Reporte 2 Técnicas básicas para el cultivo de microorganismos: siembra y estudio de bacterias
- 1. CENTRO DE BACHILLERATO TECNOLÓ GICO INDUSTRIAL Y DE SERVICIOS. N.128 Practica 2.Técnicas básicas para el cultivo de microorganismos: siembra y estudio de bacterias Sub-módulo 3. Ejecuta técnicas de identificación de Microorganismos con base a las normas. Integrantes. Barrón Arredondo Evelin, Batres Arias Viviana, Bernal Loera Alejandro, Cabral Román Brandon Said, Cardona Adriana Fernanda, Cervantes de la Cruz Ángel, Chávez Castorena Edna Paola, Chávez Ortega Miriam Vanessa, Chavira Teresa. Facilitadora: Ing. Acosta Bezada Jessica Alicia. Microbiología. Se puede definir, sobre la base de su etimología, como la ciencia que trata de los seres vivos muy pequeños, concretamente de aquellos cuyo tamaño se encuentra por debajo del poder resolutivo del ojo humano. Introducción: El medio de cultivo, es la forma por la cual, a base de un estilo de gel, en este caso, el agar, que cuenta con nutrientes ya establecido y necesario que permiten, en condiciones favorables de pH y temperatura; el crecimiento de Virus, Microorganismos, células, tejidos vegetales e inclusive pequeñas plantas. Dependiendo de lo que se necesita, el medio debe de contener y favorecer ciertas condiciones específicas para cada tipo que se espera cultivar. Generalmente los agares se presentan de forma sólida y en ocasiones líquidos, sólidos y semisólidos. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. Antes de la observación de los medios de cultivo, es necesaria la práctica de las diferentes Tinciones para que sea identificado. Tinción de Gram; La tinción de este tipo más extensamente utilizada es la tinción de Gram, denominada así por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram, quien la desarrollo. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram positivas y gramnegativos. Deben destacarse dos aspectos cruciales de la tinción de Gram: 1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento de yodo. El Yodo por sí solo tiene poca afinidad con las células. 2) La decoloración debe realizarse con poco agua para evitar que pierdan la Tinción las células Gram positivas. El proceso de decoloración debe ser corto y
- 2. Es esencial un cálculo preciso del tiempo para obtener resultados Satisfactorios. Finalmente, el carácter de Gram positivo no es siempre un fenómeno del todo o Nada. Algunos organismos son más Gram positivos que otros y algunos son Gram variables, es decir, unas veces Gram positivos y otras gramnegativos. La Tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio Bacteriológico. Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aquí con cierto detalle la tinción de Gram. Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En este estado todas las células, tanto las gramnegativos como las Gram positivas, están teñidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo (I2) – yoduro potásico (KI). El ingrediente activo es aquí el yodo, el yoduro potásico simplemente hace soluble el yodo en agua. El yodo entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células Gram positivas como las gramnegativos se encuentran en la misma situación. Se lleva a cabo después de la decoloración, usando bien alcohol o bien acetona, sustancias en las que es soluble el complejo yodo – cristal violeta. Algunos organismos (Gram positivos) no se decoloran mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está, por lo tanto, en la resistencia a la decoloración. Después de la decoloración las células Gram positivas son todavía azules, pero las gramnegativos son incoloras. Para poner de manifiesto las células gramnegativos se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células gramnegativos son rojas mientras que las Gram positivas permanecen azules. Resumen. Lo que se realizó en la práctica fue; preparar los Medios de cultivo con una serie de indicaciones muy precisas ya que de esto dependían todas las técnicas y procesos que conlleva el medio de cultivo. Después de realizar el Medio, se vacío en 9 cajas Petri, que posteriormente se metieron a incubar. Luego se inoculo con heces fecales de perro y ayuda de un asa de platino. Se regresaron a la incubadora para después hacer la morfología de las colonias (contar). Por último se realizó la tinción de Gram en las bacterias esto sirvió para clasificarlas debido al color que mostraron en la tinción. Es de suma importancia destacar que los medios de cultivo permiten el crecimiento de los microorganismos y por lo que un control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la exactitud, confiabilidad de los resultados obtenidos. Abstract. What was done was in practice; preparation
- 3. of culture media with a series of very precise indications as this depended on all the techniques and processes involved in the culture medium. After making the Middle East, was empty on 9 Petri dishes, which were subsequently put to incubate. Then I was inoculated with fecal eses dog and help of a platinum loop. They were returned to the incubator and then make the colony morphology (count). Finally Gram staining bacteria that served to classify because of the color showed staining was performed. It is important to emphasize that the culture media allow the growth of microorganisms and thus control in their manufacture, preparation, storage and use, as to the accuracy, reliability, and reliability of the result. Materiales y Métodos 9 Cajas Petri Portaobjetos Microscopio Cubreobjetos Gotero Asa 3 Mecheros 3 Mangueras 1 Bascula 1 Agitador 1 asa de platino Papel canela 1 Matraz de 500 ml Guante de asbesto Espátula Crisol Reactivos y muestras. H2O Heces fecales. Agar nutritivo. Cristal violeta. Iodo-lugol. Alcohol-cetona. Zafranina. Aceite de inmersión. Procedimiento: o Se pesa la capsula de porcelana para sumarle los correspondientes 9.2 gramos de Agar nutritivo que se tiene que agregar a la preparación del agar. o Una vez que se tiene la cantidad de agar deseada en la capsula, se vacía en un matraz que contiene 400 ml de agua. o Se conecta una manguera a la llave del gas y al mechero, se prende y se calienta el matraz que contiene el agar y el agua, agitándolo consecutivamente. o Una vez disuelto el agar se asegura que el agar quede tornado de un amarillo cristalino, cuando es así se espera a que se enfrié un poco. o Se arma un gorrito para el matraz de papel para esterilizar. o Dos días después los agares se cuajaron, se conectan los mecheros de Fitcher a las llaves de gas para montar la olla de presión. o Se incorpora en la olla aproximadamente un litro y medio de
- 4. agua y se metieron los agares de todos los equipos a baño María. o Se cerró la olla adecuadamente, se puso en la base y se prendieron los mecheros para comenzar el proceso de esterilización, a una temperatura de 127ºC y a una presión de 12-15. o Se sacaron las cajas Petri y los agares ya esterilizados. o Se prendieron 3 mecheros en forma de triángulo, a aproximadamente 18 cm de distancia cada uno, en ese espacio se vacío el agar en las cajas Petri, y se cerró la caja igual dentro del espacio. o Al día siguiente se colocaron los mecheros de igual manera, se prendieron y se empezaron a estriar los agares de EMB y nutritivo preparados por todo el grupo. o Se estrió cuatro veces dando cuatro giros a la caja tomando una muestra de hece fecal diluida con agua, con el asa ya esterilizada. o Una vez estriado el agar se cerró la caja rápidamente y se apartó. o Días después se armó de nuevo el triángulo de los mecheros y se prendieron para contar las colonias que se formaron en los agares e identificarlas de acuerdo a su morfología. o Luego se hizo el procedimiento para teñir las bacterias utilizando la técnica tinción de Gram y se observó su forma y color a 100x en el microscopio para identificar el tipo de bacteria que se obtuvo después del largo proceso. Resultados. Pudimos observar y diferenciar colonias y bacterias. (ANEXOS 1 y 2) Conclusiones. Barrón Arredondo Evelin. En la práctica pude observar muchas cosas nuevas, pues nunca había trabajado con medios de cultivo, con las asas, mucho menos realizar las tinciones. Como bien sabemos los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Por medio de esta práctica al investigar los requisitos y realizar la preparación de los medios de cultivo (Nutritivo y EMB), logramos elaboración satisfactoria de las mismos. Los M.C se usan mucho en las industrias, tanto agropecuarias y alimenticias como en la fabricación de quesos y yogurts. Al hacer la morfología de la colonia, nos dimos cuenta que es de suma importancia contar con precisión y mucha concentración, pues esto se basa principalmente en contar cada colonia y describir totalmente su morfología (como son sus bordes, margen, forma y color), ya que de esto depende saber cuántas y de qué tipo de colonias crecieron en el cultivo. También realizamos la morfología de la bacteria ya que es una de sus características
- 5. más importantes, estas características se tienen que identificar mediante el microscopio, para realizarlo utilizamos la famosa “tinción de Gram” específicamente, donde en el resultado teníamos que anotar de que bacteria se trataba con toda su descripción. Por ultimo también pusimos en práctica los métodos de envoltura de los materiales utilizados, para esterilizar en la olla a presión o autoclave, ya que al terminar la práctica todo lo utilizado se esterilizo para evitar dejar contaminados los materiales que seguiremos utilizando en las siguientes prácticas. En si todo lo que abarca los medios de cultivo es muy interesantes e importantes de alguna manera, pues se aprenden muchos métodos y de eso métodos técnicas, de las cuales podemos elegir en algunas ocasiones cual utilizar según sea el caso. Batres Arias Viviana. Mi conclusión en general, de todo lo que vimos en esta práctica es que debemos saber cómo esterilizar para que nuestros agares o cultivos no salgan con bacterias no deseadas y que también al momento de estriar lo debemos de hacer con mucho cuidado para no romper nuestro agar pero también rápido (no debemos hablar al momento de estriar, debemos de esterilizar bien la asa, lo debemos de mantener en el triángulo de seguridad que está formado con los mecheros y debemos mantener precaución con ellos). Es importante saber las formas, bordes y superficie de cada tipo colonia para poder identificarlas al momento de identificarlas para así no equivocarnos; también debemos a ser todo con precaución para no ocasionar accidentes y que todo salga bien ya que si no se hace según las instrucciones y con el cuidado necesario podríamos ocasionar todo lo que se quiere evitar y saldría mal la práctica. También es importante saber acomodar el microscopio ya que si no sabemos manejarlo no podremos ver nuestras bacterias Bernal Loera Alejandro. Por medio de esta práctica se logró utilizar las técnicas aprendidas a lo largo de prácticas pasadas. Se logró aprender a realizar algunos métodos que existen para cultivar bacterias desde las técnicas de vaciado, hasta la tinción de bacterias, de esa manera pudimos observar sus características que se ven a simple vista (macroscópicas) como microscópicas y la interpretación de las mismas, con lo que se observó de cada bacteria pudimos conocer la morfología que distingue de otras bacterias, por lo cual de esta manera se puede identificar el método de siembra correcta para análisis posteriores. Por ultimo fuera de la práctica aprendimos a respetar la vida microscópica. Cabral Román Brandon Said. Gracias a esta práctica podemos saber cómo cultivar las bacterias sin afectarnos respetando las normas de seguridad, saber aplicar las técnicas de vaciado para saber contar las colonias, borde, margen y color de cada una de las bacterias, y asi poder llevar
- 6. este tipo de prácticas con la atención y la calidad con las que se deben hacerse. Cardona Barboza Adriana Fernanda. Mi conclusión es que gracias a esta práctica que realizamos en el laboratorio (en mi caso investigaciones y observación de videos) donde comenzamos por saber envolver los materiales para esterilizar correctamente, en autoclave por medio de baño maría, también se pudo saber cómo funciona un medio de cultivo, y cual es una de las maneras adecuadas de preparar un medio, el cual debía estar esterilizado, para así poder inocular correctamente nuestros microorganismos sin contaminante alguno por medio de una asa, la cual también debía esterilizarse, e inocular por medio de un método de estriado en nuestro agar ya preparado . así como también es importante el saber contar las colonias que crecieron en nuestro medio de cultivo, y así como también aplicamos la técnica de tinción de Gram etc. En si todo esto es de suma importancia para nosotros poder obtener la muestra deseada y saber identificar que tipos de bacteria es, su tipo de tinción etc. Cervantes De la Cruz Ángel. Un medio de cultivo, es la base para dar paso al crecimiento de microorganismos y bacterias, cuando se realiza es necesario conocer los fundamentos antecesores acerca del manejo e información sobre los riesgos, que se dan cuando se trata sobre el cuidado de la vida. El manejarlos, y desarrollar mediante, las técnicas de estriado, se vuelve vital para lograr tener un éxito más práctico sobre lo que está puesto en cuestión. El triángulo de seguridad que provee la protección con el mechero, y guantes y cubre bocas, para evitar el contacto con las bacterias con las que se estaba tratando, (En este caso, la “E. Coli”). La morfología bacteriana y de colonia, es un trabajo que aunque lo bastante laborioso, toma una práctica que nos desarrolla habilidades especiales, fuera de las microbiológicas, entre ellas la paciencia, y un desarrollo más amplio de la vista y el análisis. En esta práctica nuevamente se tomó la esterilización como un medio de prevención para los objetos de cristal, y también para acabar con las bacterias ya establecidas: Correcta envoltura, y preciso manejo de la olla de presión/auto clave. Chávez Castorena Edna Paola Mi conclusión es que aprendimos a cómo hacer agares y que es trabajar con seres vivos y tener cuidado con ellos, aprendimos a como trabajar con medidas de seguridad y técnicas de estriado trabajamos con heces fecales de perro para poder hacer nuestro estriado supimos esterilizar y saber identificar nuestras bacterias si son Gram positivas o gramnegativos Chávez Ortega Miriam Vanessa
- 7. Por conclusión tengo que los agares son una parte muy importante y fundamental en microbiología ya que al momento del cultivo de agar nutritivo teníamos como objetivo la identificación de Gram positiva o ya sea Gram negativa comenzamos con la preparación para luego vaciar y colocar en la incubadora, y esperar un tiempo determinado, comenzar a estriar con heces fecales de un animal dentro de tres mecheros bunsen en forma de triángulo con una distancia aproximada de 18 cm terminando este proceso para concluir empezar a teñir y así la determinación las bacterias de Gram, aprendimos a trabajar con vida y las normas estrictas que se necesitaban para su supervivencia y las medidas de seguridad. Chavira Teresa Edith NO PRESENTO CONCLUSION. Discusión. Por medio de esta práctica aprendimos a utilizar los distintos medios de cultivo y sus diferentes nutrimentos y funciones ya que en algunos crecen determinadas bacterias impidiendo el crecimiento y desarrollo de otras, también utilizamos la incubadora para acelerar el crecimiento de bacterias deseadas las cuales las obtuvimos de heces fecales. Se llevaron a cabo anotaciones en cuadernos y bitácoras que fueron de la mano con la práctica conforme avanzábamos en ella. Por ultimo logramos cumplir el objetivo que fue detectar la morfología de colonias y bacterias al igual que aprender técnicas y métodos básicos para la preparación de medios de cultivo en los cuales se desarrollaron nuestras bacterias. Bibliografía APA: Villegas, Elci (2014) “Introducción a los Medios de Cultivo. Microbiología” (http://www.webdelprofesor.ula.ve/ nucleotrujillo/elciv/clases_microbiolo gia/unidad_1.pdf) Anexos. ANEXO 1 Forma Bacteria Portaobjetos 1 E. coli (bacilos rosa) y S.,aureus (cocos violeta) Portaobjetos 2 estreptococos
- 8. Portaobjetos 3 estreptococos Portaobjetos 4 Diplococos Portaobjetos 5 estreptococos COLONIA FORMA COLOR SUPERFICIE BORDE No nutritivo *1 irregular Amarillo, blanco plana ondulado 442 nutritivo *2 Irregular Amarillo pálido convexa rizado 39 Nutritivo *3 Umbilicada Amarillo Plana umbilicada Entero 290 EMB *1 Filamento Violeta naranja Elevada Entero 150 EMB *2 Irregular Morado Umbeliforme Rizado EMB *3 Filamentosa Rosa violeta Umbeliforme Entero 250 ANEXO 2