/m3
un 76,5 % del anticuerpo remanente precipita. Prediga la
concentración de sal requerida para la precipitación total del
anticuerpo. ¿Cuál es la solubilidad del anticuerpo en medio
libre de sal?
 La concentración de anticuerpo luego de la
primera adición de sal es:
 (0,5 -0,5 X 90/100)=0,05 mg/mL = 3,2 x 10-7
kmol/m3
 MM Sulfato de amonio= 158 kg/mol
 Después de la segunda adición:
 (0,05-0,05X0,765) =0,0118 mg/mL=7,44x10-8
kmol/m3
ln S = β – k’ c
ln(3,2 x l0-7) = β - k’ x l ,5
ln(7,58 x l0-8) = β - k’ x l ,75
 k’ = 5,8 m3/kmol
 ln(3,2 x l0-7) = β – 5,8 x l ,5
 b=-6,25

 Para precipitación total se asume que S es casi 0.

Considerando un valor 10-12 (Si se pone 0 se indefine la
expresión)
 ln(l0-12) = -6,25 – 5,8 x c
 c= 3,7 kmol/m3

 Como β = ln (solubilidad) la solubilidad del anticuerpo

es anti ln (-6,26) =0,00191 kmol/m3 = 296 kg/m3
Las sales caotrópicas
 Actúan por disrupción intramolecular de los
puentes de hidrógeno y de las interacciones
hidrofóbicas en las proteínas.
 No se usan en fraccionamiento pero sí en el
“refolding” de la proteína, particularmente en
el procesamiento de cuerpos de inclusión.
 Se usan en la purificación de ADN y ARN ya
que precipitan las proteínas pero dejan los
ácidos nucleicos sin afectación.
Inmunoprecipitación

 Se logra con el reconocimiento del par

antígeno- anticuerpo y el enlace.
 Cuando antígenos multivalentes reaccionan
con anticuerpos en solución forman
enrejados moleculares.
 Los largos complejos que se forman
eventualmente precipitan y se llaman
precipitinas, las que se pueden retirar por
separación sólido- líquido.
Precipitación con solvente orgánicos
 El principal efecto de esta precipitación es reducir la
actividad del agua disminuyendo la constante
dieléctrica del medio en que están presentes las
macromoléculas.
 El agua se sustituye por el solvente orgánico y la
constante dieléctrica del medio disminuye debido a
la baja constante dieléctrica del solvente. Solventes
más comunes: acetona y etanol.
 Las proteínas pierden estabilidad en presencia de
solventes orgánicos, dado el debilitamiento de las
fuerzas hidrofóbicas causado por la menor polaridad
del solvente.
 Disminuyendo la temperatura por debajo de
0ºC, los puentes de hidrógeno y las fuerzas
electrostáticas son suficientes para impedir la
desnaturalización.
 La ecuación que gobierna es:
Donde
S Solubilidad de la proteína en el medio
Sw Solubilidad de la proteína en agua
e Constante dieléctrica del medio
ew Constante dieléctrica del agua

Por ejemplo: e del agua a 25ºC 78,3; del etanol 24,3.

Término negativo de donde S< Sw

Algunas variables a controlar

 Temperatura: Cerca de 0°C para evitar la

desnaturalización de la proteína. Los
solventes orgánicos disminuyen el punto de
congelación de la solución.
 Fuerza iónica (sal): Ni alta ni baja (0,05 –0,2
mol/L). A alto valor la agregación
electrostática se dificulta, se requiere más
solvente orgánico y es más probable la
desnaturalización. A bajo valor el precipitado
es muy fino y se dificulta la sedimentación.
 Algunas variables a controlar
 Concentración de proteína: 5 – 30 mg/mL
 Concentración del solvente orgánico: La
mayoría de las enzimas precipitan con acetona
en el intervalo 20-50 %. Con las moléculas
largas el grado de desnaturalización de la
proteína es mayor. O sea el butanol
desnaturaliza más que el etanol. Esto es
porque hay más probabilidades de presentar un
área superficial cargada para unirse a la
proteína
 pH: Las proteínas son más solubles lejos del pI.
 Un ejemplo de precipitación por solvente
orgánico es la purificación de las proteínas
del plasma humano.
 Una serie de pasos de precipitación con
etanol a diferentes concentraciones de etanol
y T y pH de la solución diferentes permiten
obtener la serie de productos albúmina, IgG,
plasminógeno, lipoproteínas y protrombinas.
Precipitación por cambio de solvente
 El fraccionamiento por solventes orgánicos
puede ser un excelente tratamiento inicial.
 Puede usarse para concentrar y purificar una
enzima.
 Antes del fraccionamiento con solvente
orgánico hay que remover el sulfato de
amonio u otra sal en exceso y previo a un
fraccionamiento salino hay que remover el
solvente orgánico.
 Diálisis, gel filtración o calentamiento (por
ejemplo para eliminar acetona) pueden ser
utilizados en esta remoción.
Problema
 La solubilidad de la albúmina en agua a
25ºC es 390 kg/m3. Cuando 30 mL de
etanol se añaden a una solución de
albúmina en agua de 50 mg/mL, el 33 %
de la proteína precipita. ¿Cuánta proteína
precipitaría si 100 mL de etanol se
añadieran a 100 mL de una solución
similar de proteína a la misma
temperatura?
La constante dieléctrica del agua a 25ºC es
78,3 y la del etanol puro es 24,3.

Si se asume que la constante dieléctrica varía

linealmente con la concentración, la mezcla
de 30 mL de etanol y 100 mL de solución
acuosa tendría una constante dieléctrica de
65,8. (regla aditiva)

La constante dieléctrica de la mezcla de 100

mL de etanol y 100 mL de solución será 51,3.
 Cuando el 33 % de albúmina precipitó, precipitaron
(0,33 X 50 mg/mL = 16,5 mg / mL
o sea quedaron 33,5 mg/mL mg/mL.

 ln (33,5/390) = A/RT (78,3 -1 – 65,8 -1 ) Condición 1

 ln (S/390) = A/RT (78,3 -1 – 51,3 -1 ) Condición 2
 Simultaneando S= 0,204 mg/mL
 Precipitó: 50-0,204= 49,8 mg/mL (99,6 %)
Polímeros orgánicos
 La función del polímero orgánico es la misma
que la del solvente orgánico. Puede
precipitar proteínas sin desnaturalización.

 Polietilenglicol (PEG) es el más usado

MM: 6 000 - 20 000 (polímero de alta masa
molar, neutro y soluble en agua)
Polímeros orgánicos
 Protamina: Una proteína de enlace del ADN
de la esperma. La adición de una solución
neutra de sulfato de protamina al extracto
precipita los complejos de ADN y ARN.
 Polietilenimina: Un polímero sintético
cargado positivamente que interactúa con los
ácidos nucleicos y causa la precipitación de
proteínas de núcleo-proteínas. Tiene un
efecto similar a la anterior lo que requiere
muy pequeñas dosis. (0,1% peso)
Polímeros orgánicos
 Fáciles de manipular. No tóxicos, baratos
 Requieren relativamente baja concentración para
precipitar la mayor parte de las proteínas ( 25 %).
 Las soluciones son muy viscosas. La viscosidad
puede causar problemas con la remoción.
 La dilución con un tampón y la aplicación a una
columna de intercambio iónico puede remover el
polímero.
Cómo se forma el precipitado
 Dependiente del tiempo
 Formación de pequeñas partículas por
agregados macromoleculares
 Consta de:
 Mezclado
 Nucleación
 Crecimiento gobernado por la difusión
 Crecimiento gobernado por la convección
 El proceso comienza con la mezcla
homogénea de componentes que
intervienen en la operación. Por ejemplo:
macromoléculas, solvente y agente
precipitante.
 El mezclado no es instantáneo.
 Tiempo necesario para el mezclado:
  =( le2 / 4D)
 Donde
  = tiempo de mezclado (s)
 le = longitud media de onda (m)
 D = difusividad (m2/s)

La distancia media de onda depende de volumen

del sistema, densidad, viscosidad del medio y
potencia de mezclado.
 Nucleación se forma en zonas de
sobresaturación producto de un mezclado
inadecuado.
 Una sobresaturación controlada conduce a
precipitados amorfos fácilmente filtrables y
centrifugables.
 La deposición de más moléculas sobre los
núcleos de precipitado ocurre por difusión.
 La velocidad de formación de partículas de
tamaño dado responde a una cinética de
segundo orden:
 dn/dt= -kn2 donde
 n = número de partículas de un tamaño dado
 k = constante de velocidad específica que
depende de la difusividad y diámetro de la
molécula
 Siguen creciendo y chocan entre ellas
formándose partículas mayores gobernando la
convección.
 dn/dt= -fn2 donde
 φ = constante de velocidad específica que
depende diámetro de la partícula, viscosidad
densidad del medio, volumen y potencia
Operación a escala producción
 Una vez seleccionado el agente precipitante, puede
pasarse al diseño a gran escala del proceso.
 Tipo de reactor, condiciones de operación (flujo
concentración, etc) y consideraciones para el escalado.
 Los tres tipos básicos de reactores usados son: por lote,
continuo en tanque agitado y tubular. El primero en
probarse es el por lote.
 El proceso se inicia añadiendo lentamente el agente
precipitante a la solución de proteína que está siendo
mezclada, hasta alcanzar la sobresaturación deseada
de la proteína a precipitar.
 En este punto empieza la nucleación y la precipitación
continua a través de las etapas de crecimiento y
aglomeración.
Operación a escala producción
 El mezclado continua hasta completar la
precipitación.
 El parámetro clave en el escalado es el
mezclado. Se recomienda similitud geométrica,
y potencia por unidad de volumen constante.
 Cuando el precipitado es susceptible de
fracturarse al crecer, P/V no es recomendable.
Ejemplos de uso combinado Purificación de
lipopolisacárido de Neisseria meningitidis

 Se colectó el sobrenadante de ultracentrifugación.

 Se precipitó con etanol al 80% (m/v) y se conservó a -
20 ºC durante toda la noche.
 Se centrifugó a 4,000 g durante 30 min para colectar el
precipitado y conservarlo a -20 ºC.
 Se resuspendió a 4 ºC con agitación, en tampón fosfato
de sodio 40 mmol/L, EDTA 5 mmol/L, pH 7, a una
relación de 3 mL de tampón por cada gramo de
precipitado.
 Se realizó la extracción de las proteínas con fenol al
90% (v/v), previamente calentado entre 65-70 ºC y se
incubó a 6 ºC en un baño termostatado, durante 15 min,
con agitación.
 La emulsión se enfrió en baño de hielo y centrifugó a 10,000 g
durante 20 min, para colectar la fase acuosa superior.
 La interfase y parte de la fase fenólica se extrajeron con igual
volumen de agua.
 La solución acuosa de LPS recuperada, se precipitó con 10
volúmenes de etanol al 96% (m/v) a -20 ºC; el precipitado se
obtuvo mediante centrifugación a 4,000 g por 20 min.
 Se resuspendió el precipitado en agua destilada, se ajustó a
pH 7 y se trató con ribonucleasa A y desoxirribonuclea A ambas
a 50 g/mL, durante tres horas a 37 ºC.
 Se realizó una extracción con fenol frío al 90% (m/v) durante 15
min, se centrifugó a 10,000 g durante 30 min, se colectó la fase
acuosa y se dializó contra agua destilada hasta eliminar fenol.
 Se añadió solución de NaCl 5 mol/L y se precipitó con etanol al
96% (m/v). El precipitado de LPS se conservó a -20 ºC.
Purificación de Papiloma virus tipo 16 L1
Biotechnology and Bioprocess Engineering 17: 755-
763 (2012)

 Las células se mezclaron 1:1 con tampón de disrupción

(10 mmol/L fosfato de sodio pH 7,2; 150 mmol/L NaCl;
1,7 mmol/L EDTA; 0,01% Tween 80) y luego se
rompieron en un molino de bolas (perlas de vidrio). El
debris se removió por centrigugación a 12000 g for 15
min.
 La fracción soluble se precipitó con sulfato de amonio
45% saturado y el precipitado se recuperó por
centrifugación a 12000 g for 15 min.
Purificación de IgG
State-of-the-Art in Downstream Processing of Monoclonal
Antibodies: Process
Trends in Design and ValidationDOI 10.1002/btpr.1567
Published online June 26, 2012
 En los primeros desarrollos de la purificación
de IgG se usaba el fraccionamiento del
plasma (usando etanol para precipitar las
proteínas en su punto isoeléctrico) dada su
facilidad).
 La primera formulación intravenosa para IgG
(IVIg) se introdujo en EEUU en 1980s . El
proceso tradicional era el A.
 El B muestra el proceso de purificación del la
IgG recombinante,
 PEG Precipitation: A Powerful Tool for
Monoclonal Antibody Purification

 Los procesos de precipitación se pueden separar en:

precipitación de impurezas y precipitación de productos.
 La precipitación de impurezas es más simple pero
puede arrastrar precipitados hacia las operaciones
subsiguientes.
 La precipitación de producto tiene alto riesgo de dañar la
molécula y requiere del uso de tampón de intercambio y
resolubilización.
 Se desarrolló una precipitación con PEG de un AcM
(IgG1, pI = 8,3, 150 kDa) producido en una línea celular
PER.C6 M y se optimizó la remoción de células de
hospedero (HCP)
 Luego de precipitación se pasa a filtrado y lavado.
 Las condiciones ensayadas para precipitar
el AcM fueron MM del PEG, concentración
del PEG y pH.
 Los precipitados se recogieron por
centrifugación a 1000 g y luego se
redisolvieron en tampón salino fosfatado
(PBS).
 La concentración de PEG fue el factor dominante en el
recobrado y la pureza del AcM redisuelto.
 La precipitación con PEG 3350 fue el de mayor
recobrado, pero a expensas de mayor HCP en el AcM
redisuelto.
 Los agregados formados no fueron significativos para
ningún caso.
 La mayor reducción de HCP con el PRG 6000 fue a
expensas de la reducción de rendimiento.
 La condición final seleccionada fue 14 % (w/v) de PEG
3350 y pH 8,5.
PEG 3350