6. bases genéticas de la estructura de los anticuerpos

Bases Genéticas de la
estructura de los
anticuerpos

La respuesta inmune es supremamente
diversa. Células B y T presentan desde
1015 hasta 1018 especificidades antigénicas.
Los genes Ig y TCR usan una estrategia
particular para lograr una enorme
diversidad, utilizando centenares de
genes en lugar de millones.
Las regiones constantes y variables están
codificadas por diferentes genes. Muchos
genes de regiones variables (V) pueden
unirse a un único gen de la región
constante (C).

Tonegawa encontró que los genes de las
Igs se pueden mover y re-arreglar dentro
del genoma de una célula diferenciada.
El re-arreglo de los genes durante la
diferenciación coloca juntos un conjunto
apropiado de genes para las regiones V y
C.
El conjunto de genes re-arreglados luego
se transcribe y traduce en una cadena
completa H o L.

Davis demostró que se aplican muchos
de los mismos principios para la
generación de la diversidad de los genes
que codifican los TCR.
Al parecer los mecanismos genéticos
utilizados para generar receptores
antígeno-específicos sobre células B y T
son únicos.

Estructura y expresión genética de
genes
Organización y expresión de genes. Ver
figura.
1.El genoma de un individuo consiste de un
arreglo lineal de genes en las cadenas de
ADN en diversos cromosomas.
2.Cada célula diploide contiene el mismo
conjunto de genes. La única excepción
son los linfocitos, que difieren entre si y de
otros tipos de células en el contenido de
genes que codifican para su receptor

6. bases genéticas de la estructura de los anticuerpos

Las células difieren debido a que
expresan (transcriben y traducen)
diferentes genes.
3. La expresión de un patrón especifico de
genes determina la función celular. La
expresión genética se puede controlar a
diferentes niveles: actividad de factores
de transcripción, tasa de transcripción y
vida media del ARNm.
4. La mayoría de los genes que codifican
para una proteína tienen una estructura
característica que incluye axones e
intrones. Los exones posteriormente se
transcriben en ARNm maduro.

5. Transcrito primario de ARN consta de
axones e intrones. Posteriormente
enzimas especiales realizan “splicing”,
uniendo todos los exones requeridos
para codificar la proteína final.
Generalmente los exones codifican
para una región discreta de la proteína,
como, un dominio extracelular, región
transmembrana, o una cola
citoplasmática.

6. Genes que codifican una proteína que se
expresa sobre su superficie celular
presentan hacia el extremo 5’ de la región
codificadora una secuencia líder, que
codifica para un péptido señal de ~ 20 aa
de longitud, el cuál provee una región
hidrofóbica N-terminal utilizada para
transportar vía RE y AG hasta el lugar de
destino.

• La estructura de los genes de las Igs
difieren en varios aspectos respecto de
otros genes del genoma: varias cadenas
glucosiladas (cadenas H y L deben
ensamblarse y glucosilarse dentro de la
célula antes de alcanzar la superficie
celular), cada cadena IG tiene una cola
citoplasmática muy corta.

Eventos genéticos en la síntesis de las
cadenas de las Igs
Organización y re-arreglo de los genes de
las cadenas livianas
Los polipéptidos κ y λ consisten de dos
dominios principales VL y CL.
VL es una región N-terminal de ~ 108
residuos aa, codificada por dos segmentos
genéticos separados: un segmento
variable (V) que codifica por 95 residuos
del extremo N-terminal y un segmento
pequeño (J) “joining” que codifica por 13
residuos (96-108) del extremo C-terminal.

• Un gen V y uno J se unen en el genoma
para crear un gen único, que junto con el
gen de la región C, codifica por una
cadena L completa de Ig.
• Este mecanismo de re-arreglo genético
se conoce como recombinación V (D) J.
D, segmento involucrado en el re-arreglo
de cadenas H de las Igs.

Muchos de los pasos en este re-arreglo
genético parece son comunes tanto para
células B como para T.
La recombinasa V (D) J media el re-
arreglo para los genes receptores en
células B y T.
Este complejo enzimático se encuentra en
todas las células y esta involucrado en el
reparo de las cadenas de ADN.

¿Qué distingue a la de los linfocitos?
El producto de dos genes, RAG-1 y RAG-
2 (recombination-activating-genes),
expresados exclusivamente en linfocitos y
requeridos en los primeros estadios de
corte del ADN de Ig (y TCR).
Genes RAG son esenciales para el
desarrollo de células B y T.
“RAG knockout mice” son deficientes en
células B y T.

Síntesis de la cadena κ
El locus κ se encuentra sobre el
cromosoma 2.
El análisis genético ha demostrado que
en línea germinal de cualquier célula los
genes κ están arreglados así: ~ 40
diferentes genes Vk arreglados
linealmente y con su propia secuencia L y
separados por intrones, cada uno codifica
para los 95 aa de la región N-terminal de
la región variable k.

Corriente abajo se encuentran un conjunto
de 5 segmentos genéticos Jk, cada uno
codifica los 13 aa restantes de la región
C-terminal de la región variable k.
Un intrón largo separa al único segmento
codificador de la región constante de la
cadena k (Ck). Ver figura. Como se realiza
una cadena k.

Organización y re-arreglo de los genes
de las cadenas pesadas
Genes de las cadenas pesadas se
encuentran sobre el cromosoma 14.
Región variable esta construida de tres
segmentos genéticos (VH DH y JH ).
Segmento D “diversity” es adicional
respecto de las cadenas livianas.
Los segmentos D y J codifican por los aa
de la tercera región hipervariable o región
determinante de complementariedad
(CDR3).

Locus humano de la cadena pesada
comprende ~ 50 genes VH, ~ 20 segmentos
genéticos DH y 6 segmentos genéticos JH.
Presenta múltiples genes para la región C
de la cadena pesada de la Ig. La región C
determina la clase y por lo tanto la función
biológica del ac particular.
Cada gen C esta flanqueado por intrones
y esta separado de los genes V H por un
intrón largo. Ver figura.

Alternative (or Differential) Splicing
for IgM / IgD Synthesis

Célula temprana de la línea de
diferenciación del linfocito B sufre:
1. Selección de uno de los genes Vk y
unión a uno de los segmentos Jk.
¿Cómo? Parece al azar.
2. La unión es dirigida por secuencias de
reconocimiento, encontradas en los
extremos de estos genes.

1. Transcrito primario de ARN sufre splicing
para eliminar secuencias no
codificadoras y unir los exones Vk, Jk y
Ck.
2. ARNm maduro se traduce en la cadena
polipeptídica k en ribosomas sobre RE, y
luego se transportan, se elimina péptido
señal y cadena k queda libre para unirse
a cadena H y formar una molécula Ig.
Ver figura.

Síntesis de cadena λ
 Genes λ se encuentran sobre el
cromosoma 22. Es en principio similar a la
síntesis de las cadenas k, es decir:
involucra re-arreglo de ADN, unión de gen
V λ (codifica por la región N-terminal de la
región variable λ) con un segmento J λ
(codifica por los restantes 13 aa de la
región variable λ).
 Locus humano λ comprende ~ 40 genes V
λ y 4 genes J λ. (la región J λ contiene
también “pseudogenes”).

• Cada J λ esta asociado con un gen
diferente C λ, es decir hay tres tipos
diferentes de polipéptidos C λ en el
humano.
• Los genes C mas cerca de los de la
región V son “μ” y “δ”, que se transcriben
primero durante el desarrollo de células B.
• Utiliza el mismo mecanismo de re-arreglo
de las cadenas L. La unión de los
diferentes segmentos genéticos es
mediada por la recombinasa V(D)J.

• Deben ocurrir dos mecanismos de re-
arreglo durante la vida temprana de una
célula B particular: Unión de un segmento
D con un segmento J, Unión de un
segmento V a la unidad DJ, determinando
así la especificidad antigénica de la
cadena pesada.
• Además ADN re-arreglado se transcribe
junto con los genes “μ” y “δ” de la región
C.

• Transcrito primario puede sufrir dos
splicing alternativos para producir dos
tipos de ARNm, VDJ-”μ” o VDJ-” δ”.
• Traducción en RE puede generar dos
tipos de polipéptidos “μ” o “δ”.
• ¿Los polipéptidos “μ” y “δ” tienen la
misma especificidad antigénica?

Regulación de la expresión genética de
las Igs
- Una célula B produce una Ig de una única
especificidad antigénica.
- En teoría, podría producir dos tipos de
moléculas Ig una sola célula B por tener
dos juegos de cromosomas (diploide),?
- Las cadenas Ig (y TCRs) están
codificadas por únicamente un conjunto
de genes, bien sea materno o paterno. La
utilización de un solo cromosoma parental
se conoce como exclusión alélica.
¿Cómo explicar este fenómeno?

- Re-arreglo comienza en ambos
cromosomas, el primer re-arreglo exitoso
sobre un cromosoma inhibe de alguna
manera el re-arreglo sobre el otro
cromosoma.
- Para cadenas H, re-arreglo VDJ, y para
cadenas L, re-arreglo VJ primero para los
genes de la cadena k y luego para los de
la cadena Lambda.
- Que pasa si la célula no produce re-
arreglos de cadenas H y L? No produce
receptores Ig y muere por apoptósis.

Cambio de clase o isotipo
Los re-arreglos VJ (cadena liviana) y
VDJ (cadena pesada) ocurren en
ausencia de antígenos en estadios
tempranos de diferenciación de células
B. Si embargo, durante la vida de una
célula individual, esta puede cambiar y
producir una clase diferente de ac,
como IgG, IgE o IgA, reteniendo la
misma especificidad antigénica,
proceso conocido como cambio de
clase o isotipo.
¿Qué re-arreglo posterior de ADN
involucra?

Cambio de clase:
- ocurre en células B maduras,
- es dependiente de estimulación antigénica
y de citoquinas liberadas por células T
- y es distintivo de las cadenas H.
Las citoquinas que afectan el cambio de
clase inducen posterior re-arreglo del ADN
de la célula B y produce el cambio a otras
clases de Igs en una progresión corriente-
abajo. De modo que una sola célula B con
una única especificidad es capaz de hacer
un ac de todas las clases posibles.

• ¿Cómo ocurre el cambio de clase en las
células B maduras? Ver figura.
• Todo gen de la región C de la cadena H (CH),
a excepción del gen delta, tiene hacia su
extremo 5’ una secuencia de bases repetida
llamada región S (switch), la cual permite a
cualquier región CH asociarse a una unidad
VDJ.
• Estimulación ag y de citoquinas lleva a que
una célula B con una afinidad VDJ ligada a C
“miu” y C “delta” re-arregle su ADN y ligue
una VDJ a una región S de otro gen de las
región C. El ADN de la región C involucrada
se pierde.
• ¿Se puede revertir el cambio de clase?

• Se produce un transcrito primario de ARN
a partir del ADN re-arreglado. Splicing de
transcrito primario genera un ARNm
codificador de la Ig a producir.
• El gen CH seleccionado para el cambio
de clase depende de la citoquina presente
en el momento de la activación antigénica
de la célula B.
• En ratones, el interferon alfa promueve
síntesis de IgG2, IL-4 promueve síntesis
de IgG4 o IgE.

• ¿Cómo las citoquinas realizan esta
función?
• Relajando la estructura de la molécula de
ADN en ciertos puntos a lo largo del locus
Ig, habilitando a la “recombinasa de
cambio” reconocer ADN que codifica
regiones C especificas.

Generación de la diversidad de acs
• Existen varios mecanismos para generar
diversidad: VJ y VDJ
1.Presencia de múltiples genes V en
línea germinal
2.Asociación combinatoria VJ y VDJ.
Región variable de cadena liviana.
Asociación de cualquier segmento
genético V con cualquier segmento
genético J puede formar una cadena
polipeptídica liviana de 200 cadenas
posibles κ y una de 160 cadenas posibles
λ.
¿Por qué?

Multiple Germ-line Gene Segments

Chrom- # V gene # D gene # J gene
osome # segments segments segments
Total of
Heavy
165
chain 14 50 20 6 different
κ Light gene
chain 2 40 ------ 5 segments
λ Light
chain 22 40 ------ 4

3. Región variable de cadena pesada.
Asociación de cualquier segmento
genético V con cualquier segmento
genético D y J puede formar una cadena
polipeptídica pesada de 6.000 cadenas
pesadas posibles.
¿Por qué?

Combinatorial V-(D)-J Joining

• heavy chain: 50 (V) x 20 (D) x 6 (J) = 6000 possibilities
• kappa chain: 40 (V) x 5 (J) = 200 possibilities
• lambda chain:40 (V) x 4 (J) = 160 possibilities

Random Association of Heavy
and Light Chains

• Kappa-containing Ig molecules: 6000 (H) x 200 (L) = 1.2 x 10 6 possibilities
• Lambda-containing Ig molecules: 6000 (H) x 160 (L) = 9.6 x 10 5 possibilities

Therefore 165 germ line gene segments, using combinatorial V-D-J
joining and random association of heavy and light chains, can generate a
total of approximately two million DIFFERENT antibody molecules.
Additional diversity is created by the remaining four mechanisms.

4.Diversidad de unión e inserción.
Diversidad de unión.
Por falta de precisión en la unión de los
segmentos V, J, o V, D y J se pueden
generar delecciones o falta de aa que
afectan el sitio de unión al ag.
Diversidad de inserción.
Por inserción de pequeños conjuntos de
nt en las uniones V-D y D-J.
¿Mecanismo? Enzima TdT
(deoxonucleotidiltransferasa terminal).

5. Hipermutación somática. El fenómeno
de maduración de afinidad en la
respuesta secundaria es explicado por
mutaciones puntuales en la unidad
recombinada V(D)J, que llevan a cambios
individuales de aa.
Estas mutaciones ocurren a una tasa
1.000 veces mayor de lo normal, la
hipermutación somática incrementa la
variedad de ac producidos por la
población de células B.
Parece que ocurre justo después de
estimulación ag en centros germinales de
bazo y ganglio linfático.

Conversión somática de genes.
•En estudios de células de ratón y humanas
la diversidad Ig es generada por
recombinación V(D)J e hipermutación
somática.
•Gallinas, conejos, vacas, cerdos, utilizan
un mecanismo conocido como conversión
somática de genes para generar diversidad
de especificidades de células B.
•¿Cómo? Involucra intercambio no-
recíproco de secuencias entre genes: parte
del gen donante se copia en un gen aceptor
quien es alterado. Ver figura.

¿Mecanismo?
Todavía no está claro.
Muchas especies (gallinas, conejos,
vacas, y cerdos), a diferencia de ratones y
humanos, utilizan conversión somática de
genes e hipermutación somática para
generar diversidad antes de estimulación
ag.

7. Edición del receptor.
Proceso que involucra un segundo arreglo
de la unidad recombinada V(D)J.
Involucra segmentos no re-arreglados V y
D y V y J, para cadenas pesadas. Ver
figura.
Este proceso puede ocurrir cuando una
célula B interactúa con un ag propio; el
segundo re-arreglo puede generar una
unidad de reconocimiento V(D)J para un
ag foráneo, en lugar de un ag propio.

• Los siete mecanismos mencionados
contribuyen a la formación de un
repertorio gigantesco de linfocitos B con
todas (o casi todas) las especificidades
requeridas para tratar con el universo de
diversos epítopos.
• El número total de especificidades Ig es
de ~ 1015 , el cuál puede aumentar por
hipermutación somática.

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