Avances en la producción de elaborados cárnicos seguros y saludables
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El documento detalla los avances en la producción de elaborados cárnicos seguros y saludables a través del proyecto Carnisenusa, que reunió a numerosas instituciones y expertos en busca de innovaciones en la industria cárnica española. Se mencionan logros en la mejora de la seguridad microbiológica, la reducción de nitrificantes y el desarrollo de productos cárnicos funcionales. Además, se resalta la colaboración interinstitucional y el impacto en la formación de nuevos investigadores en el ámbito de la ciencia y tecnología de la carne.
![38 J. J. Córdoba, J. Yangüela, A. Otero, T. Aymerich, A. Rodrigo, M. Rodríguez
Para el desarrollo y la optimización de los protocolos de PCR y qPCR, se realizó en primer
lugar el diseño cebadores utilizando el programa Primer Express (Applied Biosystem) para una
PCR doble que garantice la especificidad en la detección del microorganismo (Tabla 4). Esta
estrategia combinaba dos marcadores específicos del serotipo de E. coli O157:H7 que incluye la
amplificación de los genes rfbE y fliCh7, que codifican, respectivamente el antígeno somático
O157 y el antígeno flagelar H7.
Tabla 4. Secuencias de nucleótidos de los cebadores y sondas utilizadas para los ensayos de
PCR y qPCR basados en metodología SYBR Green y TaqMan para la detección de E.
coli O157:H7 (Gordillo y col., 2011)
Cebadores /
sondas Metodología Secuencia de nucleótidos (5’-3’)
Tamaño del
producto
amplificado Referencia
FLICH7-F
FLICH7-R
PCR GCGCTGTCGAGTTCTATCGAGC
CAACGGTGACTTTATCGCCATTCC
625 pb Gannon y
col. (1997)
RFBEO157-F
RFBEO157-R
RFBEO157-P
PCR
qPCR (TaqMan)
GGATGACAAATATCTGCGCTGC
GGTGATTCCTTAATTCCTCTCTTTCC
[HEX]TACAAGTCCACAAGGAAAG[BHQ1]
213 pb Gordillo y
col. (2011)
RGfliCh7-F
RGfliCh7-R
RGfliCh7-P
qPCR (TaqMan)
qPCR (SYBR
Green)
GCGCGAAGTTAAACACCACG
CGGTGACTTTATCGCCATTCC
[FAM]CCGAAAATACCTTGTTAACTACCGA[TAMRA]
109 pb
RGrfbE-F
RGrfbE-R
qPCR (SYBR
Green)
GAGCCACCCCCATTTTCG
GTTCTATGTCACTAACAGACATTTGCC
65 pb
Se optimizaron las concentraciones de los cebadores y las sondas y las condiciones de las
reacciones de PCR y de qPCR tal y como se muestra en la tabla 5.
Tabla 5. Condiciones de temperatura y tiempo de las reacciones de PCR y qPCR, basados en
metodología SYBR Green y TaqMan, concentraciones de los cebadores y sondas
utilizados y valores de las distintas curvas de disociación (Tm)
Metodología
Concentraciones de
cebadores y sondas (μM) Tm (ºC) Condiciones de la reacción
PCR RFBEO157-F/-R: 0,2
FLICH7-F/-R: 0,2
95 ºC/2,5 min
35 ciclos: 94 ºC/30 s, 58 ºC/1 min, 72 ºC/1 min
72 ºC/1 min
qPCR
(SYBR
Green)
RGrfbE-F/-R: 0,6
RGfliCh7-F/-R : 0,1
76,5 ± 0,34
79,5 ± 0,35
95 ºC/10 min
40 ciclos: 95 ºC/15 s, 60 ºC/1 min
Curva de disociación: 95 ºC/15 s, 60 ºC/1 min, 95 ºC/15 s
qPCR
(TaqMan)
RFBEO157-F/-R: 0,6
RFBEO157-P: 0,3
RGfliCh7-F/-R: 0,1
RGfliCh7-P: 0,05
95 ºC/10 min
40 ciclos: 95 ºC/15 s, 58 ºC/30 s, 60 ºC/30 s
En la PCR convencional se confirmó la especificidad del método por la visualización en los
geles de agarosa de los dos productos amplificados de 625 pb y 213 pb sólo en las cepas de E.
coli O157:H7. Con el análisis de las curvas de disociación en las reacciones de qPCR con tecno-
logía SYBR Green se confirmó la amplificación de los 2 productos esperados sólo en las mismas
cepas. Se obtuvieron resultados idénticos mediante la metodología TaqMan. Los límites de de-
tección de los protocolos de PCR y qPCR diseñados, estuvieron en torno a 1 ufc/g con ADN y
ARN (microorganismos viables) extraídos a partir de matrices cárnicas inoculadas (Tabla 6). Los
métodos de qPCR diseñados fueron más sensibles que la PCR convencional, ya que se conseguía](https://image.slidesharecdn.com/carnisenusa-131002045131-phpapp01/85/Avances-en-la-produccion-de-elaborados-carnicos-seguros-y-saludables-38-320.jpg)
![84 Mª Isabel Cambero, Gonzalo D. García de Fernando, Margarita Medina
Uno de los factores limitantes de la aplicación de un determinado tratamiento es su reper-
cusión en las características sensoriales del alimento. Las radiaciones ionizantes pueden originar
cambios en el olor, color y sabor del producto con un impacto significativo en su aceptación por
el consumidor (Ordóñez y col., 2007; Cambero y col., 2012). Por ello, para la optimización del
tratamiento, se consideró que la máxima dosis que podría aplicarse sería aquella que garantiza-
se un producto final con características sensoriales similares a las de un producto sin irradiar.
Con este objetivo se llevaron a cabo distintos tipos de análisis sensoriales (de diferenciación,
preferencia y descriptivos) en los que se ha evaluado, de forma aislada y en conjunto, el olor,
sabor y sensación en boca. Para determinar el efecto de los EA en el color se estudiaron los
parámetros CIELAB [L* (luminosidad o brillo), a* (tendencia al rojo) y b* (tendencia al amarillo)].
El efecto en la textura se valoró mediante análisis de perfil de textura (TPA) y ensayos de trac-
ción en los que se determinaron diversos parámetros (dureza, cohesividad, adhesividad, elasti-
cidad y resistencia a la rotura).
La aplicación de EA, aparte de inactivar hasta niveles seguros las bacterias patógenas, redu-
ce también el número de bacterias alterantes, que se traduce en un aumento de la vida útil. En
los estudios realizados, la vida útil se limitó al momento en que el recuento de microorganismos
en un medio nutritivo alcanzó el valor de 5 x 107
ufc/g o cm2
.
2.1.1. Tratamiento con EA de distintos productos cárnicos RTE
Los productos cárnicos suelen presentar un pH por encima de 5, pero su aw puede ser su-
perior o inferior a 0,92. Por tanto, la higienización de productos cárnicos RTE por cualquier
tecnología tendría que cumplir los valores de las regulaciones que se recogen en los apartados
2a y 3 de la Tabla 1. Entre los productos cárnicos con una aw superior a 0,92 se incluyen jamón
cocido, mortadela, fiambres de ave y otros alimentos nitrificados (pH 5,5) y una serie de pro-
ductos frescos de consumo en crudo (p.e. carpaccio y tartar). Entre los que presentan una aw
menor de 0,92, los de mayor interés son el jamón, lomo curado y cecina (pH 5) y embutidos
madurados (pH 4,5 – 5).
Se ha estudiado la aplicación de EA en un amplio abanico de productos cárnicos RTE (fer-
mentados, cocidos, curados y crudos). La tabla 2 muestra resumidamente el criterio del proceso
(dosis que es necesario aplicar para conseguir el FSO) para diversos productos. Puede observarse
que todas las dosis establecidas para la higienización (optimización del proceso) están muy por
debajo (en un 70–90%) de la dosis permitida (10 kGy) por diversas organizaciones nacionales e
internacionales. Dosis de 1,5-1,8 kGy logran productos cárnicos que cumplen el criterio microbio-
lógico del Reglamento 1441/2007 para la UE. Sin embargo, en países con el criterio de “tolerancia
cero” para L. monocytogenes, es necesario aumentar la dosis del tratamiento hasta, en el peor de
los casos, 2,8 kGy. En general, con dosis ≤ 2 kGy, puede afirmarse que apenas se ve afectado el
flavor, sin que se diferencien significativamente los productos tratados de los controles. En cambio,
con dosis próximas a 3 kGy, se han apreciado modificaciones ligeras en el sabor y olor del alimen-
to recién tratado que, normalmente, se disipa durante su almacenamiento. En productos RTE a
base de carne fresca con elevado contenido en mioglobina, como el carpaccio de vacuno, el
tratamiento, aún siendo a bajas dosis, ocasiona una oxidación de la mioglobina a metamioglobina,
adquiriendo un color pardo que sería cuestionable para el consumidor. Sin embargo, cuando el
pigmento se ha fijado al formarse nitrosohemocromo, como en el caso del jamón cocido, o nitro-
somioglobina, como en el curado, no se producen cambios notorios en el color.
En relación con la vida útil, los productos RTE con aw 0,92 almacenados a temperaturas
de refrigeración pueden considerarse microbiológicamente estables, por lo que no cabe valorar
el efecto de los EA. Sin embargo, las dosis requeridas para alcanzar el FSO de acuerdo con los
criterios microbiológicos de la UE y EEUU, permitieron duplicar la vida útil de la mayoría de los
productos cárnicos con aw ≥ 0,92 (Tabla 2).
Cabe destacar que la ubicuidad de los microorganismos patógenos, sobre todo Salmonella
spp. y L. monocytogenes, y la posibilidad de que esta última pueda multiplicarse en alimentos](https://image.slidesharecdn.com/carnisenusa-131002045131-phpapp01/85/Avances-en-la-produccion-de-elaborados-carnicos-seguros-y-saludables-84-320.jpg)
![Uso de tecnologías emergentes para garantizar la seguridad alimentaria de la carne y sus derivados 87
Aunque la carne fresca de ave es la fuente más importante de C. jejuni, esta bacteria no se
consideró como microorganismo diana debido a que su peligrosidad es mucho menor que la de
Salmonella spp. ya que se trata de una bacteria muy radiolábil, ya que se han descrito valores
D en torno a 0,16-0,19 kGy, al menos, dos veces menor a los considerados para S. Enteritidis y
S. Typhimurium (Ordóñez y col., 2007). Por tanto, la optimización para Salmonella spp. asegu-
raría la destrucción de C. jejuni hasta niveles estadísticamente despreciables.
Las dosis requeridas para la consecución de los FSO permitieron además una razonable
ampliación de la vida útil, una duplicación en el caso de los filetes (de 4 días a 8) y un 50% más
en el caso de la carne picada (de 4 a 6 días). Incluso se podría aplicar dosis de hasta 1,5 kGy
para cubrir un ocasional abuso de temperatura (incremento hasta unos 8 ºC) durante el almace-
namiento y distribución de la carne, sin menoscabo de su calidad.
B) Aplicación en carne de cerdo
El lomo (longissimus dorsi) es una de las piezas de la canal de porcino de mayor calidad y
valor comercial. En este estudio, el microorganismo considerado para el establecimiento del
criterio de proceso fue L. monocytogenes. La presencia de Y. enterocolitica tiene menor interés
debido a que su radioresistencia es mucho menor que la de L. monocytogenes [por ejemplo, 0,1
a 0,2 kGy del primer microorganismo frente a 0,35 a 0,5 kGy del segundo (Cabeza y col., 2007
y 2009)]. S. Enteritidis es otro microorganismo a controlar. Sin embargo, dado que esta bacteria
no puede crecer a temperaturas de refrigeración, y que sus tiempos de generación son mayores
que los de L. monocytogenes, [por ejemplo, 14 h frente a 7 h en jamón cocido a 10 ºC (Cabeza
y col., 2010)] supone un riesgo menor que el correspondiente a la listeria. Por lo tanto, el tra-
tamiento establecido para eliminar L. monocytogenes permitiría el control de Yersinia y Salmo-
nella. En resumen, puede decirse que el tratamiento con dosis de 1 y 2 kGy del producto
envasado en películas plásticas de baja permeabilidad a los gases, duplica y cuadriplica res-
pectivamente la vida útil del producto refrigerado (4 ºC), pasando de los habituales 5 días a
11 y 20 días, respectivamente (García-Márquez y col., 2012a). Desde el punto de vista de la se-
guridad alimentaria, el tratamiento con EA a dosis inferiores a 2 kGy permite el suministro de
carne libre de L. monocytogenes durante 2 semanas. Este tratamiento no produjo modificaciones
significativas de las características sensoriales de la carne. Cuando el tratamiento aplicado sobre-
pasó los 2 kGy se observó un incremento de la liberación de exudados asociado a una pérdida
de la capacidad de retención de agua (CRA), lo que condujo a un producto menos jugoso tras
el cocinado de la carne. Asimismo, se describieron ligeros matices aromáticos a “quemado” y a
“medio de cultivo calentado”. Respecto al color, el tratamiento de irradiación redujo la tonalidad
roja e incrementó el brillo de la carne, sin duda debido a la mayor liberación de exudados. Sin
embargo, estos cambios fueron sutiles no afectando a la aceptación general del producto (Gar-
cía-Márquez y col., 2012a).
Resultados análogos se obtuvieron cuando se trató lomo adobado con EA (García-Márquez
y col., 2012b), aunque el efecto en las características sensoriales fue menor. Cuando ambos pro-
ductos (fresco y adobado) se envasaron a vacío o en atmósferas modificadas (MAP), y se trataron
con 1 y 2 kGy, se consiguió igualmente duplicar y triplicar la vida útil respecto al control y ase-
gurar un producto libre de L. monocytogenes durante al menos 15 días (Cabeza y col., 2011).
Estos tipos de envasado modificaron el efecto de los EA en el color de la carne fresca de forma
que el producto tratado presentó un color rojo más intenso, probablemente asociado a la forma-
ción de carboximioglobina. Cabe añadir que el tratamiento con EA, tanto de lomo fresco como
adobado, en ningún caso afectó a la textura del producto.
Se ha sugerido que los tratamientos de irradiación pueden acelerar las reacciones de oxi-
dación debido a la formación de radicales libres, lo que podría conducir a la formación de
compuestos nocivos, como los derivados de la oxidación del colesterol (COPs). Ante esta con-
jetura, se estudió el contenido de COPs en lomo fresco y adobado (García-Márquez y col.,
2010), tratado con distintas dosis. Los resultados obtenidos permitieron concluir que los pro-
ductos no tratados presentan los mismos CPOs que los tratados con dosis de 1 y 2 kGy, aunque](https://image.slidesharecdn.com/carnisenusa-131002045131-phpapp01/85/Avances-en-la-produccion-de-elaborados-carnicos-seguros-y-saludables-87-320.jpg)
![88 Mª Isabel Cambero, Gonzalo D. García de Fernando, Margarita Medina
en estos últimos el contenido total de COPs fue ligeramente superior. Por otra parte, no se
observaron cambios en la fracción de fosfolípidos de la grasa intramuscular atribuibles al trata-
miento con EA (García-Márquez y col., 2013). En conjunto, los resultados obtenidos sugieren
que la ionización electrónica a dosis ≤ 2kGy permite incrementar la seguridad y la vida útil de
ambas formas de comercialización del lomo de cerdo sin efectos adversos.
C) Aplicación en carne de vacuno
El solomillo de vacuno es una pieza de elevado valor comercial tanto para el consumo
directo como para la preparación de algunos RTE como el carpaccio. Al aplicar EA, para
incrementar su seguridad microbiológica y vida útil, se obtuvieron resultados muy similares
a los descritos en lomo fresco de cerdo. La vida útil en refrigeración (4 ºC) se incrementó
desde los 8 días del producto no tratado y envasado en atmósfera de aire, hasta 18 y 28 días
cuando se aplicaron 1 kGy y 2 kGy, respectivamente. En el caso de abuso de temperatura (8 ºC),
los resultados fueron igualmente satisfactorios, manteniéndose la carne aceptable para el
consumo durante 15 y 22 días con las dosis mencionadas, frente a los 4 días del mismo pro-
ducto sin tratar. Este tratamiento además permitió la consecución del FSO para L. monocyto-
genes de acuerdo al criterio de la UE (Tabla 1) y de EEUU durante 28 y 18 días, respectiva-
mente, en refrigeración correcta (4 ºC) y durante 22 y 15 días si se produce un abuso en la
temperatura de refrigeración. Sin embargo, dosis ≥ 2 kGy dieron lugar a la liberación de
exudados y aparición de ligeros olores extraños aunque el cocinado enmascaró estos defec-
tos. A dosis de 1 kGy no se observaron cambios en el color pero a partir de 2 kGy se produ-
jo un oscurecimiento de la carne sin llegar a la aparición de la tonalidad pardo-marrón que
refleja la oxidación de la mioglobina.
La carne picada fue otro de los productos de vacuno estudiados, dado su gran interés
industrial. Este material es un medio excelente para el crecimiento bacteriano tanto superfi-
cial como en su interior y, en general, presenta una vida útil muy corta (no más de 2-4 días
a 4 ºC). Al igual que la microbiota alterante, la posibilidad de encontrar patógenos en la car-
ne picada es mayor que en las canales, piezas o filetes. E. coli O157:H7, L. monocytogenes y
Salmonella spp. son algunos de los más frecuentes. Por ejemplo, en Estados Unidos, el 49%
de los casos anuales de infecciones con E. coli O157:H7 y el 3% de las salmonelosis se atri-
buyen al consumo de hamburguesas u otras preparaciones a base de carne picada tras un
cocinado insuficiente. En el trabajo aquí esbozado se trató carne picada envasada sin exclu-
sión de aire y en MAP con EA. En las primeras experiencias realizadas se observó que, inde-
pendientemente del tipo de envasado, este tratamiento era muy eficaz para reducir la carga
de microorganismos alterantes. Sin embargo, el color de la carne se vio intensamente afecta-
do, perdiéndose la tonalidad rojiza con la concomitante aparición de zonas oscuras par-
do-marrón y negruzcas, incluso con dosis de 1 kGy (Cambero y col., 2012). Estos cambios
asociados a la rápida oxidación de la mioglobina confieren a la carne fresca un aspecto in-
aceptable para el consumidor. Como estrategia para evitar, o reducir este efecto se recurrió a
la adición de sulfitos, en una formulación similar a la establecida para la burger meat (83%
carne picada y un 17% de una mezcla de agua, sulfito sódico, proteína de soja, ácido ascór-
bico y cítrico) y/o a la incorporación de CO en un 1% en la mezcla de gases del envasado
[CO2 (50%)/O2 (24%)/N2 (25%)/CO (1%)]. De esta forma, se consiguió la fijación del pigmen-
to de la carne con la formación de un color rojizo estable debido, sin duda, a la carboximio-
globina. Fue necesaria la combinación de ambas estrategias (sulfitos y CO) para el manteni-
miento del color de la carne tras el tratamiento (Cambero y col., 2012). El incremento de la
vida útil (considerando el criterio microbiológico y sensorial) fue entonces de hasta 40 días
con la aplicación de 2 kGy y hasta 35 días con 1 kGy, lo que suponía duplicar el tiempo de
almacenamiento de este producto y garantizar niveles seguros de L. monocytogenes. La au-
sencia de E. coli O157:H7 también está asegurada por su mayor radiosensibilidad (valor D
calculado de 0,26 kGy frente a 0,41 y 0,35 kGy para L. monocytogenes respectivamente en
carne picada y burger meat).](https://image.slidesharecdn.com/carnisenusa-131002045131-phpapp01/85/Avances-en-la-produccion-de-elaborados-carnicos-seguros-y-saludables-88-320.jpg)
![Desarrollo de metodología y estrategias para garantizar la seguridad alimentaria... 113
4.1. Control de mohos productores de aflatoxinas
El efecto protector del cultivo protector de P. chrysogenum RP42C se evaluó primero en
condiciones controladas en lonchas de jamón curado donde se comprobó la implantación de P.
chrysogenum RP42C sobre el crecimiento de la cepa de Aspergillus flavus CBS 573.65 producto-
ra de aflatoxinas. Para ello, se inocularon por separado y conjuntamente ambas cepas a una
concentración de 104
ufc/cm2
en dichas lonchas. A continuación, se incubaron durante 20 días,
en condiciones de temperatura y humedad relativa similares a las del proceso de maduración de
jamón curado (Figura 2).
Con el objetivo de evaluar la implanta-
ción en las lonchas de jamón de P. chryso-
genum RP42C de forma sensible y rápida,
se desarrolló un protocolo de qPCR múlti-
ple que permitiera detectar simultáneamen-
te al moho utilizado como cultivo protector
(P. chrysogenum RP42C) y al moho toxigé-
nico (A. flavus CBS 573.65). Para ello se
procedió en primer lugar al diseño de ceba-
dores y sondas (F-Pc/R-Pc y P-Pc) utilizan-
do el programa Primer Express (Applied
Biosystems, Foster City, USA) a partir de la
secuencia del gen pgafp que codifica para
la proteína antifúngica PgAFP (Rodrí-
guez-Martín y col., 2010) para amplificar la
cepa de P. chrysogenum RP42C (Bernáldez
y col., 2013b) (Tabla 1).
También se ensayaron las parejas de ce-
badores F-omt/R-omt y las sondas de hidró-
lisis OMTprobe (Rodríguez y col., 2012f), para la amplificación de mohos productores de afla-
toxinas. Finalmente, se utilizó un control interno de amplificación (IAC) no competitivo cuyos
cebadores y sondas (TubF1/TubR1 y Tubprobe) están diseñados a partir del gen de la β-tubuli-
na para cuantificar la presencia de población fúngica (Rodríguez y col., 2012c). A continuación,
se optimizó el protocolo de qPCR triple basado en la metodología TaqMan, para la detección y
cuantificación simultánea del cultivo protector y de mohos productores de aflatoxinas con un
IAC no competitivo.
Tabla 1. Secuencia de nucleótidos de los cebadores y sondas utilizadas para los ensayos de
qPCR para detectar y cuantificar el gen pgafp de P. chrysogenum productor de pép-
tidos antifúngicos. Se especifica también el tamaño del producto de qPCR esperado
Nombre del
cebador / sonda Secuencia de nucleótidos (5’-3’)
Tamaño del
producto (pb) Posición dentro del gena
FPc CAGATCACCAGCATTGCCA 73 4
RPc CTCGGGCATCAAGATCGTCC 75
PPc [FAM]-CATCGCGAGGGAGTC-[TAMRA] 60
a
posición en relación con la secuencia del gen pgafp de P. chrysogenum RP42C (Rodríguez-Martín y col., 2010; Bernáldez y
col., 2013b)
El método de qPCR demostró ser muy específico dado que sólo hubo amplificación de
los cebadores específicos cuando se ensayaron las cepas productoras de aflatoxinas o la cepa
de P. chrysogenum RP42C, observándose amplificación siempre por parte del IAC. En la
determinación de la sensibilidad a partir de las lonchas de jamón curado inoculadas artificial-
Figura 2. Lonchas de jamón curado una vez depositado el
inóculo en recipientes previamente esterilizados. En el fondo
del recipiente se introdujo una solución salina sobresaturada
de cloruro potásico (aw = 0,84) para controlar con el
recipiente cerrado la humedad relativa ambiental](https://image.slidesharecdn.com/carnisenusa-131002045131-phpapp01/85/Avances-en-la-produccion-de-elaborados-carnicos-seguros-y-saludables-113-320.jpg)
Avances en la producción de elaborados cárnicos seguros y saludables
- 1. Avances en la producción de elaborados cárnicos Seguros y saludables Instituciones participantes en CARNISENUSA Avancesenlaproduccióndeelaboradoscárnicos Segurosysaludables Editores: Juan Antonio Ordóñez Pereda, Francisco Jiménez Colmenero, Jacint Arnau Arboix JuanAntonioOrdóñezPereda, FranciscoJiménezColmenero, JacintArnauArboix Centros: Industrias: El Pozo, Campofrio, COVAP, FACCSA-PROLONGO y CONFECARNE Patrocinadores de la edición: Universidad Complutense de Madrid (UCM) Coordinador Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA) Universidad de Navarra (UN) Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (IRTA) Gestor Universidad de Barcelona (UB) Universidad Politécnica de Valencia (UPV) Centro Tecnológico AINIA Universidad de Extremadura (UEX) Universidad de Zaragoza (UNIZAR) Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN-CSIC) Universidad de León (ULE)
- 3. Editores: Juan Antonio Ordóñez Pereda Francisco Jiménez Colmenero Jacint Arnau Arboix Coordinador de la edición Lluís SalvàVila Avances en la producción de elaborados cárnicos seguros y saludables Barcelona 2013
- 4. Cualquier forma de reproducción, distribución, comunicación pública o transformación de esta obra solo puede ser realizada con la autorización de sus titulares, salvo excepción prevista por la ley. Diríjase a CEDRO (Centro Español de Derechos Reprográficos, www.cedro.org) si necesita fotocopiar o escanear algún fragmento de esta obra. Editores: Juan Antonio Ordóñez Pereda Francisco Jiménez Colmenero Jacint Arnau Arboix Coordinador de la edición Lluís SalvàVila Edición cofinanciada por: © De los autores, 2013 Edita: Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries Passeig de Gràcia, 44 - 3er. 08007 Barcelona (España) Tel: 934 674 040 http://www.irta.cat ISBN: 978-84-86469-48-1 D.L.: B-19207-2013 Maquetación e impresión: El Tinter, SAL (empresa certificada EMAS)
- 5. “A la industria cárnica española”
- 6. Comité de Gestión de CARNISENUSA Coordinador General: Juan A. Ordóñez Pereda Vice-coordinador: Josep Mª Monfort Bolívar (2007-2010) Pedro Roncalés Rabinal (2010-2013) Coordinadores de subproyectos: DETRAPAT: Juan J. Córdoba Ramos FUNCIOCA: Francisco Jiménez Colmenero NITRARED: Jacint Arnau Arboix PROCARTE: Lorenzo de la Hoz Perales (2007-2011) (†) Mª Isabel Cambero Rodríguez (2011-2013) Coordinador del Programa de Formación: Jesús Ventanas Barroso (2007-2011) Mar Rodríguez Jovita (2011-2013) Gestor del proyecto: Lluís Salvà Vila
- 7. Índice Prefacio...................................................................................................................................... 9 Prologo....................................................................................................................................... 11 Capítulo I La industria cárnica española y su fortalecimiento por las investigaciones de CARNISENUSA...................................................................................................................... 13 Capítulo II Génesis y actividades del proyecto “Productos cárnicos para el siglo XXI: seguros, nutritivos y saludables” (CARNISENUSA).................................................................. 19 Capítulo III Detección e incidencia de microorganismos patógenos en carne y productos cárnicos................................................................................................................. 29 Capítulo IV Estrategias tecnológicas y beneficios saludables de elaborados cárnicos funcionales................................................................................................................................. 49 Capítulo V Implicaciones de la reducción de los niveles de uso de nitratos y nitritos en la seguridad, conservación, características sensoriales y modificaciones tecnológicas de los productos cárnicos crudos-curados......................................................... 67 Capítulo VI Uso de tecnologías emergentes para garantizar la seguridad alimentaria de la carne y sus derivados.......................................................................................................................... 81 Capítulo VII Programa de formación. Resultados del máster y del curso internacional............................ 103 Capítulo VIII Desarrollo de metodología y estrategias para garantizar la seguridad alimentaria en la industria cárnica............................................................................................................... 109
- 8. Capítulo IX Pósters presentados en las sesiones de 2012 y 2013............................................................... 123 Capítulo X Indicadores de calidad y producción en I+D+i de CARNISENUSA........................................ 185 Apéndice I: Relación de investigadores de CARNISENUSA.................................................... 193 Apéndice II: Relación de publicaciones................................................................................... 203
- 9. Prefacio Transcurría el año 2005, época de bonanza no sólo económica sino también de buenas ideas entre aquellos que tenían la responsabilidad de la gestión de la ciencia de calidad. Por aquel entonces acontecieron dos hechos fundamentales. El primero empezó a fraguarse a partir del verano de 2003, pues se había resuelto la incorporación de grupos de excelencia al primer Cen- tro de Competencia Científico Tecnológico (CECOC) que preveía el Plan Nacional de I+D+i, articulado en red, y que lo fue en el ámbito de los productos transformados de la carne (CE- COC-PTC). Y digo que empezó a fraguarse porque fue a partir de ese hecho que los 11 grupos científicos adscritos pertenecientes a 6 centros de investigación y diversos departamentos univer- sitarios, un centro tecnológico y cuatro empresas, por primera vez en la historia reciente inicia- ron un interesantísimo proceso de interacción compartiendo enfoques y conocimientos; se había conseguido una masa crítica cercana a 200 investigadores de alto nivel alrededor de un ámbito enfocado al sector más competitivo de la industria alimentaria española y durante un año y me- dio se configuró una propuesta interna de necesidades de investigación. El segundo aconteci- miento decisivo fue la definición y aprobación de los proyectos Consolider Ingenio 2010, cuya primera convocatoria se lanzó en 2005, y que ofrecía financiación para proyectos de larga dura- ción, entre 5 y 6 años, y conformados alrededor de redes o consorcios de investigación. Ambos hechos permitieron que la práctica totalidad de los grupos públicos y privados ads- critos al CECOC-PTC, más algunos otros que se añadieron para cubrir lagunas de la técnica o del conocimiento, definieran, protocolizaran y finalmente presentaran el proyecto CARNISENUSA, acrónimo de CARNe SEgura, NUtritiva y SAludable, en primera instancia a la convocatoria que se cerró en enero de 2006. Al no obtener financiación pese a haber sido evaluado muy positiva- mente, se volvió a presentar a la siguiente convocatoria con fecha de cierre el 23 de diciembre de 2006 y que finalmente dio lugar al convenio de ejecución con el entonces Ministerio de Edu- cación y Ciencia, el 10 de diciembre de 2007. El Investigador Coordinador del proyecto fue desde su inicio el Prof. Juan Antonio Ordoñez, a quien debemos la ingente tarea de seguimiento, estímulo y liderazgo imprescindibles para que tan ardua empresa colectiva llegue a buen fin, asistido por los coordinadores de los cuatro sub- proyectos, los Drs. Isabel Cambero, Francisco Jiménez Colmenero, Jacinto Arnau Arboix y Juan José Córdoba. Pero en nuestro recuerdo siempre estarán presentes dos investigadores que for- maron parte del núcleo impulsor desde su concepción y que desgraciadamente ya no están entre nosotros, los Drs. Lorenzo de la Hoz y Nieves López. CARNISENUSA está llegando a su fin. El 9 de diciembre de 2013 concluirá oficialmente, tras un año de ampliación administrativa. Esto ha permitido la participación de 165 investigadores pertenecientes a 11 grupos de investigación, que hasta el momento ha dado lugar a la publica- ción de medio centenar de capítulos de libro y cerca de 300 artículos científicos de los cuales el 89% figuran en revistas del primer cuartil de las distintas áreas de publicación establecida por el Journal Citation Report (JCR). Durante su ejecución se han formado en torno a 40 nuevos investigadores, de los cuales casi el 50% ya ha obtenido su título de doctor y el resto lo harán previsiblemente a lo largo de 2013 y el siguiente. Asimismo, el índice h (Hirsch) de los 25 inves- tigadores principales ha aumentado un 50% llegando a una media de 20,9. En definitiva, se ha conseguido un impulso sin precedentes en la generación de conocimiento en un ámbito tan estratégico para nuestra industria alimentaria, que no olvidemos es el primer sector industrial representando más del 18% del PIB. Complementariamente y de nuevo por primera vez, se ha diseñado, impartido y consolidado el Máster en Ciencia y Tecnología de la Carne, gestionado desde la Universidad de Extremadura y con la participación de un elenco de profesores investigadores españoles en la materia. Al mismo
- 10. 10 Prefacio tiempo se han ampliado los contenidos y la asistencia al Curso Internacional de Tecnología de los Productos Cárnicos, impartido en las instalaciones del IRTA, habiendo aumentado la inscrip- ción al mismo alrededor del 50% en el cuatrienio. La presencia de los grupos de investigación de las empresas participantes ha aportado un gran valor añadido, el del enfoque hacia la innovación, en definitiva a la valorización en el mer- cado de los nuevos conocimientos adquiridos. Entre los logros alcanzados cabe citar el de la mejora de la seguridad microbiológica de productos cárnicos listos para el consumo, la reduc- ción de los niveles de nitrificantes en el proceso de curado, la optimización del empleo de tec- nologías no térmicas y su combinación con bioconservantes para la higienización de productos listos para el consumo, la introducción en el mercado internacional de nuevos productos cárni- cos funcionales, y un largo etcétera. Pero si hay algo de lo que todos los participantes en el proyecto CARNISENUSA estarán de acuerdo es en las sinergias que se han detectado y se han puesto en valor entre los diferentes grupos participantes, la cooperación interinstitucional que se ha producido, y en muchísimos casos la profunda amistad que se ha generado. Corresponde a los actuales gestores de la Secretaria de Estado del Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) evaluar el conjunto de proyectos Consolider que finalizan, pero si la mayor parte han conseguido obtener los mismos réditos que CARNISENUSA, sin duda habrá que reconocer el enorme acierto de aquellos gestores que en 2004-2005 idearon y diseñaron este instrumento. Barcelona a 7 de junio de 2013 Josep Mª Monfort i Bolívar Director General del IRTA
- 11. Prólogo El presente libro, titulado “AVANCES EN LA PRODUCCION DE ELABORADOS CARNICOS SEGUROS Y SALUDABLES”, es un resumen de las actividades acometidas en el ámbito del pro- yecto “PRODUCTOS CARNICOS PARA EL SIGLO XXI: SEGUROS, NUTRITIVOS Y SALUDABLES”, de acrónimo CARNISENUSA, financiado en la convocatoria de 2007 por el entonces Ministerio de Educación y Ciencia (MEC) dentro del programa CONSOLIDER-INGENIO 2010. El proyecto es- taba programado en principio para 5 años pero se solicitó una prórroga de un año, que fue concedida, con el fin de concluir las investigaciones que estaban en curso, discutir resultados pendientes y publicar los artículos en vías de evaluación o en fase de redacción. Inicialmente, se proyectó la celebración de una reunión plenaria anual con el fin de hacer un seguimiento del proyecto y programar las actividades de la siguiente anualidad, con la parti- cipación de los investigadores de CARNISENUSA y los representantes de las industrias y asocia- ciones cárnicas que apoyan el proyecto. En la fase preparativa (Junio de 2011) de la reunión a celebrar en Septiembre de ese año en Cáceres, merced a la iniciativa y cofinanciación de la Universidad de Extremadura, se presentó una magnífica oportunidad para editar un libro que recogiera las actividades de CARNISENUSA hasta aquel momento. No se desaprovechó la oca- sión y el libro se presentó en la reunión de Cáceres distribuyéndose entre los asistentes a la misma y a un buen número de instituciones, departamentos, asociaciones e industrias relaciona- das con el sector cárnico. En él, se presentaron los logros obtenidos hasta esa fecha, incluyendo diversas monografías relacionadas estrechamente con las temáticas de los subproyectos, cuyos autores eran investigadores de CARNISENUSA. Entonces, ya se sabía que la obra quedaría incon- clusa y, por tanto, sería necesario completarla con la elaboración de un nuevo libro cuando fi- nalizara el proyecto, o estuviera próximo su fin. La presente obra es el resultado de ese reto. La estructura de este libro se ha realizado en armonía con el editado en Cáceres, el cual lleva el mismo título que el del proyecto de investigación. Sin embargo, éste no es una adenda a esa publicación sino que encierra un contenido que pretende, por una parte, reflejar las acti- vidades globales realizadas en el marco de CARNISENUSA y, por otra, dar explicaciones de la gestión que se ha hecho con los recursos que en su día el MEC puso a disposición de centenar y medio de investigadores. Sin embargo, es lógico que, a veces, se vuelvan a esgrimir los mismos conceptos y se reiteren algunos de los resultados recogidos en el volumen anterior porque el desarrollo de un proyecto de investigación no es una tarea que se vaya completando por módu- los sucesivos, sino que es una labor en la que los hallazgos de una fase son las bases que im- pulsan las investigaciones en las etapas sucesivas. Incluso una vez finalizado el periodo de tiempo programado para el proyecto siempre quedan abiertos nuevos frentes en los que se plantean otras hipótesis que reclaman comprobación. El contenido del libro pues, ilustra, desde el punto de vista de la I+D+i, avances en Ciencia y Tecnología de la Carne y Productos Cárnicos y, desde el administrativo y económico, se ofrece un balance respecto a los compromisos que se adquirieron seis años atrás con el MEC con el fin de comunicar el rendimiento que han pro- porcionado los fondos suministrados en el contexto de la política científica del estado español. La obra puede ser de utilidad en primer lugar, y de forma destacada, para los gestores de las industrias cárnicas y las personas adscritas a los departamentos de I+D+i de las mismas. Pueden encontrar en el libro diversos tipos de información. Unos, relativos a los medios tecnológicos que pueden utilizarse para la higienización de productos cárnicos, fundamentalmente los listos para su consumo, con el fin de garantizar la seguridad alimentaria (microbiológica y abiótica); algunos de naturaleza analítica, al ofrecer detalles de nuevos métodos (físicos, químicos o mi- crobiológicos), o modificaciones de los existentes, para el control de la composición y calidad microbiológica o como herramientas de la trazabilidad de los productos; y otros, para acceder a
- 12. 12 Prólogo estrategias que permitan el desarrollo de formulaciones encaminadas a la obtención de produc- tos saludables y funcionales. Asimismo, el libro proporciona información sobre las aportaciones de las investigaciones realizadas en CARNISENUSA al conocimiento universal en el campo de carne y productos cárni- cos, como se deriva de la relación de artículos científicos que figura en el anexo I, de los cuales, una gran mayoría han sido publicados en revistas de prestigio internacional, lo que asegura su difusión a nivel mundial. Finalmente, se espera que el libro sea de utilidad a los organismos públicos y privados de investigación implicados en el tema, al poder disponer de actualizaciones en varias facetas (tec- nológicas, analíticas, nutritivas, sanitarias, etc.) relativas a la carne y productos cárnicos. Y dentro del binomio investigación-docencia, puede decirse también que, a buen seguro, los centros universitarios podrán incluir mucha de la información científica descrita en el libro en los pro- gramas de las asignaturas incluidas en las titulaciones que imparten relacionadas con la Ciencia y Tecnología de Alimentos. Finalmente, los editores desean expresar su agradecimiento a las entidades que han colabo- rado de una u otra forma a la subvención del libro. En primer lugar, al MEC por la concesión del proyecto CARNISENUSA (CSD2007-00016), al ANICE-CONFECARNE que ha cofinanciado la edi- ción del libro y al IRTA por su cesión desinteresada de su infraestructura para la confección del libro. Los editores desean también agradecer a todos los autores de los capítulos incluidos en la publicación que, después de ser revisados por los editores, se trasladaron a los autores corres- pondientes para su aprobación, de modo que los abajo firmantes asumen los posibles errores editoriales que puedan detectarse. Monells a 4 de Junio de 2013 Los editores Juan A. Ordóñez Pereda Francisco Jiménez Colmenero Jacint Arnau Arboix
- 13. CAPITULO I La industria cárnica española y su fortalecimiento por las investigaciones de CARNISENUSA Generoso García Presidente de la Asociación Nacional de Industrias de la Carne de España (ANICE) y de la Confederación de Organizaciones Empresariales del Sector Cárnico de España (CONFECARNE) 1. Introducción general La industria cárnica es el cuarto sector industrial de nuestro país, sólo por detrás de sectores del tamaño de la industria automovilística, la industria del petróleo y combustibles y la producción y distribución de energía eléctrica. Nuestro sector, formado por mataderos, salas de despiece e industrias de elaborados, tiene un tejido industrial constituido básicamente por algo más de 3.000 pequeñas y medianas empresas, repartidas por toda la geografía nacional; de hecho, el 75% de las industrias cárnicas españolas tiene menos de 20 personas ocupadas, según el Instituto Nacional de Empleo (INE). Con esta dimensión, la industria cárnica ocupa con diferencia el primer lugar de toda la industria española de alimentos y bebidas, representando una cifra de negocio de 21.164 millones de euros, más de un 20% de todo el sector alimentario español. Esta cifra supone el 2% del PIB total español (a precios de mercado) y el 14% del PIB de la rama industrial, y el empleo sectorial directo de nuestras empresas, 83.310 trabajadores, representa igualmente más del 23% de la ocupación total de la industria alimentaria española. Un dato muy relevante, como se verá más adelante, es que la industria cárnica exportó 1,56 millones de toneladas de productos de todo tipo por valor de 4.157 millones de euros a mercados de todo el mundo, con una balanza comercial muy positiva (si en 2010 la tasa de cobertura fue del 229% y en 2011 se elevó hasta un 283%, en 2012 fue del 345%), un dato que muy pocos sectores económicos importantes pueden presentar, y que contribuye a paliar el tradicional déficit comer- cial de nuestro país. Esta sucinta radiografía de nuestro sector da idea de la relevancia económica, social, industrial y comercial de la industria cárnica como locomotora de la cadena de valor de la carne, singularmen- te de la de porcino, y de la importancia estratégica de que nuestras industrias cuenten con el apoyo científico-técnico que representan proyectos tan importantes como CARNISESUSA, que son la base necesaria para, tras la correspondiente trasferencia de conocimiento desde los centros tecnológicos y universitarios, poner en el mercado productos cada vez más seguros, saludables y apetecibles. Por ello, me voy a permitir repasar a continuación los principales datos sectoriales, ceñidos a la carne de cerdo y sus productos, así como introducir al lector en los resultados de las inves- tigaciones de CARNISENUSA y su impacto en la industria cárnica española. 2. Producción de carne y elaborados cárnicos En 2012, la producción española de carne de porcino creció un 1,4% en peso/canal, supe- rando la cifra histórica de 3,5 millones de toneladas por primera vez. Esto supone un crecimien- to que, aunque ligeramente inferior a los registrados en 2010 y 2011, confirma la senda en alza de este tipo de carne tras el fuerte traspiés experimentado en 2009 (Tabla 1).
- 14. 14 Generoso García El número de animales sacrificados fue de 42,39 millones (un 1,55% superior al año anterior) y el peso medio resultante fue de 82,9 Kg, prácticamente el mismo que en 2011. Hay que reseñar que aproximadamente el 58% de la producción de carne de porcino es para consumo directo y el 42% para consumo industrial. Tabla 1. Producción española de carne (Tm) Años Especies ganaderas Otras carnes Porcino Vacuno Ovino Caprino Equino Aves Conejos 1990 1.788.848 513.989 217.396 16.417 7.127 836.700 s.d. 2000 2.912.390 631.784 232.331 18.801 6.732 986.712 s.d. 2001 3.020.239 642.033 236.409 15.369 8.639 1.307.265 s.d. 2002 3.122.577 654.161 239.500 15.101 5.742 1.331.700 s.d. 2003 3.322.385 700.065 236.548 13.861 4.963 1.339.106 s.d. 2004 3.076.120 713.886 231.463 13.373 5.001 1.268.319 72.158 2005 3.168.039 715.331 224.126 13.621 5.070 1.287.422 70.524 2006 3.235.241 670.408 214.179 11.690 5.275 1.260.853 72.308 2007 3.439.442 643.167 196.189 10.446 5.168 1.328.091 74.666 2008 3.484.364 658.332 156.985 9.253 6.210 1.375.295 68.686 2009 3.290.566 598.425 124.424 8.831 6.366 1.316.670 61.195 2010 3.389.772 589.525 125.299 9.189 6.684 1.341.235 63.243 2011 3.469.348 601.163 130.587 11.142 11.265 1.373.604 64.139 2012 3.515.445 596.898 122.801 10.289 15.661 1.382.651 63.429 Fuente: Elaboración ANICE-CONFECARNE con datos del MAGRAMA. Tabla 2. Producción española de elaborados cárnicos (Tm) Producto 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 Jamón y paleta curados 204.339 234.000 245.700 249.400 251.345 265.168 270.470 271.900 245.000 251.000 255.000 Embutidos curados 179.094 184.466 191.844 194.300 193.386 192.999 196.280 197.020 185.200 188.000 185.000 Jamón y paleta cocidos 150.607 158.137 169.997 172.500 174.398 178.583 183.050 183.510 175.000 174.000 175.600 Prod. tratados por el calor 299.222 329.323 345.789 351.000 355.212 360.540 367.750 382.450 385.000 393.000 408.700 Prod. adobados y frescos 167.637 170.000 170.680 174.500 178.165 181.772 183.600 185.400 180.400 182.500 185.000 Platos preparados 59.918 63.513 66.688 78.700 71.105 73.593 77.273 84.220 80.600 82.000 83.000 Total elaborados 1.060.817 1.139.439 1.190.698 1.220.400 1.223.611 1.252.655 1.278.423 1.304.500 1.251.200 1.270.500 1.292.300 Fuente: ANICE-CONFECARNE. Como es notorio, en la producción cárnica española destacan los volúmenes de carne de porcino, que representa el 82,5% de las de ungulados producidas en nuestro país, en 2012 (el 61,6% de todas las carnes, si incluimos avicultura y cunicultura). Con ese volumen de produc- ción, España se consolida ya en estos últimos años como cuarto mayor productor mundial de carne de porcino, por detrás de China (que por sí sola produce el 49% de la carne de cerdo
- 15. La industria cárnica española y su fortalecimiento por las investigaciones de CARNISENUSA 15 de todo el mundo), EEUU (10% de la producción mundial) y Alemania, y como segundo país europeo, por delante de Francia, Polonia, Dinamarca, Países Bajos y Bélgica. En cuanto a la producción de elaborados cárnicos (Tabla 2), hay que indicar que España, con 1,3 millones de toneladas anuales, se sitúa en cuarto lugar en la Unión Europea, por detrás de Alemania, Italia y Francia. Por productos, destacan en volumen los fiambres cocidos y en valor los jamones y paletas curados (blancos e ibéricos). Aún con estos altos volúmenes, hay que señalar que la capacidad de producción instalada en las industrias es todavía excedentaria. 3. La exportación, un eje estratégico del sector cárnico español La industria cárnica es el primer sector exportador de la agroalimentaria española, habiendo superado, ya en 2009, al sector del vino en su actividad exterior. Y con los sectores ganaderos tan desarrollados, y como en el caso del sector porcino, líderes a nivel mundial, nuestra produc- ción es claramente excedentaria, y por ello, la exportación es tanto una necesidad como una oportunidad de desarrollo y generación de riqueza. El sector cárnico español exportó en 2012 un total de 1,46 millones de toneladas de produc- tos frescos (Tabla 3), y 123.000 toneladas de elaborados (Tabla 4), lo que representó unas ventas exteriores de 4.157 millones de euros, un 14% superiores a los 3.644 millones de euros de 2011, que a su vez habían crecido un 17,1% respecto a los 3.112 millones facturados en 2010. Las exportaciones de carnes de porcino supusieron unas ventas de 2.333 millones y las de despojos 336 millones de euros, mientras que los elaborados vendidos en el exterior facturaron 880 millones de euros, encabezados por jamones curados (238 millones) y embutidos curados (300 millones de euros). Hay que reseñar como hito, que las exportaciones de carnes de cerdo (congelada y fresca) superaron por primera vez el millón de toneladas, y suponen por sí solas casi el 60% del valor de las exportaciones cárnicas. Todas las exportaciones de carnes han experimentado avances en sus volúmenes, del mismo modo que los elaborados, con la única excepción de los productos cocidos, que se estancaron un año más. Las exportaciones de carnes y despojos realizadas por nuestra industria en 2012 representa- ron el 34,4% de la producción cárnica, pero las de elaborados sólo representan el 9,5% de la producción total, aunque en estos últimos ejercicios este porcentaje ha ido progresando suave pero continuamente. En todo caso, hay que distinguir el desigual comportamiento de las exportaciones por tipos de producto y por destino. Así, en el periodo 2008-2011 nuestras ventas de carne de porcino a la Unión Europea crecieron un 8%, y a terceros países progresaron un 56%, mientras que en productos elaborados crecieron un 17% a la UE aunque descendieron casi en el mismo porcen- taje a países terceros. Este talón de Aquiles tiene que hacer reflexionar sobre la necesidad de impulsar el comercio con estos mercados fundamentales para la industria española pero todavía llenos de trabas para nuestras empresas. Tabla 3. Exportaciones españolas de carne (Tm) Exportaciones 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 Carne de Vacuno 140.813 147.199 121.502 107.831 139.223 102.569 115.246 121.437 128.094 Carne de Porcino 528.669 603.825 603.596 667.360 828.000 864.938 879.828 995.319 1.029.067 Carne de ovino 20.333 19.503 25.217 25.365 20.631 18.244 27.224 28.629 31.560 Despojos 164.566 179.005 188.214 208.904 256.138 231.649 217.914 260.560 276.118 TOTAL 854.381 949.532 938.529 1.009.460 1.243.992 1.217.400 1.240.212 1.405.945 1.464.839 Fuente: Elaboración ANICE-CONFECARNE con datos de ICEX.
- 16. 16 Generoso García Tabla 4. Exportaciones españolas de elaborados cárnicos (Tm) Exportaciones 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 Jamón curado 15.158 17.707 19.903 22.813 28.131 22.282 23.147 25.151 26.807 Embutidos curados 18.750 20.913 22.110 26.421 28.535 27.611 29.731 33.765 38.216 Jamón/paleta cocidos 4.963 6.406 6.913 6.174 5.315 5.503 5.777 6.746 6.458 Embutidos cocidos 9.588 8.800 8.816 9.353 9.074 8.670 9.173 10.673 10.215 Otros productos 32.548 37.265 43.822 45.928 53.130 38.668 42.884 39.736 41.285 TOTAL 81.007 91.091 101.564 110.689 124.185 102.734 110.712 116.071 122.981 Fuente: Elaboración ANICE-CONFECARNE con datos de ICEX Como se puede observar en la tabla 5, las exportaciones de jamones curados (de capa blan- ca e ibéricos) han seguido una senda ascendente en los últimos años, tanto en volumen como en valor, pero registran un cierto estancamiento en cuanto a su peso relativo respecto al total de productos elaborados que son exportados. Tabla 5. Exportaciones españolas de jamones curados (incluye blanco e ibérico) Miles de euros Toneladas 2009 2010 2011 2012 2009 2010 2011 2012 Jamón Curado 184.731 201.093 215.624 237.600 22.282 23.147 25.151 26.807 % sobre total elaborados 30,9% 28,3% 28,9% 27,0% 21,7% 20,9% 21,7% 21,8% TOTAL 597.108 710.289 747.177 879.689 102.734 110.712 116.071 122.981 Fuente: Elaboración ANICE-CONFECARNE con datos de ICEX El 82% de lo exportado corresponde a jamones deshuesados en formatos diferentes a la pieza, esencialmente loncheados, tacos, centros, etc., mientras que solo un 17% corresponde a piezas y sólo un 1% corresponde a paletas. Pese a que se han ido abriendo y desarrollando en los últimos años mercados importantes para nuestros jamones, a día de hoy Alemania sigue siendo nuestro principal cliente (7.240 to- neladas), con un 27% de las ventas al exterior, seguido de nuestros dos vecinos, Francia (6.000 toneladas y un 22,3% del total) y Portugal (2.500 toneladas y un 9,2%). Además, hay que destacar a países como Noruega, Italia y Japón, en compras de piezas, y Bélgica, Italia, México, EEUU o Países Bajos, en lonchas, como los otros mercados de referencia para nuestros jamones. 4. Impacto de las investigaciones de CARNISENUSA en la industria cárnica española A pesar de la crisis económica, laboral y financiera tan acusada que está atravesando España, el sector cárnico está soportándola mejor que otros y es de esperar que salga de ella fortalecido. Al menos es lo que parecen indicar las estadísticas relativas a la producción de productos cárnicos y, de forma particular, los aumentos tan destacados de la exportación a la Unión Europea y a terceros países. Las cifras que se han ofrecido más arriba sobre la exportación de carne y produc-
- 17. La industria cárnica española y su fortalecimiento por las investigaciones de CARNISENUSA 17 tos cárnicos son elocuentes. A modo de ejemplo y resumidamente se puede citar que la exporta- ción total de carne de porcino en el periodo 2008-2012 aumentó un 24,3% y de forma particular la de lomo fresco a los países del Oriente Lejano que sufrió un enorme incremento, ya que en el periodo enero-noviembre de 2010 se exportaron a Japón, Corea del Sur y China 397,75 Tm. En el mismo periodo de 2011 y 2012 pasó a 713,91 Tm y 1.186,75 Tm, respectivamente, es decir, se produjo un aumento de en torno al 66% en 2012 respecto al año anterior y prácticamente se du- plicó en estos dos años. Espectaculares también son los datos de las variaciones en las exportaciones de jamón cu- rado, el producto más emblemático que fabrica la industria cárnica española, ya que en 2004 la exportación total fue de 15.158 Tm y en 2012 el comercio exterior se incrementó en más de un 76% (se exportaron 26.807 Tm) pero resulta aún más impresionante el incremento sufrido por la exportación de jamón deshuesado que en el periodo a que se ha hecho referencia pasó de 11.946 Tm a 21.993 Tm, o sea, que casi se duplicó mientras que el comercio de jamón en piezas se estancó (de 3.144 Tm a 4.512 Tm en ese periodo de 2004 a 2012). Estos datos demuestran la importancia que tiene la fabricación de productos cárnicos en la economía del sector agroali- mentario de España y que en relación con el jamón curado, la mejor forma de comercializarlo es deshuesado. Es, pues, una industria que merece la pena cuidar y auxiliar en el mundo globalizado actual, ya que, por otra parte, no está exento de dificultades y de competencia. La carne fresca es un producto muy perecedero y de gran sensibilidad frente a contaminaciones, por ello es necesario que su elaboración, distribución y almacenamiento se realice guardando las más rigurosas prác- ticas higiénicas. Aún así, accidentalmente pueden llegar al producto agentes contaminantes de diversa índole, entre los que figuran fundamentalmente microorganismos patógenos proceden- tes de los manipuladores, entorno industrial o de otras fuentes. El jamón curado es, en cambio, un producto estable y seguro que tiene un historial sanitario excelente. Sin embargo, la forma comercial más idónea para su exportación es deshuesado, bien en piezas fácilmente manejables o en lonchas como alimento listo para su consumo. Se podían hacer las mismas consideraciones que las que se han mencionado para la carne fresca. Las ope- raciones que pueden aplicarse para poner estos productos cárnicos en el mercado son diversas, desde las manuales, como el deshuesado y loncheado a mano, hasta las aplicadas con equipos sofisticados en que la intervención del operario es prácticamente nula. No obstante, como antes se mencionaba, aunque se apliquen buenas prácticas de fabricación, hay que asegurar que el producto final esté exento de contaminantes. Conviene tomar medidas pues, para garantizar su seguridad. Lógicamente es un deseo ansiado por todo industrial y al que se aplica toda la tecno- logía y conocimiento científico-técnico disponible. El proyecto CARNISENUSA ha acometido investigaciones para alcanzar esta meta. Las regu- laciones sanitarias de los países de destino son muy rigurosas y exigentes, sobre todo en relación con ciertos microorganismos. En el citado proyecto se han optimizado métodos para la higieni- zación de productos cárnicos. Se remite al lector a otros capítulos del presente libro donde se informa detalladamente del efecto de las aplicaciones de altas presiones, electrones acelerados, pulsos de luz y el uso de bioconservantes para la higienización de productos cárnicos (funda- mentalmente lonchas de jamón listas para su consumo) y también para ampliar la vida útil de lomos frescos. Unos de estos procedimientos se aplican ya en la industria (altas presiones), algunos están aún en estudio (pulsos de luz) y se ha demostrado en el proyecto la eficacia de otros (electrones acelerados), habiéndose solicitado su autorización para este último al Ministerio de Sanidad, Servicios Sociales e Igualdad. También se ha abordado la posibilidad de utilizar bioconservado- res (por ejemplo, bacteriocinas) para el control de patógenos, bien solos o en combinación con otros métodos. Todos estos resultados constan en el presente libro que está a disposición de industriales a través de ANICE-CONFECARNE o dirigiéndose directamente a los coordinadores del proyecto.
- 18. 18 Generoso García Pero en el aspecto que se comenta, es decir, la contaminación con agentes patógenos (mi- croorganismos y toxinas) se han llevado a cabo otras investigaciones que pueden ser de utilidad a la industria cárnica. Están relacionadas con la detección de patógenos por métodos de van- guardia que pueden aplicarse a productos cárnicos, superficies y utillajes de las industrias o el análisis de ciertas micotoxinas que puedan estar presentes en las capas externas de los produc- tos, sobre todo en el jamón curado. Además, se ofrece información de la prevalencia de microor- ganismos patógenos en los alimentos y en las instalaciones de industrias cárnicas, lo que puede ser muy útil para gestionar el riesgo en las mismas. Los resultados se recogen también en el presente libro. En otro orden de cosas, puede decirse que la carne y muchos productos cárnicos (por ejem- plo, jamón y lomos) son alimentos saludables de gran valor nutritivo; son productos magros, con un relativamente bajo contenido de grasa que vehiculan nutrientes destacables, por ejemplo, hierro y ciertas vitaminas. No obstante, hay otros productos cárnicos que aunque poseen pro- piedades sensoriales excepcionales (por ejemplo, embutidos, tanto frescos como fermentados/ madurados), tienen una calidad nutricional diferente. Para optimizar estos aspectos nutricionales –en cuanto a grasas y ciertos nutrientes- y en un afán por diversificar los productos cárnicos tradicionales, fundamentalmente emulsiones cárni- cas y embutidos, se han hecho estudios en el presente proyecto con el objetivo de elaborar productos más saludables. Para ello, se ha trabajado en diversas vertientes, como adición de antioxidantes o minerales, reducción del valor calórico mediante sustitución de la grasa por otros compuestos alimentarios más adecuados desde el punto de vista nutritivo. Finalmente, hay una presión por parte de algunos países de la Unión Europea para reducir la cantidad de nitrito que puede añadirse para la elaboración de productos cárnicos. No cabe duda de que es una iniciativa elogiable, dirigida a la salvaguarda de la salud del consumidor. Sin embargo, los nitratos y nitritos desempeñan funciones de muchísima importancia en los produc- tos cárnicos a los que se añaden, siendo la de mayor relevancia la inhibición de C. botulinum. Era necesario conocer la respuesta de los productos genuinamente españoles (jamones y embu- tidos madurados) en el caso de que la UE decida rebajar la tasa máxima permitida de estos aditivos. En el libro se recogen los resultados de los estudios realizados al respecto. Aparte de las actividades investigadoras incluidas en el proyecto, también se ha contempla- do la labor formativa. En los más de cinco años que ha durado el proyecto se han celebrado un máster en productos cárnicos en la Universidad de Extremadura y un curso internacional en el IRTA-Monells, ambos de carácter anual. El resultado ha sido la formación de una serie de licen- ciados que han podido incorporarse a empresas, organismos oficiales o han ingresado en cen- tros de investigación para lograr el grado de doctor. Iniciativas como éstas merecen elogios. El rendimiento de tales actividades figura también en las páginas del presente libro. En conclusión, puede decirse que un amplio grupo de investigadores españoles, apoyado por algunas industrias y organizaciones cárnicas, se asociaron hace media docena de años y crearon un consorcio con el fin de estudiar aspectos y problemas relativos a la industria cárnica española. El grupo está compuesto por alrededor de 150 investigadores procedentes de una docena de instituciones (universidades, organismos públicos de investigación y centros tecnoló- gicos) dirigidos por científicos con currículos destacados en el mundo de la carne y productos cárnicos. Los resultados de sus investigaciones figuran resumidamente en el presente libro, junto a las publicaciones a que han dado lugar y a las que el lector puede dirigirse. Como persona impli- cada plenamente en las labores de la industria cárnica, deseo agradecer el interés que han mos- trado los participantes en el proyecto al preocuparse por la potenciación del subsector cárnico. Seguro que muchas de las técnicas, tecnologías y otras actividades recogidas en la obra serán captadas por las industrias y con la posibilidad de aplicarlas con éxito.
- 19. CAPITULO II Génesis y actividades del proyecto “Productos cárnicos para el siglo XXI: seguros, nutritivos y saludables” (CARNISENUSA) Juan A. Ordóñez Coordinador General de CARNISENUSA. Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos, Facultad de Veterinaria (UCM). Avenida Puerta de Hierro s/n. 28040 Madrid 1. Génesis de CARNISENUSA En los últimos lustros, diversos investigadores españoles han hecho un buen número de aportaciones a la Ciencia y Tecnología de la Carne y Productos Cárnicos cuya calidad ha estado avalada por recensores de las revistas de mayor prestigio internacional en el campo. Una ojeada a la base de datos de la ISI Web of Science permite deducir que desde 1980, los investigadores españoles han publicado varios centenares de artículos relacionados con la carne y productos cárnicos en revistas incluidas en el Journal Citation Reports (JCR) principalmente en el primer tercio del bloque correspondiente, no sólo en el área de Food Science and Technology sino tam- bién en otras como, por ejemplo, Applied Chemistry, Analytical Chemistry, Applied Microbiology, Nutrition and Dietetetics, etc. Los temas que se han cultivado han sido diversos. Unos, en aspec- tos relacionados con actividades enzimáticas del músculo (catepsinas, por ejemplo) o proteasas de diferentes orígenes (vegetal, como la bromelaína o microbiano, como proteinasas fúngicas o bacterianas) para acelerar la maduración de embutidos; algunos, en aspectos de seguridad mi- crobiológica con el objetivo de higienizar los productos cárnicos mediante métodos tanto físicos (altas presiones hidrostáticas, electrones acelerados o pulsos de luz) como biológicos (biocon- servadores, como bacteriocinas o lactoferrina); otros, desarrollando métodos analíticos microbio- lógicos (pruebas rápidas para detectar bacterias alterantes o toxinas fúngicas) o físico-químicos (detección de hidrocarburos como sustancias indicadoras de la aplicación de métodos físicos de conservación o aplicación de espectrofotometrías avanzadas para monitorizar la trazabilidad de productos cárnicos) y también se ha trabajado en aspectos nutricionales (reducción del conteni- do calórico o aumento de ácidos grasos de la familia n-3 de diversos productos cárnicos o enri- quecimiento de los mismos en sustancias en que son deficitarios, como antioxidantes, fibra ali- mentaria o ciertos minerales) y la formulación de alimentos funcionales para diversificación de la oferta alimentaria. En fin, son numerosas y variadas las facetas en que han trabajado investi- gadores españoles en el mundo de la carne y productos cárnicos, lo que les ha permitido adqui- rir un historial científico digno de mencionar. Los equipos que han desarrollado estos estudios proceden de universidades, instituciones públicas de investigación y centros tecnológicos con el apoyo o cooperación de departamentos de I+D+i de algunas industrias cárnicas. Los investigadores, aunque estaban en contacto y había ciertas sinergias entre sus equipos, realizaban independientemente sus tareas, financiadas me- diante subvenciones conseguidas en convocatorias de proyectos competitivos tanto de nivel nacional como internacional y contratos con empresas y administraciones. Puede decirse, en definitiva, que ya adentrados en el presente siglo los equipos poseían una sólida formación y estaban dispuestos, por tanto, a lanzarse a proyectos más ambiciosos. Se presentó una oportu- nidad cuando a finales de 2005 el entonces denominado Ministerio de Educación y Ciencia
- 20. 20 Juan A. Ordóñez (MEC) concibió el programa Consolider-Ingenio 2010 (BOE 293 de 08/12/2005). Los líderes de unos pocos equipos, con la pretensión de contribuir a resolver problemas que tenían planteados la tecnología de la carne y productos cárnicos y el deseo de cooperar en el impulso de la indus- tria, identificaron las lagunas que se podrían abordar para satisfacer las necesidades de mayor calado con el objetivo último de aportar primicias tecnológicas a la industria cárnica española para situarla en los primeros lugares en una Europa integrada por países muy competitivos. Ante tal oportunidad, se constituyó un grupo gestor en 2006 compuesto por una decena de investigadores que después de analizar minuciosamente el estado actual de la industria cárnica, la evolución de la misma en la década, los nuevos hábitos alimentarios y las presiones de los consumidores demandando alimentos seguros, saludables y nutritivos, concluyeron que había dos temas que reclamaban una solución si se pretendía que los productos cárnicos fabricados en España fuesen en el futuro competitivos a nivel internacional. 1) Necesidad de desarrollar un método para higienizar los productos cárnicos listos para su consumo (productos RTE), debido, por una parte, al creciente incremento del consumo de los mismos y, por otra, a la imposibilidad de aplicar las tecnologías convencionales en estos alimentos con ese fin. 2) Estudiar el impacto de la posible reducción a nivel de la Unión Europea de las dosis máxi- mas permitidas en los productos que se someten a nitrificación tanto cocidos como madu- rados y, de forma particular, cómo afectaría a la seguridad y vida útil de los productos cárnicos genuinamente españoles, como el jamón curado y los embutidos fermentados/ madurados. Adicionalmente, también se contemplaron otras líneas de investigación, de las cuales se eligieron dos, no menos importantes que las anteriores, con la esperanza de que los resultados, una vez transferidos, repercutieran en una potenciación de la producción de productos cárnicos. a) Estudiar los niveles de contaminación de productos cárnicos emblemáticos y de las instala- ciones de una selección de industrias cárnicas así como el desarrollo de métodos rápidos y modernos que permitieran detectar microorganismos no deseables (alterantes y patógenos) con premura y a bajos niveles o toxinas elaboradas por los mismos, como micotoxinas. b) El cuarto frente derivaba de la tendencia actual y necesidad de disponer de productos más ajustados a los requerimientos específicos de amplios sectores de la sociedad, constituyen- do, en consecuencia, una excelente oportunidad de diferenciación, diversificación y posicio- namiento del sector cárnico en un mercado emergente. En tal sentido, se estimó de interés abordar el “desarrollo productos cárnicos saludables y funcionales”. Tomando como base estas premisas, el grupo gestor decidió asistir a la primera convocato- ria, en 2006, del programa Consolider-ingenio 2010 para lo que, en primer lugar, fue necesario definir las acciones que había que considerar y decidir los equipos de investigación más idóneos para acometer las investigaciones. Se contactó con diferentes equipos españoles, cuyo resultado fue un colectivo de alrededor de 150 investigadores (desde becarios hasta científicos versados en el tema avalados por sólidos curricula) procedente de siete universidades (Barcelona, Com- plutense de Madrid, Extremadura, León, Navarra, Politécnica de Valencia y Zaragoza), tres insti- tuciones públicas de investigación (Departamento de Tecnología de los Alimentos del INIA, Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición ICTAN-CSIC (antes Instituto del Frío) e IRTA y un centro tecnológico (AINIA). Se solicitó apoyo logístico a diversas empresas cárnicas (El Pozo Alimentación, S.A., Frigoríficos Andaluces de Conservas de Carne –FACSA– Campofrío S.A, Cooperativa Andaluza Ganadera del Valle de los Pedroches –COVAP–) y a dos asociaciones alimentarias (ANICE-CONFECARNE y FIAB) que calurosamente apoyaron la iniciativa. Se elabo- ró una memoria que se presentó a la convocatoria de 2006 que fue evaluada positivamente por científicos extranjeros especialistas recomendando su financiación pero no se hizo debido a que, según indicó al autor del presente artículo la entonces Directora General con la frase textual “las prioridades de política científica” y “las disponibilidades presupuestarias no permiten atender su
- 21. Génesis y actividades del proyecto “Productos cárnicos para el siglo XXI” 21 solicitud en esta ocasión” aunque el MEC le adjudicó la categoría de A(-), correspondiente a una evaluación “muy positiva” y a “equipos y programas excelentes”. Hasta tal punto se consideró el proyecto como financiable que la Directora General animaba encarecidamente al grupo que volviera a presentar la solicitud de una forma verdaderamente estimulante que queda resumida en la siguiente frase textual: “…tanto su equipo como su Programa de Actividad han sido valo- rados muy positivamente, por lo que entiendo que, con una probabilidad muy alta, esta misma solicitud –tal vez con pequeñas modificaciones– será financiada en la próxima convocatoria”. Se realizaron las modificaciones que apuntaron los evaluadores, se presentó de nuevo el proyec- to en la convocatoria de 2007 y se aprobó para su ejecución en el período 2007-2012. Arrancó con la fecha de concesión (07/06/07), se trabajó durante un lustro y unos meses antes de su fecha de finalización, el 09/12/2012, se solicitó una prórroga para discutir resultados almacena- dos y redactar los consiguientes artículos, así como finalizar las tesis doctorales comprometidas y rematar otros compromisos aún pendientes. Se concedió la prórroga solicitada hasta el 09/12/2013. Se remite al lector a un artículo publicado previamente (Ordoñez y col., 2011) don- de encontrará información adicional sobre otros pormenores de la solicitud del proyecto. El proyecto financiado quedó estructurado en cuatro subproyectos que corresponden a los temas que se han mencionado anteriormente, el cual se esquematiza en la figura 1. Asimismo, se instituyó un programa de formación en la materia para lo que se incluyó en CARNISENUSA el Máster en Ciencia y Tecnología de la Carne y Productos Cárnicos y el Curso Internacional en Tecnología de Productos Cárnicos que venían impartiéndose en la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Extremadura y en el IRTA-Monells, respectivamente. Una información detallada Figura 1. Actividades de CARNISENUSA desglosadas por subproyectos y acciones de los mismos.
- 22. 22 Juan A. Ordóñez sobre el contenido de los subproyectos y programa de formación ha sido descrita por Ordoñez y col. (2011) y en los capítulos siguientes (III, DETRAPAT; IV, FUNCIOCA; V, NITRARED; VI, PROCARTE y VII, Master y Curso Internacional), donde se describen los logros conseguidos en cada caso así como en el programa de formación. No se va a detallar aquí las actividades desa- rrolladas por cada uno de estos subgrupos pero sí puede resultar provechoso un resumen de los resultados obtenidos de mayor relevancia. 2. Resumen de las actuaciones más significativas desarrolladas en CARNISENUSA 2.1. Consideraciones generales En relación con el tipo de investigación, las actuaciones realizadas se han encuadrado, de forma general, como sigue: 15% investigación básica (IB), 25% investigación aplicada (IA) y 60% desarrollo (D). Algunos resultados se han patentado (una decena) y muchos pueden ser inme- diatamente transferidos a las industrias o, simplemente, una vez conocidos por los departamen- tos de I+D+i de las mismas, aplicarlos según sus intereses. No obstante, otros, quizás, precisen previamente de un escalado. 2.2. Actuaciones más destacadas de los subproyectos 2.2.1. Subproyecto DETRAPAT Tanto la incidencia como la prevalencia de microorganismos patógenos en alimentos en general y en carne y productos cárnicos en particular, son temas prioritarios en la Unión Euro- pea y en terceros países. Ligado estrechamente a estas peculiaridades de salud pública están los métodos analíticos, alternativos a los tradicionales, de detección de dichos microorganismos en los alimentos. El proyecto DETRAPAT se ha preocupado de ambas facetas y ha llevado a cabo las diferentes acciones que se resumen a continuación: • Se ha desarrollado un nuevo método de muestreo de superficie (mini-roller) cuya eficacia se ha comprobado analizando la incidencia de Listeria spp. en una treintena de industrias ali- mentarias y en más de un centenar de productos cárnicos, de los cuales la mitad eran listos para su consumo (productos RTE). (IA/D). • Se ha estudiado la incidencia de varias cepas de Salmonella spp., Aeromonas sp., Yersinia enterocolitica, Escherichia coli productoras de toxinas shiga y Campylobacter jejuni en pro- ductos cárnicos (mayoritariamente RTE). Asimismo, se ha investigado la presencia de las bac- terias mencionadas en casos clínicos con síndrome diarreico (IA). • Se han desarrollado métodos PCR-convencional y PCR-en tiempo real para la detección/cuan- tificación de L. monocytogenes, Salmonella spp., S. aureus y E. coli O157:H7 y mohos produc- tores de micotoxinas (aflatoxinas, patulina y ocratoxina A) en productos cárnicos (IA/D). • Tipificación molecular de diferentes cepas de L. monocytogenes (IA). • Se ha estudiado la utilidad de métodos qPCR para la detección de virus mediante ensayos de inoculación de mengovirus en diferentes matrices cárnicas (choped, salchichón y chorizo) (IA/D). 2.2.2. Subproyecto NITRARED Desde tiempo inmemorial, se vienen añadiendo nitratos y nitritos a los productos cárnicos. Como se especifica en el capítulo dedicado a NITRARED los efectos beneficiosos son diversos: determinan el color, influyen el sabor y protegen frente a microorganismos no deseables. Sin embargo, debido a la posible formación de nitrosaminas a consecuencia de reacción del nitrito y sus derivados con aminas secundarias, algunos países integrados en la Unión Europea están haciendo una fuerte presión para reducir el nivel de adición de nitratos y nitritos. Preocupa
- 23. Génesis y actividades del proyecto “Productos cárnicos para el siglo XXI” 23 saber, pues, si se llegara a rebajar la cantidad máxima actualmente permitida, cómo repercutirá en los productos cárnicos y especialmente en los productos españoles genuinos y, en defini- tiva, en la actividad de las industrias cárnicas españolas. Este subproyecto se ha ocupado de ofrecer datos al respecto. A continuación se expone un resumen de los mismos: • Se ha mejorado la metodología para determinar y evaluar el color de productos cárnicos (IA). • La reducción en un 25 o 50% de nitratos/nitritos añadidos a jamón curado es viable dado que no afecta a la formación y estabilidad del color ni a las propiedades sensoriales (IA/D). • La reducción de nitritos en embutidos es más compleja ya que estos actúan como barrera importante frente al crecimiento de determinados microorganismos no deseables, unos pa- tógenos y otros alterantes. Sin embargo, el flavor y textura no se ven afectados por la reduc- ción de la cantidad de nitratos y nitritos añadidos del 25 y 50% respecto al máximo permi- tido (IA/D). • En productos cocidos, la disminución del contenido de nitrito puede afectar al color superfi- cial y a la estabilidad del color (IA/D). • La formación de Zn-protoporfirina es responsable del color de jamones curados sin nitratos/ nitritos añadidos y parcialmente en los jamones de pH5,6 a los que se les ha añadido ni- trito (IB). 2.2.3. Subproyecto FUNCIOCA Las actividades que se han acometido en este subproyecto abordan la producción de elabo- rados cárnicos saludables y funcionales. Tal planteamiento se ha realizado a dos niveles. Por un lado, a través de la aplicación de estrategias tecnológicas encaminadas a reducir, incrementar, reemplazar o modificar la presencia de diversos compuestos bioactivos, demostrando la viabili- dad tecnológica y sensorial de un notable número de productos cárnicos (frescos, cocidos y madurados) reformulados. Por otro, centrado en la obtención de evidencias científicas acerca de los efectos beneficiosos de estos nuevos desarrollos. De forma resumida se exponen los princi- pales aspectos: • Se han ensayado distintas estrategias de preparación, estabilización, caracterización y medida de actividades específicas de ingredientes/compuestos bioactivos empleados en la reformula- ción de elaborados cárnicos. Así por ejemplo, se han realizado diversos estudios sobre la es- tabilización de aceites en emulsiones de aceite-en-agua y de agua-en-aceite-en-agua, así como la evaluación de la actividad antioxidantes de diversos ingredientes funcionales (B). • Dado que los lípidos se encuentran entre los ingredientes funcionales que mayor atención han recibido por sus implicaciones en la salud, se han reformulado diversos productos reempla- zando la grasa animal por otra de origen vegetal o marino, obteniendo productos cárnicos frescos, cocidos y madurados en los que se ha reducido la grasa (ácidos grasos saturados y calorías) y/o se ha incrementado el nivel de ácidos grasos MUFA (oleico) y PUFA (n-3 de ca- dena incluyendo EPA y DHA) (D). • Por sus potenciales implicaciones en la salud y limitada ingesta, la incorporación de fibra en alimentos y en particular en productos cárnicos resulta de especial interés. En tal sentido se han añadido a algunos productos cárnicos distintos ingredientes ricos en fibra (algas, fructoo- ligosacáridos, etc.) (D). • Se han formulado diversos productos modificando la presencia de minerales. Por un lado re- duciendo los niveles de sodio y por otro favoreciendo la presencia de otros, como p.e., calcio y selenio (D). • Se han diseñado productos cárnicos (p.e., hamburguesas y mortadela) enriquecidos en ácido fólico, habiéndose analizado la retención de actividad durante la vida útil (D). • Diversos compuestos fitoquímicos han sido incorporados en varios productos cárnicos, entre ellos luteína, extractos de Borago officinalis L., Verbena officinalis L. y Melissa officinalis L., etc. (D).
- 24. 24 Juan A. Ordóñez • Como es bien sabido, en el desarrollo de alimentos funcionales resulta esencial la necesidad de demostrar de forma satisfactoria el efecto beneficioso. Para tal fin se han realizado estudios de biodisponibilidad/bioaccesibilidad de compuestos bioactivos (luteína, ácido fólico, calcio y licopeno) incorporados en diversos productos cárnicos mediante estudios in vitro estáticos y dinámicos, así como en animales de experimentación (IA). • Se ha realizado un estudio de intervención en humanos demostrando que la inclusión en la dieta de algunos productos cárnicos reformulados en el marco de este proyecto da lugar a una disminución de la concentración de LDL-colesterol en sujetos con riesgo cardiovascular elevado (AI). En el capítulo correspondiente a este subproyecto se ofrecen ejemplos de productos cárnicos desarrollados susceptibles de incluir declaraciones nutricionales de acuerdo con el Reglamento (CE) 1924/2006 del Parlamento Europeo y del Consejo de la UE y ejemplos de prestaciones de propiedades saludables avaladas por las declaraciones nutricionales (Reglamento 432/2012). 2.2.4. Subproyecto PROCARTE Este proyecto se perfiló debido a que los alimentos RTE, de gran aceptación por parte de la población, pueden potencialmente contaminarse con microorganismos patógenos durante su preparación. Como, por otra parte, la salvaguarda de la salud del consumidor es una preocupa- ción prioritaria de la industria alimentaria, es necesario disponer de métodos apropiados para higienizar los alimentos RTE. En este subproyecto se han realizado investigaciones con este fin en distintas matrices cárnicas. Los resultados obtenidos se describen brevemente a continuación: • La aplicación de electrones acelerados a productos cárnicos RTE es un método muy efectivo para higienizar e incrementar la vida útil sin que se modifiquen significativamente sus propie- dades sensoriales. Cabe mencionar que en alimentos de humedad intermedia y, en general los que tienen una aw 0,92, (p.e., jamón curado o embutidos madurados) es suficiente una dosis de 1,5 kGy, (un 85% más baja que la permitida por organismos nacionales e internacio- nales en los alimentos) para satisfacer las regulaciones de los productos bajo el criterio de “tolerancia cero” (IA/D). • La fase de latencia y el tiempo de generación de las bacterias (al menos S. aureus y L. mono- cytogenes) supervivientes al tratamiento con electrones acelerados aumenta significativamen- te, lo que se traduce en una mayor seguridad (IB), de tal forma que a las dosis mencionadas anteriormente, la seguridad está garantizada incluso en condiciones de abuso de temperatura (incremento de 2-4 ºC sobre los 4-5 ºC habituales de los productos refrigerados) durante el almacenamiento (IA). • La aplicación de electrones acelerados a lomos de cerdo frescos y adobados (estudio llevado a cabo a petición de la industria) permite duplicar su vida útil en refrigeración, lo que es de gran interés comercial para la exportación de estos a puntos de destino lejanos (IA/D). • Los virus son resistentes al tratamiento con electrones acelerados. Se requieren dosis muy elevadas (alrededor de 15 kGy) para lograr 3-5 reducciones decimales (IB), lo que ha llevado a la conclusión de que esta tecnología no es útil para reducir la presencia de virus hasta nive- les convenientes (IA-IB). Está en estudio la respuesta de virus (HAV y MNV) frente a los pulsos de luz, avanzándose que dosis de 20 J/cm2 inducen 3,44 y 2,94 reducciones logarítmicas en HAV y MNV, respectivamente (IB/IA). • Las altas presiones es otra tecnología útil para higienizar productos cárnicos RTE, pudiéndose lograr reducciones de patógenos suficientes para cumplir los objetivos de seguridad alimenta- ria establecidos en las regulaciones. Por ejemplo, en carpaccio RTE, presurizaciones a 450 MPa (5 y 10 minutos) ocasiona reducciones de 3,7 y 5,9 unidades logarítmicas de S. Enteritidis. • Los pulsos de luz permiten la eliminación parcial de patógenos en productos cárnicos RTE. Se pueden tratar productos envasados en plásticos de espesor 40-60 µm. Particularmente, en ja- món cocido RTE se logran reducciones del número de L. monocytogenes entre 1,1-1,8 D y, al tiempo, se consigue aumentar la vida útil del producto unos 30 días (IA).
- 25. Génesis y actividades del proyecto “Productos cárnicos para el siglo XXI” 25 • Los bioconservantes (nisina por ejemplo) incrementan la acción letal de las altas presiones. Se ha determinado la viabilidad y eficacia de varios tratamientos combinados (IA/D). Por ejem- plo, el efecto listericida en jamón cocido RTE aumentó cuando se combinaron presurizaciones de 600 MPa con enterocinas A y B (IB-IP). • La lactoferrina y derivados (en particular los amidados) son antimicrobianos con actividad sinérgica con otros agentes como las bacteriocinas. Por ejemplo, la combinación de lactoferri- na activada con presurizaciones de 450 MPa redujo el número de patógenos entre 1 y 3 uni- dades logarítmicas (IB/IA). • Se ha estudiado el efecto de algunas tecnologías (electrones acelerados y tratamientos térmi- cos) en la variabilidad y fase de latencia de varios microorganismos. 2.3. Líneas adicionales que han surgido durante el desarrollo del proyecto • Subproyecto PROCARTE: Estudio estructural de productos cárnicos mediante técnicas espec- troscópicas avanzadas y no destructivas (Raman, resonancia magnética nuclear –RMN–, ima- gen de resonancia magnética –IRM– y resonancia de espín electrón –REE–). Por ejemplo, la RMN de alta resolución ha demostrado ser útil para diferenciar jamón curado obtenido a partir de cerdos con distintos regímenes de alimentación y cría de los mismos. Está en estudio una nueva tecnología basada en la aplicación de fluidos supercríticos asistidos por ultrasoni- dos para eliminar microorganismos contaminantes. • Subproyecto DETRAPAT: Estudio de la antibiorresistencia en cepas de L. monocytogenes aisla- das del ambiente de industrias cárnicas y productos cárnicos. Aplicación del conocimiento adquirido a la detección de virus de interés en la industria cárnica. • Subproyecto NITRARED: Formación de Zn-protoporfirina en ausencia de nitratos/nitritos. • Subproyecto FUNCIOCA: Incremento de los componentes bioactivos ensayados, así como de los elaborados cárnicos que ha sido objeto de procesos de reformulación para obtener pro- ductos saludables y funcionales. 2.4. Programa de formación (Master y Curso Internacional) El máster ha sido acreditado por la ANECA, lo que avala su excelencia. El máster proporcio- na acceso a un doctorado con mención de calidad en “Ciencia de los Alimentos” y coexiste con doble titulación con un master en “Ingeniería Alimentaria” que imparte la Universidad de Beja de Portugal. La importancia del máster y del curso internacional está estrechamente relacionada con la transferencia de personal formado; en términos generales, el destino de un 40-50% de los alum- nos del máster ha sido su incorporación a centros de investigación para realizar el doctorado, un 30-35% están desarrollando su actividad profesional en administraciones públicas y un 20- 25% se ha incorporado a industrias cárnicas. La procedencia de la mayoría (más del 80%) de los alumnos del Curso Internacional ha sido de las empresas del sector cárnico y de las de servicio y equipamiento industrial. Por otra parte, de las encuestas realizadas al final del máster y curso internacional transciende un alto grado de satisfacción por parte de los alumnos tanto en los aspectos docentes como en los de gestión. Asimismo, han supuesto un punto de encuentro idó- neo para establecer relaciones profesionales perdurables entre las entidades y empresas de procedencia de alumnos y profesores. 2.5. Interacciones entre los diferentes grupos de CARNISENUSA Uno de los aspectos más destacados que figuraba en las bases de la convocatoria del Pro- grama Consolider-Ingenio 2010 era la interacción y colaboración entre distintos grupos científi- cos con el objetivo de potenciar la investigación de vanguardia y obtener el máximo rendimien- to posible de los recursos destinados a la investigación científica y técnica. Así, en el preámbulo
- 26. 26 Juan A. Ordóñez de la Resolución 20220/2005 por la que se establece el Programa Consolider-Ingenio 2010, entre otras cosas, se especifica que “El Programa Consolider pretende trascender del ámbito propio de una organización concreta, fomentando que investigadores de distintos centros de I+D trabajen en colaboración. Por todo ello se estructura como un programa abierto, siempre que se trate de equipos de alto nivel y que se comprometan a la evaluación externa de su Programa de actividad investigadora”. Y más adelante, lo dispuesto en el apartado quinto, punto 2 indica que: “Los Programas de actividad investigadora incluirán actividades de I+D que tenderán a potenciar las interfases activas; facilitarán la colaboración entre investigadores que actúen tanto en el sector público como en el privado, abriendo puentes entre unos y otros; favorecerán tanto la agrupa- ción de investigadores y tecnólogos como de recursos y proyectos, a los efectos de potenciar un marco de excelencia”. Atendiendo a estas disposiciones, se preparó un plan de trabajo para acudir a la convocatoria acorde con lo especificado en esta Resolución, el cual ha ido comple- tándose y acentuándose a media que transcurría el desarrollo del proyecto CARNISENUSA, pu- diéndose decir que las sinergias (interacciones, colaboraciones e intercambio de conocimientos) han sido intensas y continuas. En la figura 2 se muestran esquemáticamente. UEX Nitrosaminas Olfatometría AINIA Sensorial CSIC (ICTAN) NitritosUNIZAR Pigmentos UPV Migración de nitritos UCM Microbiología (alterantes y patógenos) Volátiles IRTA Jamones Embutidos Vitaminas Oxidación enzimática INDUSTRIA PROCARTE UB Virus HOSPITAL AINIA Virus (PCR) ULE Prevalencia Contaminación alimentos UNIZAR Prevalencia Toma de muestras IRTA Métodos Microorganismos patógenos UEX Micotoxinas Patógenos Métodos Micro UN Minerales Pefil lipídico AINIA Pefil lipídico Extractos vegetales CSIC (ICTAN) Pefil lipídico Extractos (algas, nuez,mananos,etc.) Licopeno UCM (Vet) Licopeno Vitaminas Minerales UPV Diseño productos IRTA Extractos vegetales Anserina, taurina, etc. UCM (Far) Perfil lipídico Extractos vegetales IONISOS Ibérica E-Beam HOSPITAL IRTA HPH Bacteriocinas Nisina Pulsos DETRAPAT AINIA Virus (PCR) UCM Variabilidad microbiana INIA HPH Bacteriocinas Lactoferrina UB Virus UCM E-Beam Espectros Pulsos de luz UPV Modelización SupercríticosNITRARED UNIZAR MAP CAI-UCM RMN IONISOS Ibérica E-Beam CSIC (IEM) Grupos pertenecientes al mismo subproyecto Grupos de distinto subproyecto pero pertenecientes a CARNISENUSA Institución ajena a CARNISENUSA Interacción activa con trabajos experimentales conjuntos Intercambio de conocimientos Figura 2. Representación esquemática de las interacciones y colaboraciones entre grupos de investigación de las instituciones que han participado en el proyecto CARNISENUSA. La actividad científica desarrollada en CARNISENUSA no se ha limitado a investigaciones programadas por los equipos de los subproyectos y en las interacciones entre los mismos sino que también se han mantenido relaciones con equipos extranjeros en varios frentes, las que se han clasificado en cuatro tipos. Entre ellos, el que adquiere más importancia quizás sea el de
- 27. Génesis y actividades del proyecto “Productos cárnicos para el siglo XXI” 27 estancias superiores a 3 meses de investigadores de CARNISENUSA en centros de investigación extranjeros con el objetivo de profundizar en la formación científica de investigadores jóvenes. No menos importante ha sido la admisión de investigadores extranjeros en centros CARNI- SENUSA, desde estancias cortas hasta otras de periodos largos (más de 2 años) con la finalidad, estas últimas, de realizar la tesis doctoral. Un tercer grupo son las estancias cortas (menos de tres meses) de investigadores de CARNISENUSA en centros extranjeros con el fin de poner a punto una técnica o aplicar algún método que estaba plenamente desarrollado en el laboratorio de destino. Finalmente, una actividad muy normal en las universidades es la acogida de estudiantes “Erasmus” y de otros países no acogidos a este programa de intercambio, muchos de ellos, apar- te de la formación docente, han participado en la parte experimental de algunas líneas e incluso figuran como coautores en los artículos que se publicaron; es una vertiente de menor importan- cia pero hay que manifestarla porque ha sido una forma más de ensanchar el rendimiento de los fondos del proyecto. En la figura 3 se muestra esquemáticamente las relaciones de CARNI- SENUSA con centros extranjeros. DETRAPAT FUNCIOCA NITRARED PROCARTE X. Fernández IFR-Norwich J. Aguirre IFR-Norwich Reino Unido M. Locatelli (Ita) P. Motzo (Ita) A. Ozcelik (Tk) R. Botta (Ita) S. Cammarotta (Ita) I. Galán TNO-Zeist Holanda M. García Univ. Gante Bélgica M. Gratacós Univ. Copenhagen S. Ventanas Univ. Helsinki Finlandia M. Decimo CNR (Milán) J. Gómez Colombia J. Sánchez Univ. México R.I. Castillo Univ. México I. Paniagua Univ. México C. Gámez Univ Roma I. López Univ. Connecticut L. Salcedo Univ. Massachusetts M. Utrera Univ. México J.G. Rodríguez Univ. Nayarit Méjico R. Maneta Inst. Polit. Leiria Portugal D. Djenane Univ. Tizi-Ouzou Argelia C. Cabeza Univ. Milán J. Aguirre Univ. Tesalónica Grecia M. del Alba Univ. Reading Reino Unido C. Ortuño Univ. Auckland Nueva Zelanda M. Bertoni (Ita) Tania Toscani Est. Experimtal Parma (Italia) D. Aguilar (Chile) V. Agurto (Chile) Mª X. González (Guatemala) Al. Rodríguez Univ. Cranfield Irlanda Al. Rodríguez Univ. Aarhus Dinamarca D. Gómez Univ. Galway Irlanda M. J. Andrade Univ. Copenhaguen Dinamarca S. Bover-Cid DTU-Food Dinamarca A. Hereu DTU-Food Dinamarca N. Belletti Univ Bologna Italia Mª Milagros Medina (Paraguay) Violeta Hernández (México) Trinidad Pérez Univ. Oporto Portugal M. Serdaroglu Univ. Izmir (Turquía) S. Tahmouzi R.A.N.R. (Irán) Figura 3. Relaciones de CARNISENUSA con centros de investigación extranjeros. 2.6. Otras actividades de CARNISENUSA En este documento se han recogido resumidamente las actividades de CARNISENUSA en el ámbito científico pero hay otras de otro tipo relacionadas con los compromisos que en su día se firmaron con el MEC. Una vez financiado el proyecto hubo que redactar un Convenio de Ejecución con el objetivo de precisar los compromisos de los beneficiarios, las condiciones
- 28. 28 Juan A. Ordóñez de desarrollo y los parámetros de evaluación y otras premisas de obligado cumplimiento, todas ellas recogidas en las condiciones especificadas en la Resolución publicada en el BOE. A tal fin, el Convenio de Ejecución se firmó el 9 de Diciembre de 2007, por parte del MEC, por el Secre- tario General de Política Científica y Tecnológica y, por la de CARNISENUSA, por el represen- tante legal de la Entidad Gestora, el IRTA, y el coordinador general del proyecto, el autor del presente escrito. En el convenio se especifican una serie de cláusulas relativas, entre otras, a compromisos del equipo beneficiario, obligaciones y responsabilidades, evaluación, control y seguimiento, programa de financiación y duración del convenio. Son facetas de tipos admi- nistrativo, estadístico y económico que no caen dentro del objetivo del presente capítulo. No obstante, la elaboración del presente libro pretende también “rendir cuentas” a la sociedad con el fin de dar a conocer el uso que se ha hecho de los recursos que el Estado Español puso en nuestras manos que, en definitiva, son aportaciones de los ciudadanos españoles. En consecuencia, se recogen en el libro una serie de capítulos donde puede observarse el grado de cumplimiento de los compromisos que los investigadores de CARNISENUSA adquirieron en su día. Agradecimientos Las actividades resumidas en este capítulo se han realizado en el marco de CARNISENUSA agradeciendo al MEC su financiación y también a otros proyectos que han colaborado en las investigaciones, los cuales han quedado reflejados en los capítulos correspondientes a cada uno de los subproyectos. Referencia Ordóñez, J.A., Córdoba, J.J, y Ventanas, J. 2011. Productos cárnicos para el siglo XXI: seguros, nutritivos y saludables. Universidad de Extremadura. Servicio de Publicaciones. Cáceres.
- 29. Capítulo III Detección e incidencia de microorganismos patógenos en carne y productos cárnicos Juan J. Córdoba Higiene y Seguridad Alimentaria. Facultad de Veterinaria (UEx). Cáceres Javier Yangüela Higiene, Inspección, Control y Microbiología de los Alimentos. Facultad de Veterinaria (UNIZAR). Zaragoza Andrés Otero Higiene y Tecnología de los Alimentos. Facultad de Veterinaria (ULE). León Teresa Aymerich Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (IRTA). Monells Alejandro Rodrigo AINIA. Valencia Mar Rodríguez Higiene y Seguridad Alimentaria. Facultad de Veterinaria (UEx). Cáceres 1. Introducción El análisis de la incidencia de patógenos en alimentos es uno de los objetivos prioritarios de la Unión Europea en materia de seguridad alimentaria y concretamente en carne y productos cárnicos. Se pretende con ello valorar el riesgo derivado del consumo de este tipo de productos, así como la adopción de criterios microbiológicos, medidas preventivas y correctoras eficaces que eviten la presencia de patógenos en los productos elaborados. Para poder adoptar medidas preventivas y correctoras en los procesados de carne y productos cárnicos es necesario que previamente la industria disponga de técnicas sensibles capaces de de- tectar de forma precisa y específica a los microorganismos patógenos. Además deben ser técnicas rápidas que permitan a la industria cárnica agilizar la gestión y la toma de decisiones para evitar la presencia de microorganismos patógenos en los productos elaborados. Entre los métodos de de- tección de patógenos están los tradicionales de recuento e identificación en medios de cultivo, que requieren tiempo prolongado de análisis y suelen ser muy laboriosos. Como alternativa a los mé- todos tradicionales están los métodos moleculares basados en ADN. Entre ellos, la reacción en ca- dena de la polimerasa (PCR) que permite la detección rápida, sensible y específica de un gran número de muestras (Selma y col., 2008; Nicolaisen y col., 2009). No obstante, su aplicación en carne y productos cárnicos puede ser problemática debido a la complejidad de la matriz cárnica, a la baja concentración en la que suelen encontrarse los microorganismos patógenos, así como a la posible detección de células muertas (Paterson, 2007; Paterson y Lima, 2009; Sant’Ana y col., 2010).
- 30. 30 J. J. Córdoba, J. Yangüela, A. Otero, T. Aymerich, A. Rodrigo, M. Rodríguez En este trabajo se han desarrollado diferentes métodos de PCR para la detección, enumera- ción y tipificación de Listeria monocytogenes, Salmonella, E. coli O157:H7, Staphylococcus aureus enterotoxigénico y mohos toxigénicos valorando su eficacia/tiempo en relación a los métodos de referencia. Se han evaluado los diferentes protocolos de PCR en tiempo real (qPCR) desarrollados en combinación con diferentes pre-tratamientos para eliminar los inhibidores de la PCR y/o con- centrar la muestra, con el objetivo de mejorar el límite de detección de la técnica aplicada, dismi- nuir el tiempo de pre-enriquecimiento, detectar diferencialmente células viables y agilizar la ob- tención de resultados. Así mismo mediante la utilización de métodos tradicionales de cultivo y aislamiento en pla- ca y técnicas de PCR se ha evaluado la incidencia de las bacterias patógenas más preocupantes en carne y productos cárnicos. Además se ha considerado la tipificación molecular de diferentes cepas de L. monocytogenes aisladas de productos cárnicos mediante técnicas moleculares como factores clave en planes APPCC. 2. Incidencia y prevalencia de baterías patógenas en las industrias cárnicas Se ha evaluado la incidencia en productos listos para el consumo (ready to eat, RTE) e industrias elaboradoras de bacterias patógenas preocupantes tales como L. monocytogenes, Salmonella, Aeromonas, Yersinia enterocolitica, E. coli productoras de toxinas shiga y Cam- pylobacter. 2.1. Incidencia de Listeria monocytogenes Previamente al análisis de la incidencia de L. monocytogenes se ha evaluado la eficacia de diferentes métodos en la recuperación de este patógeno de superficies de equipos y utensilios, con el objetivo de seleccionar el más adecuado. Se han evaluado 9 procedimientos de toma de muestras ambientales esponja de celulosa, toalla pre-humedecida, hisopos (de algodón, de alginato y metálico), disco de algodón, gasa de algodón, 5 modelos de mini-rodillos homoge- neizados en Stomacher y Vibromatic, bolitas de estropajo de acero inoxidable, placas RODAC (con agar PALCAM y agar ALOA) y sistema Petrifilm (Gómez y col., 2012a; Gómez y col., 2012b). El mini-rodillo 100% fibra de lana muestra el mayor porcentaje de recuperación de L. monocytogenes en las superficies de acero inoxidable, mientras que la esponja de celulosa es el método más eficaz sobre superficies de polietileno de alto peso molecular. Sin embar- go, el hisopo muestra una baja y muy variable capacidad de recuperación bacteriana, que puede oscilar entre 25% a 91% de los microorganismos inoculados artificialmente en super- ficies duras metálicas y de otros materiales, de acuerdo a lo observado por Angelotti y col. (1964). Las técnicas de muestreo más eficaces (mini-rodillo 100% fibra de lana y esponja de celu- losa) se han utilizado para evaluar la incidencia de L. monocytogenes en las superficies de industrias cárnicas de las provincias de Zaragoza (5), Teruel (7), Salamanca (6), Cáceres (4), Badajoz (5) y Huelva (5). En cada muestra se realizó, como análisis de rutina, recuento de L. monocytogenes e investigación de Listeria spp. (Gómez y col., 2012b). Al mismo tiempo que se realizó el muestreo ambiental, se recogieron 87 productos cárnicos RTE en las mismas in- dustrias (15 productos cocidos, 48 crudos curados, 23 madurados con estructura muscular íntegra (MEMI) y 1 producto adobado). Además se adquirieron 42 productos cárnicos en esta- blecimientos de las ciudades de Huesca y Zaragoza (20 productos cocidos, 8 crudos curados y 14 madurados con estructura muscular íntegra). En estos productos se realizó el recuento de L. monocytogenes/g (UNE-EN-ISO 11290-2: 2000/A1, 2005) y la investigación de Listeria spp./25 g (UNE-EN-ISO 112910-1: 1997/A1, 2005) en cada alimento al día 0 (toma en la industria o compra en establecimientos comerciales) y a mitad y al final del período de duración mínima almacenadas a 4 °C y 10 °C.
- 31. Detección e incidencia de microorganismos patógenos en carne y productos cárnicos 31 En general, en el 24,3% de las muestras de superficies de las industrias cárnicas españolas muestreadas se detectó la presencia de L. monocytogenes. Hay que destacar el alto número de resultados positivos en las máquinas embutidoras (29,4%), amasadoras (29,4%) y picadoras (28,6%); así como, en las mesas de acero inoxidable (26,0%) y cintas transportadoras de PVC (17,9%). En las superficies muestreadas con plantilla de 100 cm2 , se comprueba un rendimiento similar en la recuperación de L. monocytogenes con la esponja de celulosa y el mini-rodillo. En el análisis de los productos cárnicos RTE, se detectó L. monocytogenes en el 17,1% de los productos cocidos analizados el día 0, y este resultado se mantuvo constante durante todo el período de duración mínima en las muestras almacenadas a 4 °C, mientras que a 10 °C descen- dió el número de muestras positivas (Tabla 1). En los productos MEMI, un alto porcentaje de las muestras (37,5% y 24,3%, respectivamente) fueron positivas el día 0, descendiendo el número de positivos a lo largo de su período de duración mínima. Cuando se analiza el recuento de L. monocytogenes en las muestras positivas se observa que el 7,8% de las muestras de productos cárnicos analizados el día inicial (día 0) presentaron re- cuentos de L. monocytogenes inferiores a 100 ufc/g, mientras que el 4,7% de las muestras exce- dió este límite. Por grupos de productos, en el 8,6% de los producto cocidos analizados el día 0 se detectó L. monocytogenes. En los productos crudos curados, el 19,6% de las muestras presen- taron recuentos entre 1,0 x 10 ufc/g y 9,1 x 102 ufc/g el día 0, disminuyendo drásticamente a lo largo de su período de duración mínima. Tabla 1. Número de muestras positivas en la investigación de L. monocytogenes (Lm)/25 g y en las muestras de productos cárnicos RTE analizadas (Gómez y col., 2012a, 2012b, 2012c) Grupo alimento Día 0 MPDMa FPDMb 4°C 10°C 4°C 10°C Nº Lm/25 g Nº Lm/25 g Nº Lm/25 g Nº Lm/25 g Nº Lm/25 g Cocidos 35 6 35 6 35 2 34 5 34 4 Crudos curados 56 21 54 18 54 9 54 13 54 3 MEMIc 37 9 37 1 37 1 37 1 37 1 Adobados 1 0 1 0 1 0 1 1 1 0 27,9% 19,7% 9,5% 15,9% 6,4% a MPDM: mitad del período de duración mínima. b FPDM: final del período de duración mínima. c MEMI: madurados con estructura muscular íntegra. 2.2. Tipificación de cepas de L. monocytogenes aisladas de productos cárnicos y ambiente Se realizó un estudio en 13 empresas españolas de productos cárnicos RTE en las que se aisló L. monocytogenes. Se caracterizaron 81 cepas aisladas del día 0, 28 cepas aisladas de equi- pamiento y 53 cepas aisladas de productos finales a diferentes temperaturas de conservación y tiempos de vida útil. Las cepas fueron caracterizadas a nivel de serotipado clásico y molecular por PCR múltiple, (Doumith y col., 2004), y genotipado mediante protocolos normalizados de MLST (multilocus locus sequence typing, www. Pasteur.fr/mlst, Institute Pasteur, Francia) para genes constitutivos y MLVST (Chen y col., 2007) y MLVA (multi locus variable tandem repeats) (Sperry y col., 2008). Los serotipos 1/2a y 1/2c fueron los predominantes. El serotipo 4b (el más asociado a brotes de listeriosis) tuvo una baja incidencia y sólo se aisló en tres empresas (Figura 1). El
- 32. 32 J. J. Córdoba, J. Yangüela, A. Otero, T. Aymerich, A. Rodrigo, M. Rodríguez genotipado de las cepas mediante MLST fue mucho más discriminante que el serotipado y permitió establecer con fiabilidad diferentes contaminaciones cruzadas entre equipamiento y producto final en varias de las empresas analizadas. El genotipado por MLVA fue también muy discriminante. Figura 1. Serotipos de L. monocytogenes aislados de diferentes empresas cárnicas españolas productoras de produc- tos cárnicos fermentados y/o curados listos para consumo. A: en equipamiento, B: en producto. (A) Serotipos L. monocytogenes en equipamiento (B) Serotipos L. monocytogenes en producto 2.3. Incidencia y tipificación de Salmonella, Aeromonas, Yersinia enterotolitica, Escherichia coli productoras de toxinas shiga y Campylobacter Se evaluó la incidencia de cepas patógenas de Aeromonas móviles, Salmonella, Y. entero- tolitica, E. coli productoras de toxinas shiga y Campylobacter, así como de genes de patogeni- cidad de estos grupos bacterianos en productos cárnicos (mayoritariamente listos para el consumo), comercializados en una ciudad española (León). Se seleccionaron tres supermerca- dos correspondientes a dos zonas distintas de esta ciudad. En cada uno de ellos se procedió a adquirir, en períodos diferentes (correspondientes a estaciones climatológicas diferentes), siete tipos de productos cárnicos (5 listos para el consumo: jamón cocido, pechuga de pavo cocida, mortadela, chorizo, salchichón; 2 frescos: pechuga de pollo, lomo de cerdo). En los productos indicados se procedió a investigar la presencia de las bacterias antes mencionadas (empleando procedimientos convencionales de enriquecimiento, aislamiento en medio sólido, identificación en base a características morfológicas y bioquímicas, así como a la búsqueda, mediante métodos basados en la PCR, de la presencia, en las cepas sospechosas, de genes asociados a patogenicidad (aerA, hlyA, alt, ast y laf (en Aeromonas), invA (en Salmonella), fla (en Campylobacter), yst (en Y. enterocolitica), stx1 y stx2 (en Aeromonas y E. coli)). Adicional- mente, se han recogido y caracterizado cepas de las bacterias arriba indicadas procedentes de casos de gastroenteritis y diarreas prolongadas diagnosticados en el Complejo Hospitalario de León (Servicio de Microbiología). La similitud entre las cepas de diversos orígenes se estable- ció mediante un procedimiento de electroforesis en campos pulsantes. Los porcentajes de detección fueron del 1,7, 14, y 14% respectivamente para Salmone- lla, Aeromonas y Campylobacter (Tabla 2). En Salmonella destaca el 4% de muestras posi- tivas encontrado en lomo fresco de cerdo y también en productos madurados como el chorizo. Por lo que respecta a Aeromonas hubo hasta un 45% de muestras positivas en carne fresca (pechuga de pollo y lomo fresco de cerdo). Igualmente en un porcentaje muy elevado de muestras de pechuga de pollo (64%) y de lomo fresco de cerdo (32%) se detec- tó Campylobacter. En ninguna de las muestras de las carnes frescas y de los productos cárnicos analizados se detectó la presencia de Y. enterocolitica yst+ ni de E. coli stx1+ ó stx2+. La incidencia de estas bacterias sería pues inferior al 0,6% en cada uno de los productos analizados (inferior al 0,08% si se consideran la totalidad de ellos).
- 33. Detección e incidencia de microorganismos patógenos en carne y productos cárnicos 33 Por otra parte, de un total de 864 casos clínicos (de gastroenteritis y diarreas prolongadas) diagnosticados en el Complejo Hospitalario de León se han aislado 18 cepas de Salmonella invA+, 56 de Aeromonas hlyA+ ó alt+ ó aerA+ ó ast+ ó laf+, 46 cepas de Campylobacter fla+, 10 cepas de Y. enterocolitica yst+ y 16 cepas de E. coli stx1+ ó stx2+. La comparación genética mediante electroforesis de gel en campo pulsante (PFGE), entre las cepas patógenas aisladas de carnes y productos cárnicos analizados en este trabajo, las cepas de origen clínico y las de otros orígenes que forman parte de la colección nuestro cen- tro pusieron de manifiesto que: 1) Para Aeromonas, las cepas de carnes y productos cárnicos eran poco similares (menos de un 50%) a las cepas de origen clínico. Las cepas aisladas de agua en su mayoría eran poco similares a las clínicas y a las procedentes de carnes y productos cárnicos (entre un 50 y un 70% de similitud). 2) Para Salmonella las cepas aisladas de carnes y productos cárnicos eran poco similares a las clínicas (menos de un 30%). Todas las cepas de origen clínico eran más similares entre sí que lo eran con las aisladas de carnes y productos cárnicos. 3. Desarrollo de métodos para la detección de microorganismos patógenos en carne y pro- ductos cárnicos Se han desarrollo métodos de PCR convencional y qPCR para la detección y cuantificación de microorganismos patógenos en carne y productos cárnicos. En estos métodos se incluyen procedimientos eficaces para la obtención del ADN a partir de las matrices cárnicas y evalua- ción de su aplicabilidad en productos cárnicos. 3.1. Detección de L. monocytogenes y Salmonella spp. 3.1.1. Tratamientos pre-PCR y límite de detección de la qPCR En la detección de patógenos como L. monocytogenes y Salmonella el tratamiento pre-PCR es una de las posibles causas de falsos negativos o disminución de la sensibilidad. Con el ob- jetivo de buscar un tratamiento pre-PCR que eliminen inhibidores procedentes de las matrices Tabla 2. Incidencia de presuntas cepas patógenas de Salmonella, Aeromonas móviles y Cam- pylobacter en carnes frescas y en productos cárnicos listos para el consumo Producto Salmonella (invA+) Aeromonas hlyA+/alt+/aerA+/ast+/laf+1 Campylobacter fla+ Pechuga de pollo 1% 45% 64% Lomo (fresco) de cerdo 4% 45% 32% Jamón cocido 1% 0,6%2 0,6%2 Pechuga de pavo cocida 0,6%2 4% 0,6%2 Mortadela 2% 2% 0,6%2 Chorizo 4% 1% 0,6%2 Salchichón 0,6%2 0,6%2 0,6%2 Todos los productos cárnicos RTE 1,4% 1,7% 0,1% Todos los productos 1,7% 14% 14% 1 Poseedoras de alguno de los genes señalados. 2 No se detectaron bacterias de este tipo en ninguna de las muestras analizadas. La incidencia se considera, por tanto, inferior al 0,6%.
- 34. 34 J. J. Córdoba, J. Yangüela, A. Otero, T. Aymerich, A. Rodrigo, M. Rodríguez cárnicas se han evaluados distintos protocolos de tratamiento en diferentes homogeneizados cárnicos (jamón cocido, mortadela, jamón curado y fuet). Entre los métodos evaluados están los protocolos PrepMan® Ultra (Applied Biosystems) y los normalizados del sistema BAX® (Dupont, Qualicon) para Salmonella y L. monocytogenes 24E (Oxoid). También se han evalua- do los sistemas de aislamiento y purificación de ADN a partir del homogeneizado mediante el robot QIAcube y el DNeasy® Blood Tissue Mini Kit de Qiagen, así como la concentración y purificación de la muestra mediante separación inmunomagnética recirculante (PATHA- TRIX® AUTO, Matrix Bioscience). En los diferentes productos cárnicos evaluados, el límite de detección (LD) de la qPCR fue, en general, mejor para Salmonella que para L. monocytogenes. El LD más bajo se obtu- vo mediante la combinación de la qPCR con el aislamiento de ADN más purificado (Dneasy® kit y robot extracción automática QIAcube). La lisis rápida con PrepMan®, aun siendo un método sencillo, rápido y económico, no consiguió eliminar todos los inhibidores presentes en la muestra, hecho más evidente en la detección de L. monocytogenes, para la cual se uti- lizó un medio complejo (LEB24). El sistema BAX® presentó un LD alrededor de 4 log ufc/ ml para Salmonella spp. y superior a 5 log ufc/ml para L. monocytogenes. (Tabla 3). La se- paración inmunomagnética (Pathatrix®) si bien permitió eliminar la mayoría de inhibidores de la PCR, no consiguió concentrar adecuadamente L. monocytogenes y Salmonella. Tabla 3. Límites de detección (LD, en log ufc/ml) estimados (según modelos de regresión logística A y B) para Salmonella spp. y L. monocytogenes dependiendo del tipo de muestra y tratamiento pre-PCR (Martín y col., 2012) L. monocytogenes LD (log ufc/ ml) Salmonella LD (log ufc/ml) Pre-PCR Tratamiento Volumen Jamón curado Jamón cocido Fuet Jamón curado Jamón cocido Fuet Modelo A PrepMan 2 ml 4,68 4,45 4,08 4,71 2,84 2,31 QIAcube 2 ml 1,48 1,35 1,15 1,77 1,28 1,17 BAX 5,28 5,20 5,07 4,38 3,75 4,38 Modelo B PrepMan 2 ml 4,89 4,30 3,85 5,16 2,77 2,27 4 ml 4,63 4,07 3,39 4,69 2,48 1,92 10 ml 4,98 4,98 3,67 4,38 2,29 1,69 QIAcube 2 ml 1,19 1,32 1,09 1,82 1,14 1,13 4 ml 0,89 1,08 0,91 1,60 0,97 0,94 10 ml 1,22 1,14 1,00 1,45 0,85 0,81 3.1.2. Efecto de los tratamientos pre-PCR específicos para la diferenciación de células viables mediante qPCR La PCR debe ofrecer la posibilidad de distinguir entre células viables y no viables, especial- mente cuando se detectan patógenos en elaborados cárnicos en los que hay un tratamiento térmico (productos cocidos), se ha producido una reducción de la actividad del agua (cru- dos-curados) o ha habido un descenso del pH. Estas modificaciones han podido provocar la inactivación de los microorganismos patógenos que sin embargo siguen siendo detectados en una PCR, y generando de esta forma un resultado poco real. En este trabajo se ha pretendido establecer una metodología que aplicada a la PCR permita diferenciar entre células muertas y vivas de patógenos. Para ello se han evaluado diversas estrategias que puedan aplicarse a la detección por qPCR.
- 35. Detección e incidencia de microorganismos patógenos en carne y productos cárnicos 35 1. Centrifugación mediante gradientes de densidad a diferente osmolaridad y viscosidad (Per- coll 10-100%). 2. Aislamiento de ARN (robot QIAcube y el kit Rneasy Bacteria Protect de Qiagen), transcrip- ción reversa (QuantiTect Reverse Transcription Kit de Qiagen), y amplificación del cDNA de genes constitutivos mediante qPCR. 3. Finalmente se evaluó pre-tratamiento de las células mediante los agentes intercalantes, EMA (monoazida de etidio) y PMA (monoazida de propidio) presumiblemente selectivos para células muertas. Los resultados de la analítica realizada en un ensayo con fuets inoculados artificialmente a altas concentraciones de L. monocytogenes (106 ufc/g) presurizados o no, constataron que me- diante el aislamiento de ADN seguido de la qPCR se detectaban tanto células viables como muertas puesto que, mientras el valor de ciclo umbral (Ct) era prácticamente el mismo en las muestras tratadas o no tratadas por AP, el recuento de viables en placa mostró una reducción de 5 ciclos logarítmicos. En los ensayos realizados con gradientes de densidad, las condiciones óptimas obtenidas para la diferenciación de células viables y muertas fueron Percoll al 70% y centrifugación 20.000 g (Figura 2). No obstante, se observó interferencia entre las células vivas y muertas, especialmen- te en los tratamientos en alimentos, lo que compromete su aplicación en matrices cárnicas. Figura 2. Diferenciación de células vivas y muertas de L. monocytogenes mediante centrifugación por gradiente de densidad (Percoll) (Martin y col., 2012). Los ensayos de expresión génica específica realizadas bajo diferentes tipos de estrés poten- cialmente presentes en los alimentos permitieron seleccionar cuatro genes domésticos como dianas para su posible aplicación en la detección y cuantificación de L. monocytogenes. La efi- ciencia de la qPCR de estas dianas fue muy buena, tanto cuando se ensayó con diferentes con- centraciones de ARN purificado, como cuando se ensayó a partir de la extracción de ARN de diferentes muestras de jamón cocido inoculadas con distintos niveles de L. monocytogenes y con un buen límite de detección. No obstante, en aplicación posterior en tratamientos de desconta- minación se observaron falsos positivos en las primeras horas tras la muerte celular por persis- tencia de las moléculas de ARN. La tercera estrategia, mediante combinación de la qPCR con la tinción y entrada selectiva del fluoróforo PMA en las células muertas, permitió la detección diferencial de células viables tanto en cultivo puro como en mezcla y homogeneizado cárnico en un rango dinámico de entre 102 -107 ufc/ml (Figura 3). No obstante, se observó que el EMA no era selectivo y que penetraba tanto en células muertas como vivas, con membrana intacta y afectando a su viabilidad. En los tratamien- tos térmicos llevados a cabo en homogeneizado de jamón cocido, la concentración de PMA, el
- 36. 36 J. J. Córdoba, J. Yangüela, A. Otero, T. Aymerich, A. Rodrigo, M. Rodríguez tiempo de fotoactivación y el tamaño del fragmento amplificado se han observado como factores clave para una correcta diferenciación y cuantificación de células viables (Martín y col., 2103). Figura 3. Efecto del PMA sobre la PCR a tiempo real de células de salmonelas vivas e inactivadas mediante tratamiento térmico. Cultivo CECT545 (107 UFC/ml) (Martín y col., 2013). 3.1.3. Aplicabilidad de la PCR en los estudios de incidencia de Salmonella y L. monocytogenes en productos cárnicos Se pretendió evaluar la aplicabilidad del método de PCR con el pre-tratamiento desarrollado en la detección de contaminación por L. monocytogenes y Salmonella en diferentes fases de ela- boración de productos cárnicos. Se evaluaron 10 industrias artesanales de embutidos crudos-cura- dos a lo largo de un período de tres años. Se analizaron 500 cm2 de las superficies de diferentes tipos de equipamiento, cuchillos y mesas y de 25 g de mezcla cárnica inicial, tripa natural y pro- ducto final (fuet). La presencia/ausencia de Salmonella y L. monocytogenes se determinó después del enriquecimiento de la muestra en el medio de cultivo adecuado durante 24 h/48h a 37ºC y mediante técnicas de PCR (Malorny y col., 2003 y d’Agostino y col., 2004) y cultivo en placa. L. monocytogenes fue, como ya ha sido indicado por otros autores (Thévenot y col., 2006), la bacteria más ubicua, dado que se detectó en todas las muestras evaluadas tanto de producto como de equipamiento a excepción de las mezcladoras. La masa inicial del producto presentó el porcentaje más alto de muestras positivas (47,4%), seguida del equipamiento (11,8%), aunque en porcentajes muy variables dependiendo del mismo y los productos finales (15,8%), aunque con recuentos inferiores a 100 ufc/g. El equipamiento con un mayor porcentaje de positivos fue la embutidora, aunque el recuento más elevado se localizó en una picadora con 575 ufc/100 cm2 . Salmonella sólo se detectó en la materia prima, con un 26,3% en la masa y un 21,1% en las tripas (Martín y col., 2011) (Figura 4). En cinco de las 10 fábricas se realizaron diferentes muestreos en un período de 2-3 años. Se observó una variación importante de la presencia de patógenos pero no se pudo establecer ninguna relación entre la estación del año y la localización geográfica. 3.1.4. Aplicabilidad de la qPCR en la detección de L. monocytogenes artificialmente inoculada en productos cárnicos fermentados y/o curados Con este estudio se pretendió evaluar la aplicabilidad del método de qPCR con el tratamien- to previo de la muestra para la detección de L. monocytogenes en productos cárnicos, valorando la capacidad de detección en productos madurados y sometidos a otros tratamientos como altas presiones (AP). Para el desarrollo del trabajo se inocularon artificialmente con L. monocytogenes y en un rango entre 10-103 ufc/g, diferentes productos cárnicos, masa inicial del fuet y los pro-
- 37. Detección e incidencia de microorganismos patógenos en carne y productos cárnicos 37 ductos finales, chorizo, lomo y jamón curado. Se envasaron al vacío y posteriormente la mitad de las muestras se trataron por AP (600 MPa). Los productos loncheados, objeto de estudios de vida útil segura se conservaron en refrigeración. En las muestras se determinó el recuento de L. monocytogenes viable en agar ALOA y la determinación de presencia/ausencia del patógeno se realizó previo enriquecimiento (medio OB y LEB 24h), siembra en placa y detección por qPCR mediante protocolo normalizado, BAX®system (Dupont, Qualicon, http://www2.dupont.com/ Qualicon/en_US/prodcts/BAX_System/index.htm) que incluye lisis celular rápida, extracción de ADN (robot Qiacube) y método de qPCR (Rodríguez-Lázaro y col., 2004). Figura 4. Incidencia de Salmonella spp. y L. monocytogenes en industrias artesanales de embutidos (fuet) mediante métodos rápidos de PCR (Martín y col., 2011). Se observó una capacidad de detección diferencial según el tratamiento pre-PCR aplicado, el protocolo utilizado y el alimento analizado. En lomo curado y fuet, el sistema BAX® System fue capaz de detectar un 82% y un 92%, respectivamente, de las muestras positivas al cabo de 24 h de enriquecimiento y un 100% de las mismas al cabo de 48 h de enriquecimiento en ambos productos. No obstante, en jamón curado sólo fue capaz de detectar el 66,6% a 24h y el 85,2% a 48 h y en chorizo, el porcentaje disminuyó al 26,6% a las 24 h y al 44,4% a las 48 h. Utilizando el método de qPCR desarrollado (aislamiento ADN robot Qiacube + qPCR), el 100% de las mues- tras fueron concordantes con el método tradicional de detección en medio de cultivo. No obs- tante e incluso utilizando el medio de enriquecimiento selectivo optimizado, un pequeño por- centaje de las muestras necesitaron 48 h de incubación para obtener un resultado positivo, lo que demuestra la necesidad de utilizar enriquecimiento para una detección sensible mediante qPCR de L. monocytogenes. 3.2. Detección de Escherichia coli O157:H7 E. coli O157:H7 es otro de los microorganismos patógenos preocupantes en carne y produc- tos cárnicos. En este trabajo se ha pretendido desarrollar métodos de PCR y de qPCR capaces de detectar de forma rápida y sensible a este patógeno en las matrices cárnicas. Para evaluar el efecto de la matriz cárnica y la sensibilidad de los métodos de PCR y qPCR, se inocularon por triplicado 10 tipos de productos cárnicos RTE (crudos curados y cocidos) con E. coli O157:H7 CECT 4267 a concentraciones desde 106 a 1 ufc/g y posteriormente, se realizó un enriquecimiento a 37 ºC en Caldo Verde Brillante Bilis, tomando muestras a las 0, 2, 4 y 6 h para la extracción del ADN y del ARN, previa concentración de los microorganismos con Dyna- beads anti-E. coli O157 (Gordillo y col., 2011).
- 38. 38 J. J. Córdoba, J. Yangüela, A. Otero, T. Aymerich, A. Rodrigo, M. Rodríguez Para el desarrollo y la optimización de los protocolos de PCR y qPCR, se realizó en primer lugar el diseño cebadores utilizando el programa Primer Express (Applied Biosystem) para una PCR doble que garantice la especificidad en la detección del microorganismo (Tabla 4). Esta estrategia combinaba dos marcadores específicos del serotipo de E. coli O157:H7 que incluye la amplificación de los genes rfbE y fliCh7, que codifican, respectivamente el antígeno somático O157 y el antígeno flagelar H7. Tabla 4. Secuencias de nucleótidos de los cebadores y sondas utilizadas para los ensayos de PCR y qPCR basados en metodología SYBR Green y TaqMan para la detección de E. coli O157:H7 (Gordillo y col., 2011) Cebadores / sondas Metodología Secuencia de nucleótidos (5’-3’) Tamaño del producto amplificado Referencia FLICH7-F FLICH7-R PCR GCGCTGTCGAGTTCTATCGAGC CAACGGTGACTTTATCGCCATTCC 625 pb Gannon y col. (1997) RFBEO157-F RFBEO157-R RFBEO157-P PCR qPCR (TaqMan) GGATGACAAATATCTGCGCTGC GGTGATTCCTTAATTCCTCTCTTTCC [HEX]TACAAGTCCACAAGGAAAG[BHQ1] 213 pb Gordillo y col. (2011) RGfliCh7-F RGfliCh7-R RGfliCh7-P qPCR (TaqMan) qPCR (SYBR Green) GCGCGAAGTTAAACACCACG CGGTGACTTTATCGCCATTCC [FAM]CCGAAAATACCTTGTTAACTACCGA[TAMRA] 109 pb RGrfbE-F RGrfbE-R qPCR (SYBR Green) GAGCCACCCCCATTTTCG GTTCTATGTCACTAACAGACATTTGCC 65 pb Se optimizaron las concentraciones de los cebadores y las sondas y las condiciones de las reacciones de PCR y de qPCR tal y como se muestra en la tabla 5. Tabla 5. Condiciones de temperatura y tiempo de las reacciones de PCR y qPCR, basados en metodología SYBR Green y TaqMan, concentraciones de los cebadores y sondas utilizados y valores de las distintas curvas de disociación (Tm) Metodología Concentraciones de cebadores y sondas (μM) Tm (ºC) Condiciones de la reacción PCR RFBEO157-F/-R: 0,2 FLICH7-F/-R: 0,2 95 ºC/2,5 min 35 ciclos: 94 ºC/30 s, 58 ºC/1 min, 72 ºC/1 min 72 ºC/1 min qPCR (SYBR Green) RGrfbE-F/-R: 0,6 RGfliCh7-F/-R : 0,1 76,5 ± 0,34 79,5 ± 0,35 95 ºC/10 min 40 ciclos: 95 ºC/15 s, 60 ºC/1 min Curva de disociación: 95 ºC/15 s, 60 ºC/1 min, 95 ºC/15 s qPCR (TaqMan) RFBEO157-F/-R: 0,6 RFBEO157-P: 0,3 RGfliCh7-F/-R: 0,1 RGfliCh7-P: 0,05 95 ºC/10 min 40 ciclos: 95 ºC/15 s, 58 ºC/30 s, 60 ºC/30 s En la PCR convencional se confirmó la especificidad del método por la visualización en los geles de agarosa de los dos productos amplificados de 625 pb y 213 pb sólo en las cepas de E. coli O157:H7. Con el análisis de las curvas de disociación en las reacciones de qPCR con tecno- logía SYBR Green se confirmó la amplificación de los 2 productos esperados sólo en las mismas cepas. Se obtuvieron resultados idénticos mediante la metodología TaqMan. Los límites de de- tección de los protocolos de PCR y qPCR diseñados, estuvieron en torno a 1 ufc/g con ADN y ARN (microorganismos viables) extraídos a partir de matrices cárnicas inoculadas (Tabla 6). Los métodos de qPCR diseñados fueron más sensibles que la PCR convencional, ya que se conseguía
- 39. Detección e incidencia de microorganismos patógenos en carne y productos cárnicos 39 esta sensibilidad con solo 4 h de enriquecimiento en lugar de las 6 h necesarias en el protocolo de PCR convencional. Tabla 6. Límites de detección del ensayo de qPCR con la tecnología TaqMan con E. coli O157:H7 CECT 4267 inoculado en diferentes productos cárnicos antes y después de 2 y 4 h de enriquecimiento a 37 °C. Los datos están expresados en ufc/g (Gordillo y col., 2013) Producto cárnico 0 h 2 h 4 h ADN ADNc ADN ADNc ADN ADNc Jamón curado (3,5±0,67) x 102 (3,1±0,81) x 101 (3,5±0,67) x 100 (3,1±0,81) x 100 1 1 Lomo curado (3,1±1,06) x 101 (4,2±2,04) x 100 (3,2±1,06) x 100 1 1 1 Salami (3,1±1,83) x 102 (3,9±1,77) x 101 (3,1±1,83) x 101 (3,9±1,77) x 100 1,1±1,83 1 Salchichón (3,5±0,74) x 102 (3,3±0,83) x 100 (3,5±0,74) x 101 1 1 1 Chorizo (2,6±0,68) x 102 (4,8±2,1) x 100 (2,6±0,68) x 101 1 1 1 Pechuga de pavo (4,1±1,54) x 101 (5,1±2,78) x 100 (4,1±1,54) x 100 1 1 1 Jamón cocido (3,1±1,45) x 101 (4,2±2,56) x 100 (3,1±1,45) x 100 1 1 1 Chopped (3,9±1,17) x 102 (5,3±2,78) x 101 (3,9±1,17) x 101 (5,3±2,78) x 100 1 1 Mortadela (4,1±1,38) x 101 (8,2±2,76) x 100 (4,1±1,38) x 100 1 1 1 3.3. Detección de Staphylococcus aureus enterotoxigénico El objetivo de este trabajo ha sido diseñar un método de qPCR para la cuantificación en pro ductos cárnicos de S. aureus productores de enterotoxinas. Para ello se han diseñado cebadores que permiten la amplificación de los genes que codifican las más de 20 toxinas estafilocócicas descritas hasta el momento. Se utilizaron cebadores descritos en la bibliografía (Sharma y col., 2000), aunque para poder detectar todas las enterotoxinas hubo que diseñar cebadores específicos, para ello se alinearon todas las secuencias de los genes que codifican cada toxina estafilocócica y mediante el progra- ma OligoAnalyzer 3.1 se diseñaron varios cebadores reversos degenerados debido a la escasez de zonas conservadas entre estas secuencias Se optimizó un protocolo de PCR y se evaluó la especificidad del método utilizando 10 ce- pas de S. aureus, 38 cepas de otras especies del género Staphylococcus y 8 cepas de otros géne- ros microbianos, productoras y no productoras de todas las enterotoxinas. La sensibilidad del método se determinó realizando diluciones decimales de cepas enterotoxigénicas y la posterior extracción del ADN de cada una de ellas. Con el protocolo de qPCR optimizado se obtuvo un único producto de amplificación con un tamaño aproximado de 161 ± 4 pb y que por tanto presentaba dos valores de temperatura de fusión (Tm) debido a las diferencias encontradas en- tre los fragmentos amplificados de cada enterotoxina (Figura 5). Para evaluar el efecto de la matriz cárnica y la sensibilidad del método de qPCR, se inocu- laron por triplicado 6 tipos de productos cárnicos RTE (crudos curados y cocidos) con S. aureus a concentraciones desde 106 a 1 ufc/g y posteriormente, se realizó un enriquecimiento a 30 ºC en Caldo Manitol Sal tomando muestras a las 4, 6 y 8 h para la extracción del ADN, que se rea- lizó utilizando el kit “Epicentre MasterPure DNATM ” previo tratamiento con lisostafina. Se optimizaron las concentraciones de los cebadores y las sondas y las condiciones de la qPCR tal y como se muestra en la tabla 7. Con el análisis de las curvas de disociación en las reacciones de qPCR con tecnología SYBR Green se confirmó la amplificación del producto es- perado en las mismas cepas. Este producto no se detectó en ninguna de las demás cepas utili- zadas, demostrándose así la especificidad de los protocolos de qPCR diseñados.
- 40. 40 J. J. Córdoba, J. Yangüela, A. Otero, T. Aymerich, A. Rodrigo, M. Rodríguez Tabla 7. Condiciones de temperatura y tiempo de las reacciones de qPCR, basados en meto- dología SYBR Green y concentraciones de los cebadores Concentraciones de cebadores (μM) Tm ( ºC) Condiciones de la reacción SaU: 0,2 Sa3-r: 1,5 76,8 y 78,6 95 ºC/8 min 50 ciclos: 95 ºC/10 s, 53 ºC/10 s, 72 ºC/25 s Curva de disociación: 95 ºC/15 s, 60 ºC/1 min, 95 ºC/15 s Los límites de detección de los protocolos de qPCR diseñados, estuvieron entre 1-40 ufc/g en ADN extraído a partir de matrices cárnicas inoculadas artificialmente (Tabla 8). Tabla 8. Límite de detección de la qPCR en diferentes productos cárnicos inoculados con S. aureus después de 4, 6 y 8 h de enriquecimiento a 30 °C. Los datos están expresados en ufc/g Producto cárnico 4 h 6 h 8 h Jamón curado (4,1±4,24)x104 (4,1±4,24)x102 4,1x101±4,24 Lomo curado (3,45±1,91)x102 (3,45±1,91)x101 3,45±1,91 Salchichón (2,6±1,27)x102 (2,6±1,27)x101 2,6±1,27 Chorizo (2,21±2,21)x102 (2,21±2,21)x101 2,21±2,21 Jamón cocido (2,09±0,66)x102 (2,09±0,66)x101 2,09±0,66 3.4. Detección de mohos toxigénicos Los mohos productores de ocratoxinas A (OTA), aflatoxinas, patulina, esterigmatocistina, verrucosidina y ácido ciclopiazónico son un peligro sanitario en productos cárnicos madurados como embutidos crudos-curados y jamón curado (Rodríguez y col. 2012f). En el presente traba- jo se han desarrollado métodos de qPCR para la cuantificación de mohos productores de las anteriores micotoxinas. 0,05 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 70 72 74 76 78 80 82 84 Fluorescencia Temperatura (ºC) Figura 5. Curva de disociación del producto amplificado con los valores de Tm obtenidos con las cepas de estafilococos productores de diferentes enterotoxinas.
- 41. Detección e incidencia de microorganismos patógenos en carne y productos cárnicos 41 Para el desarrollo de estos protocolos se diseñaron cebadores y sondas de hidrólisis TaqMan para la detección específica de los mohos anteriormente indicados. Los cebadores para la detec- ción de mohos productores de aflatoxinas, OTA y patulina fueron diseñados a partir de secuen- cias obtenidas de productos amplificados por PCR convencional usando cebadores previamente publicados y disponibles en la bibliografía (Bogs y col., 2006, Paterson, 2004, Richard y col., 2009), basados en los genes o-metil-transferasa (omt-1), no-ribosomal péptido sintetasa (otanpsPN) e isoepoxidon deshidrogenasa (idh) implicados en la biosíntesis de aflatoxinas, OTA y patulina respectivamente (Rodríguez y col., 2011a, 2011b y 2012e). Para los mohos productores de ACP, esterigmatocistina y verrucosidina, el diseño de cebadores y sondas se hizo a partir de secuencias conocidas de los genes dimetialil triptófano sintasa (dmaT) (Referencia de acceso GenBank DQ121455), fluG (Referencia de acceso GenBank L27817.1) y de la sonda SVr1 (Aran- da y col., 2002) implicados en la producción de estas micotoxinas, respectivamente (Rodríguez y col., 2012a, 2012b y 2012g). El análisis de las anteriores secuencias, permitió el diseño a partir de las zonas conservadas de estos genes, de 1 pareja de cebadores y de 1 sonda TaqMan para cada uno de los mohos productores indicados utilizando el software Primer Express (Applied Biosystems). A continuación, se optimizaron distintos protocolos de qPCR individuales basados en las metodologías SYBR Green y TaqMan para la detección de cada uno de los mohos pro- ductores de micotoxinas anteriormente indicados (Rodríguez y col. 2011a, 2011b. 2012a, 2012b, 2012e y 2012g). Además, se diseñaron controles internos de amplificación (IAC) para su inclu- sión en los métodos de qPCR y evitar falsos resultados negativos. Así se diseñó un IAC no com- petitivo basado en el gen de la ß-tubulina y un IAC competitivo diseñado a partir del gen hly de L. monocytogenes, para la cuantificación de mohos productores de verrucosidina y ACP, res- pectivamente. Una vez diseñados los cebadores se optimizaron las concentraciones de los cebadores y las sondas y las condiciones de la reacción de qPCR individuales para la detección de los mo- hos productores de cada micotoxina, tal y como se muestra en la Tablas 9 y 10. Con el análisis de las curvas de disociación en las reacciones de qPCR con tecnología SYBR Green de cada una de las micotoxinas, se confirmó la amplificación de un solo producto de PCR en todas las cepas de mohos productoras de cada una de las micotoxinas (Tablas 9 y 10). Estos productos no se detectaron en ninguna de las cepas no productoras, demostrándose así la especificidad de los protocolos de qPCR diseñados. Resultados idénticos se obtuvieron mediante la metodo- logía TaqMan. Además, en aquellos protocolos donde se incluyó un IAC, se demostró la vali- dez de los resultados de PCR debido a que siempre hubo amplificación de dichos IAC hubie- ra o no presencia del ADN diana de mohos toxigénicos. Tabla 9. Resumen de los resultados obtenidos en las reacciones de qPCR individuales basa- dos en las metodologías SYBR Green para cuantificar mohos productores de aflato- xinas, OTA y patulina que incluye las concentraciones de los cebadores y sondas, las condiciones de de la qPCR y los valores de las distintas curvas de disociación (Rodríguez y col. 2011a, 2011b. 2012a, 2012b, 2012e y 2012g) Micotoxinas Genes Tm (ºC) Concentración de los cebadores (nM) Condiciones de las reacciones de qPCR Aflatoxinas omt-1 86,4 ± 0,4 F-omt: 200 95 °C/10 min 40 ciclos: 95 °C/15 s 60 °C/1 min Curva de disociación: 95 °C/15 s 60 °C/1 min 95 °C/15 s R-omt: 400 OTA otanpsPN 84,6 ± 0,3 F-npstr: 400 R-npstr: 400 Patulina idh 88,0 ± 0,4 F-idhtrb: 400 R-idhtrb: 700 Esterigmatocistina fluG 84,2 ± 0,3 FluGF1: 300 FluFR1: 300
- 42. 42 J. J. Córdoba, J. Yangüela, A. Otero, T. Aymerich, A. Rodrigo, M. Rodríguez Tabla 10. Resumen de los resultados obtenidos en las reacciones de qPCR individuales basa- dos en las metodologías TaqMan para cuantificar mohos productores de aflatoxi- nas, OTA y patulina que incluye las concentraciones de los cebadores y sondas y las condiciones de temperatura y tiempo de las reacciones de la qPCR (Rodríguez y col. 2011a, 2011b. 2012a, 2012b, 2012e y 2012g) Micotoxina Genes Concentración de los cebadores, sondas (mM) Condiciones de las reacciones de qPCR Aflatoxinas omt-1 F-omt: 200 1 ciclo de 2 min a 50 ºC, 1 de 10 min a 95 ºC, 40 de 15s a 95 ºC y 40 de 1min a 60 ºC R-omt: 400 OMTprobe: 400 OTA otanpsPN F-npstr: 400 R-npstr: 400 NPSprobe: 500 Patulina idh F-idhtrb: 450 R-idhtrb: 450 IDHprobe: 450 ACP dmaT dmaTF: 300 dmaTR: 300 dmaTp: 200 IACp: 200 Copias IAC: 100 Esterigmato- cistina fluG FluGF1: 200 1 ciclo de 2 min a 50 ºC, 1 de 10 min a 95 ºC, 40 de 15s a 95 ºC y 1 final de 30 s a 59 ºC y 30 s a 61 ºC FluFR1: 200 FluGp: 200 Verrucosidina SVr1 VerF1: 400 1 ciclo de 2 min a 50 ºC, 1 de 10 min a 95 ºC y 45 de 15s a 95 ºC y 1 final de 30 s a 57 ºC y 30s a 60 ºC VerR1: 400 Verprobe: 400 TubF1: 80 TubR1: 80 Tubprobe: 80 Múltiple (aflatoxinas, OTA y patulina) omt-1 otanpsPN idh F-omt: 80 1 ciclo de 2 min a 50 ºC, 1 de 10 min a 95 ºC y 40 de 30s a 95 ºC y 1 final de 1 min a 95 ºC, 2 min a 58 ºC y 30s a 95 ºC R-omt: 160 OMTprobe: 160 F-npstr: 480 R-npstr: 480 NPSprobe: 600 F-idhtrb: 720 R-idhtrb: 720 IDHprobe: 720
- 43. Detección e incidencia de microorganismos patógenos en carne y productos cárnicos 43 Una vez optimizados los protocolos de qPCR individuales, se diseñó un protocolo de qPCR múltiple basado en los genes omt-1, otanpsPN e idh que permitió cuantificar simultáneamente mohos productores de aflatoxinas, OTA y patulina (Rodríguez y col., 2012c). Las eficiencias de los distintos métodos optimizados, tanto cuando se realizaron con el dilu- ciones de ADN genómico o con el número de copias de los distintos genes variaron entre 95 y 112% (Figura 6). Figura 6. Eficiencias de amplificación de las curvas estándar obtenidas a partir de diluciones de ADN genómico o del número de copias de los diferentes genes de los métodos de qPCR desarrollados para cuantificar cada uno de los grupos de mohos productores de micotoxinas con tecnologías SYBR Green (superior) y TaqMan (inferior). (Rodríguez y col. 2011a, 2011b. 2012a, 2012b, 2012d, 2012e, 2012g y 2012h). Los métodos de qPCR desarrollados se validaron en matrices cárnicas donde se evaluó su sensibilidad, límite de detección y eficacia en la cuantificación de mohos toxigénicos. Los lí- mites de detección variaron entre 1 y 10 esporas/g y las eficiencias entre 80 y 112%, depen- diendo de la cepa de moho y de la matriz cárnica utilizada. Estos valores se encuentran en el rango óptimo descrito por Fredlund y col. (2008), quiénes sugirieron que dichos valores de- bían estar en el rango entre 80 y 110% y el coeficiente de correlación ser ≥ 0,98. Cuando se determinó la capacidad de los métodos de qPCR diseñados para cuantificar el crecimiento fúngico en muestras inoculadas artificialmente a diferentes tiempos de incuba- ción, se obtuvo una estrecha relación (coeficiente de correlación entre 0,95 y 0,99) entre el recuento obtenido en placa (ufc) y la cuantificación mediante qPCR (Rodríguez y col. 2011a, 2011b, 2012a, 2012b, 2012e y 2012g). El método de qPCR múltiple desarrollado para la cuantificación de forma simultánea de mohos productores de aflatoxinas, OTA y patulina mostró una alta especificidad y sensibi- lidad detectando entre 10 a 100 esporas/g en diferentes matrices cárnicas inoculadas artifi- cialmente (Rodríguez y col., 2012c). Además, los valores de eficiencias en todas las matrices cárnicas variaron desde 81 a 109% y la cuantificación de la carga fúngica (esporas y mi- celio) de los alimentos inoculados en el tiempo, se observó al igual que en los ensayos de qPCR individuales, una estrecha correlación entre los recuentos obtenidos en placa y me- diante qPCR.
- 44. 44 J. J. Córdoba, J. Yangüela, A. Otero, T. Aymerich, A. Rodrigo, M. Rodríguez Los métodos de qPCR desarrollados tanto individuales como múltiples permiten la cuantifi- cación de mohos productores de micotoxinas en productos cárnicos madurados y constituyen una herramienta precisa para la cuantificación de estos mohos durante el proceso de elabora- ción. Se trata de métodos rápidos que permiten obtener resultados en 4-5 horas de análisis, lo que permite tomar medidas correctoras en partidas de productos o en secaderos concretos para evitar que los jamones o embutidos que están contaminados con este tipo de mohos toxigénicos puedan tener micotoxinas al final de la maduración. 3.5. Detección de virus entéricos humanos Los virus entéricos humanos causantes de infecciones alimentarias son otros de los microor- ganismos preocupantes en productos cárnicos RTE. En este trabajo se han desarrollado métodos de qPCR para la detección sensible de este virus en estas matrices cárnicas. Como paso inicial para la optimización del método de extracción viral a partir de diversos productos cárnicos (choped, salchichón, chorizo) inoculados artificialmente con mengovirus, se probaron previa- mente diversos tampones a pH 9,5 (tampón Tris glicina y el tampón Tris Glicina adicionado con extracto de ternera a diferentes concentraciones) y el uso opcional de una purificación final con cloroformo:butanol. Una vez optimizado este método recomendado por el Comité Europeo de Normalización (CEN) para otras matrices alimentarias se utilizó en productos cárnicos y se comparó frente a otros dos métodos automatizados (Maxwell16 de Promega y EZ1 de Qiagen) en muestras inocu- ladas con mengovirus. Finalmente, se comparó el método de extracción térmica utilizado para la realización de la recta de calibración del mengovirus según el método CEN, frente al método con tiocianato de guanidino/sílica utilizado para la extracción a partir de muestras reales, al objeto de verificar si se obtenían resultados equivalentes. La extracción del mengovirus para la realización de la curva de calibración con diferentes métodos mostró ligeras variaciones en función del método empleado como se muestra en la Tabla 11. Tabla 11. Resultados de la curva de calibración obtenida con diferentes métodos de extrac- ción de mengovirus Concentración Mengovirus Manual BioMerieux Automatizada EZ1 Automatizada Maxwell16 Lisis térmica ARN Directo1 20,25 20,33 19,92 23,10 1/10 23,34 23,46 23,00 26,21 1/100 26,85 26,89 26,61 29,64 1/1000 30,15 29,99 30,39 33,09 La lisis térmica es la que da lugar a peores resultados (Ct más altos) a pesar de ser la reco- mendada, mientras que los 3 métodos basados en tiocianato de guanidino/sílica se comportan de forma similar (Ct similares). Respecto a los ensayos realizados sobre diversos productos cárnicos se valoraron únicamen- te los métodos manuales y automatizados basados en sílica magnética y tiocianato de guanidino. De los resultados obtenidos (Tabla 12), consideramos la mejor opción, el uso del método auto- matizado Maxwell16 para la extracción del ARN viral, tanto por su eficacia, como por la ausencia de manipulación y fácil uso. De los resultados obtenidos, consideramos la mejor opción, el uso del método automati- zado Maxwell16 para la extracción del ARN viral, tanto por su eficacia, como por la ausencia
- 45. Detección e incidencia de microorganismos patógenos en carne y productos cárnicos 45 de manipulación y fácil uso. Como alternativa, el método manual de BioMerieux (recomenda- do por el CEN) también ha dado lugar a resultados satisfactorios, aunque su metodología es más tediosa. 4. Avances y aplicación de métodos en productos cárnicos Los métodos de qPCR desarrollados permiten la cuantificación de L. monocytogenes, Salmo- nella, E. coli O157:H7, estafilococos enterotoxigénicos, mohos toxigénicos y virus en carne y productos cárnicos. Se trata de métodos muy específicos y altamente sensibles detectando en la mayoría de los casos entre 1 y 10 ufc/g de producto. Además son métodos rápidos que permiten obtener resultados en tiempos de análisis muy bajos, en todo caso inferior a 12 horas, para los que se utilicen pre-enriquecimientos. Se trata pues, de protocolos que pueden aplicarse para el control de materias primas y productos en proceso dado que permiten la adopción de medidas correctoras rápidas en los procesados de carne y productos cárnicos con el objetivo de obtener productos finales libres de microorganismos patógenos. Algunos de estos métodos desarrollados están siendo utilizados por las industrias cárnicas en combinación con medidas preventivas como herramienta útil para el control de la seguridad de los productos cárnicos que elaboran (Bernáldez y col. 2013a y b). 5. Conclusiones Este trabajo demuestra que hay una importante incidencia de algunos microorganismos pa- tógenos preocupantes en las industrias cárnicas españolas. Especialmente destaca el porcentaje superior al 20% encontrado en L. monocytogenes y Aeromonas sp. en las industrias cárnicas y productos RTE analizados. También hay incidencia en la industria cárnica de otros patógenos como Salmonella y Campylobacter, si bien en porcentajes muchos más bajos. Se deduce pues de estos resultados que es necesario incidir en el control de patógenos en las industrias cárnicas con el objetivo de minimizar su incidencia. Para lograr este objetivo adquiere extraordinaria im- portancia el uso de nuevas tecnologías para eliminación de patógenos, aspecto considerado en otros capítulos de este libro, pero también son fundamentales el desarrollo de métodos que permiten la detección rápida y sensible de estos microorganismos patógenos. En este sentido, en este trabajo se han desarrollado nuevos protocolos para recuperar de forma eficaz L. mono- Tabla 12. Resultados obtenidos tras la extracción de mengovirus en productos cárnicos Muestras Método de extracción viral del mengovirus Resultados (mengovirus) Ct qPCR Eficiencia Extracción % Muestra 1 (jamón cocido) Nuclisens manual 27,96 3,95 Automatizado EZ1 29,75 1,35 Automatizado Maxwell 27,66 8,00 Muestra 2 (jamón cocido) Nuclisens manual 26,89 8,35 Automatizado EZ1 27,64 6,10 Automatizado Maxwell 26,31 19,60 Muestra 3 (salchichón) Nuclisens manual 28,33 5,45 Automatizado EZ1 31,11 1,00 Automatizado Maxwell 28,51 8,20 Muestra 4 (chorizo) Nuclisens manual 27,98 7,35 Automatizado EZ1 30,77 1,30 Automatizado Maxwell 28,37 11,20
- 46. 46 J. J. Córdoba, J. Yangüela, A. Otero, T. Aymerich, A. Rodrigo, M. Rodríguez cytogenes de las superficies de equipos y utensilios en las industrias cárnicas basados en mini-ro- dillo 100% fibra de lana y esponja de celulosa. Además se han desarrollado métodos de PCR convencional y PCR en tiempo real específicos y sensibles para la detección e incluso cuantifi- cación de patógenos tales como L. monocytogenes, Salmonella, E. coli O157:H7, S. aureus ente- rotoxigénico, mohos productores de micotoxinas y mengovirus en las industrias cárnicas espa- ñolas. Se trata además de métodos que, por su rapidez, permiten adoptar decisiones durante los procesados sobre el destino y tratamiento de materias primas y de productos que se están ela- borando, con el objetivo final de obtener productos cárnicos RTE libres de microorganismos patógenos. Equipos participantes Los resultados que se recogen en este capítulo derivan de las investigaciones realizadas en las distintas acciones desarrolladas por los equipos que han participado en las diferentes accio- nes del subproyecto DETRAPAT y que han sido coordinadas por Javier Yangüela (UNIZAR), Andrés Otero (UNILEÓN), Teresa Aymerich (IRTA), Mar Rodríguez (UNEX) y José Enrique Carre- res (AINIA). Agradecimientos La investigación que recoge este capítulo ha sido llevada a cabo en el marco del Proyecto Consolider-Ingenio 2010 CARNISENUSA CSD2007-00016, en colaboración con los siguientes proyectos: AGL2007-64639, AGL 2010-21623, AGL2011-26118 (Ministerio de Economía y Compe- titividad), GRU08100, GRU09158, GRU10162 del Gobierno de Extremadura y FEDER, Diputación General de Aragón por el proyecto: Grupo Consolidado de Investigación (A01/2011) “Análisis y evaluación de la seguridad alimentaria” y al FSE (Fondo Social Europeo) y GR155 de la Junta de Castilla y León. 6. Referencias Angelotti, R., Wilson, J.L., Litsky, W., Walter, W.G. 1964. Comparative evaluation of the cotton swab and RODAC methods for the recovery of Bacillus subtilis spore contamination from stainless steel sur- faces. Health Laboratory Science 1, 289-296. Aranda, E., Rodríguez, M., Benito, M.J., Asensio, M.A., Córdoba, J.J. 2002. Molecular cloning of verruco- sidin-producing Penicilllium polonicum genes by differential screening to obtain a DNA probe. International Journal of Food Microbiology 76, 55-61. Bernáldez, V., Córdoba, J.J., Rodríguez, M, Cordero, M., Polo, L., Rodríguez, A. 2013a. Effect of Penici- llium nalgiovense as protective culture in processing of dry-fermented sausage “salchichón”. Food Control, 32, 69-76. Bernáldez, V, Rodríguez, A, Martín, A., Lozano, D., Córdoba, J.J. 2013b. Development of a multiplex qPCR method for simultaneous quantification in dry-cured ham of an antifungal-peptide P. chryso- genum strain used as protective culture and aflatoxin-producing moulds. Food Control. Aceptado. Bogs, C., Battilani, P., Geisen, R. 2006. Development of a molecular detection and differentiation system for ochratoxin A producing Penicillium species and its application to analyse the occurrence of Penicillium nordicum in cured meats. International Journal of Food Microbiology 107, 39-47. Chen, Y., Zhang, W., Knabel, S.J. 2007. Multi-virulence-locus sequence typing identifies single nucleotide polymorphisms which differentiate epidemic clones and outbreak strains of Listeria monocytoge- nes. Journal Clinical Microbiology 45, 835-846 D’Agostino, M.,Wagner, M., Vazquez-Boland, J. A, Kuchta, T., Karpiskova, R., Hoorfar, J., Novella, S., Scortti, M., Ellison, J., Murray, A., Fernandes, I., Kuhn, M., Pazlarova, J., Heuvelink, A. y Cook, N. 2004. A validated PCR- based method to detect Listeria monocytogenes using raw milk as a food model-towards an international standard. Journal of Food Protection 67, 1646-1655. Doumith, M., Buchrieser C., Glaser P., Jacquet C., Martin P. 2004. Differentiation of the Major Listeria monocytogenes Serovars by Multiplex PCR. Journal of Clinical Microbiology, 42, 3819-3822.
- 47. Detección e incidencia de microorganismos patógenos en carne y productos cárnicos 47 Fredlund, E., Gidlund, A., Olsen, M., Börjesson, T., Spliid, N.H.H., Simonsson, M. 2008. Method evalua- tion of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantifi- cation and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 73, 33-40. Gómez, D., Ariño, A., Carramiñana, J.J., Rota, C., Yangüela, J. 2012a. Comparison of sampling procedu- res for recovery of Listeria monocytogenes from stainless steel food contact surfaces. Journal of Food Protection 75, 1077-1082. Gómez, D., Ariño, A., Carramiñana, J.J., Rota, C., Yangüela, J. 2012b. Sponge versus mini-roller for the surface microbiological control of Listeria monocytogenes, total aerobic mesophiles and Enterobac- teriaceae in the meat industry. Food Control 27, 242-247. Gómez, D., McGuinness, S., Reddington, K., O’Grady, J., Yangüela, J., Barry T. 2012c. Evaluation of a novel Listeria enrichment broth combined with a real-time PCR diagnostics assay for the specific detection of Listeria monocytogenes in RTE pork products. International Journal of Food Science and Technology. Doi:10.1111/ijfs.12053. Gordillo, R., Córdoba, J.J., Andrade, M.J., Luque, M.I., Rodríguez, M. 2011. Development of PCR assays for detection of Escherichia coli O157:H7 in meat products. Meat Science 88, 767-773. Malorny, B., Hoorfar, J., Hugas, M., Heuvelink, A., Fach, P, Ellerbroek, L., Bunge, C., Dorn, C. y Helmu- th, R. 2003. Interlaboratory diagnostic accuracy of a Salmonella specific PCR-based method. Inter- national Journal of Food Microbiology 89, 241-249. Martín, B., Garriga, M. y Aymerich, T. 2011. Prevalence of Salmonella spp. and Listeria monocytogenes at small-scale Spanish factories producing traditional fermented sausages. 2011. Journal of Food Protection. 74, 812-815. Martín B., Garriga M., Aymerich T. 2012. Pre-PCR treatments as a key factor on the probability of detection of Listeria monocytogenes and Salmonella in ready-to-eat meat products by real-time PCR. Food Con- trol 27, 163-169. Martín B, Raurich S., Garriga M, Aymerich T. 2013. Effect of amplicon lengths in propidium monoazide quantitative PCR for the enumeration of viable cells of Salmonella in cooked ham. Food Analytical Methods 6, 683-690. Nicolaisen, M., Suproniené, S., Nielsen, L.K., Lazzaro, I., Spliid, N.H., Justesen, A.F. 2009. Real-time PCR for quantification of eleven individual Fusarium species in cereals. Journal of Microbiological Methods 76, 234-240. Paterson, R.R.M. 2004. The isoepoxydon dehydrogenase gene of patulin biosynthesis in cultures and se- condary metabolites as candidate PCR inhibitors. Mycology Research 108, 1431-1437. Paterson, R.R.M. 2007. Internal amplification controls have not been employed in fungal PCR hence po- tential false negative results. Journal of Applied Microbiology 12, 1-10. Paterson, R.R.M., Lima, N. 2009. Mutagens manufactured in fungal culture may affect DNA/RNA of produ- cing fungi. Journal of Applied Microbiology 106, 1070-1080. Richard, E., Heutte, N., Bouchart, V., Garon, D. 2009. Evaluation of fungal contamination and mycotoxin production in maize silage. Animal Feed Science and Technology 148, 309-320. Rodríguez-Lázaro, D.,Hernández, M.,Scortti, M.,Esteve, T.,Vázquez-Boland, J.A. y Pla, M. 2004. Quantitative detection of Listeria monocytogenes and Listeria innocua by real-time PCR: Assesssment of hly, iap and lin02483 targets and amplifluor technology. Applied and Environmental Microbiology 70, 1366- 1377. Rodríguez, A., Córdoba, J.J., Gordillo, R., Córdoba, M.G., Rodríguez, M. 2012a. Development of two quan- titative real-time PCR methods based on SYBR Green and TaqMan to quantify sterigmatocystin-pro- ducing molds in foods. Food Analytical Methods DOI: 10.1007/s12161-012-9411-9. Rodríguez, A., Córdoba, J.J., Werning, M.L., Andrade, M.J., Rodríguez, M. 2012b. Duplex real-time PCR method with internal amplification control for quantification of verrucosidin producing molds in dry-ripened foods. International Journal of Food Microbiology 153, 85-91. Rodríguez, A., Luque, M.I., Andrade, M.J., Rodríguez, M., Asensio, M.A., Córdoba, J.J. 2011a. Development of real-time PCR methods to quantify patulin-producing molds in food products. Food Microbiology 28, 1190-1199. Rodríguez, A., Rodríguez, M., Andrade, M.J., Córdoba, J.J. 2012c. Development of a multiplex real-time PCR to quantify aflatoxin, ochratoxin A and patulin producing molds in foods. International Journal of Food Microbiology 155, 10-18. Rodríguez, A., Rodríguez, M., Luque, M.I., Justesen, A.F., Córdoba, J.J. 2011b. Quantification of ochratoxin A-producing molds in food products by SYBR Green and TaqMan real-time PCR methods. Internatio- nal Journal of Food Microbiology 149, 226-235.
- 48. 48 J. J. Córdoba, J. Yangüela, A. Otero, T. Aymerich, A. Rodrigo, M. Rodríguez Rodríguez, A., Rodríguez, M., Luque, M.I., Justesen, A.F., Córdoba, J.J. 2012d. A comparative study of DNA extraction methods to be used in real-time PCR based quantification of ochratoxin A-producing molds in food products. Food Control 25, 666-672. Rodríguez, A., Rodríguez, M., Luque, M.I., Martín, A., Córdoba, J.J. 2012e. Real-time PCR assays for detec- tion and quantification of aflatoxin producing molds in foods. Food Microbiology 31, 89-99. Rodríguez, A., Rodríguez, M., Martín, A., Núñez, F., Córdoba, J.J. 2012f. Evaluation of hazard of aflatoxin B1, ochratoxin A and patulin production in dry-cured ham and early detection of producing moulds by qPCR. Food Control 27, 118-126. Rodríguez, A., Werning, M.L., Rodríguez, M., Bermúdez, E., Córdoba, J.J. 2012g. Quantitative real-time PCR method with internal amplification control to quantify cyclopiazonic acid producing molds in foods. Food Microbiology. 32, 397-405. Rodríguez, A., Rodríguez, M., Bernáldez, V., Lozano, D., Córdoba, J.J. 2012h. Desarrollo de métodos PCR en tiempo real para la cuantificación de mohos productores de micotoxinas en productos cárnicos madurados. Eurocarne. 205, 116-125. Sant’Ana, A.S., Simas, R.C., Almeida, C.A.A., Cabral, E.C., Rauber, R.H. Mallmann, C.A., Eberlin, M.N., Ro- senthal, A., Massaguer, P.R., 2010. Influence of package, type of apple juice and temperature on the production of patulin by Byssochlamys nivea and Byssochlamys fulva. International Journal of Food Microbiology 142, 156-163. Selma, M.V., Martínez-Culebras, P.V. Aznar, R. 2008. Real-time PCR based procedures for detection and quantification of Aspergillus carbonarius in wine grapes. International Journal of Food Microbiology 122, 126-134. Sharma, N.K., Rees, C.E., Dodd, C.E. Development of a single-reaction multiplex PCR Toxin typing assay for Staphylococcus aureus strains. 2000. Applied and Environmental Microbiology 66, 1347- 1353. Sperry, K.E.V., Kathariou, S., Edwards, J.S., Wolf, L.A. 2008. Multiple-locus variable-number tandem-re- peat analysis as a tool for subtyping Listeria monocytogenes strains. Journal Clinical Microbiology 46, 1435-1450. Thévenot, D., Dernburg, A. y Vernozy-Rozand, C. 2006. An updated review of Listeria monocytogenes in the pork meat industry and its products. Journal of Applied Microbiology 101, 7-17.
- 49. CAPITULO IV Estrategias tecnológicas y beneficios saludables de elaborados cárnicos funcionales Francisco Jiménez Colmenero Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN-CSIC). Madrid Mª Dolores Selgas Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos, Facultad de Veterinaria (UCM). Madrid Diana Ansorena Departamento de Ciencias de la Alimentación y Fisiología. Facultad de Farmacia (UNAV). Pamplona 1. Introducción Uno de los principales motivos que impulsa el desarrollo de nuevos alimentos viene deter- minado por la necesidad de disponer de productos más ajustados a los requerimientos específi- cos de amplios sectores de la sociedad, entre ellos los relacionados con el binomio dieta-salud. Los avances en el conocimiento producidos en las últimas décadas están abriendo extraordinarias posibilidades para, a través del efecto de componentes específicos (nutrientes y no nutrientes) de los alimentos, contribuir a mejorar determinadas funciones fisiológicas en el organismo para ase- gurar el máximo de bienestar, salud y calidad de vida. En este contexto, la producción de elabo- rados cárnicos saludables y funcionales constituye una excelente oportunidad de diferenciación, diversificación y posicionamiento en un mercado en continuo crecimiento. Hecho especialmente importante para un sector que, como el cárnico, está claramente necesitado de mejorar su ima- gen, entre otras razones por la asociación establecida entre algunos de sus componentes y varias de las enfermedades crónicas no transmisibles más importantes en nuestra sociedad. Es de des- tacar que, por su elevada frecuencia y nivel de consumo, notable contribución a los niveles de ingesta de distintos nutrientes, gran versatilidad de presentación, amplio grado de aceptación, considerable aptitud para experimentar procesos de reformulación (cambios de composición) usando ingredientes de diversas procedencias, etc., los elaborados cárnicos son alimentos excep- cionales para actuar como vehículo para condicionar la presencia de compuestos bioactivos sin modificar los hábitos de consumo (Jiménez-Colmenero y col., 2012b). Así, el enriquecimiento de ciertos alimentos en determinados compuestos bioactivos constituye una estrategia eficaz para lograr cubrir las recomendaciones nutricionales actuales (Berasategi y col., 2011a). Tomando en consideración esos aspectos, y ante la necesidad de disponer de “PRODUCTOS CÁRNICOS PARA EL SIGLO XXI: SEGUROS, NUTRITIVOS Y SALUDABLES”, en el marco del sub- proyecto FUNCIOCA se ha realizado un notable esfuerzo para desarrollar y ensayar estrategias de reformulación de elaborados cárnicos encaminadas a optimizar la presencia cuantitativa y/o cuali- tativa de diversos compuestos con potenciales implicaciones en la salud, favoreciendo básicamen- te la presencia de componentes con efectos positivos y limitando el contenido de aquellos otros con consecuencias negativas. Este capítulo tiene como objetivo proporcionar una panorámica ge- neral de los avances en la producción de elaborados cárnicos saludables y funcionales realizados
- 50. 50 Francisco Jiménez Colmenero, Mª Dolores Selgas, Diana Ansorena en el marco del subproyecto FUNCIOCA. Para ello se han planteado dos planos de actuación complementarios, sin los cuales el estudio sería incompleto. Por un lado, se expone de manera resumida los principales procesos de reformulación ensayados y los hallazgos más relevantes en relación con aspectos de la viabilidad tecnológica y sensorial de diversos productos cárnicos (fres- cos, tratados por el calor, crudos curados) potencialmente funcionales reformulados con diferentes ingredientes bioactivos. Por otro, se analizan las distintas posibilidades que se han identificado y/o explorado a fin de evidenciar el efecto saludable de los productos desarrollados anteriormente. 2. Contribución al desarrollo de productos cárnicos saludables y funcionales Varios aspectos han de tenerse en cuenta a la hora de describir el esfuerzo investigador en relación con el diseño y estrategias de desarrollo de productos cárnicos saludables y funcionales. En primer lugar hay que considerar la naturaleza de los elaborados cárnicos a reformular. Así los procesos de optimización de la presencia de componentes bioactivos se han llevado a cabo en productos que presentan distintas características de composición, granulometría, procesado, for- mas de presentación, etc., abarcando elaborados frescos, tratados térmicamente y crudo-curados. En segundo lugar es esencial considerar el tipo de compuestos implicados en los procesos de reformulación, los cuales se han seleccionado generalmente en base a su contribución tecno- lógica (propiedades ligantes de agua y grasa, textura, actividad antioxidante, etc.), su potencial implicación en la salud (metabolismo óseo, efectos antiaterogénicos o anticancerígenos, etc.) y posibilidades de asimilación por el organismo. En este sentido, las actividades se han enfocado a reducir, incrementar, reemplazar o modificar la presencia de diversos compuestos básicamente en relación con la: a) modificación del contenido y el perfil lipídico; b) adición de fibras dieté- ticas o ingredientes ricos en ellas; c) modificación en la concentración de varios minerales; d) incorporación de componentes fitoquímicos y vitaminas. Finalmente, hay que considerar que el diseño ha de tener en cuenta la magnitud del cambio de composición a realizar. Evidentemente además de asimilable por el organismo, las modifica- ciones inducidas en la concentración de una determinada sustancia (presencia/ausencia) han de ser tales que cuando el producto final se consume en cantidades razonables ha de aportar nive- les de ingesta capaces de ejercer el efecto nutricional y/o fisiológico deseado. Teniendo en cuenta la variabilidad de productos y compuestos/ingredientes bioactivos con- siderados, y que muchos de estos requieren a su vez de estudios específicos relacionados con las condiciones de preparación, estabilización o evaluación de su actividad, y en beneficio de la claridad de exposición, los avances en la producción de elaborados cárnicos saludables y fun- cionales se agrupan en cuatro apartados. El primero de ellos trata de describir estrategias de estudio, preparación y/o estabilización de compuestos bioactivos, y los tres restantes, uno por tipo de elaborado cárnico, dirigidos a agrupar las actividades realizadas sobre procesos de refor- mulación de elaborados frescos, tratados por el calor y crudo-curados. 2.1. Estrategias de preparación y/o estabilización de compuestos bioactivos En ocasiones los compuestos bioactivos o los ingredientes que los contienen y que van a emplearse en nuevas formulaciones de elaborados cárnicos precisan de estudios previos que permitan el desarrollo de procesos de estabilización, establecimiento de las condiciones de ob- tención, valoración de una actividad específica, etc. A continuación se exponen algunos de los aspectos más relevantes en ese sentido. 2.1.1. Formación y propiedades de ingredientes no-cárnicos para mejorar el contenido y/o perfil de ácidos grasos Los lípidos se encuentran entre los ingredientes funcionales que mayor atención han reci- bido por sus implicaciones en la salud. La preparación de productos con un contenido y/o perfil más saludable desarrollados en FUNCIOCA se ha basado en la reducción del contenido
- 51. Estrategias tecnológicas y beneficios saludables de elaborados cárnicos funcionales 51 y/o la sustitución de grasa animal por otra de origen vegetal o marino más acorde con las re- comendaciones nutricionales sobre salud. Así se han reformulado distintos tipos de derivados cárnicos reemplazando básicamente tocino por aceites vegetales (oliva y lino) y/o de origen marino (pescado y algas) estabilizados en forma de emulsiones de aceite-en-agua (O/W) (pre-emulsiones) empleando para ello diversos sistemas proteicos. Las características de estas emulsiones resultan de especial interés por cuanto son ingredientes en la preparación de los productos reformulados y pueden ejercer un papel determinante en los atributos de calidad de los mismos. Es por ello que se han realizado diversos estudios para evaluar sus características estructurales y propiedades tecnológicas en función de variables asociadas a la composición de la fase lipídica (aceites de oliva, lino, pescado, algas, individualmente utilizados en combina- ción de diseño), o al tipo de emulsionante hidrofílico empleado (caseinato, proteína de soja sola o combinada con transglutaminasa de origen microbiano-MTG) (Jiménez-Colmenero y col., 2010b; García-Iñiguez de Ciriano y col., 2010a; Campos y col., 2011; Herrero y col., 2011a y 2011b; Delgado-Pando y col., 2010b). Además de emulsiones simples (O/W), se han estudiado la preparación y propiedades de emulsiones múltiples tipo de agua-en-aceite-en-agua (W/O/W) (Poyato y col., 2012 y 2013; Co- frades y col., 2013). Por sus propiedades, entre ellas la capacidad de atrapar y proteger diversas sustancias y producir su liberación controlada desde el interior de una fase a otra, este tipo de emulsiones abre nuevas posibilidades en el diseño y desarrollo de alimentos funcionales (Jimé- nez Colmenero, 2013). Dentro de las estrategias tecnológicas utilizadas para reducir los niveles de grasa de los pro- ductos cárnicos se han empleado una amplia variedad de ingredientes: carbohidratos, proteínas o lípidos. Estos ingredientes han de suponer por un lado, escasa aportación energética, y por otro, han de impartir al producto las características deseadas. De entre las distintas fibras cono- cidas, el konjac glucomanano (KGM) resulta de especial interés debido sus notables efectos fi- siológicos, y excepcionales propiedades tecnológicas, entre ellas su capacidad de retención de agua y formación de geles capaces de simular las propiedades organolépticas de grasa (sensa- ción en la boca). Basándose en esto se han preparado análogos de grasa a base de geles de KGM, realizando un análisis comparativo de sus características con grasa animal (Jiménez-Colmenero y col., 2012a) y evaluando su comportamiento en procesos de refrigeración y congelación (Ji- ménez-Colmenero y col., 2013a). Los geles de KGM se han estudiado además como agentes de carga de aceites. Aceite de oliva y combinaciones de aceites de oliva, lino, pescado se han esta- bilizado en una matriz de gel de konjac que se emplearon para reemplazar grasa animal en procesos de reformulación de distintos tipos de transformados cárnicos (Jiménez-Colmenero y col., 2013b; Salcedo-Sandoval y col., 2013; Triki y col., 2013a, 2013b y 2013c). 2.1.2. Preparación, caracterización y/o actividad antioxidante de ingredientes funcionales La sustitución de grasa saturada por insaturada, aplicada en la obtención de elaborados cár- nicos con un perfil lipídico más saludable, incrementa el riesgo (velocidad y extensión) de oxi- dación lipídica. Este fenómeno, que constituye un grave problema tanto a nivel tecnológico como de salud, puede limitarse mediante la aplicación de varios tipos de estrategias. Una de las más empleadas consiste en la incorporación de antioxidantes. Ya que el empleo de aditivos de síntesis está siendo cuestionado por su potencial riesgo para la salud, se está incrementando la utilización de antioxidantes naturales. En tal sentido, en el ámbito del subproyecto FUNCIOCA se han realizado diversas actividades, entre ellas la evaluación de la actividad antioxidante en matrices cárnicas de extractos de algarrobo (Bastida y col., 2009), de Borago officinalis (Gar- cía-Iñiguez de Ciriano y col., 2009), varios tipos de algas (López-López y col, 2009a; Cofrades y col., 2010), hidroxitirosol (Cofrades y col., 2011b), extractos de Hypericum perforatum L (Sán- chez-Muniz y col., 2012) y extractos liofilizados acuosos o hidroalcohólicos de Melissa officinalis (García-Iñiguez de Ciriano y col., 2010b y 2012; Berasategi y col., 2011b). Además, se han carac- terizado exhaustivamente extractos de Verbena officinalis y Melissa officinalis con el propósito de determinar los compuestos responsables de su actividad antioxidante (Rehecho y col., 2011;
- 52. 52 Francisco Jiménez Colmenero, Mª Dolores Selgas, Diana Ansorena Encalada y col., 2011). En el caso de la melisa, se ha podido describir también su actividad an- tiproliferativa (Encalada y col., 2011). De igual modo, se ha analizado in vitro la actividad an- tioxidante del licopeno tanto en piel de tomate seca, como en el concentrado de tomate antes y después de someterlos a radiaciones ionizantes. La utilización de estas fuentes de licopeno procedentes de subproductos o excedentes de la industria tomatera, supone un beneficio medioambiental, dada la no utilización de solventes (Calvo y col., 2008). Diversos estudios han permitido establecer las condiciones óptimas de secado de tomillo (Thymus vulgaris) para maximizar la capacidad antioxidante de extractos obtenidos mediante fluidos supercríticos (Rodríguez y col., 2012 y 2013). Adicionalmente se han realizado estudios encaminados al desarrollo de procedimientos analíticos y determinación de algunos compuestos bioactivos naturalmente presentes en carne y productos cárnicos (Clariana y col., 2010). 2.2. Productos frescos Distintos tipos de elaborados cárnicos frescos han sido reformulados a fin de obtener produc- tos más saludables. En tal sentido, se han desarrollado productos tipo hamburguesas con reducido contenido en grasa y sal (sodio) mediante la sustitución parcial de grasa animal por aceite de oliva (O/W) e incorporación del alga Wakame (Undaria pinnatifida) (López-López y col., 2010 y 2011). Filetes reestructurados de pollo con bajo contenido en sodio han sido elaborados median- te el empleo de MTG e incorporación del alga Espagueti de mar (Himanthalia elongata) (Cofrades y col., 2011a). Se ha observado que la utilización de algas como ingredientes no cárnicos puede emplearse como medio para reducir sodio, dotando además al producto de distintos compuestos bioactivos entre ellos fibra, minerales, etc. También se ha estudiado cómo mejorar el perfil lipídico y reducir los niveles sodio en salchicha fresca tipo “merguez” (producto típico del norte de África) reemplazando grasa animal por aceite de oliva estabilizado en una matriz de konjac y sustituyendo el NaCl por otras sales (Triki y col., 2013a y 2013b). Otras estrategias de mejora del perfil lipídico en salchichas frescas tuvieron por objetivo incrementar el aporte de ácidos grasos omega-3 me- diante la incorporación de aceite de lino o pescado, remplazando a su vez parcialmente al tocino de cerdo (Valencia y col., 2008). Se obtuvieron productos estables siempre y cuando se estabiliza- ra la formulación con antioxidantes (catequinas de té y extractos de café verde). Se han formulado hamburguesas enriquecidas con ácido fólico (AF) a una concentración (2,4 mg/100 g) superior a la ingesta diaria recomendada (IDR) para compensar posibles pérdi- das. Este producto sometido a irradiación (2-4 kGy) presentó una buena calidad tecnológica y sensorial, manteniendo la concentración de AF incluso después de 3 meses de almacenamiento a vacío y en refrigeración. La irradiación permitió prolongar la vida útil del derivado cárnico conservado en refrigeración más de 20 días, detectándose pérdidas de AF (20-30%) solo a 4 kGy. No hubo pérdidas adicionales durante el almacenamiento a 4 ºC, apreciándose que en cualquier caso, el producto contenía concentraciones de AF superiores a IDR (Galán y col., 2010). Las sales de calcio se incorporaron en diferentes concentraciones y buscando siempre un compromiso entre la calidad tecnológica y sensorial. El citrato-malato y el lactato cálcicos fueron las que rindieron los mejores resultados tecnológicos y sensoriales incluso a concentraciones suficientes para que 100 g aportasen hasta el 40% de la IDR (Soto y col., 2010). El enriquecimiento con licopeno (carotenoide con alto poder antioxidante) se hizo con los derivados del tomate (piel y tomate en polvo) hasta en un 6%. Los resultados obtenidos mostra- ron como el cocinado favorece la liberación del licopeno del interior de las células vegetales (García y col., 2009; Gámez y col., 2011). La conservación no condicionó la concentración ni la isomerización del carotenoide. Los mejores resultados se obtuvieron con el 4,5% de cada deri- vado del tomate y el contenido final en licopeno fue de 4,9 y 6,4 mg/100 g en hamburguesas adicionada con piel de tomate o de tomate concentrado, respectivamente. La concentración de licopeno disminuyó ligeramente a 4 kGy, debido a su reacción con radicales libres formados con la irradiación (Selgas y col., 2009a; Gámez y col., 2011).
- 53. Estrategias tecnológicas y beneficios saludables de elaborados cárnicos funcionales 53 En todos los casos, la calidad sensorial de los productos (enriquecidos con AF y licopeno) irradiados a 4 kGy experimentaron un ligero deterioro debido a la aparición de olores desagra- dables “a irradiado” asociados a la formación de compuestos volátiles azufrados durante el pro- ceso. Los tratados con 3 kGy presentaron buena calidad sensorial a la vez que fueron higiénica- mente seguros. 2.3. Productos tratados por el calor En productos tratados por el calor, los estudios encaminados al desarrollo de elaborados cárnicos saludables y funcionales se han llevado a cabo sobre salchichas tipo frankfurt y bolog- na, así como en paté. En las salchichas tipo frankfurt, los estudios se han dirigido fundalmentalmente a mejorar su contenido y perfil lipídico, reducir sodio e incorporar otros compuestos bioactivos. La mejora del contenido y perfil lipídico se ha realizado reemplazando básicamente tocino por aceites vegeta- les (oliva y lino) y/o de origen marino (pescado y algas) estabilizados en forma de emulsiones O/W o en agentes de carga (matriz de konjac). En tal sentido y a fin de favorecer la presencia de ácidos grasos monoinsaturados (AGM) se han preparado productos mediante la sustitución parcial de grasa animal por aceite de oliva en productos tipo salchicha de frankfurt (Fernán- dez-Martín y col., 2009; Jiménez-Colmenero et al., 2010b; Carmona y col., 2011; Herrero y col., 2012). De igual modo se han empleado distintas combinaciones de aceites de oliva, lino, pesca- do o alga para favorecer la presencia de ácidos grasos poliinsaturados (López-López y col., 2009b y 2009c; Delgado-Pando y col., 2010b y 2011b). La sustitución parcial de la grasa animal por emulsiones O/W preparadas con una combinación de aceites (de origen vegetal y marino) y diferentes sistemas proteicos resulta una estrategia adecuada para desarrollar salchichas tipo frankfurt potencialmente funcionales en base a un contenido lipídico mejorado. De igual modo, el empleo del alga Espagueti de mar ha permitido la obtención de productos con propiedades saludables en base al menor contenido en Na y grasa y a la presencia de ciertos compuestos biológicamente activos, principalmente fibra dietética, polifenoles y minerales (López-López y col. 2009b y 2009c; Jiménez-Colmenero y col., 2010a). Estudios sobre la incorporación de luteína (carotenoide implicado en la prevención de la degeneración macular asociada a la edad) en salchichas tipo frankfurt han demostrado la viabi- lidad de este desarrollo experimental para el enriquecimiento en luteína (Granado-Lorencio y col., 2010). También se ha puesto de manifiesto la actividad antioxidante del hidroxitirosol (com- puesto fenólico procedente del aceite de oliva con potenciales efectos beneficiosos para la sa- lud) en este tipo de elaborados cárnicos (Cofrades y col., 2011b). En el caso de los productos tipo bologna, la utilización de emulsiones tipo O/W de aceite de lino y proteína de soja, estabilizadas con extractos de melisa ha resultado eficaz en la mejora del perfil lipídico de los productos, logrando disminuir significativamente el cociente n-6/n-3 y los índices aterogénico y trombogénico, y manteniendo buenas propiedades sensoriales. Los resultados de la medida de la actividad antioxidante residual en los productos demuestran la viabilidad del extracto como potente antioxidante, resultando efectivo tanto antes como después del tratamiento térmico de pasterización (Berasategi y col., 2011b). Para los procesos de enriquecimiento con ácido fólico y calcio se utilizaron productos tipo mortadela. El estudio con ácido fólico se hizo en las mismas concentraciones que en las ham- burguesas y los resultados obtenidos fueron igualmente muy satisfactorios. Los niveles de AF se mantuvieron estables durante el procesado y el almacenamiento en refrigeración, tan solo se observó un ligero descenso cuando se irradiaron a 4 kGy. En este tipo de productos, los cambios sensoriales asociados a la irradiación quedaron enmascarados con la mezcla de especias incor- porada. La vida útil se prolongó más de 3 meses en el producto irradiado y al final de este pe- riodo aumentó la valoración sensorial probablemente debido a la interacción entre los compues- tos volátiles responsables del olor “a irradiado”. Una ración de 50 g del producto final aportaría cerca del 100% de la IDR (Galán y col., 2011a y 2013). En el caso del calcio, los resultados fueron
- 54. 54 Francisco Jiménez Colmenero, Mª Dolores Selgas, Diana Ansorena igualmente similares a los de las hamburguesas, ya que el gluconato de calcio tampoco fue tec- nológicamente viable en productos cocidos y de nuevo fue el citrato-malato y el lactato las sales con las que se obtuvieron los mejores resultados, pudiendo llegar a aportar hasta el 40% de la IDR (Soto y col., 2011). El proceso de reformulación encaminado al desarrollo de paté potencialmente funcional en base a un contenido lipídico mejorado (reducción de grasa y enriquecimiento con ácidos grasos poliinsaturados n-3), se llevó a cabo mediante la sustitución de tocino de cerdo por una emul- sión O/W de aceites de oliva, linaza y pescado e inclusión del gel de konjac. En tales condicio- nes se obtiene un producto con un 50% menos de grasa y con elevadas cantidades de ácidos grasos poliinsaturados n-3, incluyendo 723 mg/100 g de eicosapentanoico (EPA) y docosahexae- noico (DHA). El paté obtenido, además de ventajas desde el punto de vista de su composición, presenta adecuada viabilidad tecnológica, sensorial y microbiológica, incluso en periodos pro- longados de conservación en refrigeración (Delgado-Pando y col., 2011a y 2012). 2.4. Productos crudo-curados Los procesos de reformulación de productos crudo-curados se han realizado en chorizo, salchichón y sobrasada. Entre los estudios efectuados para dotar a este tipo de productos de propiedades nutricio- nales y saludables ocupan un papel destacado los encaminados a producir una mejora del con- tenido y perfil lipídico en chorizo. En tal sentido se han llevado a cabo procesos de reducción de grasa basados en la sustitución de tocino por geles de konjac, evaluándose su impacto sobre factores de procesado, atributos de calidad y estabilidad en refrigeración (Ruiz-Capillas y col., 2012a y 2012b). De manera análoga se han elaborado productos con reducido contenido en grasa y con un perfil de ácidos grasos más saludable empleando como estrategia la sustitución de tocino por una combinación de aceites de oliva, lino y pescado estabilizados en una matriz de konjac (Jiménez-Colmenero y col. 2013b; Triki y col., 2013c). Las emulsiones O/W también han resultado ser viables tecnológica y sensorialmente para incorporar lípidos altamente insaturados (lino o lino y alga) en productos crudos-curados tipo chorizo. Su empleo como sustituto parcial del tocino de cerdo, en una proporción de hasta un máximo de un 25%, en productos estabilizados con antioxidantes naturales o sintéticos, ha pro- porcionado productos sensorial y tecnológicamente aceptables (García-Iñiguez de Ciriano y col., 2009, 2010b y 2012). Otro de los retos tecnológicos afrontados en productos curados ha sido la reducción del con- tenido en sodio y la incorporación de minerales de interés. Así, a la mejora del perfil lipídico, se ha podido sumar simultáneamente en un mismo producto, los beneficios saludables del yodo y selenio mediante el uso de sal yodada y levadura de selenio como ingredientes (García-Iñiguez de Ciriano y col., 2010b). Además, se ha logrado la sustitución de parte de su contenido en NaCl por ascorba- to cálcico, logrando, no sólo disminuir el Na, sino incrementar significativamente el aporte de calcio en productos enriquecidos en ácidos grasos omega-3 (García-Iñiguez de Ciriano y col., 2013). Dentro de las estrategias de reformulación de productos crudos-curados se ha utilizado fibra dietética soluble (fructooligosacáridos, FOS). Los FOS se incorporaron en salchichones elabora- dos con diferentes cantidades de grasa (30, 15 y 6%), lo que supuso la reducción de hasta un 58% de grasa. Se incorporaron en cantidades de hasta el 6% y a estos niveles, los FOS actuaban como buenos sustitutos de grasa resultando embutidos con una buena aceptabilidad tecnológica y sensorial, y con niveles medios de grasa (15%). El resultado final es un producto madurado reducido en grasa y enriquecido con un prebiótico y fibra dietética soluble (Salazar y col., 2009). El enriquecimiento con ácido fólico, calcio y licopeno se realizó también en salchichón. Los embutidos obtenidos al incorporar AF fueron tecnológica y sensorialmente aceptables como en los productos cárnicos anteriores (Galán y col., 2011b), incluso en aquellos listos para consumo (RTE) tras 90 días de almacenamiento. En relación la incorporación de calcio, la concentración
- 55. Estrategias tecnológicas y beneficios saludables de elaborados cárnicos funcionales 55 de sales ensayadas tuvo que ser inferior a la señalada en productos frescos y tratados por el calor (descritos anteriormente), situándose en este caso el límite tecnológico en el 30% de la IDR; de nuevo el citrato-malato cálcico resultó ser la sal más adecuada (Selgas y col., 2009b). En el caso del licopeno, las cantidades máximas viables de piel de tomate y de tomate en polvo fueron del 2%. En estas concentraciones, el licopeno, pigmento de color naranja, y la presencia de fibra, modificaron el color y la textura de estos productos cárnicos. En los productos RTE, 2 kGy fue la máxima dosis aceptable. El licopeno se redujo ligeramente pero aun así, la concen- tración final fue suficiente para que 100 g aportaran el 24% de la ingesta recomendada como saludable. El tiempo de almacenamiento no influyó en la concentración ni en la isomerización del licopeno (Gámez y col., 2011). Se ha empleado fibra de zanahoria en la formulación de sobrasada. Para optimizar su efecto se desarrollaron redes neuronales a fin de modelar la evolución de diferentes parámetros físi- co-químicos y sensoriales a lo largo del proceso de curado, en función de la concentración de fibra (0-12%). Se formuló y resolvió un problema de optimización, maximizando la cantidad del ingrediente, y estableciendo como restricción que se preservara la evolución de los parámetros durante el proceso de curado. El nivel óptimo de ingrediente depende, lógicamente, de las con- diciones de operación (humedad relativa y temperatura) (Eim y col., 2013). 3. Declaraciones de propiedades nutricionales y saludables de los productos cárnicos obtenidos La legislación europea exige que aquellos alimentos a los que se pretende atribuir un bene- ficio nutricional o saludable cumplan con ciertos requisitos en su composición y se haya demos- trado científicamente los beneficios asociados a la presencia de ciertos compuestos bioactivos (Reglamento 1924/2006; Reglamento 116/2010; Reglamento 432/2012). La tabla 1 recoge algunos ejemplos de los productos desarrollados a lo largo del proyecto que son susceptibles de poder incluir declaraciones nutricionales de acuerdo con los dos primeros Reglamentos. Como conse- cuencia de los beneficios nutricionales logrados, es posible atribuir propiedades saludables re- lacionadas, ejemplos de las cuales se presentan de una forma sintética en la tabla 2. 4. Avances en la evaluación de efectos saludables de productos cárnicos diseñados como potencialmente funcionales Como es bien sabido, en el desarrollo de alimentos funcionales resulta esencial la necesidad de demostrar de forma satisfactoria el efecto beneficioso relativo a la mejora del estado de salud y bienestar y/o para la reducción de riesgo de enfermedad de los productos reformulados. Tal demostración, que sin duda favorecerá la posibilidad de exhibir declaraciones de propiedades saludables, ha de sustentarse en evidencias científicas sólidas basadas en tres tipos generales de estudios: a) bioquímicos, celulares o en animales; b) observacionales y; c) de intervención en humanos (Ashwell, 2002). En este sentido, en el marco del subproyecto FUNCIOCA se han lle- vado a cabo tanto actividades centradas en estudios bioquímicos, celulares o de experimenta- ción animal, como aquellos otros de intervención en humanos. A continuación se refieren los aspectos más destacables. 4.1. Estudios de biodisponibilidad/bioaccesibilidad Diversos estudios se han realizado sobre compuestos bioactivos (luteína, ácido fólico, calcio y licopeno) incorporados en productos cárnicos. La bioaccesibilidad in vitro de luteína fue evaluada en salchichas tipo frankfurt (prepara- das con dos niveles de grasa) y enriquecidas con este carotenoide. Los resultados obtenidos indicaron que la luteína en la matriz cárnica era muy estable a la digestión in vitro, con una recuperación total de más de 84% al final de la fase duodenal y con baja isomerización. La
- 56. 56 Francisco Jiménez Colmenero, Mª Dolores Selgas, Diana Ansorena Tabla 1. Ejemplos de productos cárnicos desarrollados en el marco de FUNCIOCA susceptibles de incluir declaraciones nutricionales de acuerdo con el Reglamento 1924/2006 Declaraciones Referencia Productos frescos Salchichas: Con aceite de lino o pescado preemulsificado como sustituto de tocino (15%) y con antioxidantes Alto contenido omega-3 Alto contenido proteínas Valencia y col. (2008) Hamburguesas: Adición de ácido fólico (máx 2.4 mg/100 g) Fuente de ácido fólico Galán y col. (2010) Hamburguesas: Adición de licopeno (máx 7.9 mg/100 g) Contiene licopeno Selgas y col. (2009a) Hamburguesas: Adición de Ca (400 mg/100 g) en forma de citrato-malato y lactato cálcico Fuente de calcio Soto y col. (2010) Producto tipo hamburguesa con algas (Wakame) Fuente de magnesio y potasio López-López y col. (2010) Productos cocidos Salchichas tipo frankfurt: Mezcla de aceites preemulsificada (oliva+lino+pescado) como sustituto de tocino (100%) Alto contenido omega-3, AGM y AGI Alto contenido proteínas Delgado Pando y col. (2010) Mortadela: Adición de ácido fólico (máx 2.4 mg/100 g) Fuente de ácido fólico Galán y col. (2011a) Mortadela: Aceite de lino preemulsificado como sustituto de tocino (25%) y con antioxidantes (Melissa officinalis) Alto contenido omega-3 Alto contenido proteínas Berasategi y col. (2011b) Mortadela: Adición de Ca (máx. 400 mg/100 g) en forma de citrato-malato, gluconato y lactato cálcico Fuente de calcio Soto y col. (2011) Paté: Gel de konjac con mezcla de aceites (oliva+lino+pesca- do) como sustituto de tocino (100%) Valor energético reducido Alto contenido proteínas Alto contenido omega-3, AGM y AGI Delgado-Pando y col. (2011a) Productos crudos curados Chorizo: Aceite de lino preemulsificado como sustituto de tocino (25%) y con antioxidantes (Borago officinalis) Alto contenido omega-3 Alto contenido proteínas García Iñiguez de Ciriano y col. (2009) Chorizo: Mezcla de aceites preemulsificada (lino+alga 3:2) como sustituto de tocino (25%), con sal yodada, levadura de selenio y antioxidantes (Melissa officinalis) Alto contenido omega-3 Alto contenido proteínas Alto contenido en yodo y selenio García Iñiguez de Ciriano y col. (2010b) Chorizo: Aceite de lino preemulsificado como sustituto de tocino (25%) , con sal yodada y ascorbato cálcico Fuente de omega-3 Alto contenido proteínas Alto contenido en calcio Contenido reducido de sodio García Iñiguez de Ciriano y col. (2013) Chorizo: Gel de konjac con mezcla de aceites (oliva+li- no+pescado) como sustituto de tocino (25-100%) Valor energético reducido Alto contenido proteínas Alto contenido omega-3, AGM y AGI Jiménez-Col- menero y col. (2013b) Salchichón: Adición de Ca (máx. 300 mg/100 g) en forma de citrato, gluconato y lactato cálcico. Fuente de calcio Contenido reducido de grasa Selgas y col. (2009b) Salchichón: Adición de ácido fólico (máx 2,4 mg/100 g) Fuente de ácido fólico Galán y col. (2011a) Salchichón con fructooligosacáridos, FOS (máx. 6%)- Reduc- ción de grasa (58%) Fuente de fibra Contenido reducido de grasa Salazar y col. (2009) Salchichón: Adición de licopeno (1,2 mg/100 g) Contiene licopeno Gámez y col. (2011) AGM: Ácidos grasos monoinsaturados; AGI: Ácidos grasos insaturados.
- 57. Estrategias tecnológicas y beneficios saludables de elaborados cárnicos funcionales 57 Tabla 2. Ejemplos de declaraciones de propiedades saludables autorizadas para elaborados cárnicos desarrollados en FUNCIOCA con propiedades avaladas por declaración nutricional (Reglamento 432/2012) Declaración nutricional Declaración saludable Fuente de ácidos grasos omega-3 (α-linolénico) El ácido linolénico contribuye a mantener niveles normales de co- lesterol sanguíneo Fuente de ácidos grasos omega-3 (EPA-DHA) Los ácidos EPA y DHA contribuyen al funcionamiento normal del corazón Mín 40mg DHA/100g y 100kcal El ácido DHA contribuye a mantener el funcionamiento normal del cerebro y al mantenimiento de la visión en condiciones normales. Alto contenido en grasas insaturadas La sustitución de grasas saturadas por grasas insaturadas contribuye a mantener niveles normales de colesterol sanguíneo. El ácido olei- co es una grasa insaturada. Alto contenido en grasas insaturadas La sustitución de grasas saturadas por grasas insaturadas contribuye a mantener niveles normales de colesterol sanguíneo (los AGM y AGP son grasas insaturadas). Fuente de calcio El calcio contribuye a la coagulación sanguínea normal, al metabo- lismo energético normal, al funcionamiento normal de los múscu- los, de la neurotransmisión y de las enzimas digestivas. El calcio contribuye al proceso de división y diferenciación de las células y es necesario para el mantenimiento de los huesos y dientes en condiciones normales. Fuente de yodo El yodo contribuye a la función cognitiva normal, al metabolismo energético normal, al funcionamiento normal del sistema nervioso, al mantenimiento de la piel en condiciones normales, a la produc- ción normal de hormonas tiroideas y a la función tiroidea normal. Fuente de selenio El selenio contribuye al mantenimiento del cabello y uñas en con- diciones normales, al funcionamiento normal del sistema inmu nitario, a la función tiroidea normal, a la protección de las células frente al daño oxidativo y a la espermatogénesis normal. Contenido reducido en sodio Un menor consumo de sodio contribuye a mantener la tensión ar- terial normal. Fuente de folatos Los folatos contribuyen al crecimiento de los tejidos maternos du- rante el embarazo, a la síntesis normal de aminoácidos, a la forma- ción normal de células sanguíneas, al metabolismo normal de la homocisteína, a la función psicológica normal, al funcionamiento normal del sistema inmunitario, al proceso de división celular, al metabolismo energético normal y ayudan a disminuir el cansancio y la fatiga. Fuente de proteínas Las proteínas contribuyen a conservar y aumentar la masa muscu- lar, y al mantenimiento de los huesos en condiciones normales
- 58. 58 Francisco Jiménez Colmenero, Mª Dolores Selgas, Diana Ansorena micelarización resultó elevada, aunque dependió del contenido de grasa: va desde 29-34% de la cantidad inicialmente presente en salchichas con bajo contenido de grasa, hasta 73-81% con alto contenido de grasa. La conservación (22 días a 4 °C) no afectó significativamente el con- tenido de luteína o su bioaccesibilidad. Estos resultados demuestran dos aspectos relevantes. Por un lado, la utilidad de los modelos in vitro para proporcionar una destacada información sobre la biodisponibilidad de nutrientes funcionales añadidos a nuevas formulaciones de ali- mentos. Por otra, la idoneidad de los productos cárnicos como portadores de luteína y como un medio para incrementar su ingesta de manera sistemática (Granado-Lorencio y col., 2010). El estudio de la bioaccesibilidad del AF en los elaborados cárnicos se realizó por procedi- mientos in vitro estáticos (Galán y col., 2012) y dinámicos, en este último caso, en el TNO Qua- lity for Life de Zeist (Holanda) con el grupo del Dr. R. Havenaard; la bioaccesibilidad fue alta en todos los casos, llegando a alcanzar el 100% en los elaborados cárnicos frescos. En productos RTE se observó aumento de la bioaccesibilidad en los productos cocidos y en los madurados, probablemente debido a que la irradiación modifica la estructura de la matriz cárnica, favorece su extracción y deja, en consecuencia, mayor cantidad libre de AF para poder ser absorbido. En el caso del calcio, la bioaccesibilidad se estudió utilizando células Caco-2. Los estudios se realizaron en los elaborados cárnicos con las concentraciones máximas de las sales cálcicas con las que se habían obtenido los mejores resultados. Los niveles de bioaccesibilidad variaron en función de la matriz cárnica; así, los índices de permeabilidad aparente (Papp) fueron más bajos en los productos madurados (máximo 70%), mientras que la mayor bioaccesibilidad fue observada en los productos frescos, con valores muy próximos a los obtenidos en la leche enri- quecida en calcio utilizada como control (aprox. 20%) (Soto y col., 2012). Se han evaluado mediante métodos in vitro estáticos, utilizando membranas de diálisis, la bioaccesibilidad del licopeno en los productos cárnicos reformulados. Los resultados obtenidos mostraron una accesibilidad baja, inferior al 20%. Los mayores valores se observaron también en los productos cárnicos frescos, independientemente del derivado del tomate utilizado. En cola- boración con la Dra. Paola Palozza en el Instituto de Patología General de la Facultad de Medi- cina de la Universidad Católica del Sacro Cuore de Roma, y empleando cultivos celulares de fi- broblastos RAT-1, se ha demostrado que la irradiación es capaz de aumentar la capacidad antioxidante del licopeno presente tanto en los derivados del tomate utilizados, como en las hamburguesas a los que se ha añadido, al inhibir el estrés oxidativo inducido y disminuir de forma significativa la producción intracelular de especies reactivas al oxígeno. Así mismo se ob- servó que la irradiación reduce los niveles de todo-E-licopeno y aumenta los de Z-licopeno. 4.2. Estudios de experimentación animal En coordinación con las estrategias de obtención de los derivados cárnicos reformulados con algas y con glucomanano (konjac) descritos en la sección 2, en el marco de FUNCIOCA y con el propósito de avanzar en la evaluación de las propiedades saludables, se han realizado estu- dios de experimentación animal empleando este tipo de derivados. En tal sentido se ha analizado el efecto que lleva aparejado la ingesta continuada de rees- tructurados de cerdo (RC) enriquecidos con distintos tipos de algas en ratas Wistar macho. Tales productos fueron diseñados para mejorar el perfil lipoproteico y el status antioxidante por su riqueza en compuestos bioactivos. Con tal fin se han empleado cuatro tipo de algas: Nori (Por- phyra sp.), Kombu (Laminaria sp), Espagueti de mar y Wakame. Los resultados obtenidos han demostrado que el consumo de los reestructurados ofrece protección frente a la enfermedad cardiovascular, aunque los mecanismos implicados varían en función del tipo de alga (Sán- chez-Muniz, 2012). Sin embargo, también se ha constatado que estos productos, por su elevado contenido en hierro, producen peroxidación lipídica hepática, oxidación de proteínas hepáticas y daño oxidativo asociado a otros tejidos (Olivero-David y col., 2011). Niveles de inclusión de algas (desecadas) de hasta el 7% no afectan a la aceptabilidad de las dietas. El crecimiento de las ratas (ganancia de peso) en términos generales fue bueno, aunque la dieta conteniendo Kombu
- 59. Estrategias tecnológicas y beneficios saludables de elaborados cárnicos funcionales 59 sin colesterol produjo un menor crecimiento, lo que originó un índice de conversión (ganancia de peso/ingesta) también ligeramente menor. La generalización de que cualquier alga es hipo- colesterolemiante y antioxidante no parece acertada. En tal sentido se ha demostrado que dietas ricas en colesterol inducen hipercolesterolemia, infiltración grasa hepática y peroxidación lipídi- ca en las ratas, efectos que fueron parcialmente controlados con la inclusión en la dieta de pro- ductos cárnicos conteniendo algas Nori y Espagueti de mar (Schultz-Moreira y col., 2011 y 2013). También, se ha observado que la presencia del alga Espagueti de mar en los reestructurados bloquea parcialmente el efecto hipercolesterolémico de la dieta y modifica la expresión de en- zimas lipogénicas/lipolíticas, reduciendo el efecto atrófico de la hipercolesterolemia en el tejido adiposo de las ratas (Gonzalez-Torres y col., 2012a). El consumo de algas afecta al glutation total y reducido, a la actividad de la glutation reductasa, y a la capacidad antioxidante global en el hígado. Moreira y col. (2010) demostraron que la inclusión de Wakame en RC, incluso en dietas enriquecidas con colesterol, mejora la actividad y expresión génica de enzimas antioxidantes. La disminución en el status antioxidante de las ratas alimentadas con Kombu se relacionó con el elevado contenido de arsénico de este alga, el cual lleva al incremento compensatorio de la ac- tividad del enzima glutation reductasa. Las diferencias en las propiedades hipolipemiantes y antioxidantes de las dietas con RC en- riquecidos con distintas algas se atribuyeron a su diferente composición (por ejemplo, fibra dietética soluble o total, minerales, vitaminas, y contenido fitoquímico) (González-Torres y col., 2012a; Moreira y col., 2010). Por otra parte, los resultados obtenidos también sugieren que algu- nos elementos de la carne (por ejemplo, hierro) pueden interactuar con algunos compuestos de las algas y neutralizar sus efectos (Moreira y col., 2010). El glucomanano, como fibra dietética, y el alga espirulina (Spirulina máxima), se han incor- porado en reestructurados cárnicos para su inclusión en dietas para ratas diabéticas obesas con el fin de reducir el exceso de lípidos en la sangre. Dichas dietas fueron bien toleradas y resulta- ron más efectivas en la pérdida de peso que la control. La asociación de glucomanano y espiru- lina disminuyó notablemente el efecto hipercolesterolémico de una dieta enriquecida con RC adicionado de colesterol, y normalizó las distintas lipoproteinas, fundamentalmente las LDL (González-Torres y col., 2012b). Los efectos de la adición de un 15% de un producto cárnico con glucomanano y espirulina en la dieta hipercolesterolémica en ratas Fa/Fa, se asocian a una re- ducción en el hígado del estado inflamatorio y a una activación de la AMPK (proteína quinasa dependiente de AMP). La AMPK regula el metabolismo de los carbohidratos y lipidos y su fos- forilación se inhibe en el síndrome metabólico, caracterizado por obesidad, diabetes y dislipide- mia. La mejora de la dislipidemia en las ratas hipercolesterolémicas sugiere que el glucomanano tiene beneficios notables en el síndrome metabólico (Benedi y col., 2012). En resumen, la menor resistencia a la insulina producida por la fibra soluble y la espirulina en las dietas hipercoleste- rolemicas conduce a la activación de la AMPK en el hígado y tejido adiposo, dirigiendo la acti- vidad metabólica hacia el consumo de energía. Con ello contribuye a una menor acumulación lipídica y a un menor estado oxidativo a nivel hepático. 4.3. Estudios de intervención en humanos La fundamentación científica del efecto funcional (declaraciones de salud) debe basarse en estudios metodológicamente correctos realizados sobre seres humanos y de manera especial en estudios experimentales o de intervención (Ashwell, 2002; Aggett y col., 2005). En este contexto se ha realizado un estudio de intervención empleando algunos de los productos cárnicos desa- rrollados en FUNCIOCA. Concretamente se ha comparado el consumo de salchichas tipo frank- furt y paté reformulados: a) reducidos en grasa (RF) (≈ 15% de grasa); b) reducidos en grasa y enriquecidos con ácidos grasos n-3 (n-3 RF) (≈ 15% de grasa), con c) productos tipo comercial (NF) (contenido en grasa 18% salchichas y 30’8% paté). Sobre tales elaborados, además de esta- blecer su viabilidad tecnológica y sensorial (comentadas en el apartado 2.3), se evaluó el posible efecto funcional de su consumo (durante 4 semanas) en una población diana en riesgo cardio- vascular (Delgado-Pando y col., 2013). Para ello se diseñó un estudio de intervención cruzado y
- 60. 60 Francisco Jiménez Colmenero, Mª Dolores Selgas, Diana Ansorena controlado con 22 voluntarios, incorporando como criterio de inclusión dos de los siguientes factores de riesgo de ECV: nivel de colesterol total superior a 200 mg/dl, nivel de LDL-colesterol superior a 110 mg/dl e índice de masa corporal entre 25 y 34,9 kg/m2 . Las variables principales del estudio fueron parámetros de uso clínico como colesterol total, LDL y HDL colesterol y tri- glicéridos, y también una medida de la oxidación de las LDL. Los resultados obtenidos indicaron que el consumo regular de productos cárnicos con redu- cido contenido en grasa, enriquecidos o no en ácidos grasos n-3, afecta positivamente el perfil de lipoproteínas de los voluntarios, disminuyendo los niveles de LDL colesterol y LDL oxidado, y por lo tanto el riesgo de accidente cardiovascular. En comparación con los efectos de la inges- ta de productos con el nivel habitual de grasa (NF), las respuestas que presenta el consumo de elaborados con reducido contenido en grasa enriquecidos o no con PUFA n-3 (n-3 RF y RF) es diferente. Mientras que la ingesta de productos n-3 RF indujo una reducción del LDL colesterol, LDL oxidado y de la relación de colesterol LDL-colesterol/HDL, la ingesta de productos RF mo- dificó sólo el nivel de LDL oxidado. Para verificar que la muestra de sujetos en la que se ha observado el efecto funcional es representativa de la población con riesgo cardiovascular, y poder así generalizar resultados, se deberán realizar adicionales estudios de intervención con este tipo de productos (Delgado-Pando y col., 2013). En todo caso se puede señalar que a través de la estrategia de reformulación planteada, se pueden elaborar productos cárnicos saludables, de contenido graso reducido, estables, con propiedades físico-químicas y organolépticas ade- cuadas y con un perfil lipídico optimizado de acuerdo a los objetivos nutricionales actuales. La inclusión en la dieta de estos productos cárnicos reformulados da lugar a una disminución de la concentración de LDL-colesterol en sujetos con riesgo cardiovascular elevado. 5. Conclusiones Como consecuencia del trabajo realizado en el marco de FUNCIOCA se ha puesto de ma- nifiesto la viabilidad tecnológica y sensorial de un notable número de elaborados cárnicos (frescos, crudo curados o tratados por el calor) reformulados mediante diversas estrategias tecnológicas. Estas han sido empleadas tanto para reducir la presencia de componentes no deseados (p.e. grasa y sodio), como para favorecer la de aquellos otros con efectos beneficio- sos (DHA, EPA, minerales, carotenoides, fibra, ácido fólico, etc.). Otra novedad ha sido la ela- boración de productos cárnicos funcionales listos para el consumo. Acompañando al desarrollo tecnológico, los estudios realizados sobre su biodisponibilidad, así como en los ensayos de experimentación animal han demostrado la actividad funcional de varios de los ingredientes bioactivos incorporados en los elaborados cárnicos. De igual modo se ha realizado un estudio de intervención en humanos que ha puesto de manifiesto que la ingesta de este tipo de pro- ductos (menor contenido en grasa y perfil lipídico optimizado) dentro de la dieta habitual produce efectos funcionales, ya que mejora los niveles de algunos biomarcadores de riesgo cardiovascular en los consumidores. Por otro lado, complementariamente se ha ensayado la aplicación de algunas tecnologías nuevas de conservación a los productos reformulados. En tal sentido los electrones acelerados se perfilan como una tecnología útil para la higienización de productos cárnicos funcionales RTE obteniéndose alimentos seguros y sensorialmente aceptables (véase el capítulo VI del subpro- yecto PROCARTE) con un contenido de los compuestos bioactivos estudiados que los hace adecuados para su inclusión en una dieta “más saludable”. Equipos participantes Los resultados que se recogen en este capítulo derivan de las investigaciones llevadas a cabo en las distintas acciones realizadas por los equipos que han participado en el subproyecto FUN- CIOCA que han sido coordinadas por F. Jiménez Colmenero (ICTAN-CSIC), I. Astiasarán (UNAV), M.D. Selgas (UCM), J.A. García Regueiro (IRTA) y J. Bon (UPV).
- 61. Estrategias tecnológicas y beneficios saludables de elaborados cárnicos funcionales 61 Agradecimientos La investigación que recoge este capítulo ha sido llevada a cabo en el marco del Proyecto Consolider-Ingenio 2010 CARNISENUSA CSD2007-00016, en colaboración con los siguientes proyectos: AGL2005-07204-CO2-02, AGL-2008-04892-C03- 01/ALI, AGL2008-01099/ALI, AGL2011- 29644-C02-01 (Ministerio de Economía y Competitividad), S-505/AGR-0314 (TEMINYSA) (Comu- nidad de Madrid) y BSCH-UCM GR58/08 (Gr.Nº. 920276) (Universidad Complutense). 6. Referencias Aggett P.J., Antoine J.M., Asp N.G., Bellisle F., Contor L., Cummings J.H., Howlett J., Müller D.J.G., Persin C., Pijls L.T.J., Rechkemmer G., Tuijtelaars S. Verhagen H. 2005. PASSCLAIM. Process for the assess- ment of scientific support for claims on foods. Consensus Criteria. European Journal Nutrition Suppl 1, 44:I/1 – I/30. Ashwell, M. 2002. Concepts of functional foods. International Life Science Institute. ILSI Europe Concise Monograph Series. Brussels. Belgium. Bastida, S., Sánchez-Muniz, F, Olivero, R., Pérez-Olleros, L., Ruiz-Roso, B., Jiménez-Colmenero, F. 2009. Antioxidant activity of carob fruit extracts in cooked pork meat systems during chilled and frozen storage. Food Chemistry 116, 748-754. Benedi, J., González-Torres, L., Vázquez-Velasco, M., Bastida, S., Sánchez-Muniz, F.J. 2013. Restructured meat enriched in glucomannan increases the pAMPK levels and ameliorates dyslipidemia in Fa/Fa rats. 6th European Congress of Pharmacology. EPHAR2012, Granada Spain. P450. http://bps.conferen- ce-services.net/resources/344/3046/pdf/EPHAR2012_0412.pdf Berasategi, I., Cuervo, M., Ruiz de las Heras, A., Santiago, S., Martínez, J.A., Astiasarán, I., Ansorena, D. 2011a. The inclusion of functional foods enriched in fibre, calcium, iodine, fat-soluble vitamins and omega-3 fatty acids on a conventional diet improve the nutrient profile according to the Spanish re- ference intakes. Public Health Nutrition 14, 451-458. Berasategi, I., Legarra, S., Garcia-Iñiguez de Ciriano, M., Calvo, M.I., Cavero, R.Y., Navarro-Blasco, I., An- sorena, D., Astiasarán, I. 2011b. High in omega-3 fatty acids bologna-type sausages stabilized with an aqueous-ethanol extract of Melissa officinalis. Meat Science 88, 705-711. Calvo M.M., García, M.L., Selgas, M.D. 2008. Dry fermented sausages enriched with lycopene from tomato peel. Meat Science 80, 167-172. Campos, S., Berasategi, I., Poyato, C., García-Iñiguez de Ciriano, M., Larequi, E., Astiasarán, I., Ansorena, D. 2011. Effect of antioxidants on thermal stability of oil in water emulsions Rich in unsaturated fatty acids. 9th EURO FED LIPID CONGRESS: Oils, Fats and Lipids for a Healthy and Sustainable World. Roterdam (Holanda), 19-21 Septiembre. Carmona, P., Ruiz-Capillas, C., Jiménez-Colmenero, F., Pintado, T., Herrero, A. M. 2011. Infrared study of structural characteristics of frankfurter formulated with olive oil-in-water emulsion stabilized with casein as pork backfat replacer. Journal Agriculture and Food Chemistry 59, 12998-13003. Clariana, M., Gratacós-Curbasí, M., García-Regueiro, J. A., Castellari, M. 2010. Analysis of seven purines and pyrimidines in pork meat products by ultra high performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A 1217, 4294-4299. Cofrades, S. Antoniou, I., Solas, M. T., Herrero, A. M., Jiménez-Colmenero, F. 2013. Preparation and impact of multiple (water-in-oil-in-water) emulsions in meat systems. Food Chemistry 141, 338-346. Cofrades, S., López-López, I., Bravo, L., Ruiz-Capillas, C., Bastida, S., Larrea, M. T., Jiménez Colmenero, F. 2010. Nutritional and antioxidant properties of different brown and red spanish edible seaweeds. Food Science and Technology International 16, 361-370. Cofrades, S., López-López, I., Ruiz-Capillas, C., Triki, M., Jiménez-Colmenero, F. 2011a. Quality characteristics of low-salt restructured poultry with microbial transglutaminase and seaweed. Meat Science 87, 373-380. Cofrades, S., Salcedo, L., Delgado-Pando, G., López-López, I., Ruiz-Capillas, C., Jiménez-Colmenero, F. 2011b. Antioxidant activity of hydroxytyrosol in frankfurters enriched with n-3 polyunsaturated fatty acids. Food Chemistry 129, 429-436. Delgado-Pando, G., Celada, P., Sánchez-Muniz, F., Jiménez-Colmenero, F., Olmedilla-Alonso, B. 2013. Effects of improved fat content of frankfurters and pâtés on lipid and lipoprotein profile of volunteers at increased cardiovascular risk. A placebo-controlled study. European Journal of Nutrition DOI 10.1007/s00394-013-0502-1.
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- 67. CAPITULO V Implicaciones de la reducción de los niveles de uso de nitratos y nitritos en la seguridad, conservación, características senso- riales y modificaciones tecnológicas de los productos cárnicos crudos-curados Jacint Arnau, M. Dolors Guàrdia y Marta Gratacós Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (IRTA). Monells Manuela Fernández y Eva Hierro Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos, Facultad de Veterinaria (UCM). Madrid Pedro Roncalés Tecnología de los Alimentos, Universidad de Zaragoza (UNIZAR). Zaragoza José Carballo Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN-CSIC). Madrid Beatriz Villegas Asociación de Investigación de la Industria Agroalimentaria (AINIA). Valencia Jorge Ruiz Universidad de Extremadura (UEX). Cáceres Neus Sanjuan Universidad Politécnica de Valencia (UPV). Valencia 1. Introducción Los nitritos se han añadido tradicionalmente a los productos cárnicos para inhibir el creci- miento de los microorganismos alterantes y los patógenos que potencialmente puedan alcanzar al producto, conferir y estabilizar el color del curado, ejercer una acción antioxidante y contri- buir al desarrollo de su flavor típico. El nitrato por sí solo carece de estas propiedades y su efecto depende de su reducción a nitrito. La acción antimicrobiana es, sin duda, una de las fun- ciones más destacables ya que afecta a la seguridad alimentaria y, por tanto, a la salud del con- sumidor. La carne supone un sustrato ideal para el crecimiento de una gran diversidad de mi- croorganismos y, por ello, los productos cárnicos han requerido del uso de métodos eficaces para su conservación. Algunos de estos métodos se basan en la acción conjunta de diferentes obstáculos. Así por ejemplo en los embutidos crudos-curados se produce la acción combinada de la disminución del pH, disminución de la actividad de agua (aw) y la adición de nitrificantes.
- 68. J. Arnau, M. D. Guàrdia, M. Gratacós, M. Fernández, E. Hierro, 68 P. Roncalés, J. Carballo, B. Villegas, J. Ruiz, N. Sanjuan Cuando se añade nitrito a la carne, se producen reacciones con varios de sus componentes. El destino final del nitrito responde, según Cassens (1990), a la siguiente situación: nitrito resi- dual (5-20%), reacción con la mioglobina (5-15%), transformación a nitrato (1-10%), disipación en forma de gas (1-5%) y productos derivados de su interacción con grupos sulfidrilo (5-15%), con lípidos (1-5%) y con proteínas (20-30%). Esto implica que el nitrito total disminuye a lo lar- go de las etapas de procesado, conservación, preparación y consumo, en función de diversos factores relacionados con el tipo de producto y las condiciones de cada etapa. Por ello, la deter- minación del nitrito residual como parámetro para evaluar la cantidad de nitrito adicionado se ha considerado de utilidad limitada. Entre los distintos métodos analíticos disponibles para la determinación de nitratos y nitritos en carne, el análisis por inyección de flujo (FIA) es una im- portante alternativa a los métodos de control tradicionales tanto en laboratorios de análisis ruti- narios, como en los de la administración y la industria, ya que este sistema presenta importantes ventajas, permitiendo una determinación precisa, simple y rápida de pequeñas cantidades de nitratos y nitritos con bajo consumo de reactivos y empleo de pequeños volúmenes de muestras (Ruiz-Capillas y Jiménez-Colmenero, 2008a y 2008b). Sin embargo, conocer el efecto de la reduc- ción de los niveles de nitrito añadido es de gran interés no sólo por su importancia en la esta- bilidad de los productos (color, oxidación de lípidos, seguridad, etc.), sino también por su im- plicación en la salud de los consumidores. El nitrito que permanece en la matriz cárnica a lo largo del proceso de maduración sirve como reservorio de óxido nítrico con acción continuada en la estabilización de los pigmentos del color, pero también puede permitir la producción de nitrosaminas. Todo ello implica una acción directa de los nitrificantes sobre la seguridad abiótica de los productos cárnicos. Por otra parte, en las últimas décadas se ha descubierto en el ámbito de las ciencias biomédicas que el óxido nítrico obtenido a partir de la reducción del nitrito tiene importantes beneficios terapéuticos. Así, por ejemplo, puede prevenir, entre otros, varios tipos de problemas cardiovasculares (Sindelar y Milkowski, 2011). Por tanto, puede que haya que considerar a los nitratos como compuestos con efectos diversos, unos nocivos derivados de la formación de nitrosaminas, algunos necesarios como aditivos tecnológicos y, otros, recomenda- bles como micronutrientes esenciales, por lo que no parece descabellado pensar que en un fu- turo próximo se considere esta última propiedad de los nitratos como deseable para la salud (Lundberg y col., 2011). Además de la transformación de nitrato a nitrito, de nitrito a óxido nítrico y subsiguientes reacciones, las conversiones que los nitratos y/o nitritos experimentan en el proceso de elabo- ración de una pieza entera como el jamón curado son, si cabe, más complejas, pues dependen de la velocidad de difusión desde la superficie al interior (Arnau y col., 1995; Arnau y col., 2003; Gómez Salazar, 2013). Actualmente, existe una importante presión por parte de las autoridades sanitarias de revisar los niveles de nitratos y nitritos autorizados en productos cárnicos. Por tanto, es posible que las cantidades de nitritos y nitratos autorizados se reduzcan en un futuro próximo. Por ello, el sector cárnico debe estar preparado para afrontar el posible cambio normativo garantizando en todo momento la seguridad de los productos cárnicos para proteger la salud de los consumidores. En estos fundamentos tiene su origen el subproyecto NITRARED que tiene dos objetivos principa- les: a) valorar el efecto de la reducción de la cantidad de nitritos y nitratos añadidos en la calidad sensorial, en la vida útil y en la seguridad de dos productos fermentados (salchichón extra y chorizo vela) y dos productos madurados (fuet extra y jamón curado) y b) optimizar las condi- ciones de nitrificación, según los resultados obtenidos, para mejorar la seguridad y las caracte- rísticas sensoriales de los productos cárnicos crudos-curados. Este capítulo tiene como objetivo fundamental exponer los resultados, de interés práctico para la industria cárnica, relacionados con la adición de nitrificantes a los productos cárnicos que se han obtenido en el subproyecto NITRARED. Se expone de forma resumida la actividad antimicrobiana de los nitrificantes, su efecto en los atributos sensoriales, en la seguridad abiótica, en los compuestos nutricionales y en la estabilidad oxidativa. Finalmente se discuten los factores que afectan a la heterogeneidad del contenido de nitrificantes, especialmente en jamón curado.
- 69. Implicaciones de la reducción de los niveles de uso de nitratos y nitritos en la seguridad,... 69 2. Actividad antimicrobiana del nitrato y nitrito Como ya se ha indicado anteriormente, el nitrito ejerce una importante función en la segu- ridad microbiológica de los productos curados, destacando la inhibición del crecimiento de Clostridium botulinum y Salmonella spp. Sin embargo, el nitrato por sí sólo carece de actividad antimicrobiana y su contribución a la seguridad depende de su reducción a nitrito, lo cual tiene lugar durante la maduración. No obstante, la estabilidad y seguridad de los productos cárnicos crudos-curados, desde el punto de vista microbiológico, no sólo se debe a la acción de los nitratos y nitritos, sino que es el resultado de la combinación de los obstáculos que se establecen consecutivamente du- rante el proceso de elaboración, como son el potencial redox, la actividad de los cultivos iniciado- res, el pH y la aw (Leistner, 1992). Cualquier variación en estos factores podría traducirse en impor- tantes cambios microbiológicos en el producto, lo que supondría la necesidad de establecer modificaciones tecnológicas para garantizar la seguridad de estos alimentos. En particular, en los productos cárnicos crudos-curados, la adición de nitratos y nitritos, junto a la del cloruro sódico, es crítica en las fases iniciales del proceso cuando aún no se han establecido los demás obstáculos. En los estudios que se han realizado en jamón curado en el marco del subproyecto NITRA- RED se ha observado que la adición de nitrificantes influye de forma notable en la concentración de aerobios mesófilos totales y Staphylococcus spp. (Fernández y col., 2011). En las experiencias realizadas en este subproyecto no se detectaron enterobacterias en el producto final, indepen- dientemente del tipo o la concentración de nitrificantes utilizada, ni tampoco se observó influen- cia de estos compuestos en los recuentos de mohos y levaduras en el interior del jamón. Cuando no se emplearon nitrificantes y el pH inicial medido en el músculo Semimembra- nosus (pHSM) del pernil fue inferior a 5,5, los recuentos de aerobios mesófilos totales en el pro- ducto final fueron 2-4 log ufc/g más elevados que cuando se añadieron por frotación superfi- cial 600 mg/kg de KNO3 y 800 mg/kg de NaNO2 en el presalado previo al apilado. Esta diferencia fue menor cuando el pHSM fue de 5,5-6,0 (hasta 2 log ufc/g) y no se observó diferencia a valores de pHSM superiores a 6,0 (Hospital y col., 2011). También se han realizado investigaciones en jamón curado comparando la utilización de una mezcla de nitrato y nitrito a 150 mg/kg o 600 mg/kg de cada uno con la adición de sólo nitrato a 150 ó 600 mg/kg de KNO3, los recuentos de aerobios mesófilos totales y Staphylococcus spp. fueron 0,5-2 log ufc/g menores (dependiendo del punto de muestreo y del grupo microbia- no) en los jamones a los que se incorporaron las mezclas. Por otra parte, la concentración final de estos mismos grupos bacterianos fue del orden de 0,5-1 log ufc/g inferior en los lotes con 600 mg/kg, tanto de nitrato sólo como de la combinación de nitrato y nitrito, respecto a los lotes con 150 mg/kg. La incorporación de 500 mg/kg de ascorbato sódico a jamones elaborados con 600 mg/kg de KNO3 y 600 mg/kg de NaNO2 dio recuentos de aerobios mesófilos totales y Sta- phylococcus spp. similares a los jamones sin ascorbato sódico. Por otra parte, en los estudios llevados a cabo en embutidos crudos-curados la adición de KNO3 y NaNO2 no tuvo efecto en los recuentos de aerobios mesófilos totales ni en los de bac- terias lácticas. Sí que se observaron diferencias en los recuentos de cocos Grampositivos catala- sa-positivos, cuya concentración final fue 1-2 log ufc/g inferior en los lotes con 150 mg/kg nitra- to + 150 mg/kg nitrito y en los lotes elaborados con una reducción de nitrificantes al 75% en comparación con embutidos elaborados sin nitrificantes o con una reducción al 50% de los mismos. Los resultados obtenidos también evidencian la importancia de una adecuada concentración de nitrificantes en la masa para controlar la población de enterobacterias de los embutidos. En salchichón, sólo en los lotes con el máximo añadido permitido por el Reglamento 1333/2008 (150 mg/kg nitrato + 150 mg/kg nitrito) no se detectaron estos microorganismos en el producto final. Empleando cantidades inferiores, los niveles finales de enterobacterias fueron de 1-2 log ufc/g, apreciándose en los lotes sin nitrificantes y con una reducción del 50% un incremento
- 70. J. Arnau, M. D. Guàrdia, M. Gratacós, M. Fernández, E. Hierro, 70 P. Roncalés, J. Carballo, B. Villegas, J. Ruiz, N. Sanjuan durante la fase fermentativa. En el fuet, la reducción de la cantidad de nitrificantes dio lugar a recuentos de enterobacterias superiores, en torno a 1 (reducción al 75% de la cantidad máxima permitida), 2 (reducción al 50%) y 3 log ufc/g (sin nitrificantes) más que en los productos ela- borados con el nivel máximo autorizado por la legislación. Durante el desarrollo del subproyecto NITRARED también se han realizado ensayos de inoculación de embutidos con Listeria innocua (como subrogado de Listeria monocytogenes). En ausencia de sales nitrificantes, Listeria se multiplicó durante la fase fermentativa, lo que motivó que los recuentos finales fueran similares a los iniciales. En presencia de nitrificantes se observó una inhibición ya desde las primeras etapas del proceso de maduración, cuya de- pendencia de la concentración de nitratos y nitritos se hizo evidente a partir de la primera semana. Los recuentos finales fueron aproximadamente 1,5 log ufc/g mayores en los lotes con reducción de nitrificantes al 75 y 50% respecto del lote con el máximo permitido (Hospital y col., 2012). 3. Efecto del nitrato y nitrito en los atributos sensoriales 3.1. Efecto sobre el aroma El desarrollo del aroma en los productos cárnicos curados es muy complejo debido al gran número de reacciones implicadas. Los compuestos responsables del aroma surgen como con- secuencia de fenómenos microbiológicos (fermentativos, esterificaciones y acciones sobre lí- pidos, proteínas, péptidos y aminoácidos), reacciones químicas (oxidación lipídica, reacción de Maillard y degradación vía Strecker de aminoácidos) y enzimáticas de origen endógeno (proteolisis y lipolisis), sin olvidar a los componentes aportados por la propia carne, ingre- dientes, aditivos, especias o ahumado (Ordóñez y col., 1999) y la interacción conjunta de los mismos. La adición de nitratos y/o nitritos afecta a la lipolisis y a las reacciones de degrada- ción de aminoácidos, al crecimiento de determinados microorganismos y a la oxidación de distintos componentes de la carne. Además, evita la aparición de aromas no deseados relacio- nados con la degradación del producto. Sin embargo, la reducción de nitratos y nitritos a un 50% de la concentración máxima permitida no parece que afecte a las características sensoria- les de embutidos crudos-curados como fuet, salchichón y chorizo (Lorente y col., 2011a y 2011b). El perfil de compuestos volátiles de los salchichones estudiados en el subproyecto NITRA- RED mostró que el grupo mayoritario fue el procedente de la fermentación de los carbohidratos. Dicho perfil fue similar en todos los salchichones elaborados con nitratos y nitritos, indepen- dientemente de la concentración utilizada. Sin embargo, sí se observaron diferencias significati- vas (p0,05) con el lote preparado sin nitrificantes. Este lote se caracterizó por presentar, además de un mayor contenido de compuestos procedentes de la fermentación de carbohidratos, niveles más altos de volátiles derivados de la oxidación lipídica y de la degradación de aminoácidos que los lotes elaborados con nitrificantes. En fuet las muestras control elaboradas sin nitrificantes también presentaron niveles superiores de volátiles, concretamente aquellos derivados de la oxidación lipídica (Hierro y col., 2011). En jamón, la reducción de la cantidad añadida de nitratos y nitritos de 600 mg/kg a 150 mg/ kg disminuyó significativamente la intensidad del flavor a curado en los jamones de corta cura- ción. En los jamones de larga curación, el efecto se detectó en la intensidad global de flavor. En ambos casos, el efecto fue significativo aunque se considera poco importante en términos sen- soriales (Lorente y col., 2012). La adición de ascorbato en jamones de larga curación elaborados con 600 mg/kg de nitratos y nitritos dio lugar a un descenso de la intensidad de flavor global aunque de escasa importancia. En general, los resultados obtenidos sugieren que la reducción de nitrificantes en jamón de corta y larga curación resultaría viable desde el punto de vista sen- sorial (Lorente y col., 2012).
- 71. Implicaciones de la reducción de los niveles de uso de nitratos y nitritos en la seguridad,... 71 3.2. Efecto sobre el color Los consumidores utilizan el color como uno de los parámetros para evaluar la calidad y el buen estado de conservación de los alimentos y, en definitiva, para tomar la decisión de compra, lo cual acentúa la importancia de conseguir y mantener un color atractivo para los mismos. Los agentes nitrificantes son responsables de la formación del pigmento nitrosil-mioglobina que contribuye al color rojizo característico de los productos cárnicos curados. En los productos cocidos el pigmento nitrosil-mioglobina se transforma durante el tratamiento térmico en nitrosil- miocromógeno de color rosa. En las experiencias realizadas en el marco del subproyecto NITRARED en jamón curado, tanto de corta como larga curación, el índice de curado (Icurado = I nitrificación- I decoloración) demostró que la utilización de nitrificantes, bien a 600 mg/kg de nitrato y a 600 mg/kg de nitrato + 600 mg/kg de nitrito o bien a 150 mg/kg de nitrato y 150 mg/kg de nitrato + 150 mg/kg de nitrito, dio lugar a un color aceptable en todos los casos, a pesar de que se detectaron diferencias sig- nificativas entre lotes. A nivel sensorial, para jamón de corta curación se observaron diferencias entre aquellos elaborados con 600 mg/kg de nitrato y 600 mg/kg de nitrato y nitrito, siendo la intensidad de color mayor en jamón con nitrato y nitrito añadidos. Para jamón de larga curación, a las concen- traciones estudiadas no se observaron diferencias significativas (Lorente y col., 2011a). La adición de ascorbato de sodio mejoró ligeramente el color de curado. Por otra parte, los jamones sin nitrificantes añadidos presentaron un índice de curado muy inferior. Sin embargo, en la evaluación sensorial del color no se detectaron diferencias significativas. Ello fue debido a que en ausencia de nitrificantes, se forma lentamente Zn-protoporfirina (ZnPP), que posee un color similar al de la nitrosil-mioglobina, como se demostró en el estudio de Wakamatsu y col. (2004). Estos resultados sugieren la posibilidad de la no utilización de nitrificantes como aditivos para la obtención de un color de curado apropiado, siempre que esté garantizada la seguridad alimentaria mediante el establecimiento de obstáculos apropiados durante el procesado. Si bien la Zn-protoporfirina es el pigmento mayoritario en jamones sin nitratos y nitritos añadidos, se observó también su presencia en el interior de jamones con pHSM5,5 y nitrificados por frotado superficial mediante 600 mg/kg de nitrato y 800 mg/Kg de nitrito por kg de jamón fresco. Sin embargo, no se observó cuando el pHSM6,0 (Roncales y col., 2011). La presencia de ZnPP se puede relacionar con la aparición de halos de nitrificación (Figuras 1a y 1b). Serra y col. (resul- tados no publicados) fruto de un estudio reciente obtuvieron un 38% de jamones con halos. La incidencia de halos fue de un 66% en los jamones con un pHSM5,6 y del 10% en los de pHSM5,6. En los jamones sin nitrificantes añadidos la presencia de pequeñas cantidades de nitrificantes (p.e. agua de lavado) puede generar una ligera nitrificación de la zona cercana a la superficie del producto (Figura 2). Figura 1 a/b. Halos de nitrificación
- 72. J. Arnau, M. D. Guàrdia, M. Gratacós, M. Fernández, E. Hierro, 72 P. Roncalés, J. Carballo, B. Villegas, J. Ruiz, N. Sanjuan Figura 2. Halo externo producido por adición de pequeñas cantidades de nitrificantes En los jamones y paletas, en ocasiones se produce una oxidación del pigmento responsable del color en la zona situada debajo de los huesos superficiales (coxal y escápula) debido a la combinación de una deficiente nitrificación y un ambiente microaerófilo (Figuras 3 y 4). Para evitarlo, debe asegurarse que se aplican nitrificantes sobre el hueso y que éste tiene suficiente humedad para absorberlos (Arnau, 2007). Figura 4. Nitrificación deficiente del magro de jamón adyacente al hueso Figura 3. Nitrificación deficiente del magro de paleta adyacente al hueso En jamón curado se observó un aumento entre el post-salado y el final de proceso de los pigmentos totales (PT), los nitroso-hemo-pigmentos (NHP) y el porcentaje de conversión (NHP/ PT). La intensidad de nitrosación (NHP/PT) fue mayor cuando se añadieron cantidades de nitri- ficantes elevadas (600 mg/kg de nitrato; 600 mg/kg de nitrato+600 mg/kg de nitrito; 600 mg/kg de nitrato+600 mg/kg de nitrito+500 mg/kg ascorbato) que cuando fueron bajas (150 mg/kg de nitrato; 150 mg/kg de nitrato+150 mg/kg de nitrito), sin que se observaran diferencias entre que fueran nitratos o nitritos (Carballo y Andrade, 2011). Por lo que se refiere a la evolución del color a lo largo de la conservación, las lonchas en- vasadas al vacío y mantenidas a 4 ºC conservaron un color adecuado durante 6 meses siempre que se mantuvieran en oscuridad. La presencia de luz dio lugar a una decoloración significativa (Figura 5), que fue mayor en las muestras con menor cantidad de nitrato o nitrito. En el caso de los embutidos (salchichón, fuet y chorizo), la presencia de nitrato y/o nitrito (cantidad máxima, 25 y 50% de reducción) dio lugar a un índice de curado satisfactorio, con pequeñas diferencias dependientes de la concentración. La no adición de nitrificantes dio lugar a un bajo índice de curado, que se relaciona con un color no adecuado. Así pues, en embutidos crudos-curados resulta indispensable utilizar nitrificantes para obtener el color propio de los mismos (Lores y col., 2011).
- 73. Implicaciones de la reducción de los niveles de uso de nitratos y nitritos en la seguridad,... 73 En cuanto a la evolución del color a lo largo de la conservación, el embutido ente- ro envasado en un material macroperforado permitió mantener el color durante 2 me- ses, incluso a temperatura ambiente. Lo mismo puede decirse de las lonchas enva- sadas al vacío y mantenidas a 4 ºC en oscu- ridad, que sólo mostraron una ligera deco- loración. Por el contrario, las lonchas de embutido sometidas a iluminación sufrieron una decoloración significativa a los dos me- ses de conservación. En los embutidos crudos-curados debe evitarse el embarrado de la pasta, ya que afecta negativamente al color típico del cu- rado y al de algunos colorantes (Figuras 6a y 6b). Por otra parte, cuando se añaden sólo nitratos, su transformación a nitrito se ve dificultada si el pH disminuye muy rápi- damente, lo cual da lugar a un desarrollo deficiente del color (Figura 7). En los embu- tidos crudos-curados sin moho de cobertu- ra, la acción combinada de una humedad baja que reduzca la absorción de oxígeno en la superficie del embutido (evitando el acortezado), la adición de nitrificantes y cultivos con capacidad nitratoreductasa fre- na la oxidación del color en superficie (Fi- guras 8 y 9). La presencia de pequeñas cantidades de nitrificantes provoca un cambio importante del color en productos cárnicos cocidos a los que habitualmente no se añaden nitritos (Figura 10). Algunos autores (Sindelar y col., 2011) consideran que la adición de 2 a 14 mg/kg, en función de la especie animal utilizada como materia prima, son suficientes para alcanzar el color rosado, mientras que otros lo sitúan Figura 5. Decoloración de loncha de jamón sometida a iluminación Figura 7. Transformación deficiente de nitrato a nitrito Figura 6 a/b. Defectos de coloración seriados debidos a embarrado durante la embutición.
- 74. J. Arnau, M. D. Guàrdia, M. Gratacós, M. Fernández, E. Hierro, 74 P. Roncalés, J. Carballo, B. Villegas, J. Ruiz, N. Sanjuan en 30-50 mg/kg (Wirth, 1984). Por otra par- te, en los productos cárnicos envasados se produce un aumento de la permeabilidad al oxígeno durante el tratamiento térmico de- bido a que la acción combinada de una temperatura y humedad relativa elevadas facilita la oxidación de la superficie del pro- ducto cárnico, especialmente en aquellas zonas donde el espesor del film se ha redu- cido por efecto de tensiones mecánicas (Fi- gura 11). Este problema se ve especialmen- te agravado cuando el producto cárnico produce poca cantidad de óxido nítrico du- rante la cocción, debido a la adición de una cantidad reducida de nitrito, o a un valor de pH elevado (Arnau, resultados no publicados). En los productos con una cantidad de nitrito reducida, la adición de ascorbato, si bien sería beneficiosa en productos de pH elevado, afec- taría negativamente a la estabilidad del color en los de pH bajo. En los productos cocidos envasados, la acción combinada de la luz y el oxígeno produce un deterioro del color (Figura 12). Para evitar este problema se recomienda la utilización de envases alta barrera al oxígeno y en los productos envasados en atmósfera protectora un residual de oxígeno inferior a 0,15% en el espacio de cabeza. El ascorbato y el isoascorbato aceleran la transformación del nitrito en óxido nítrico, evi- tan la “quemadura” superficial originada por nitrito (Figura 13) y frenan la formación de nitro- saminas en el magro. Ambos deben distribuirse de forma homogénea de manera que no for- Figura 8. Oxidación superficial del color Figura 9. Efecto estabilizante del color producido por la adición de Staphylococcus spp. Figura 12. Oxidación superficial en salchichas cocidas debido a la acción combinada de iluminación y elevada permeabilidad al oxígeno. Figura 10. Nitrificación superficial debida a la presencia de pequeñas cantidades de substancias nitrificantes en el horno de cocción. Figura 11. Oxidación superficial en jamón cocido producida durante la cocción
- 75. Implicaciones de la reducción de los niveles de uso de nitratos y nitritos en la seguridad,... 75 men grumos ya que éstos, en los productos crudos-curados, podrían producir manchas oscuras en la grasa debidas a la reacción de pardeamiento que sufren sus productos de oxi- dación (Figura 14). 4. Efecto del nitrato y nitrito sobre la seguridad abiótica Los compuestos N-nitroso (NOC) o compuestos nitro-derivados son agentes teratogénicos, mutagénicos y carcinógenos (Cassens, 1995). Se producen como resultado de la interacción de un agente nitrosante con un compuesto susceptible de sufrir dicha nitrosación. Los NOC se dividen en dos clases según la estructura química que presenten: las nitrosaminas (NAs), que derivan de aminas, y las nitrosamidas, que resultan de la sustitución de ureas, amidas, carba- matos, guanidinas y compuestos similares. Las nitrosaminas constituyen el grupo más relevante de los NOC como sustancias carci- nogénicas. Se forman por la reacción de compuestos derivados de los nitritos, fundamental- mente con aminas secundarias. Debido a la existencia de aminas en los alimentos, y la adi- ción de nitritos y nitratos durante su elaboración, esta reacción es común en muchos alimentos, como en los productos cárnicos curados. Se ha comprobado que algunos aminoá- cidos que presentan el carácter de amina secundaria como la prolina, hidroxiprolina o sar- cosina, pueden formar nitrosaminas con cierta facilidad. La glicina es el precursor de la N-nitrosodimetilamina y la alanina es el precursor más característico de la N-nitrosodietila- mina. Otra nitrosamina como la N-nitrososarcosina tiene como precursor a la creatinina que es uno de los componentes de la carne. La prolina y la ornitina, originadas a partir de las proteínas del tejido conectivo, actúan como precursores nitrosables de la N-nitrosopirroli dina. Las aminas pueden también derivar de la adición de algunas especias, como es el caso de la piperidina, o incluso pueden provenir de los materiales empleados para el embalaje de dichos productos. Además, los tratamientos térmicos potencian la formación de nitrosaminas a partir de dichos precursores según el tiempo y temperatura de cocción utilizados (Antón y Lisazo, 2003). Los resultados obtenidos en el subproyecto NITRARED mediante la técnica SPME/GC/MS (Ruiz y Calvarro, 2011), indican que las NAs más frecuentes en productos cárnicos, tan sólo se detectaron en un número reducido de embutidos crudos-curados y jamones curados, y no estuvieron asociadas a la mayor o menor presencia de sales nitrificantes en los mismos (Cal- varro y Ruiz, 2011). Figura 14. Pardeamiento de la grasa producido por ascorbato Figura 13. Efecto del ascorbato en el color superficial de un jamón nitrificado con nitrito y nitrato (rojo) y sin adición de ascorbato (verde).
- 76. J. Arnau, M. D. Guàrdia, M. Gratacós, M. Fernández, E. Hierro, 76 P. Roncalés, J. Carballo, B. Villegas, J. Ruiz, N. Sanjuan 5. Otros efectos de los nitratos y nitritos 5.1. Efecto del nitrato y nitrito sobre compuestos nutricionales y estabilidad oxidativa Además de las reacciones que se han indicado anteriormente, el óxido nítrico puede unirse al hierro de distintas hemoproteínas, como la guanilato ciclasa, los citocromos y la hemoglobina, reaccionar con el centro activo de la enzima alcohol deshidrogenasa y, posiblemente, con dife- rentes metaloproteínas biológicamente activas. En este sentido y, en jamón curado, se ha obser- vado que en jamones elaborados con nitrato y nitrito el contenido de piridoxina (B6) es menor y el de nicotinamida (B3) es superior respecto a los jamones elaborados sin nitrificantes. El con- tenido de vitamina B2 y el de la mayoría de aminoácidos libres no se ve afectado. Asimismo, al adicionar nitrificantes se aumenta la actividad del enzima superóxido dismutasa (SOD) y no se afecta la actividad de otras enzimas antioxidantes como son la glutation peroxidasa (GSHPx) y la catalasa (CAT) ni el índice de TBARs inducidos. En embutidos crudos-curados las concentraciones de vitaminas del grupo B no se modifica- ron por las distintas cantidades de nitrificantes añadidos, pero si se pudo observar que el nivel de vitamina B6 disminuía en comparación con los productos elaborados sin nitrificantes (Grata- cós y col., 2010). 5.2. Heterogeneidad en el contenido residual de nitrificantes En la mayoría de los productos cárnicos existe una regulación de la cantidad añadida de nitratos y/o nitritos, por lo que las diferencias entre piezas se pueden minimizar si se efectúa una buena homogeneización de la mezcla de curado en el amasado. Para ello es conveniente diluir las sales de curado en agua o en sal común. En los jamones curados, la cantidad residual de nitrificantes está regulada (Reglamento 1333/2008), por lo que es preciso conocer aquellos factores que pueden afectar a la absor- ción de los nitrificantes y a la transformación del nitrato a nitrito. Los nitrificantes se añaden habitualmente al inicio del proceso antes del apilado, por lo que debe evitarse un exceso de agua en la sal ya que podría arrastrar a los nitrificantes. Por otra parte, mientras que en los jamones con baja capacidad de retención de agua (p.e. carnes congeladas/descongela- das o carnes exudativas) puede darse una mayor pérdida de nitrificantes superficiales, en los que haya habido una deshidratación superficial se favorecerá su absorción por la parte magra. El contenido de nitratos presente en el pernil es poco importante. En aquellos jamones a los que se le añaden nitratos, su concentración en el interior aumenta por difusión desde la zona externa y disminuye durante el reposo y secado por reducción a nitrito, mientras que en superficie disminuye a partir de la etapa de salado por difusión al interior y por reducción a nitrito. En los jamones con pH bajo (pHSM5,5) el contenido de nitratos es más elevado que en los de pHSM entre 5,5 y 6,0. Por tanto, es en aquél rango de pH donde deben realizarse los controles para evitar que haya jamones con contenido superior al máximo permitido. Por otra parte, la concentración en los músculos interiores (más húmedos) es mayor que en los exteriores, lo cual puede deberse a la tendencia a equilibrar la relación nitrato/agua (Arnau y col., 1995). El nitrito añadido en el presalado disminuye durante el salado y primeras semanas de reposo. A pH bajo, la reacción de transformación del nitrito a óxido nítrico se produce de forma más rápida, lo cual hace que se necesite mayor cantidad de nitrito añadido para lograr un color homogéneo al corte y evitar los halos de nitrificación (Arnau y col., 2003). En los procesos en los que se añaden nitratos, la concentración de nitrito aumenta durante el periodo de reposo e inicio del secado, especialmente en las zonas superficiales (Arnau y col., 1995). El momento en que se inicia la transformación del nitrato a nitrito depende del pH de la carne y de la microbiota nitratoreductasa, cuyo crecimiento está influido por la temperatura. La can-
- 77. Implicaciones de la reducción de los niveles de uso de nitratos y nitritos en la seguridad,... 77 tidad de nitrito residual es muy baja (normalmente 10 mg/kg) tanto si se ha añadido como nitrito sódico como si se ha reducido a partir de nitrato. Sin embargo, en jamones con pHSM6,0 pueden encontrarse ocasionalmente valores superiores a 50 mg/kg. La absorción de sales nitrificantes se efectúa principalmente por la parte magra, pero debe asegurarse que se produce también absorción a través de los huesos externos, corteza y grasa subcutánea. El óxido nítrico que se genera por acción de substancias reductoras de la carne puede atravesar la corteza y la grasa, y contribuye a la nitrificación del jamón y de otros situa- dos en la misma pila (Arnau y col., 2003). En las mezclas de sales que contienen nitrito sódico, si éste está húmedo, tiende a depo- sitarse en el fondo del recipiente, por lo que conviene mezclarlo de nuevo antes de usarlo. Por otra parte, el nitrito es inestable en presencia de agentes reductores y materiales orgánicos; por tanto, no debe premezclarse con substancias reductoras o especias. Los resultados obtenidos en el subproyecto NITRARED indican que de la cantidad de ni- trito añadido inicialmente, se detecta un 64-66% al inicio del proceso de curación del salchi- chón (día 0), disminuyendo su detección durante la curación, alcanzando al final de la misma (día 27) un 12-17%, en función de las diferentes formulaciones estudiadas. Estos datos con- cuerdan con los de Cassens (1990) que indicó que del total del nitrito añadido a los productos cárnicos sólo un 5-20% permanecería como nitrito residual. La evolución de la determinación de los niveles de nitrato durante la curación del salchichón fue distinta a la del nitrito ya que aumentó, pasando del 101% (día 0) al 114-120% al final del período de curación en función de los diferentes niveles de sales nitrificantes añadidos (Carballo y Andrade, 2013). Estos re- sultados también coinciden con los aportados por Cassens (1995) que observó que un 1-10% del nitrito añadido al producto se transformaría en nitrato. 6. Conclusiones La reducción de la cantidad de nitratos y nitritos añadidos del 25% y 50% respecto al máxi- mo permitido en embutidos crudos-curados no afecta de forma importante al flavor y a la tex- tura, pero puede facilitar el crecimiento de microorganismos alterantes y patógenos, lo cual plantea la necesidad de establecer modificaciones tecnológicas para garantizar su seguridad. El contenido de nitrosaminas detectadas ha sido muy bajo en todos los tratamientos. El pigmento Zn-protoporfirina se detectó en jamones sin nitrificantes y, en menor medida, en jamones nitri- ficados de pH bajo. Desde el punto de vista nutricional, la única consecuencia relevante obser- vada de la adición de nitrificantes en embutidos crudos-curados y jamón curado fue la disminu- ción del contenido de vitamina B6. Equipos participantes Los resultados que se recogen en este capítulo derivan de las investigaciones realizadas en las distintas acciones desarrolladas por los equipos que han participado en las distintas acciones del subproyecto NITRARED y que han sido coordinadas por Jacint Arnau (IRTA), José Antonio García-Regueiro (IRTA), José Carballo (ICTAN-CSIC), Pedro Roncalés (UNIZAR), Jorge Ruiz (UEX), Eva Hierro (UCM), Carmen García (UEX), Manuela Fernández (UCM), Marta Gisbert (AI- NIA) y Neus Sanjuán (UPV). Agradecimientos La investigación que recoge este capítulo ha sido realizada en el marco del Proyecto Conso- lider-Ingenio 2010 CARNISENUSA CSD2007-00016.
- 78. J. Arnau, M. D. Guàrdia, M. Gratacós, M. Fernández, E. Hierro, 78 P. Roncalés, J. Carballo, B. Villegas, J. Ruiz, N. Sanjuan 7. Referencias Antón A., Lisazo J. 2003. Nitritos, nitratos y nitrosaminas. Fundación Ibérica para la Seguridad Alimentaria, (www.fundisa.org). Arnau, J. 2007. Factores que afectan a la salazón del jamón curado. Eurocarne 160, 59-76. Arnau, J., Guerrero, L., Gou, P. 2003. Effect of meat pH and the amount of added nitrite and nitrate on colour uniformity of dry-cured hams. Fleischwirtschaft International 1, 31-32. Arnau, J., Guerrero, L., Casademont, G., Gou, P. 1995. Physical and chemical changes in different zones of normal and PSE dry-cured ham during processing. Food Chemistry 52, 63-69. Calvarro, J., Ruiz, J. 2011. Cuantificación de nitrosaminas en productos cárnicos con diferentes niveles de sales nitrificantes. En: Ordoñez, J.A., Córdoba, J.J. y Ventanas, J. (Eds.). Productos cárnicos para el siglo XXI. Seguros, nutritivos y saludables. Universidad de Extremadura. Cáceres, pp. 318. Carballo, J., Andrade, S. 2011. Evolución de los nitritos, nitratos y nitroso hemo pigmentos en jamón cura- do con diferentes niveles de sales nitrificantes. En: Ordoñez, J.A., Córdoba, J.J. y Ventanas, J. (Eds.). Productos cárnicos para el siglo XXI. Seguros, nutritivos y saludables. Universidad de Extremadura. Cáceres, pp. 135-138. Carballo, J., Andrade, S. 2013. Evolución de los nitratos y nitritos durante la curación de salchichones con diferentes niveles de sales nitrificantes. Nutrición Clínica y Dietética Hospitalaria 33, 114-115. Cassens R.G. 1995. Use of sodium nitrite in cured meats today. Food Technology 49, 72-81. Cassens, R. G. 1990. Nitrite-Cured Meat. A Food Safety Issue in Perspective. Food Nutrition Press, Inc. Trumbull, Connecticut, pp. 3-36. Fernández, M., Hospital, X.F., Hierro, E. 2011. Influencia de la concentración de nitratos y nitritos en la microbiota de los productos cárnicos crudo curados. En: Ordoñez, J.A., Córdoba, J.J. y Ventanas, J. (Eds.). Productos cárnicos para el siglo XXI. Seguros, nutritivos y saludables. Universidad de Extrema- dura. Cáceres, pp. 159-166. Gómez Salazar, J.A. 2013. Modelización de las cinéticas de difusión de nitrato de sodio y nitrito de sodio durante el salado de carne. Tesis Doctoral. Universitat Politècnica de València. Gratacós, M., Castellari. M., Sárraga, C. 2010. Implicaciones de la reducción de nitratos y nitritos en la concentración de vitaminas del grupo B y la estabilidad oxidativa del fuet, salchichón y chorizo. Eu- rocarne 186, 102-106. Hierro, E., Hospital, F.X., Fernández, M., Villegas, B., Lorente, M., Sánchez, M.J., García, C., Calvario, J., Sánchez del Pulgar, J., Gratacós-Curvasí, M. 2011. Calidad sensorial de productos cárnicos madurados elaborados con distintas concentraciones de nitrificantes. En: Ordoñez, J.A., Córdoba, J.J. y Ventanas, J. (Eds.). Productos cárnicos para el siglo XXI. Seguros, nutritivos y saludables. Universidad de Extre- madura. Cáceres, pp. 145-158. Hospital, X.F., Hierro, E., Fernández, M. 2011. Efecto de la presencia/ausencia de nitrato y del pH inicial del pernil en la microbiota del jamón curado. Proceedings del VI Congreso Nacional de Ciencia y Tecnología de los Alimentos. 8-10 junio, Valencia, España. Hospital, X.F., Hierro, E., Fernández, M. 2012. Survival of Listeria innocua in dry fermented sausages and changes in the typical microbiota and volatile profile as affected by the concentration of nitrate and nitrite. International Journal of Food Microbiology 153, 395-401. Leistner, L. 1992. The essentials of producing stable and safe raw fermented sausages. En: Smulders, F.J.M., Toldrá, F., Flores; J., Prieto, M. (Eds). New technologies for meat and meat products. Ecceamst, Audet, Nijmegen, Holanda, pp. 1-19. Lorente, M., Villegas, B., Sánchez, M.J. 2011a. Efecto de la reducción de la concentración de nitratos y nitritos en la calidad sensorial de productos cárnicos crudo-curados. Eurocarne 194, 74-79. Lorente, M., Villegas, B., Sánchez, M.J. 2011b. Análisis sensorial de embutidos crudo-curados con distin- tos niveles de nitratos y nitritos. En: Ordóñez, J.A., Córdoba, J.J. y Ventanas, J. (Eds.). Productos cárnicos para el siglo XXI. Seguros, nutritivos y saludables. Universidad de Extremadura. Cáceres, pp. 323. Lorés A., Pérez-Beriain T., Roncalés P. 2011. La formación de color y su estabilidad en los productos cru- dos-curados. En: Ordóñez, J.A., Córdoba, J.J. y Ventanas, J. (Eds.). Productos cárnicos para el siglo XXI. Seguros, nutritivos y saludables. Universidad de Extremadura. Cáceres, pp. 127-133. Lundberg, J.O., Carlström, M., Larsen, F.J., Weizberg, E. 2011. Roles of dietary inorganic nitrate in cardio- vascular health and disease. Cardiovascular Research 89, 525-552. Ordóñez, J.A., Hierro, E.M., Bruna, J.M., De la Hoz, L. 1999. Changes in the components of dry-fermented sausages during ripening. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 39, 329-367.
- 79. Implicaciones de la reducción de los niveles de uso de nitratos y nitritos en la seguridad,... 79 Reglamento (CE) nº 1333/2008 del Parlamento Europeo y del Consejo de 16 de diciembre de 2008 sobre aditivos alimentarios. DO L354, 31.12.2008. Roncalés P., Pérez-Beriain T., Lorés A. 2011. Formación y conservación del color y flavor en jamones con adición reducida o sin nitrificantes. VI Congreso Mundial del Jamón. Lugo, (España), 21-23 Septiembre. Ruiz-Capillas, C., Jiménez-Colmenero, F. 2008a. Review: Determination of preservatives in meat products by flow injection analysis (FIA). Food Additives and Contaminants, Part A, 25, 1167-1178. Ruiz-Capillas, C., Jiménez-Colmenero, F. 2008b. Aplicación del análisis de inyección de flujo (FIA) a la determinación de nitratos y nitritos en productos cárnicos. Eurocarne 171, 51-58. Ruiz J., Calbarro, J. 2011. Estudio de nitrosaminas en productos cárnicos mediante microextracción en fase sólida (SPME). En: Ordoñez, J.A., Córdoba, J.J. y Ventanas, J. (Eds.). Productos cárnicos para el siglo XXI. Seguros, nutritivos y saludables. Universidad de Extremadura. Cáceres, pp. 139-144. Sindelar, J.J., Milkowski, A. L. 2011. Sodium nitrite in processed meat and poultry. Meats: a review of curing and examining the risk/benefit of its use. AMSA White Papers, Series, Number 3. American Meat Science Association. http://www.meatscience.org/SodiumNitriteReview.aspx Wakamatsu, J., Okui, J., Ikeda, I., Nishimura, T., Hattori, A. 2004. Establishment of a model experiment system to elucidate the mechanism by which “Zn-protoporphyrin IX” is formed in nitrite free dry-cu- red ham. Meat Science 68, 313-317. Wirth, F. 1984. Pökeln, Farbbildung, Farbhaltung. Technologie der Brühwurst. Institut für Technologie der Bundesanstalt für Fleischforschung. pp. 123-143.
- 81. CAPITULO VI Uso de tecnologías emergentes para garantizar la seguridad alimentaria de la carne y sus derivados Mª Isabel Cambero y Gonzalo D. García de Fernando Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos. Facultad de Veterinaria (UCM). Madrid Margarita Medina Departamento de Tecnología de Alimentos, Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA). Madrid 1. Introducción En los últimos lustros, los hábitos alimentarios han cambiado en las sociedades desarro- lladas y en especial en las grandes ciudades, donde las distancias y la ajetreada forma de vida dificultan, o incluso impiden, perpetuar los hábitos gastronómicos tradicionales. De esta for- ma, un creciente porcentaje de la ingesta de alimentos, tanto en el hogar como fuera de él, se lleva a cabo bajo el síndrome de la “rapidez”, y habitualmente se habla de comida de consumo rápido o cocina rápida. Dentro de esta dinámica se incluyen alimentos listos para el consumo, listos para calentar o listos para cocinar, cuyas denominaciones derivan de su terminología anglosajona ready-to-eat (RTE), ready-to-heat (RTH) o ready-to-cook (RTC), respectivamente. Estas circunstancias han conducido a que alimentos ya procesados (como jamón cocido, jamón curado, embutidos, mortadela, fiambres de ave, quesos frescos y curados) o frescos (carpaccio, frutas y hortalizas, etc.) se transformen en productos RTE, lo que habitualmente implica una reducción de tamaño para la preparación de lonchas, filetes, cortes, rodajas, etc. que se envasan en porciones individuales o familiares. Estos alimentos, al igual que los RTH y RTC, facilitan el consumo, ofrecen una calidad sensorial estable, ahorran tiempo y agilizan el trabajo en el hogar. Sin embargo, su preparación conlleva diversos problemas derivados de la manipulación del alimento, siendo el más preocupante la potencial contaminación con mi- croorganismos patógenos durante las últimas operaciones (fundamentalmente reducción de tamaño, dosificación y envasado) que hay que realizar para transformar el producto elaborado en la ración envasada que se suministra al consumidor. Los alimentos RTE adquieren especial importancia desde el punto de vista de salud pública porque normalmente se consumen di- rectamente sin ningún calentamiento o cocinado adicional. Sin restar importancia a otros mi- croorganismos patógenos que puedan alcanzar el producto durante su preparación, los más peligrosos son, sin duda, varios serovares de Salmonella spp. y de Escherichia coli (incluido el O157:H7), Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus, este últi- mo en situaciones de abuso (aumento incontrolado) de la temperatura de almacenamiento y distribución que, desgraciadamente, no es infrecuente. Entre estos, L. monocytogenes alcanza especial relevancia por ser una bacteria psicrotrofa, que puede multiplicarse, si las condicio- nes son favorables, durante el almacenamiento del alimento RTE en refrigeración pudiendo alcanzar niveles peligrosos. Es obvio que la contaminación por patógenos es, afortunadamente, un fenómeno casual. Sin embargo, no es posible confiar en el azar a la espera de que los patógenos no alcancen el pro- ducto incluso aplicando las más estrictas normas higiénicas y realizando las operaciones de
- 82. 82 Mª Isabel Cambero, Gonzalo D. García de Fernando, Margarita Medina transformación en productos RTE en “salas blancas”. Por otra parte, las bacterias patógenas no sólo son importantes porque ocasionalmente pueden alcanzar el producto con el consiguiente aumento del riesgo microbiano, sino que pueden pasar a otros alimentos a través de contamina- ciones cruzadas en las instalaciones industriales y establecimientos de preparación y venta, lo que en alimentos de comida rápida alcanza especial importancia porque muchos de ellos se preparan con diversos ingredientes (incluidos diversos RTE, RTH o RTC) sin o con escaso trata- miento térmico. Las circunstancias anteriormente expuestas permiten deducir la necesidad de poner a punto un medio de reducir el número de patógenos de estos alimentos para garantizar su seguridad. Esto implica la consecución del objetivo de seguridad alimentaria (FSO) que puede definirse como “la máxima frecuencia o concentración de un peligro microbiano en un alimento en el momento de su consumo”. El criterio microbiológico universal para Salmonella spp. y E. coli O157:H7 (y otros serova- res afines) es ausencia en 25 g. Para L. monocytogenes, el criterio varía en la Unión Europea (UE) dependiendo de la población receptora y del tipo de alimento de acuerdo a lo establecido en el Reglamento de la Comisión 1441/2007. En la Tabla 1 se muestra un resumen de los criterios a seguir cuando el alimento RTE va destinado a consumidores normales, es decir, exento de cual- quier causa sensibilizadora. Tabla 1. Criterios de seguridad alimentaria para L. monocytogenes (Lm) de acuerdo con el Reglamento de la Comisión de las Comunidades Europeas 1441/2007 Producto Condición Límite 1. Con las características a) pH≤ 4,4 o aw ≤ 0,92 100 ufc/g b) pH≤ 5,0 y aw ≤ 0,94 100 ufc/g c) Vida útil 5 días 100 ufc/g 2. Puede crecer Lm a) Si se puede demostrar que no superará el valor 100 ufc/g durante su vida útil 100 ufc/g b) Si no se puede demostrar que no superará el valor 100 ufc/g durante su vida útil Ausencia/25 g 3. NO puede crecer Lm 100 ufc/g A los alimentos que presenten valores más elevados que los expresados en la Tabla 1 (apartado 1) se les aplica el criterio de “tolerancia cero” (ausencia en 25 g) si no hay un trata- miento listericida incluido en el proceso. En las reglamentaciones de otros países (por ejemplo, Japón y USDA en EEUU), el criterio microbiológico sobre L. monocytogenes es siempre de “to- lerancia cero”. En la UE, el cumplimiento del Reglamento (CE) de la Comisión 1441/2007, así como la normativa antes mencionada, implica que algunos alimentos deberían higienizarse antes de ser librados al mercado. Las tecnologías convencionales, de forma particular los trata- mientos térmicos, no pueden aplicarse a muchos productos; tal es el caso de la mayoría de los productos cárnicos RTE y de las carnes frescas, porque, además de estar ya envasados, se mo- dificarían notablemente sus características sensoriales. Es necesario, pues, recurrir a métodos de higienización no térmicos. Con este fin, las acciones del subproyecto PROCARTE han evaluado la viabilidad de tratamientos físicos (electrones acelerados, altas presiones hidrostáticas y pul- sos de luz blanca de alta intensidad) y biológicos (agentes antimicrobianos, como bacteriocinas, lactoferrina y sus derivados y sistema lactoperoxidasa). Las dos primeras tecnologías pueden aplicarse en el producto envasado. En el caso de los pulsos de luz, es preciso primero estudiar la permeabilidad del material polimérico del envase a la energía aplicada. En conjunto, se han llevado a cabo, en distintos productos cárnicos, investigaciones conducentes a la optimización de los tratamientos con las mencionadas tecnologías para la consecución de los FSO para los
- 83. Uso de tecnologías emergentes para garantizar la seguridad alimentaria de la carne y sus derivados 83 principales agentes patógenos. También en este contexto, se han utilizado distintas técnicas y modelos estadísticos y se ha analizado cómo influye la variabilidad del comportamiento micro- biano en los tratamientos microbicidas a aplicar en un alimento para alcanzar un FSO determi- nado. En una de las acciones se ha evaluado, además, el efecto de las mencionadas tecnologías no térmicas en virus entéricos de transmisión alimentaria. Cabe añadir que el grupo de la Uni- versidad Politécnica de Valencia ha desarrollado y patentado un nuevo sistema de conservación no térmica basado en el tratamiento combinado de ultrasonidos y dióxido de carbono super- críticos, inicialmente orientado al tratamiento de alimentos líquidos (Benedito y col., 2011; Ortuño y col., 2012a). 2. Potencial de la aplicación de electrones acelerados (EA) para garantizar la seguridad microbiológica de productos cárnicos El tratamiento con EA (rayos beta o ionización electrónica) se considera una de las tecno- logías no térmicas más adecuadas para higienizar alimentos RTE, por su facilidad de aplicación, la posibilidad de hacerlo de forma continua en alimentos ya envasados y su capacidad para tratar un número muy elevado de producto en tiempos cortos. Además es una tecnología bara- ta (aproximadamente 0,10 euros/envase de 250 g), no requiere operaciones preparativas ni de postproceso y ofrece resultados repetitivos. Es una de las modalidades de los tratamientos con radiaciones ionizantes bien conocida desde la década de 1980 y su aplicación está permitida y regulada para diversos alimentos. Para el tratamiento de alimentos pueden utilizarse EA con una energía nominal (energía cuántica máxima) ≤ 10 Mev (Real Decreto 348/2001). De acuerdo con las recomendaciones de las organizaciones internacionales (FAO, OMS, OIEA), a las que la AESAN se adhirió hace unos años, la dosis máxima autorizada es de 10 kGy. El poder bactericida de los EA se basa en el daño producido a moléculas vitales, normalmente los ácidos nucleicos, de los microorganismos (efec- to directo) que mueren cuando no pueden reparar la lesión. A esto se une el efecto de los radi- cales libres generados en la radiolisis (efecto indirecto), sobre todo a partir de moléculas de agua. El poder de penetración (5-8 cm en productos cárnicos) de los EA es menor que el de la radiación gamma y rayos X, pero suficiente para franquear el material de los envases comercia- les de productos cárnicos RTE (Cambero y col., 2008). 2.1. Optimización del tratamiento En las investigaciones llevadas a cabo en el subproyecto PROCARTE se ha analizado la ap- titud de los EA para conseguir el FSO en distintos productos cárnicos comerciales. Con este objetivo y para determinar las dosis requeridas se han tenido en cuenta los siguientes aspectos: a) Nivel de contaminación inicial. En el caso de los productos RTE, si se observan las más es- trictas condiciones higiénicas, se ha estimado, de acuerdo con la opinión de ICMSF en las operaciones postproceso de salchichas tipo frankfurt (ICMSF, 2004), que el número de célu- las que puede alcanzar al producto es, en el peor de los casos, de 10 células/g o cm2 . b) Los criterios microbiológicos para los distintos patógenos, de acuerdo a lo establecido por la UE (Tabla 1) y otros países. c) Posible crecimiento de los microorganismos durante el almacenamiento del producto. La bacteria de mayor relevancia es L. monocytogenes por su carácter psicrotrofo. Sin embargo, esta bacteria no puede multiplicarse si la aw del producto es inferior a 0,92. Las otras bacte- rias patógenas que preocupan no pueden multiplicarse a temperaturas de refrigeración y, por tanto, basta con reducir su carga en el alimento por debajo de su dosis infectiva o con- siderando los niveles estipulados en las regulaciones microbiológicas. Teniendo en cuenta los datos de la FDA, se han considerado incrementos medios de L. monocytogenes en pro- ductos cárnicos con aw superior a 0,92 de alrededor de 0,135 unidades logarítmicas (unida- des logarítmicas)/día a 5 ºC (Cabeza y col., 2011).
- 84. 84 Mª Isabel Cambero, Gonzalo D. García de Fernando, Margarita Medina Uno de los factores limitantes de la aplicación de un determinado tratamiento es su reper- cusión en las características sensoriales del alimento. Las radiaciones ionizantes pueden originar cambios en el olor, color y sabor del producto con un impacto significativo en su aceptación por el consumidor (Ordóñez y col., 2007; Cambero y col., 2012). Por ello, para la optimización del tratamiento, se consideró que la máxima dosis que podría aplicarse sería aquella que garantiza- se un producto final con características sensoriales similares a las de un producto sin irradiar. Con este objetivo se llevaron a cabo distintos tipos de análisis sensoriales (de diferenciación, preferencia y descriptivos) en los que se ha evaluado, de forma aislada y en conjunto, el olor, sabor y sensación en boca. Para determinar el efecto de los EA en el color se estudiaron los parámetros CIELAB [L* (luminosidad o brillo), a* (tendencia al rojo) y b* (tendencia al amarillo)]. El efecto en la textura se valoró mediante análisis de perfil de textura (TPA) y ensayos de trac- ción en los que se determinaron diversos parámetros (dureza, cohesividad, adhesividad, elasti- cidad y resistencia a la rotura). La aplicación de EA, aparte de inactivar hasta niveles seguros las bacterias patógenas, redu- ce también el número de bacterias alterantes, que se traduce en un aumento de la vida útil. En los estudios realizados, la vida útil se limitó al momento en que el recuento de microorganismos en un medio nutritivo alcanzó el valor de 5 x 107 ufc/g o cm2 . 2.1.1. Tratamiento con EA de distintos productos cárnicos RTE Los productos cárnicos suelen presentar un pH por encima de 5, pero su aw puede ser su- perior o inferior a 0,92. Por tanto, la higienización de productos cárnicos RTE por cualquier tecnología tendría que cumplir los valores de las regulaciones que se recogen en los apartados 2a y 3 de la Tabla 1. Entre los productos cárnicos con una aw superior a 0,92 se incluyen jamón cocido, mortadela, fiambres de ave y otros alimentos nitrificados (pH 5,5) y una serie de pro- ductos frescos de consumo en crudo (p.e. carpaccio y tartar). Entre los que presentan una aw menor de 0,92, los de mayor interés son el jamón, lomo curado y cecina (pH 5) y embutidos madurados (pH 4,5 – 5). Se ha estudiado la aplicación de EA en un amplio abanico de productos cárnicos RTE (fer- mentados, cocidos, curados y crudos). La tabla 2 muestra resumidamente el criterio del proceso (dosis que es necesario aplicar para conseguir el FSO) para diversos productos. Puede observarse que todas las dosis establecidas para la higienización (optimización del proceso) están muy por debajo (en un 70–90%) de la dosis permitida (10 kGy) por diversas organizaciones nacionales e internacionales. Dosis de 1,5-1,8 kGy logran productos cárnicos que cumplen el criterio microbio- lógico del Reglamento 1441/2007 para la UE. Sin embargo, en países con el criterio de “tolerancia cero” para L. monocytogenes, es necesario aumentar la dosis del tratamiento hasta, en el peor de los casos, 2,8 kGy. En general, con dosis ≤ 2 kGy, puede afirmarse que apenas se ve afectado el flavor, sin que se diferencien significativamente los productos tratados de los controles. En cambio, con dosis próximas a 3 kGy, se han apreciado modificaciones ligeras en el sabor y olor del alimen- to recién tratado que, normalmente, se disipa durante su almacenamiento. En productos RTE a base de carne fresca con elevado contenido en mioglobina, como el carpaccio de vacuno, el tratamiento, aún siendo a bajas dosis, ocasiona una oxidación de la mioglobina a metamioglobina, adquiriendo un color pardo que sería cuestionable para el consumidor. Sin embargo, cuando el pigmento se ha fijado al formarse nitrosohemocromo, como en el caso del jamón cocido, o nitro- somioglobina, como en el curado, no se producen cambios notorios en el color. En relación con la vida útil, los productos RTE con aw 0,92 almacenados a temperaturas de refrigeración pueden considerarse microbiológicamente estables, por lo que no cabe valorar el efecto de los EA. Sin embargo, las dosis requeridas para alcanzar el FSO de acuerdo con los criterios microbiológicos de la UE y EEUU, permitieron duplicar la vida útil de la mayoría de los productos cárnicos con aw ≥ 0,92 (Tabla 2). Cabe destacar que la ubicuidad de los microorganismos patógenos, sobre todo Salmonella spp. y L. monocytogenes, y la posibilidad de que esta última pueda multiplicarse en alimentos
- 85. Uso de tecnologías emergentes para garantizar la seguridad alimentaria de la carne y sus derivados 85 refrigerados con aw ≥ 0,92, unido a los criterios microbiológicos de “tolerancia cero”, está ocasio- nando un gran perjuicio a las exportaciones de productos cárnicos, lo que supone un problema tanto desde el punto de vista sanitario como comercial. Los datos mostrados anteriormente de- muestran que mediante la aplicación de EA a dosis bajas puede conseguirse la inocuidad de los productos cárnicos y superar las dificultades de exportación existentes. 2.1.2. Avances en la aplicación de EA en carne y productos cárnicos frescos Una proporción considerable de las toxiinfecciones alimentarias se ha asociado al consumo de carne y productos cárnicos. La mayoría de los brotes en los que la carne ha estado implicada se han debido a un infracalentamiento o recontaminación post-cocinado. Por otra parte, por su composición, pH (5,8-5,5) y aw (en torno a 0,99), la carne tiene una vida útil muy corta (5-7 días en refrigeración). Su deterioro se debe fundamentalmente al crecimiento de la microbiota aeró- bica Gram-negativa productora de limo, principalmente representada por Pseudomonas spp. (Ordóñez y col., 2007). A lo largo del desarrollo del subproyecto PROCARTE se ha estudiado la viabilidad del trata- miento con EA para higienizar y aumentar la vida útil de carnes (de pollo, porcino y vacuno) envasadas en porciones domésticas así como de piezas enteras (lomo de cerdo fresco y adobado y solomillo de vacuno), para su comercialización en el mercado nacional y para la exportación. A) Aplicación en carne de pollo En la carne de ave, las bacterias patógenas de mayor trascendencia son Salmonella spp y C. jejuni. Ambas son termolábiles; así, la mayoría de los brotes en los que la carne de ave ha esta- do implicada se han debido a un infracalentamiento o recontaminación post-cocinado (Ordóñez y col., 2007). No obstante, el mayor riesgo radica en que la carne portadora se convierta en fuente de estas bacterias para otros alimentos mediante contaminaciones cruzadas. De aquí la necesidad de controlar (destruir/inhibir) esta bacteria en ese material. Para estudiar el potencial del tratamiento con EA se eligió como modelo filetes y carne pi- cada de pechuga de pollo envasados. Como se ha mencionado, el criterio universal para Salmo- nella spp. en prácticamente todos los alimentos es de ausencia en 25 g de producto. Puede considerarse, pues, equivalente a un FSO de 4 ufc/100g (log10 0,04 = -1,39). En las experiencias realizadas, S. Typhimurium mostró un valor de reducción decimal de 0,46 y 0,52 kGy en filetes y carne picada, respectivamente; algo mayores que los que presentó S. Enteritidis (0,37 y 0,38 kGy) (Ordóñez y col., 2007). Asumiendo una carga inicial de 1,42 (log 1,42 = 0,152) células/g, considerando que en un gramo de carne picada se mantiene esa misma concentración de salmonelas (Ordóñez y col., 2007) y teniendo en cuenta la situación más desfavorable, es decir, el valor D de S. Typhimurium (0,52 kGy), puede calcularse el criterio del proceso en 0,8 kGy que se podría aumentar hasta 1 kGy para proporcionar un aceptable margen de seguridad. Si se sospechara que se pudiese ori- ginar un “abuso de temperatura” el tratamiento para conseguir el FSO sería de 1,4 kGy. A estas dosis no hubo cambios significativos en las características sensoriales (tanto en carne picada como en filetes). A dosis ≥ 2 kGy se produjo un ligero aumento de la tonalidad rojiza, que favo- reció la aceptación del producto. Esta modificación del color se ha atribuido a la formación del complejo monóxido de carbono-mioglobina inducido por la generación de cantidades traza de monóxido de carbono y las condiciones reductoras durante el tratamiento con EA (Ordóñez y col., 2007). La carne tratada a 3 kGy presentó además mayor brillo y una liberación de exudados más alta. Respecto al olor, se detectaron olores anómalos, con intensidad creciente con el aumen- to de la dosis aplicada. Los olores generados se calificaron como “a corral” o “a ave” a dosis cer- canas a 2 kGy y a “pluma quemada” en torno a 4 kGy. Sólo a dosis 3 kGy la intensidad de estos olores redujo la aceptación del producto y tras el cocinado, la carne se calificó con sabor a “que- mado”, astringente, regusto metálico y ligeramente picante, textura más seca, compacta y apelma- zada (Ordoñez y col., 2007), lo que, en cierto modo, limita el uso de ese nivel de ionización.
- 86. 86 Mª Isabel Cambero, Gonzalo D. García de Fernando, Margarita Medina Tabla 2. Resultados de la aplicación de electrones acelerados (EA) en productos cárnicos RTE Producto aw Microorganismo D (kGy) Criterio del proceso Vida útil Ref. Jamón cocido 0,92 L. monocytogenes ScottA 0,36 0,78 (UE); 2,00 (EEUU) Aprox. duplicación (microbiología) 1,2,3 L. monocytogenes Otras cepas 0,48 1,00 (UE); 2,67 (EEUU) L. innocua 0,49 1,07 (UE); 2,73 (EEUU) S. aureus 0,47 No crece 5 ºC (no tto*) E. coli O157:H7 0,35 0,84 Jamón cocido MAP** (100% N2) 0,92 L. monocytogenes ScottA 0,45 0,98 (UE); 2,50 (EEUU) Aprox. duplicación (microbiología) 4 L. innocua 0,69 Jamón curado 0,89 L. monocytogenes ScottA 0,42 no tto (UE); 1,00 (EEUU) Microbiológi- camente estable 5,6 L. innocua 0,47 no tto (UE); 1,12 (EEUU) S. Typhimurium 0,53 1,27 E. coli O157:H7 0,26 0,62 Salchichón 0,88 L. innocua 0,47 no tto (UE); 1,12 (EEUU) Microbiológi- camente estable 7 S. Enteritidis 0,41 0,98 S. Typhimurium 0,53 1,27 Chorizo 0,82 L. innocua 0,53 no tto (UE); 1,27 (EEUU) Microbiológi- camente estable 7 S. Enteritidis 0,43 1,03 S. Typhimurium 0,54 1,29 Cecina 0,90 L. monocytogenes ScottA 0,49 no tto (UE); 1,17 (EEUU) Microbiológi- camente estable 5 L. innocua 0,57 no tto (UE); 1,36 (EEUU) S. Typhimurium 0,52 1,24 E. coli O157:H7 0,25 0,60 Atún ahumado 0,89 L. monocytogenes 0,43 0,50 (UE); 2,00 (EEUU) Microbiológi- camente estable 5L. innocua 1,67 0,86 (UE); 3,13 (EEUU) S. Typhimurium 1,67 * No tto: No requiere tratamiento. ** MAP: Envasado en atmósferas modificadas. Ref. 1: Benedito y col. (2011); 2, 3, 4: Cabeza y col. (2007, 2010, 2011); 5: Cambero y col. (2012); 6: Hoz y col. (2008); 7: Cabeza y col. (2009).
- 87. Uso de tecnologías emergentes para garantizar la seguridad alimentaria de la carne y sus derivados 87 Aunque la carne fresca de ave es la fuente más importante de C. jejuni, esta bacteria no se consideró como microorganismo diana debido a que su peligrosidad es mucho menor que la de Salmonella spp. ya que se trata de una bacteria muy radiolábil, ya que se han descrito valores D en torno a 0,16-0,19 kGy, al menos, dos veces menor a los considerados para S. Enteritidis y S. Typhimurium (Ordóñez y col., 2007). Por tanto, la optimización para Salmonella spp. asegu- raría la destrucción de C. jejuni hasta niveles estadísticamente despreciables. Las dosis requeridas para la consecución de los FSO permitieron además una razonable ampliación de la vida útil, una duplicación en el caso de los filetes (de 4 días a 8) y un 50% más en el caso de la carne picada (de 4 a 6 días). Incluso se podría aplicar dosis de hasta 1,5 kGy para cubrir un ocasional abuso de temperatura (incremento hasta unos 8 ºC) durante el almace- namiento y distribución de la carne, sin menoscabo de su calidad. B) Aplicación en carne de cerdo El lomo (longissimus dorsi) es una de las piezas de la canal de porcino de mayor calidad y valor comercial. En este estudio, el microorganismo considerado para el establecimiento del criterio de proceso fue L. monocytogenes. La presencia de Y. enterocolitica tiene menor interés debido a que su radioresistencia es mucho menor que la de L. monocytogenes [por ejemplo, 0,1 a 0,2 kGy del primer microorganismo frente a 0,35 a 0,5 kGy del segundo (Cabeza y col., 2007 y 2009)]. S. Enteritidis es otro microorganismo a controlar. Sin embargo, dado que esta bacteria no puede crecer a temperaturas de refrigeración, y que sus tiempos de generación son mayores que los de L. monocytogenes, [por ejemplo, 14 h frente a 7 h en jamón cocido a 10 ºC (Cabeza y col., 2010)] supone un riesgo menor que el correspondiente a la listeria. Por lo tanto, el tra- tamiento establecido para eliminar L. monocytogenes permitiría el control de Yersinia y Salmo- nella. En resumen, puede decirse que el tratamiento con dosis de 1 y 2 kGy del producto envasado en películas plásticas de baja permeabilidad a los gases, duplica y cuadriplica res- pectivamente la vida útil del producto refrigerado (4 ºC), pasando de los habituales 5 días a 11 y 20 días, respectivamente (García-Márquez y col., 2012a). Desde el punto de vista de la se- guridad alimentaria, el tratamiento con EA a dosis inferiores a 2 kGy permite el suministro de carne libre de L. monocytogenes durante 2 semanas. Este tratamiento no produjo modificaciones significativas de las características sensoriales de la carne. Cuando el tratamiento aplicado sobre- pasó los 2 kGy se observó un incremento de la liberación de exudados asociado a una pérdida de la capacidad de retención de agua (CRA), lo que condujo a un producto menos jugoso tras el cocinado de la carne. Asimismo, se describieron ligeros matices aromáticos a “quemado” y a “medio de cultivo calentado”. Respecto al color, el tratamiento de irradiación redujo la tonalidad roja e incrementó el brillo de la carne, sin duda debido a la mayor liberación de exudados. Sin embargo, estos cambios fueron sutiles no afectando a la aceptación general del producto (Gar- cía-Márquez y col., 2012a). Resultados análogos se obtuvieron cuando se trató lomo adobado con EA (García-Márquez y col., 2012b), aunque el efecto en las características sensoriales fue menor. Cuando ambos pro- ductos (fresco y adobado) se envasaron a vacío o en atmósferas modificadas (MAP), y se trataron con 1 y 2 kGy, se consiguió igualmente duplicar y triplicar la vida útil respecto al control y ase- gurar un producto libre de L. monocytogenes durante al menos 15 días (Cabeza y col., 2011). Estos tipos de envasado modificaron el efecto de los EA en el color de la carne fresca de forma que el producto tratado presentó un color rojo más intenso, probablemente asociado a la forma- ción de carboximioglobina. Cabe añadir que el tratamiento con EA, tanto de lomo fresco como adobado, en ningún caso afectó a la textura del producto. Se ha sugerido que los tratamientos de irradiación pueden acelerar las reacciones de oxi- dación debido a la formación de radicales libres, lo que podría conducir a la formación de compuestos nocivos, como los derivados de la oxidación del colesterol (COPs). Ante esta con- jetura, se estudió el contenido de COPs en lomo fresco y adobado (García-Márquez y col., 2010), tratado con distintas dosis. Los resultados obtenidos permitieron concluir que los pro- ductos no tratados presentan los mismos CPOs que los tratados con dosis de 1 y 2 kGy, aunque
- 88. 88 Mª Isabel Cambero, Gonzalo D. García de Fernando, Margarita Medina en estos últimos el contenido total de COPs fue ligeramente superior. Por otra parte, no se observaron cambios en la fracción de fosfolípidos de la grasa intramuscular atribuibles al trata- miento con EA (García-Márquez y col., 2013). En conjunto, los resultados obtenidos sugieren que la ionización electrónica a dosis ≤ 2kGy permite incrementar la seguridad y la vida útil de ambas formas de comercialización del lomo de cerdo sin efectos adversos. C) Aplicación en carne de vacuno El solomillo de vacuno es una pieza de elevado valor comercial tanto para el consumo directo como para la preparación de algunos RTE como el carpaccio. Al aplicar EA, para incrementar su seguridad microbiológica y vida útil, se obtuvieron resultados muy similares a los descritos en lomo fresco de cerdo. La vida útil en refrigeración (4 ºC) se incrementó desde los 8 días del producto no tratado y envasado en atmósfera de aire, hasta 18 y 28 días cuando se aplicaron 1 kGy y 2 kGy, respectivamente. En el caso de abuso de temperatura (8 ºC), los resultados fueron igualmente satisfactorios, manteniéndose la carne aceptable para el consumo durante 15 y 22 días con las dosis mencionadas, frente a los 4 días del mismo pro- ducto sin tratar. Este tratamiento además permitió la consecución del FSO para L. monocyto- genes de acuerdo al criterio de la UE (Tabla 1) y de EEUU durante 28 y 18 días, respectiva- mente, en refrigeración correcta (4 ºC) y durante 22 y 15 días si se produce un abuso en la temperatura de refrigeración. Sin embargo, dosis ≥ 2 kGy dieron lugar a la liberación de exudados y aparición de ligeros olores extraños aunque el cocinado enmascaró estos defec- tos. A dosis de 1 kGy no se observaron cambios en el color pero a partir de 2 kGy se produ- jo un oscurecimiento de la carne sin llegar a la aparición de la tonalidad pardo-marrón que refleja la oxidación de la mioglobina. La carne picada fue otro de los productos de vacuno estudiados, dado su gran interés industrial. Este material es un medio excelente para el crecimiento bacteriano tanto superfi- cial como en su interior y, en general, presenta una vida útil muy corta (no más de 2-4 días a 4 ºC). Al igual que la microbiota alterante, la posibilidad de encontrar patógenos en la car- ne picada es mayor que en las canales, piezas o filetes. E. coli O157:H7, L. monocytogenes y Salmonella spp. son algunos de los más frecuentes. Por ejemplo, en Estados Unidos, el 49% de los casos anuales de infecciones con E. coli O157:H7 y el 3% de las salmonelosis se atri- buyen al consumo de hamburguesas u otras preparaciones a base de carne picada tras un cocinado insuficiente. En el trabajo aquí esbozado se trató carne picada envasada sin exclu- sión de aire y en MAP con EA. En las primeras experiencias realizadas se observó que, inde- pendientemente del tipo de envasado, este tratamiento era muy eficaz para reducir la carga de microorganismos alterantes. Sin embargo, el color de la carne se vio intensamente afecta- do, perdiéndose la tonalidad rojiza con la concomitante aparición de zonas oscuras par- do-marrón y negruzcas, incluso con dosis de 1 kGy (Cambero y col., 2012). Estos cambios asociados a la rápida oxidación de la mioglobina confieren a la carne fresca un aspecto in- aceptable para el consumidor. Como estrategia para evitar, o reducir este efecto se recurrió a la adición de sulfitos, en una formulación similar a la establecida para la burger meat (83% carne picada y un 17% de una mezcla de agua, sulfito sódico, proteína de soja, ácido ascór- bico y cítrico) y/o a la incorporación de CO en un 1% en la mezcla de gases del envasado [CO2 (50%)/O2 (24%)/N2 (25%)/CO (1%)]. De esta forma, se consiguió la fijación del pigmen- to de la carne con la formación de un color rojizo estable debido, sin duda, a la carboximio- globina. Fue necesaria la combinación de ambas estrategias (sulfitos y CO) para el manteni- miento del color de la carne tras el tratamiento (Cambero y col., 2012). El incremento de la vida útil (considerando el criterio microbiológico y sensorial) fue entonces de hasta 40 días con la aplicación de 2 kGy y hasta 35 días con 1 kGy, lo que suponía duplicar el tiempo de almacenamiento de este producto y garantizar niveles seguros de L. monocytogenes. La au- sencia de E. coli O157:H7 también está asegurada por su mayor radiosensibilidad (valor D calculado de 0,26 kGy frente a 0,41 y 0,35 kGy para L. monocytogenes respectivamente en carne picada y burger meat).
- 89. Uso de tecnologías emergentes para garantizar la seguridad alimentaria de la carne y sus derivados 89 2.2. Evaluación del efecto de la aplicación de EA. Identificación de alimentos irradiados En la actualidad, más de 40 países permiten la aplicación de radiaciones ionizantes a alimen- tos en alguna de las tres modalidades, sobre todo radiación gamma y EA. Sin embargo, las nor- mativas que regulan este tratamiento (tipo de alimentos, dosis, etc.) varían de unas naciones a otras, siendo, en todo caso, obligatorio la indicación del tratamiento en el etiquetado del pro- ducto. En este marco, adquiere importancia disponer de métodos analíticos para la estimación del tratamiento aplicado, tanto para facilitar la inspección y control legislativo como para contri- buir a la confianza del consumidor en esta tecnología. En esta línea de trabajo, se han utilizado distintos métodos de análisis para, por una parte, profundizar en el estudio del efecto de la aplicación de EA en distintas matrices alimentarias y, por otra, conocer su utilidad para la traza- bilidad de alimentos tratados con radiaciones ionizantes. En concreto, se ha recurrido a las es- pectroscopias de resonancia magnética nuclear (RMN) y de resonancia de espín electrónico (REE) y a la imagen de resonancia magnética nuclear (IRM). Todas ellas son técnicas no destruc- tivas, que requieren una mínima cantidad de muestra para su análisis. Seguidamente, se resumen los resultados más destacados. La IRM aporta información de la estructura de distintas matrices, a partir de las cuales se pueden cuantificar diversos parámetros, entre los que se encuentran los tiempos de relajación longitudinal (T1) y transversal (T2), y coeficiente de difusión aparente (ADC). Estos parámetros son potencialmente sensibles a modificaciones de la estructura de los tejidos. Esta técnica se ha aplicado a distintos miosistemas tratados con EA (jamón curado, cocido y salmón ahumado en frío) (Herrero y col., 2010). La espectroscopia REE es el único método disponible para la detección directa de especies paramagnéticas en sistemas biológicos. Por tanto, puede utilizarse para evaluar la formación de radicales libres en alimentos sometidos a diversos procesos. La UE ha aceptado la REE como método estándar para la detección de alimentos irradiados que contengan residuos óseos (EN 1786, 1996), celulosa (EN 1787, 2000) o azúcar cristalizado (EN 13708, 2001). En el trabajo reali- zado se ha demostrado la utilidad de esta espectroscopia (Escudero y col., 2012) para evaluar el tratamiento con radiaciones ionizantes en diversos tipos de jamón habiéndose obtenido modelos de regresión que permiten relacionar la intensidad de distintas señales del espectro con la dosis aplicada. Asimismo, se ha comprobado el potencial de la espectroscopia RMN del exudado cár- nico como un método no invasivo, fácil y rápido para la trazabilidad de carnes irradiadas (Escu- dero y col., 2013). En colaboración con la Universidad de Milán, se han analizado, mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC/MS), los volátiles de carne de vacuno, habiéndose identifi- cado algunos hidrocarburos asociados al tratamiento con EA. La GC/MS de hidrocarburos es una de las técnicas admitidas para la detección de alimentos irradiados que contienen grasa (EN 1784, 2003). Los avances en este campo de análisis permitirían su mejor adaptación a la detec- ción de carnes irradiadas. 3. Potencial de la aplicación de pulsos de luz (PL) para garantizar la seguridad microbioló- gica de productos cárnicos Los PL son una tecnología no térmica de conservación de los alimentos que consiste en la aplicación de destellos de luz blanca de amplio espectro (200-1000 nm) y corta duración (10−3 - 102 ms). Su efecto antimicrobiano se debe principalmente al componente UV-C (200-290 nm) emitido en cada pulso, que impide la replicación celular debido a la formación de dímeros de pirimidina en el ADN. En los alimentos sólidos, dada la escasa penetración de la luz, la des- contaminación tiene lugar en la superficie, por lo que esta tecnología puede ser adecuada para la higienización de algunos alimentos RTE. En el marco del subproyecto PROCARTE, y de forma similar a lo indicado en el tratamiento con EA, se han realizado diversos estudios para evaluar la eficacia listericida de los PL en productos cárnicos crudos, cocidos y crudos-cura-
- 90. 90 Mª Isabel Cambero, Gonzalo D. García de Fernando, Margarita Medina dos, loncheados y envasados al vacío. Paralelamente, se ha analizado la calidad sensorial y microbiológica durante el almacenamiento en refrigeración de los productos tratados. La inactivación de L. monocytogenes osciló entre reducciones de 0,3 y 0,9 log ufc/cm2 en carpaccio de ternera, entre 0,4 y 1,8 log ufc/cm2 en productos cocidos (jamón y mortadela) y entre 0,9 y 1,8 log ufc/cm2 en productos crudos-curados (salchichón y lomo), con la aplicación de tratamientos comprendidos entre 0,7 y 11,9 J/cm2 (Hierro y col., 2011 y 2012; Ganan y col., 2013). La menor inactivación en el carpaccio podría explicarse por las características estructu- rales de este material. La eficacia del tratamiento con PL depende no sólo de la energía apli- cada, sino también de la topografía superficial. Así, la presencia de rugosidades y fisuras puede crear zonas de sombra que protejan a los microorganismos de los efectos letales del tratamiento. Los productos cocidos y crudos-curados muestran una superficie más firme que la de la carne cruda, en la que los microorganismos pueden encontrar un mayor número de cavidades donde alojarse y protegerse de la luz. En algunos productos, la fluencia que proporcionó el mayor grado de inactivación modi- ficó en cierta medida las propiedades sensoriales, con la aparición de una ligera decoloración, acompañada o no de notas aromáticas azufradas o ácidas según el producto. La tabla 3 ilustra los tratamientos que lograron una inactivación razonable sin afectar a la calidad sensorial. El tratamiento PL no prolongó la vida útil del carpaccio ni de la mortadela, ya que fluencias superiores a 2,1 J/cm2 , con las que el grado de inactivación microbiana fue bajo, modificaron las características sensoriales del producto. En cambio, en el jamón cocido, los PL ocasionaron un incremento de 30 días de la vida útil respecto al producto sin tratar (Hierro y col., 2011). Tabla 3. Tratamientos con pulsos de luz adecuados para la inactivación de L. monocytogenes en la superficie de productos cárnicos RTE Producto Fluencia (J/cm2 ) Inactivación (log ufc/cm2 )±DS Carpaccio de ternera 2,1 0,5 ± 0,10 Jamón cocido 8,4 1,8 ± 0,12 Mortadela 2,1 0,7 ± 0,04 Lomo curado 11,9 1,6 ± 0,15 Salchichón 11,9 1,8 ± 0,19 Puede concluirse que, si bien el grado de inactivación de L. monocytogenes obtenido en estos estudios es menor que el que se puede conseguir con otras tecnologías no térmi- cas, no sería desdeñable ante la posible contaminación post-procesado en la propia indus- tria o en un establecimiento de restauración. La tecnología PL se puede integrar fácilmente en las líneas de procesado y a un coste admisible. Además, habría que considerar el incre- mento de la vida útil que puede proporcionar en algunos productos. Todo ello hace de los PL una tecnología de interés potencial para la comercialización de algunos productos cár- nicos RTE. 4. Potencial de la aplicación de altas presiones hidrostáticas (APH) y bioconservantes para garantizar la seguridad microbiológica de productos cárnicos La tecnología de APH es un proceso físico no térmico que se emplea para eliminar mi- croorganismos patógenos y alterantes de alimentos, lo que permite ampliar su vida útil y con- seguir alimentos seguros. El tratamiento con APH se está utilizando en la práctica industrial para diversos alimentos. En este proyecto, en un afán de aportar más conocimientos acerca del poder letal de las APH, se ha profundizado en su estudio utilizando como modelos diversas
- 91. Uso de tecnologías emergentes para garantizar la seguridad alimentaria de la carne y sus derivados 91 matrices cárnicas, habiéndose establecido el grado de reducción del número de diversas bac- terias patógenas. Se han demostrado efectos antimicrobianos sinérgicos de combinaciones de APH con bac- teriocinas frente a diversos patógenos, aumentando su espectro de acción al sensibilizar a algu- nas bacterias Gram negativas. La lactoferrina (LF) es una glicoproteína cuya actividad bacterios- tática se ha asociado a su capacidad de secuestrar hierro, mientras que su actividad bactericida se ha atribuido a su unión o alteración de componentes de la pared celular. Algunos de sus derivados, como su forma amidada (AMILF) y su forma digerida con pepsina (PDLF), han sido propuestos como conservantes naturales en los alimentos. Otro sistema antimicrobiano, el lacto- peroxidasa (LPS), constituido por la enzima lactoperoxidasa, el ión tiocianato y el peróxido de hidrógeno, está catalogado como GRAS por la FDA. 4.1. Tratamientos con APH y bioconservantes 4.1.1. Efecto de la lactoferrina y derivados en sistemas tampón y en carne La LF y sus derivados (AMILF, PDLF y su forma comercial activada ALF) ejercen una potente actividad bactericida in vitro (tampón Tris 50 mM, pH 7,0), con reducciones de hasta más de 7 unidades logarítmicas para LF y ALF frente a L. monocytogenes, y de hasta 6 para AMILF frente a P. fluorescens. La concentración de máxima actividad bactericida depende del tipo de lactoferrina y ciertas combinaciones logran potenciar el efecto bactericida conjunto (Del Olmo y col., 2008 y 2009). La actividad de la LF y sus derivados depende de la especie y cepa bacteriana (Del Olmo y col., 2010, 2011, 2012a y 2012b), la carga microbiana inicial (inversamente relacionada con la eficacia bactericida), la fase de crecimiento (siendo la fase exponencial la más resistente a la LF) y el polisacárido capsular (inversamente relacionado con la eficacia bactericida). El potente efecto bactericida que la LF y derivados ejercen en condiciones in vitro se ve muy reducido, e incluso totalmente abolido, en carne (Del Olmo y col., 2009). La presencia de iones de K, Na, P, Mg y Ca afecta a la pérdida de actividad bactericida del bioconservante y sus derivados en carne. 4.1.2. Tratamientos combinados en carne de ternera y pollo Se ensayaron tratamientos por APH de ciclo único y de ciclos múltiples en muestras de car- ne picada de ternera inoculada con E. coli O157:H7 consiguiéndose reducciones de 0,8 a 3,1 log ufc/g con tiempos de aplicación de 1 a 20 min a 400 MPa (Morales y col., 2008). Con tres ciclos de 1 min (duración total 10,5 min) se alcanzó una reducción de 3,1 log ufc/g, igual a la obtenida con un ciclo de 20 min (duración total 22,5 min). Los tratamientos de ciclos únicos aumentaron los parámetros L* y b* con la duración, mientras que en los de ciclos múltiples se incrementaron con el número de ciclos. La fuerza al corte aumentó hasta valores máximos con un ciclo de 10 min o con dos ciclos de 5. Las APH (400 MPa, 10 min) aplicadas en carne de pollo mostraron un notable efecto bacte- ricida sobre L. monocytogenes, E. coli y P. fluorescens, alcanzando reducciones de entre 4 y 5 unidades logarítmicas durante los 8 días de almacenamiento en refrigeración post-presurización. No obstante, se observó una cierta recuperación bacteriana tanto de las bacterias inoculadas como de la microbiota endógena del pollo. Se ensayaron tratamientos por APH de ciclo único y de ciclos múltiples sobre filetes de pechuga inoculados con una mezcla de tres cepas de S. En- teritidis (Morales y col., 2009). El empleo combinado de las APH (400 MPa, 10 min) y la adición de LF y sus derivados (0.5 mg/g) en este producto logró una ligera mejora de la eficacia bacte- ricida de los antimicrobianos, probablemente por una sensibilización microbiana inducida por las APH, aunque la reducción adicional sobre la conseguida por la presurización no llegó a al- canzar 1 unidades logarítmicas. El empleo combinado de sonicación, electrospray y tratamiento térmico con la LF y sus de- rivados (a 0,5 mg/g) en carne de pollo logró tan sólo una ligera potenciación de la eficacia bactericida de los antimicrobianos (inferior a 1 unidad logarítmica).
- 92. 92 Mª Isabel Cambero, Gonzalo D. García de Fernando, Margarita Medina 4.1.3. Tratamientos combinados en carpaccio de ternera Los niveles de L. monocytogenes, S. Enteritidis y E. coli O157:H7 inoculados en carpaccio de ternera no variaron durante 30 días de almacenamiento a 8 ºC. La aplicación de APH para inac- tivar S. Enteritidis provocó reducciones de 3,7 y 5,9 log cfu/g a 450 MPa durante 5 y 10 min, respectivamente, mientras que el patógeno no se detectó en carpaccio presurizado a 450 MPa durante 15 min. Se registraron cambios en el color y la textura, mayores con los tratamientos más prolongados. Los valores de L* aumentaron significativamente, mientras que a* disminuyó (De Alba y col., 2012). Con tratamientos combinados de bacteriocinas y APH a 450 MPa durante 5 min, la presuriza- ción redujo los niveles de L. monocytogenes en 1 unidades logarítmicas. Con las distintas bacterio- cinas se consiguieron descensos de 0,2 a 1,4 unidades, y el efecto de los tratamientos combinados fue aditivo. Los recuentos de S. Enteritidis disminuyeron 4,1 unidades logarítmicas por la APH, no resultaron afectados por las bacteriocinas, ni se observó actividad antimicrobiana sinérgica. Sin embargo, con la APH se consiguieron reducciones de E. coli O157:H7 de 2,7 unidades logarítmicas, las bacteriocinas no afectaron a su supervivencia, y el efecto de la combinación fue sinérgico con las enterocinas A y B, la pediocina y la nisina, con tasas de inactivación 2 unidades logarítmicas superiores a las alcanzadas con la suma de los tratamientos individuales. Las APH sensibilizarían a las células de E. coli O157:H7 frente a las bacteriocinas, dando lugar al efecto sinérgico. La ALF o el sistema LPS no inactivaron a L. monocytogenes, S. Enteritidis o E. coli O157:H7 en carpaccio mantenido durante 7 días a 8 ó 22 ºC, mientras que los tratamientos a 450 MPa durante 5 min redujeron los niveles entre 1 y 3 log ufc/g, permaneciendo este efecto durante los 7 días incluso a 22 ºC. Se registró un efecto antimicrobiano sinérgico de la combinación LPS con APH frente a E. coli O157:H7. 4.1.4. Tratamientos combinados en jamón curado y en jamón cocido Se han aplicado tratamientos de 400, 500 y 600 MPa durante 5 min a lonchas de jamón cu- rado contaminadas con S. Enteritidis y mantenidas a 8 ºC durante 60 días (De Alba y col., 2012). En jamón no presurizado los niveles de S. Enteritidis decrecieron aproximadamente 2 log ufc/g durante los 60 días de almacenamiento. Tras la aplicación de 400, 500 y 600 MPa, los niveles disminuyeron 1,6, 3,0 y 4,8 log ufc/g, respectivamente. En jamón presurizado a 600 MPa no se detectó el patógeno desde el día 7 hasta el final del periodo de almacenamiento. A los 60 días, se registraron valores de 4,0 log ufc/g en jamón no presurizado y de 1,4 log ufc/g en jamón tratado a 400 y 500 MPa. La presurización provocó una ligera tonalidad pálida del producto, con valores superiores de L* y menores de a* en las muestras presurizadas con mayor intensidad. Los tratamientos de APH a 400 y 500 MPa durante 10 min resultaron efectivos en la inacti- vación de E. coli O157:H7 en jamón curado loncheado, aunque las reducciones fueron bajas. Los tratamientos con nisina o pediocina no afectaron a la supervivencia del patógeno. Sin embargo, con APH combinadas con nisina se registró un efecto antimicrobiano sinérgico. Los cambios en la textura fueron mínimos, mientras que los valores de L* fueron afectados por la presurización a 500 MPa, tendiendo a disminuir las diferencias durante el almacenamiento, como también ocurrió con los valores de a* (De Alba y col., 2013). La ALF o el LPS aplicados individualmente no afectaron a L. monocytogenes ni a S. Enteritidis en jamón curado, mientras que 450 MPa durante 10 min redujeron los niveles 0,6 y 2,2 unidades logarítmicas, respectivamente. La combinación de la APH con estos bioconservantes resultó si- nérgica frente a S. Enteritidis. En la superficie del jamón cocido se observó una acción bactericida inmediata de las entero- cinas A y B (2000 AU/g), con reducciones de L. monocytogenes de 1,3 unidades logarítmicas. Sin embargo, las bacteriocinas no tuvieron capacidad bacteriostática ni modificaron la tasa de creci- miento durante el posterior almacenamiento a 4 ºC. Mediante APH (600 MPa, 5 min) se consiguió reducir el nivel de patógeno por debajo del límite de detección (ausencia en 25 g) durante 14 y 21 días de almacenamiento sin y con enterocinas A y B, respectivamente (Jofré y col., 2011).
- 93. Uso de tecnologías emergentes para garantizar la seguridad alimentaria de la carne y sus derivados 93 4.2. Modelización matemática del efecto de las APH en el comportamiento de L. monocytogenes en productos cárnicos cocidos RTE 4.2.1. Inactivación por APH Se ha modelizado (Hereu y col., 2012a) la cinética de inactivación por APH (300- 800 MPa) de L. monocytogenes en productos cárnicos con diferente contenido en grasa (jamón cocido con ca. 4,5% y mortadela con ca. 17%). Debido a la presencia de “colas”, principalmente a presiones superiores a 450 MPa (Figura 1), el modelo primario log-linear con cola fue el más adecuado para describir la cinética de inactivación. Se han desarrollado dos modelos, uno para cada ali- mento, jamón cocido y mortadela (Hereu y col., 2012a). La validez de las predicciones de los modelos desarrollados se comprobó, tanto en condi- ciones dinámicas (i) como estáticas (ii): i) Mediante el desarrollo de un sistema de integración tiempo-presión para calcular el efecto acumulado del incremento de presión durante el periodo de subida de ésta (come-up) se comprobó la concordancia entre los valores estimados y los observados. ii) Los valores de kmax (tasa de inactivación) que predicen los modelos desarrollados se compa- raron con valores determinados experimentalmente (observados) en diferentes alimentos. En productos cárnicos los valores de sesgo (Bf=1,01) y exactitud (Af=1,24) fueron muy satis- factorios. El valor de exactitud nos indica que el error que puede cometerse al aplicar el modelo debe ser menor del 24%, mientras que un sesgo por encima de la unidad nos dice que las predicciones estiman un número de supervivientes mayor del que realmente deben quedar tras el tratamiento con APH. Es decir, es un modelo seguro. La satisfactoria validación, tanto dinámica como estática, de los modelos desarrollados utili- zando datos externos e independientes apoyan su idoneidad para fines predictivos para produc- tos cocidos RTE, como establecer o fijar los criterios de proceso necesarios para cumplir con los FSO. Así, a través de los diagramas de isoreducción (Figura 1) se deduce que para conseguir el criterio de funcionamiento de 4 unidades logarítmicas de reducción, mediante un procesado con APH durante 3 min, se requerían presiones de entre 500 y 525 MPa para los productos cárnicos cocidos magros (tipo jamón cocido) y más grasos (tipo mortadela), respectivamente (Hereu y col., 2012a). 3 505 250 300 350 400 450 500 550 600 650 0.0 1.5 3.0 4.5 6.0 7.5 9.0 10.5 12.0 13.5 15.0 Presión(MPa) Tiempo de tratamiento (min) 6 5 4 3 2 1 6 5 4 3 2 1 3 526 250 300 350 400 450 500 550 600 650 0.0 1.5 3.0 4.5 6.0 7.5 9.0 10.5 12.0 13.5 15.0 Presión(MPa) Tiempo de tratamiento (min) 6 5 4 3 2 1 6 5 4 3 2 1 MortadelaJamón cocido Figura 1. Líneas de isoreducción (log N/N0) de L. monocytogenes en productos cárnicos cocidos RTE en función de la presión y tiempo de tratamiento.
- 94. 94 Mª Isabel Cambero, Gonzalo D. García de Fernando, Margarita Medina 4.2.2. Comportamiento durante el almacenamiento en refrigeración posterior a la presurización Se ha modelizado el crecimiento de L. monocytogenes en jamón cocido y mortadela presuri- zados (400 MPa, 5 min), según el inóculo (107 y 104 ufc/g) y el estado fisiológico (después del crecimiento a 8 ºC y estrés a -80 ºC), durante la refrigeración (4 a 12 ºC) (Hereu y col., 2012b). El nivel de inóculo no tuvo un efecto significativo. Sin embargo, las características del producto y el estado fisiológico del patógeno ejercieron una influencia significativa, siendo las células previa- mente crecidas en refrigeración más sensibles a las APH que las sometidas a congelación. De acuerdo con estos resultados y con los de Bover-Cid y col. (2011), el efecto del estado fisiológico del patógeno es dependiente de las condiciones del medio (es decir, matriz alimentaria) en el que se encuentra durante la aplicación de las APH (Hereu y col., 2012a). La APH no afectó a la tasa específica de crecimiento (µmax), independientemente del nivel de inóculo, el estado fisioló- gico de L. monocytogenes y el tipo de producto. La fase de latencia de L. monocytogenes estresa- das por congelación se prolongó de forma significativa (3 días a 12 ºC y 25 a 4 ºC) en compara- ción con las células mantenidas en refrigeración (Hereu y col., 2012b; Bover-Cid y col., 2013). Los periodos de latencia en mortadela fueron ligeramente más largos que en jamón cocido. 4.3. Efecto de las APH sobre la formación de compuestos volátiles En carne picada de vacuno el tratamiento a 400 MPa durante 10 min tuvo un efecto signifi- cativo sobre 22 de los 62 compuestos volátiles encontrados después de 3 días a 4 o C, y en pe- chuga de pollo sobre 18 de los 53 compuestos analizados (Rivas-Cañedo y col., 2009a). En jamón Serrano (Rivas-Cañedo y col., 2009b) se encontraron 108 compuestos volátiles, de los cuales 38 se vieron afectados por el tratamiento a 400 MPa. El efecto de las APH en jamón fue menor que en las carnes frescas. Sus condiciones fisicoquímicas (alto contenido en sal, baja aw) no favorecen el crecimiento bacteriano. Únicamente en la superficie se desarrollan levaduras y mohos, que se asocian con la formación de cetonas insaturadas, 2-alcanoles y estireno. En salchichón se encontraron 109 compuestos volátiles, de los que 33 se vieron afectados por la APH a 400 MPa (Rivas-Cañedo y col., 2009c). La fracción volátil estuvo dominada por terpenos procedentes de las especias añadidas. En paleta cocida de cerdo (Rivas-Cañedo y col., 2011a) se encontraron 126 compuestos volátiles, 98 de ellos afectados por los tratamientos a 400, 500 ó 600 MPa durante 5 ó 10 min a lo largo de 28 d a 4 o C. El elevado número de volátiles presentes en carne y productos cárnicos aconseja el empleo de más de una técnica de extracción (Rivas-Cañedo y col., 2011b y 2012). 5. Sensibilidad de virus modelo a distintos tratamientos no térmicos La seguridad de los alimentos requiere controlar y eliminar los potenciales patógenos de naturaleza vírica de transmisión alimentaria. En PROCARTE se ha estudiado la inactivación, me- diante tres tecnologías no térmicas, PL, EA y APH (Bosch y col., 2011), de los virus entéricos más relevantes de transmisión alimentaria: los Norovirus Genogrupo I y II (NoV GGI, NoV GGII), agentes más frecuentes de brotes de gastroenteritis de origen alimentario y su modelo propaga- ble in vitro Norovirus murino tipo-1 (MNV-1) y el virus de la hepatitis A (HAV) causante de la enfermedad de mayor gravedad dentro de las más frecuentes de transmisión por alimentos. Las experiencias se han realizado utilizando como modelo jamón cocido RTE. En el caso de los tratamientos con EA, se han aplicado entre 1 y 16 kGy observándose que, conforme se aumentaba la dosis se incrementaba la caída del título infeccioso de los virus. Sin embargo, aplicando la dosis máxima recomendada de 10 kGy, sólo se consiguió inactivar entre 1,8 y 1,9 unidades logarítmicas en el caso del HAV y entre 2,7 y 2,9 unidades logarítmicas para el MNV-1. Dosis elevadas de hasta 16 kGy aumentaron la inactivación de los virus HAV y MNV- 1, alcanzándose en éste último valores máximos de hasta 4 unidades logarítmicas (Beguiristain y col., 2011).
- 95. Uso de tecnologías emergentes para garantizar la seguridad alimentaria de la carne y sus derivados 95 Por otra parte, tras la aplicación de PL de hasta 20 J/cm2 , la máxima inactivación experimen- tal observada fue de 2,9 unidades logarítmicas en el caso del HAV y 2,6 unidades logarítmicas en el caso del MNV-1. Cuando se aplicaron dosis más bajas, dentro de las permitidas por la FDA, como 12 J/cm2 , el grado de inactivación fue de 2,3 y 2,0 unidades logarítmicas, para el HAV y MNV-1, respectivamente. Con el objetivo de conocer con mayor profundidad el mecanismo de acción de las tecnolo- gías más eficaces para inactivar virus, se utilizaron poblaciones complejas de HAV adaptadas a crecer en ausencia y presencia de actinomicina D, a concentraciones de 0,05 y 0,2 mg/ml. En ambos casos, se emplearon poblaciones adaptadas durante un periodo de tiempo corto o largo. Las poblaciones adaptadas a actinomicina D, con sus potenciales cambios de plegamiento de la cápside podrían dar lugar a cápsides con mayor o menor grado de alteración, por lo que podrían ser excelentes modelos para esclarecer si los mecanismos de inactivación (en APH y PL) están relacionados con las conformaciones que adoptan dichas cápsides. Los resultados mostraron que las poblaciones sometidas a la concentración más alta de actinomicina, son más sensibles a las APH, lo que pone de manifiesto la relación de inactiva- ción del virus en función del grado de estructuración de sus cápsides. Sin embargo, cuando se sometieron dichas poblaciones a PL de 20 J/cm2 , el efecto fue similar en todas las poblaciones, observándose caídas en la infectividad del virus de 6 unidades logarítmicas. Estos resultados muestran que el efecto mayoritario de los PL podrían ser a nivel de ácido nucleico, al contrario que las APH cuyo efecto parece estar directamente relacionado con la conformación de la cáp- side del virus. 6. Inactivación de microorganismos mediante fluidos supercríticos asistidos por ultra- sonidos En el contexto del subproyecto PROCARTE, se han estudiado las cinéticas de inactivación de E. coli y Saccharomyces cerevisiae mediante la aplicación de ultrasonidos (US) en combina- ción con CO2-supercrítico (FSC) (Ortuño y col., 2012a, 2012b). Las experiencias se realizaron inicialmente en distintos medios líquidos (medio de cultivo, zumo de manzana y de naranja), donde se han ensayado diferentes presiones (10-35 MPa) y temperaturas (31-41 ºC). Cuando sólo se aplicó el tratamiento con FSC, la velocidad de inactivación aumentó con la presión y la tem- peratura del proceso. En el caso de E. coli en medio de cultivo, el tiempo promedio requerido (en las diferentes condiciones de proceso) para conseguir una reducción de 8 unidades logarít- micas fue de 50 min. La inactivación fue más lenta en zumos, probablemente debido al efecto protector ejercido por los componentes del alimento. En el proceso combinado de FSC+US, el tiempo de inactivación se redujo en un 95% para conseguir el mismo grado de reducción que con FSC. De esta forma, para E. coli se requirieron 2 min a 31 ºC y 22,5 MPa para alcanzar la mencionada reducción de 8 unidades logarítmicas y el efecto de la presión, temperatura, y tipo de medio se minimizó. Aplicando FSC, las cinéticas de inactivación de S. cerevisiae fueron más lentas que para E. coli, lo que puede atribuirse a un mayor grosor de su pared celular (Ortuño y col., 2012b). Sin embargo, aplicando FSC+US los resultados obtenidos en ambos microorganis- mos fueron muy similares. Estos resultados sugieren que la aplicación simultánea de FSC+US reduce el efecto de las variables de proceso (incluido tipo de microorganismo). Adicionalmente, se han llevado a cabo pruebas preliminares para evaluar la eficacia del mismo tratamiento en una matriz sólida y el efecto del contenido de agua en el medio. Para ello, se ha utilizado pechuga de pollo y solución isotónica. Los resultados obtenidos indican que mediante el uso de US es posible acelerar el proceso de inactivación de E. coli y la eficacia se potencia con el incremento de la adición de solución isotónica. Los resultados obtenidos sugieren que esta novedosa tecnología no térmica tiene un elevado potencial para la higienización de alimentos, especialmente líquidos. Además, las suaves condi- ciones de procesado permitirían mantener sus características sensoriales y nutritivas.
- 96. 96 Mª Isabel Cambero, Gonzalo D. García de Fernando, Margarita Medina 7. Análisis de la variabilidad de la destrucción microbiana Por regla general, si se pretende estudiar la evolución de un microorganismo en un alimen- to, se toman unas cuantas muestras, quizás 3 ó 5, en diferentes etapas del proceso de elabora- ción; se obtendrá después la media de los recuentos microbianos y podrá construirse una gráfi- ca similar a la mostrada a continuación. 0 1 2 3 4 5 6 7 5 10 15 20 25 30MTc E Tiempo (días) Logufc/g Figura 2. Representación esquemática de la evolución de la carga microbiana de un alimento sometido a un proceso conservante y después almacenado a una temperatura compatible con el desarrollo microbiano. Materia prima (M). Tratamiento conservante (Tc). Envasado (E). En la figura 2 se aprecia que la materia prima contenía, de media, 106 ufc/g, cantidad que se redujo a 10 ufc/g tras la aplicación del tratamiento de conservación, cifra que se mantuvo du- rante el envasado y unos cuantos días (fase de latencia), para luego comenzar a crecer paulati- namente a lo largo del almacenamiento hasta, finalmente, estabilizarse en torno a 106 ufc/g en la fase estacionaria. Todas las cifras serán medias de las muestras analizadas. En el marco del proyecto se ha puesto de manifiesto que tanto la inactivación microbiana (Aguirre y col., 2009, 2011 y 2012a) como la duración de la fase de latencia (Aguirre y col., 2011, 2012a, 2012b y 2013) están sujetas a cierta variabilidad que, afortunadamente, sigue unas reglas y, por tanto, es cuantificable. Cuanto más intenso es el tratamiento aplicado (térmico, de irradia- ción u otro) en un alimento, menor es el número de supervivientes, pero este número es más variable (Aguirre y col., 2009, 2011 y 2012a). Los incrementos de la variabilidad de la inactivación microbiana conforme se intensifica el tratamiento higienizante justifican la aplicación de trata- mientos “sobredimensionados”, más intensos de los estrictamente necesarios, predichos por los valores D y z. Piénsese que el valor D a una determinada temperatura es una media que se ha obtenido con una serie de datos experimentales que, en realidad, se caracterizan por estar más o menos dispersos, dispersión que se cuantifica con la desviación estándar. Obsérvese la figura 3 para una mejor comprensión del alcance práctico de tal variabilidad. Para aplicar la variabilidad de la inactivación en la práctica deben utilizarse distribuciones de frecuencias en las que se refleje la probabilidad de que, tras aplicar un determinado tratamien- to microbicida, se logre una inactivación determinada. ¿Qué significa esta variabilidad a nivel práctico? Considérese un ejemplo: a la vista de la figura 3, si la carga inicial en un producto coincide con la mostrada en esa figura, y se fija un FSO de 2 células por envase, debería apli- carse un tratamiento de 6,1 ciclos logarítmicos para lograrlo. Pero ese tratamiento dejaría 2
- 97. Uso de tecnologías emergentes para garantizar la seguridad alimentaria de la carne y sus derivados 97 células, de media, por envase y no 2 viables en todos los envases. Es muy probable que haya envases sin viables y, claro está, otros que contengan más de 2. Para poder determinar qué probabilidad se tiene de que haya un determinado número de supervivientes en un envase, ha de modelarse la variabilidad. Para ello se representa el efecto de la inactivación en la desviación estándar (Figura 4). y = 0.0892x + 0.0047 R² = 0.9449 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 1 2 3 4 5 6 7 Sddelainactivación(logufc/muestra) Inactivación (log ufc/muestra) Figura 4. Efecto de la inactivación en el grado de variabilidad de la inactivación en términos de la desviación estándar de los datos de la figura 3. Con ayuda de las ecuaciones de las figuras 3 y 4, se obtienen los datos necesarios para si- mular distribuciones normales de frecuencia, calculadas con la función DISTR.NORM de Micro- soft Excel. De esta manera, para tener 2 células de media por envase hay que aplicar un trata- miento de 6,1 ciclos, predicho por la ecuación mostrada en la figura 3, y este tratamiento conlleva una DS de 0,5488 (predicha por la ecuación mostrada en la figura 5). Con estos datos se obtiene la distribución de frecuencias del número de supervivientes mostrada en la figura 5. y = -x + 6,4 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 7 LogNºsupervivientes Inactivación (-log ufc/muestra) Figura 3. Inactivación de L. innocua en TSB a 54 ºC. Se muestran las medias del número de supervivientes ± 1,96 x DS, lo que indica que entre los extremos de las barras se incluyen el 95% de los datos. Cada punto es media de unas 70 determinaciones, excepto el dato de muestras no tratadas, que es media de 10.
- 98. 98 Mª Isabel Cambero, Gonzalo D. García de Fernando, Margarita Medina 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 -2 -1.6 -1.2 -0.8 -0.4 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 2.4 2.8 Frecuencia Log supervivientes Figura 5. Distribución de frecuencias del número de supervivientes para una media de 2 (log 2= 0,3010) y una DS de 0,5488. -4 -3.5 -3 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 Log Supervivientes/Envase Frecuencia 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Figura 6. Distribución de frecuencias del número de supervivientes para que existan 2 células o más en el 1% de los envases. Zona más oscura de la gráfica. Es evidente que la mitad de los envases de ese supuesto lote contendrán menos de 2 células y la otra mitad más. Parece obvio que este resultado no debe satisfacer a una industria cuyo FSO sea que sus envases contengan 2 o menos células. Entonces, ¿qué tratamiento debe aplicarse en este ejemplo para que un determinado porcentaje, pequeño, por ejemplo el 1%, de los envases contengan 2 o menos células? La respuesta está en las predicciones de los modelos aquí desa- rrollados. En efecto, si el tratamiento térmico aplicado hubiera sido de 7,8 ciclos logarítmicos, la media de supervivientes sería de 0,04 por envase, con una DS de 0,70, lo que arrojaría la distri- bución de frecuencias mostrada en la figura 6 en la que el área encerrada en la esquina de la derecha (más oscura), supone el 1% del total, que representa el porcentaje de muestras que contendrán 2 o más células. La aplicación de estos modelos debe permitir a la industria aquilatar lo más posible el trata- miento microbicida a aplicar para conseguir un FSO concreto.
- 99. Uso de tecnologías emergentes para garantizar la seguridad alimentaria de la carne y sus derivados 99 8. Conclusiones Como resultado de las distintas investigaciones realizadas se han determinado las condicio- nes óptimas para el tratamiento con electrones acelerados, la viabilidad de los pulsos de luz y se han establecido distintas estrategias para potenciar el efecto la de las altas presiones hidros- táticas, con el objetivo común de garantizar la seguridad alimentaria de distintos tipos de pro- ductos cárnicos y prolongar su vida útil. Al finalizar el subproyecto PROCARTE puede decirse de forma concluyente que es posible ofrecer al sector industrial distintas tecnologías para asegurar el cumplimiento de los objetivos de seguridad alimentaria en relación con los microorganismos patógenos más relevantes de acuerdo a las normativas de los distintos países. Equipos participantes Los resultados que se recogen en este capítulo derivan de las investigaciones realizadas en las distintas acciones realizadas por los equipos que han participado en el subproyecto PROCAR- TE que han sido coordinadas por T. Aymerich (IRTA, Monells), A. Bosch (UB), J. Benedito (UPV), G. García de Fernando (UCM), M. Fernández y E. Hierro (UCM), M. Núñez y M. Medina (INIA), J. A. Ordóñez, L. de la Hoz (†) y M.I. Cambero (UCM). Agradecimientos Las investigaciones que recogen este capítulo ha sido llevada a cabo en el marco del Pro- yecto Consolider-Ingenio 2010 CARNISENUSA CSD2007-00016, en colaboración con los si- guientes proyectos: AGL2007-65235-C02-01/ALI, AGL2007-65235-C02-02/ALI, AGL2010-19158, AGL2010-16598, AGL2010-16600, AGL2011-29325 (Ministerio de Economía y Competitividad), CPE03-012-C3-02 (INIA), S-505/AGR-0314 (TEMINYSA) (Comunidad de Madrid) y BSCH-UCM GR58/08 (Gr.Nº. 920276) (Universidad Complutense). 9. Bibliografía Aguirre, J.S., Pin, C., Rodríguez, M.R, García de Fernando, G.D. 2009. Analysis of the variability in the number of viable bacteria after mild heat treatment of food. Applied Environmental Microbiology 75, 6992-6997. Aguirre, J.S., Rodríguez, M.R, García de Fernando, G.D. 2011. Effects of electron beam irradiation on va- riability of the number of survivors and on duration of lag phase of four food-borne organisms. Inter- national Journal of Food Microbiology 149, 236-246. Aguirre, J., Ordóñez, J.A., García de Fernando, G.D. 2012a. A comparison of the effects of E-beam irradia- tion and heat treatment on the variability of Bacillus cereus inactivation and lag phase duration of surviving cells. International Journal of Food Microbiology 153, 444-452. Aguirre, J., Bravo, M.C., Ordóñez, J.A., García de Fernando, G.D. 2012b. The Poisson distribution is applied to improve the estimation of individual cell and micropopulation lag phases. Advances in Microbio- logy 2, 146-161. Aguirre, J., Gonzalez, A., Özçelik, N., Rodríguez, M.R., García de Fernando, G.D. 2013. Modeling the Lis- teria innocua micropopulation lag phase and its variability. International Journal of Food Microbiolo- gy 164, 60-69. Beguiristain, N., Fuentes, C., Pintó, R., Bosch, A. 2011. Nuevas técnicas de eliminación de virus en ali- mentos. En: Ordóñez, J.A., Córdoba, J.J., Ventanas, J. (Eds.), Productos Cárnicos para el Siglo XXI. Seguros, nutritivos y saludables. Universidad de Extremadura. Servicio de Publicaciones, Cáceres, pp. 197-200. Benedito, J.J., Martínez-Pastor, M.T., Mulet, A., Ortuño, C., Peña, R. 2011. Procedure of inactivation mi- croorganisms by combination of supercritical fluids and ultrasound. Spain. Patent No. P201131099. 1. Benedito, J., Cambero, M.I., Ortuño, C., Cabeza, M.C., Ordóñez, J.A., de la Hoz, L. 2011. Modeling and optimization of sensory changes and shelf-life in vacuum packaged cooked ham treated by E-beam irradiation. Radiation Physics and Chemistry 80, 505-513.
- 100. 100 Mª Isabel Cambero, Gonzalo D. García de Fernando, Margarita Medina Bosch, A., Beguiristain, N., Fuentes, C., Pintó, R.M. 2011 Nuevas técnicas de eliminación de virus en ali- mentos. Virología 14, 133-134. Bover-Cid, S., Hereu, A., Dalgaard, P., Garriga, M., Aymerich, T. 2013. Effects of the physiological sta- te of Listeria monocytogenes and high pressure processing on relative lag times during growth in chilled RTE cooked meat product. 8th International Conference on Predictive Modeling of Food, París. Bover-Cid, S., Hereu, A., Garriga, M., Aymerich, T. 2011. Pre-culture conditions and food characteristics influence the high pressure resistance of Listeria monocytogenes on RTE cured meat products. Sum- mer Conference of the Society for Applied Microbiology, Dublin. Cabeza, M.C., Cambero, M.I., Hoz, L., Ordóñez, J.A. 2007. Optimization of E-beam irradiation treatment to eliminate Listeria monocytogenes from ready-to-eat (RTE) cooked ham. Innovative Food Science and Emerging Technologies 8, 299-305. Cabeza, M.C., Cambero, M.I., Núñez, M., Medina, M., de la Hoz, L., Ordóñez, J.A. 2010. Lack of growth of Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus in temperature abuse of E-beam treated ready-to- eat (RTE) cooked ham. Food Microbiology 27, 777-782. Cabeza, M.C., de la Hoz, L., Velasco, R., Cambero, M.I., Ordóñez, J.A. 2009. Safety and quality of ready-to- eat dry fermented sausages subjected to E-beam radiation. Meat Science 83, 320-327. Cabeza, M.C., de la Hoz, L., Cambero, M.I., Velasco, R., García-Márquez, I., Manzano, S., Ordóñez, J.A. 2011. Higienización y vida útil de alimentos listos para su consumo (RTE) Tratados con electrones acelerados. En: Ordóñez, J.A., Córdoba, J.J., Ventanas, J. (Eds), Productos Cárnicos para el Siglo XXI. Seguros, nutritivos y saludables. Universidad de Extremadura. Servicio de Publicaciones, Cáceres, pp. 167-177. Cambero, M.I., Cabeza, M.C., Ordóñez, J.A., Hoz, L. 2008. Estudio de la penetración de electrones acele- rados para optimizar su aplicación en un alimento compuesto por ingredientes heterogéneos. CE- SIA-CIBSA II Congreso Iberoamericano sobre Seguridad Alimentaria y V Congreso Español de Inge- niería de Alimentos, Barcelona. Cambero, M.I., Cabeza, M.C., Escudero, R., Manzano, S., García-Márquez, I., Velasco, R., Ordóñez, J.A. 2012. Sanitation of selected ready-to-eat intermediate-moisture foods of animal origin by E-beam irra- diation. Foodborne Pathogens and Disease 9, 594-599. Cambero, M.I., Roncalés, P., Manzano, S., Cabeza, M.C., Escudero, R., Velasco, R., García Márquez, I., Or- dóñez, J.A. 2012. Strategies to retain the red colour of ground meat E-Beam treated and effects on the shelf-life and safety. International Congress of Chemical Engineering. ANQUE ICCE, Sevilla. De Alba, M., Bravo, D., Medina, M. 2012. High pressure treatments on the inactivation of Salmonella En- teritidis and the characteristics of beef carpaccio. Meat Science 92, 823-828. De Alba, M., Montiel, R., Bravo, D., Gaya, P., Medina, M. 2012. High pressure treatments on the inactivation of Salmonella Enteritidis and the physicochemical, rheological and color characteristics of sliced va- cuum-packaged dry-cured ham. Meat Science 91, 173-178. De Alba, M., Bravo, D., Medina, M. 2013. Inactivation of Escherichia coli O157:H7 in dry-cured ham by high pressure treatments combined with biopreservatives. Food Control 31, 508-513. Del Olmo, A., Morales, P., Nuñez, M. 2008. Bactericidal effect of lactoferrin and its amidated and pepsin digested derivatives on Pseudomonas fluorescens: influence of environmental and physiological fac- tors. Journal of Food Protection 71, 2468-2474. Del Olmo, A., Morales, P., Nuñez, M. 2009. Bactericidal effect of lactoferrin and its amidated and pepsin digested derivatives against Pseudomonas fluorescens in ground beef and meat fractions. Journal of Food Protection 72, 760-765. Del Olmo, A., Calzada, J., Nuñez, M. 2010. Antimicrobial effect of lactoferrin and its amidated and pep- sin-digested derivatives against Salmonella Enteritidis and Pseudomonas fluorescens. Journal of Dairy Science 93, 3965-3969. Del Olmo, A., Calzada, J., Nuñez, M. 2011. Antimicrobial efficacy of lactoferrin, its amidated and pepsin-di- gested derivatives, and their combinations, on Escherichia coli O157:H7 and Serratia liquefaciens. Letters in Applied Microbiology 52, 9-14. Del Olmo, A., Calzada, J., Nuñez, M. 2012. Effect of lactoferrin and its derivatives against gram-positive bacteria in vitro, and combined with high pressure, in chicken breast fillets. Meat Science 90, 71-76. Del Olmo, A., Calzada, J., Nuñez, M. 2012. Effect of lactoferrin and its derivatives, high hydrostatic pressu- re, and their combinations, on Escherichia coli O157:H7 and Pseudomonas fluorescens in chicken fi- lets. Innovative Food Science and Emerging Technologies 13, 51-56.
- 101. Uso de tecnologías emergentes para garantizar la seguridad alimentaria de la carne y sus derivados 101 Escudero, R., Valhondo, M., Ordóñez, J.A., de la Hoz, L., Cabeza, C., Velasco, R., Cambero, M.I. 2012. Elec- tron spin resonance (ESR) spectroscopy study of dry-cured ham treated with E-beam. Food Chemistry 133, 1530-157. Escudero, R., García-García, A.B., Cambero, M.I., Ordóñez, J.A., Romero de Ávila, M.D., Castejón, D. 2013. Viabilidad del análisis de exudados cárnicos por resonancia magnética nuclear (RMN) para el estudio de carne tratada con electrones acelerados. Congreso Internacional de Seguridad Alimentaria. ACO- FESAL, Madrid. Ganan, M., Hierro, E., Hospital, X.F., Barroso, E., Fernández, M. 2013. Use of pulsed light to increase the safety of ready-to-eat cured meat products. Food Control 32, 512-517. García-Márquez, I., Cambero, M.I., Ordóñez, J.A., Cabeza, M.C. 2012a. Shelf-life extension and sanitation of fresh pork loin by E-beam treatment. Journal of Food Protection 75, 2179-2189. García-Márquez, I., Escudero, R.M., de la Hoz, L., Ordóñez, J.A., Cambero M.I.; Lozada, J.J. Santos-Delgado, M.J., Polo-Díez, L.M. 2010. Cholesterol oxides in irradiated raw and marinated pork loin. 3rd EuChems Chemistry Congress, Nürnberg. García-Márquez, I., Narváez-Rivas, M., Gallardo, E., Cabeza, M.C., León-Camacho, M. 2013. Changes in the phospholipid fraction of intramuscular fat from pork loin (fresh and marinated) with different irradia- tion and packaging during storage. Grasas y Aceites 64, 7-14. García-Márquez, I., Ordóñez, J.A., Cambero, M.I. y Cabeza, M.C. 2012b. Use of E-beam for shelf-life exten- sion and sanitizing of marinated pork loin. International Journal of Microbiology 2012:962846 doi: 10.1155/2012/962846. Hereu, A., Dalgaard, P., Garriga, M., Aymerich, T., Bover-Cid, S. 2012a. Modeling the high pressure inacti- vation kinetics of Listeria monocytogenes on RTE cooked meat products. Innovative Food Science and Emerging Technologies 16, 305-315 Hereu, A., Dalgaard, P., Garriga, M., Aymerich, T., Bover-Cid, S. 2012b. Modeling the growth response of Listeria monocytogenes on RTE cooked meat products after high pressure processing. 23rd Internatio- nal ICFMH Symposium. FoodMicro, Istanbul. Herrero, A.M., Castejón, D., Hoz, L., Ordóñez, J.A., Cambero, M.I. 2010. Imagen de Resonancia magnética nuclear de salmón ahumado tratado con electrones acelerados. CESIA-CIBSA 2010. VI Congreso Es- pañol de Ingeniería de Alimentos, Logroño. Hierro, E., Barroso, E., de la Hoz, L., Ordóñez, J.A., Manzano, S., Fernández, M. 2011. Efficacy of pulsed light for shelf-life extension and inactivation of Listeria monocytogenes on ready-to-eat cooked meat products. Innovative Food Science and Emerging Technologies 12, 275-281. Hierro, E., Ganan, M., Barroso, E., Fernández, M. 2012. Pulsed light treatment for the inactivation of selec- ted pathogens and the shelf-life extension of beef and tuna carpaccio. International Journal of Food Microbiology 158, 42-48. Hoz, L., Cambero, M.I., Cabeza, M.C., Herrero, A.M., Ordóñez, J.A. 2008 Elimination of Listeria monocyto- genes from vacuum-packed dry-cured ham by E-beam irradiation. Journal of Food Protection 71, 2001-2006. ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Foods). 2004. Microorganismos de los Alimentos 7. Análisis microbiológico en la gestión de la seguridad alimentaria. Ed. Acribia. Zaragoza. Jofré, A., Aymerich, T., Valdivia, E., Garriga, M. 2011. Control de L. monocytogenes en jamón cocido lon- cheado mediante la aplicación combinada de enterocinas y alta presión hidrostática. 5ª Reunión de la Red Temática de BAL, Logroño. Morales, P., Calzada, J., Ávila, M., Nuñez, M. 2008. Inactivation of Escherichia coli O157:H7 in ground beef by single-cycle and multiple-cycle high pressure treatments. Journal of Food Protection 71, 811-815. Morales, P., Calzada, J., Rodríguez, B., De Paz, M., Nuñez, M. 2009. Inactivation of Salmonella Enteritidis in chicken breast fillets by single-cycle and multiple-cycle high pressure treatments. Foodborne Pa- thogens and Disease 6, 577-581. Olmo, A., Morales, P., Nuñez, M. 2009. Bactericidal effect of lactoferrin and its amidated and pepsin diges- ted derivatives against Pseudomonas fluorescens in ground beef and meat. Ordóñez, J.A., Cabeza, M., de la Hoz, L., Cambero, M.I. 2007. Uso de radiaciones beta para conseguir el objetivo de seguridad alimentaria (FSO) en carne de pollo con respecto a Salmonella spp. Revista del Comité Científico de la AESAN 6, 67-87. Ortuño, C., Martínez Pastor, M.T., Mulet, A., Benedito, J. 2012a. An ultrasound-enhanced system for micro- bial inactivation using supercritical carbon dioxide. Innovative Food Science and Emerging Technolo- gies 15, 31-37.
- 102. 102 Mª Isabel Cambero, Gonzalo D. García de Fernando, Margarita Medina Ortuño, C., Martínez Pastor, M.T., Mulet, A., Benedito, J. 2012b. Supercritical carbon dioxide inactivation of Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae in different growth stages. Journal of Supercritical Fluids 63, 8-15. Rivas-Cañedo, A., Fernández-García, E., Nuñez, M. 2009a. Volatile compounds in fresh meats subjected to high pressure processing. Effect of the packaging material. Meat Science 81, 321-328. Rivas-Cañedo, A., Fernández-García, E., Nuñez, M. 2009b. Volatile compounds in dry-cured Serrano ham subjected to high pressure processing. Effect of the packaging material. Meat Science 82, 162-169. Rivas-Cañedo, A., Nuñez, M., Fernández-García, E. 2009c. Volatile compounds in Spanish dry-fermented sausage ‘salchichón’ subjected to high pressure processing. Effect of the packaging material. Meat Science 83, 620-626. Rivas-Cañedo, A., Juez-Ojeda, C., Nuñez, M., Fernández-García, E. 2011a. Effects of high pressure proces- sing on the volatile compounds of sliced cooked pork shoulder during refrigerated storage. Food Chemistry 124, 749-758 Rivas-Cañedo, A., Juez-Ojeda, C., Nuñez, M., Fernández-García, E. 2011b. Volatile compounds in ground beef subjected to high pressure processing. A comparison of dynamic headspace and solid-phase microextraction. Food Chemistry 124, 1201-1207. Rivas-Cañedo, A., Juez-Ojeda, C., Nuñez, M., Fernández-García, E. 2012. Volatile compounds in low-acid fermented sausage “espetec” and sliced cooked pork shoulder subjected to high pressure processing. A comparison of dynamic headspace and solid-phase microextraction. Food Chemistry 132, 18-26.
- 103. CAPÍTULO VII Programa de formación. Resultados del máster y del curso internacional Mar Rodríguez Facultad de Veterinaria (UEx). Cáceres Filiberto Sánchez Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (IRTA). Monells (Girona) Jesús Ventanas Facultad de Veterinaria (UEx). Cáceres 1. Introducción El Programa de Formación del proyecto Consolider CARNISENUSA, por su carácter singular y ser el único específico del sector cárnico, se ha convertido en una de las señas de identidad de dicho proyecto. Ha contribuido de una manera destacada a la visibilidad del mismo, al flujo de ideas entre investigadores (y entre investigadores y técnicos de empresas) pero, especialmente, a la transferencia del importante pool de conocimientos generados sobre la calidad y seguridad de la carne y productos cárnicos a más de 200 profesionales, investigadores y técnicos que lo han cursado. Aunque las opciones que ofrece el Programa de Formación, el Curso Internacional de IRTA-Monells y el Máster de la Facultad de Veterinaria de Cáceres, se dictaban antes del inicio del proyecto (en el 2002 el curso y en 1992 el máster). La inclusión de los mismos en el proyec- to CARNISENUSA los ha convertido en las propuestas formativas de referencia en el ámbito del sector cárnico, que es nuestra primera industria del sector agroalimentario. Con su acreditación por la ANECA (2009), se ha logrado su consolidación definitiva, lo que garantiza su continuidad. Cuentan con un fuerte respaldo institucional, y una demanda creciente, que deriva de los con- tenidos que han sido cuidadosamente elegidos y de los excelentes recursos humanos y materia- les de que disponen, lo que permite ofrecer una formación idónea y de alto nivel para quienes deseen especializarse ó actualizar sus conocimientos en esta materia. Cabe destacar, además, la complementariedad entre ambas acciones; el máster se dirige más hacia la formación de investigadores (integrado en un Programa de Doctorado de Ciencia de los Alimentos con mención de calidad), de profesionales que trabajan en la administración pública en seguridad alimentaria o en docencia, y de tecnólogos vinculados a Departamentos de I+D ó de Calidad de empresas del sector y Consultorías. Por su parte, el curso internacional prepara técnicos y jefes de producción para la industria cárnica y auxiliares (maquinaria, servicios) y tiene un fuerte compromiso con la preparación de titulados iberoamericanos a través de la co- laboración con la Agencia Española de Cooperación Internacional para el Desarrollo (AECID). Una vez expuestos los antecedentes, objetivos y contenidos del programa de formación, procede ahora hacer una valoración de los resultados tanto del Máster como del Curso Interna- cional, desde el punto de vista del destino de los egresados (Figura 1) y su grado de satisfacción con la formación recibida.
- 104. 104 Mar Rodríguez, Filiberto Sánchez, Jesús Ventanas 2. Resultados de satisfacción e inserción laboral del Máster en Ciencia y Tecnología de la Carne Durante el curso 2012-2013 se está cursando la VII edición del Máster en Ciencia y Tecnolo- gía de la Carne, durante los siete cursos que ya han transcurrido desde que se inició el máster, se ha ofrecido a los alumnos amplios conocimientos relacionados con la carne y productos cár- nicos haciendo especial énfasis en los avances que se iban produciendo en esta temática, gracias a la colaboración de profesores de varias universidades, organismos públicos de investigación, centros tecnológicos y destacados profesionales tanto del sector industrial cárnico como de la administración. Uno de los aspectos que permite garantizar la calidad de este máster es el reducido número de alumnos admitidos por curso académico, ya que el límite está fijado en 15, lo que asegura una enseñanza muy personalizada y permite al alumno un mayor aprovechamiento de las clases. A lo largo de estos cursos, se ha podido comprobar el interés que despertaba el máster tanto en estudiantes recién licenciados, como en personal procedente de las industrias cárnicas, la inves- tigación e investigadores. Este interés ha sido cuantificado por el alto número de preinscripcio- nes realizadas durante cada curso académico (más del doble de las plazas ofertadas), lo que condujo a aplicar estrictos sistemas de selección priorizando las solicitudes en función del currí- culum académico (50%), experiencia profesional en empresas relacionadas con el sector cárnico (30%) y otros méritos declarados por los solicitantes (20%). Para determinar, con objetividad, el éxito y la viabilidad de una titulación es necesario por un lado, saber el grado de satisfacción de los estudiantes con la docencia e información recibidas y, por otro, conocer el perfil de egreso de los titulados. Para ello, la Universidad de Extremadura ha desarrollado una normativa de funcionamiento de las Comisiones de Calidad de las Titulaciones, donde se recogen las pautas para velar por la garantía de calidad de la titulación. Entre las prue- bas objetivas que se han llevado a cabo por la Comisión de Calidad del Máster en Ciencia y Figura 1. Esquema de las condiciones de acceso, orientación y entidad de la formación y actividad que desarrollan los titulados del Máster y del Curso Internacional.
- 105. Programa de formación. Resultados del máster y del curso internacional 105 Tecnología de la Carne creada en el curso 2010, está una encuesta de satisfacción de cada una de las asignaturas del máster, que se realiza de forma voluntaria por los alumnos, antes de la finalización del curso académico. De los resultados obtenidos con estas encuestas de satisfac- ción, se puede afirmar que, en una escala de 4 opciones (totalmente satisfecho, satisfecho, insa- tisfecho y completamente insatisfecho), el 95% de los estudiantes han respondido estar “total- mente satisfecho” o “satisfecho” con los contenidos de las asignaturas que han cursado y han considerado que han sido útiles para mejorar su formación. Además, otro de los parámetros de calidad que se ha podido valorar es la comprobación de que los estudiantes han alcanzado los objetivos planteados y, quizás, el indicador de mayor im- pacto ha sido la inserción laboral de los estudiantes egresados que más adelante se comenta. Se ofrece a continuación un breve resumen de los resultados obtenidos con la encuesta realizada entre los alumnos que han finalizado una de las cuatro últimas ediciones del Máster en Ciencia y Tecnología de la Carne. Durante estos últimos cuatro cursos en los que el máster ha coincidido con el desarrollo del proyecto CARNISENUSA, el número de alumnos formados ha sido de 60, correspondien- do al número máximo de admitidos (15 alumnos/curso). La encuesta se envió por correo electrónico a todos los alumnos durante el primer trimestre del año 2013 y fue cumplimenta- da por el 43,3% de los titulados. El 57,7% de los egresados que rellenaron la encuesta eran titulados que, en el momento de la matriculación en el máster se encontraban ya trabajando, aunque el 2,9% de ellos no tiene trabajo en la actualidad. Esto puede suponer una pequeña distorsión de los resultados, pues no representa la realidad de cada curso académico en el que de los 15 alumnos matriculados, solo entre el 13% y el 33% estaban ya trabajando, sien- do el resto alumnos recién licenciados. De todas formas, como se puede ver en la tabla 1, el porcentaje de titulados en el Máster en Ciencia y Tecnología de la Carne que se encuentran trabajando en la actualidad supera el 80%. Por tanto, y respecto a la situación al inicio del máster, se ha incrementado notablemente el porcentaje de egresados que se encuentran tra- bajando. Además, la actividad profesional de estos titulados está, en una gran proporción, estrechamente relacionado con la desarrollada en el máster, como refleja los resultados de la encuesta (Tabla 1). Tabla 1. Resultados obtenidos a las principales cuestiones de la encuesta ¿Estabas trabajando durante la realización del máster? SI NO Número Porcentaje Número Porcentaje Total 15 57,7 11 42,3 Actualmente ¿estás trabajando? SI NO Número Porcentaje Número Porcentaje Total 21 80,8 5 19,2 En caso afirmativo ¿el trabajo está relacionado con el máster? SI NO Número Porcentaje Número Porcentaje Total 14 66,7 7 33,3 En caso negativo ¿el máster te sirve para buscar trabajo? SI NO Número Porcentaje Número Porcentaje Total 4 80 1 20
- 106. 106 Mar Rodríguez, Filiberto Sánchez, Jesús Ventanas En la figura 2 se muestran las actividades que actualmente desarrollan los egresados, pudiéndose observar que el 52,4% se encuentra ejerciendo su labor en la Universidad reali- zando su tesis doctoral y el resto se distribuye principalmente entre la industria cárnica y la administración. Figura 2. Actividades de trabajo de los titulados en el Máster en Ciencia y Tecnología de la Carne. La encuesta realizada a los alumnos pretendía, por otra parte, obtener información acerca de la publicación de trabajos científicos y aportaciones a congresos que hubieran sido realizados por estos titulados, derivados principalmente del Trabajo de Fin de Máster que regladamente todos han tenido que realizar. En esta titulación el trabajo está enfocado especialmente al desa- rrollo de una investigación puntual para que el alumno consiga una serie de competencias que pueden ser importantes para su inserción laboral (Tabla 2). Un total del 46,2% de los titulados encuestados, habían logrado realizar la publicación de algún trabajo científico o comunicación en congresos, aunque es cierto que entre ellos se encontraban principalmente aquellos titulados que estaban trabajando en la universidad. Tabla 2. Competencias a conseguir con la realización del Trabajo de Fin de Máster en la ti- tulación del Máster en Ciencia y Tecnología de la Carne 1. Conocer la metodología de la investigación científica en Ciencia y Tecnología de la Carne. 2. Conocer el manejo de técnicas de laboratorio relacionados con la carne y los productos cárnicos. 3. Ser capaces de abordar un trabajo de investigación sobre problemas actuales de la industria cárnica. 4. Saber analizar los datos obtenidos y saber presentar los resultados y conclusiones de los mismos. 3. Resultados de participación y aceptabilidad del Curso Internacional En la tabla 3 se muestra la evolución del número de alumnos del curso según su proceden- cia geográfica y actividad. Se aprecia como el número de alumnos españoles ha permanecido estable, a excepción del año 2010 en que se registró el número más bajo de matriculados. Res- pecto a los alumnos de Latinoamérica, el descenso observado en el año 2012 se debió a que en ese año, el curso no formó parte del Programa Iberoamericano de Formación Técnica Especiali- zada (PIFTE) de la AECID.
- 107. Programa de formación. Resultados del máster y del curso internacional 107 El Curso Internacional en Tecnología en Productos Cárnicos ha acogido a profesionales de las áreas de dirección, investigación y desarrollo, producción, calidad y ventas vinculadas con la industria cárnica u otras relacionadas con éstas. Los alumnos procedentes de Latinoamérica han mostrado interés por todos los módulos, mientras que en el caso de los alumnos españoles, los módulos a los que mayoritariamente han asistido han sido los tres dedicados a las tecnologías de elaboración de productos cárnicos frescos, cocidos y curados, donde las aproximadamente 50 horas de prácticas han brindado a los alumnos una oportunidad única de adquirir habilidades en la fabricación de más de tres decenas de diferentes productos cárnicos en la planta piloto del IRTA-Monells. Después de las cárnicas, las empresas dedicadas a la fabricación y comercializa- ción de aditivos han sido las empresas que más alumnos han aportado al curso. La aceptabilidad del curso se ha evaluado mediante diferentes cuestionarios: a) Cuestionario sobre profesores. Al finalizar cada módulo, los alumnos puntuaron, con una escala de 0 a 5, los siguientes aspectos relacionados con la calidad de la formación aportada por cada profesor: calidad de la presentación, aplicabilidad de la materia y documentación. Los resultados de las 5 últimas ediciones oscilaron entre 4,5 y 4,7, es decir, una puntuación que en la escala clásica de 10 puntos se consideraría como sobresaliente. b) Cuestionario sobre aspectos puntuales referentes a la organización. En este cuestionario se incluían cuestiones relacionadas con aspectos logísticos, como el cumplimiento de horarios, trato por parte del personal, disponibilidad de profesores, etc. Este cuestionario se cumplimentaba el último día de asistencia al curso. Los resultados de las 5 últimas ediciones oscilaron entre 4,5 - 4,7 sobre un máximo de 5, del mismo nivel que el del bloque anterior de la encuesta. Tabla 3. Evolución de los alumnos según su procedencia geográfica y actividad Origen 2008 2009 2010 2011 2012 Total Administración España 5 1 2 8 Portugal y Latinoamérica 4 6 5 6 21 Universidades y centros I+D España 1 1 1 3 Portugal y Latinoamérica 12 13 15 15 55 Empresas cárnicas España 14 10 13 18 16 71 Portugal y Latinoamérica 11 4 7 2 24 Empresas de maquinaria, aditivos y auxiliares España 4 7 3 5 10 29 Portugal y Latinoamérica 1 1 1 1 2 6 Otros España 2 3 5 Portugal y Latinoamérica 4 4 1 9 Total España 23 27 18 27 29 124 Portugal y Latinoamérica 28 24 21 30 4 109
- 108. 108 Mar Rodríguez, Filiberto Sánchez, Jesús Ventanas c) Satisfacción global del curso. El último día de asistencia al curso, se le pedía al alumno que evaluara el grado de satisfac- ción global entre 0 y 10. Los resultados de las 5 últimas ediciones estaban entre 8,5 y 9,5. Resumiendo, los cuestionarios han revelado un alto grado de satisfacción por parte del alumnado, tanto en los contenidos como en su gestión. En ambos aspectos se ha aplicado el principio de mejora continua a lo que ha contribuido de manera importante las observa- ciones aportadas por el alumnado. Por otra parte, el curso ha supuesto un punto de encuen- tro idóneo para establecer relaciones profesionales perdurables entre las entidades y empre- sas de procedencia de alumnos y profesores.
- 109. Capítulo VIII Desarrollo de metodología y estrategias para garantizar la seguridad alimentaria en la industria cárnica Alicia Rodríguez, Mar Rodríguez, Victoria Bernáldez y Juan José Córdoba Higiene y Seguridad Alimentaria. Facultad de Veterinaria (UEx). Avda. de la Universidad s/n. 10003 Cáceres José Antonio Risquez Cooperativa Ganadera del Valle de los Pedroches (COVAP). Calle Mayor, 56, 14400 Pozoblanco, Córdoba Luis Polo Mataderos Industriales Soler S.A. (Prolongo)/Frigoríficos Andaluces de Conservas de Carne S.A. (FACCSA), Plaza Prolongo 1-2. 29580 Cártama Estación (Málaga) M.ª Concepción Cabeza Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos. Facultad de Veterinaria (UCM). Ciudad Universitaria. 28040 Madrid Rosa García Centro de Investigación y Calidad Agroalimentaria del Valle de los Pedroches (CICAP). Pozoblanco, Córdoba 1. Introducción El consumo de carne y productos cárnicos sigue causando problemas de infecciones e in- toxicaciones alimentarias debidas a la presencia de microorganismos patógenos. Así, en el últi- mo informe de la Agencia Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA, 2013) sobre infecciones e intoxicaciones de origen alimentario, el consumo de carne y productos cárnicos de diferentes especies (vacuno, cerdo, pollo y otras especies) supone el 15,5% de los casos provocados por el consumo de alimentos. Entre los microorganismos más preocupantes por su patogenicidad y carácter de psicrotrofo es, sin duda, Listeria monocytogenes. Es bien sabido, además, que esta bacteria puede acanto- narse y sobrevivir durante mucho tiempo en diferentes nichos ecológicos de los equipos (juntas, válvulas, recodos, soldaduras ásperas), recipientes, utensilios, paredes, tabiques y suelos, guan- tes y delantales de los manipuladores y superficies diversas, como las de trabajo que van a estar en contacto directo con los alimentos. A partir de esta fuente de contaminación, la bacteria puede acceder al alimento de forma directa, por contacto, o indirecta, suspendidas en aerosoles o gotitas de condensación. Además de L. monocytogenes en carne y productos cárnicos preocu- pan otros patógenos como Salmonella spp., Yersinia enterocolítica, Campylobacter spp. y Esche- richia coli O157:H7, a lo que hay que añadir el peligro en productos madurados derivado de la presencia de estafilococos productores de enterotoxinas y mohos productores de micotoxinas (Núñez y col., 1996; Lizaso y col., 1999; Portacarrero y col., 2002; Sosa y col., 2002).
- 110. 110 A. Rodríguez, M. Rodríguez, V. Bernáldez, J. A. Risquez, L. Polo, C. Cabeza, R. García, J. J. Córdoba La situación es, pues, preocupante. No obstante, en los procesos de elaboración se están aplicando acciones tendentes a reducir la contaminación de microorganismos patógenos funda- mentadas, entre otras medidas, en la correcta aplicación de Buenas Prácticas Higiénicas y ade- cuados programas de limpieza y desinfección. Además, es necesario minimizar el desarrollo de los microorganismos patógenos durante los procesos de elaboración mediante la aplicación de medidas preventivas basadas en el almacenamiento en temperatura inferior al límite de creci- miento de estos patógenos, la reducción de la actividad de agua de los productos durante el proceso de elaboración y la utilización de envasado en atmósferas modificadas o de cultivos protectores, entre otras. Igualmente la utilización de métodos de eliminación de patógenos ba- sados en la aplicación de modernas tecnologías como tratamientos con electrones acelerados o altas presiones pueden ser de una gran utilidad para conseguir carne y productos cárnicos libres de microorganismos patógenos. Además hay que dotar a los sistemas de control de las industrias cárnicas basados como el APPCC de técnicas analíticas rápidas y sensibles de apoyo que permitan la detección de microor- ganismos patógenos en las diferentes fases del proceso de elaboración de los productos y en los productos finales, que puedan ser utilizadas tanto en la monitorización como en la verificación. Estas técnicas permitirían detectar contaminaciones de microorganismos patógenos en materias primas y productos en proceso, pudiendo de esta forma adoptarse soluciones rápidas (medidas correctoras) sobre el destino de estos productos en proceso. Entre los métodos más prometedores está el de la reacción en cadena de la polimerasa. Esta metodología permite la detección de patógenos mediante la PCR convencional e incluso la cuan- tificación mediante la PCR en tiempo real. La utilización de la PCR como técnica rápida de de- tección de patógenos en alimentos no se ha explotado hasta el momento de una forma signifi- cativa debido a la falta de protocolos validados y de utilidad a la industria. La industria cárnica necesita pues la transferencia de los resultados de investigación en forma de medidas preventivas eficaces en el control de microorganismos patógenos, modernas tecnologías de eliminación de patógenos y métodos de detección de patógenos precisos y realistas con el objetivo final de innovar en la garantía sanitaria de los productos que están elaborando. En este trabajo se describen algunas estrategias conjuntas desarrolladas entre investigadores del proyecto CARNISENUSA e industrias cárnicas españolas con el objetivo de la transferencia de los resultados de investigación del proyecto al sector industrial. 2. Higienización de productos cárnicos por tecnologías no térmicas La aplicación de las tecnologías encuadradas bajo el término de no térmicas afecta princi- palmente a los productos listos para su consumo (RTE) que se envasan en raciones individuales o familiares y se consumen directamente. La preparación de alimentos RTE conlleva una serie de manipulaciones (desde las manuales, como el loncheado de jamón a mano, hasta el lon cheado con equipos sofisticados en que la intervención del operario es prácticamente nula). No obstante, aunque se guarden estrictas normas de buenas prácticas de fabricación, no es posible asegurar que los microorganismos del entorno, no alcancen los alimentos RTE durante su elabo- ración. De hecho, se ha observado que lonchas de jamón cocido y bacon tenían una incidencia mayor de L. monocytogenes que los mismos productos antes del loncheado, lo que indica una contaminación durante esta operación o la de reenvasado (Zhu y col 2005). La posible multiplicación de L. monocytogenes en productos cárnicos con aw 0,92 y la mera presencia de este microorganismo en productos con aw 0,92 en aquellos países donde rige el criterio de “tolerancia cero” para esta bacteria, permite deducir que la higienización de produc- tos cárnicos RTE conllevaría un beneficio sanitario y comercial. Esta acción apremia si se tiene en cuenta el notable incremento que se ha producido en la exportación de productos cárnicos emblemáticos, como el jamón curado. Como ejemplo, pueden citarse las exportaciones de ja-
- 111. Desarrollo de metodología y estrategias para garantizar la seguridad alimentaria... 111 món curado deshuesado (la gran mayoría como producto RTE) que pasaron de 1.023 Tm en 2011 a 16.280 Tm de Enero a Septiembre de 2012 (CONFECARNE – ANICE, 2013), es decir, el aumento fue espectacular, multiplicándose por un factor de 16 en el periodo mencionado. Como en los productos RTE ya envasados no pueden aplicarse tratamientos térmicos pas- teurizantes, es necesario recurrir a tecnologías no térmicas para su higienización. Entre ellas, las más adecuadas quizás sean los electrones acelerados (u otra modalidad de radiación ionizante), las altas presiones hidrostáticas (APH) y los pulsos de luz. En el capítulo VI de esta obra se dis- cute la aptitud de cada una de estas tecnologías (Cambero y col., 2013). Baste decir aquí que los pulsos de luz están aún en estudio y son los electrones acelerados (E-beam) o las APH las que actualmente se pueden transferir a la industria. Una de las diferencias más destacada entre am- bas tecnologías es la cinética de muerte (Figura 1, izquierda). La respuesta de la muerte de mi- croorganismos frente a los E-beam se ajusta al curso de una reacción de primer orden y puede, por tanto, optimizarse su eficacia sin dificultad alguna. En cambio, la cinética de muerte por APH no rinde una línea recta al representar, a presión constante, el logaritmo del número de super- vivientes en función del tiempo de presurización sino que típicamente son graficas bifásica con “colas” largas finales que, a veces, se hacen asintóticas al eje de abscisas (Figura 1, derecha). Por tanto, no se ajusta a una ecuación de primer grado y, en consecuencia, no se puede definir en términos de reducciones decimales y es necesario expresar la destrucción de microorganismos en otros términos, habitualmente en descenso, en términos logarítmicos, del número de ufc, lo que requiere estudios detallados para la optimización del proceso en diferentes productos. No obstante, las altas presiones ya se están aplicando, mientras que la higienización mediante E-beam requiere autorización de las autoridades competentes para su uso. En este libro se deta- llan ampliamente los estudios realizados con ambas tecnologías para la higienización de produc- tos RTE (Cambero y col., 2013). Adicionalmente, merece la pena mencionar que a propuesta de la industria FACCSA-PROLONGO se realizaron investigaciones para conocer la eficacia de los E-beam con el fin de aumentar la vida útil de lomo fresco y adobado refrigerados. Los resultados han quedado recogidos en dos artículos (García Márquez y col, 2013 a, b). pudiéndose decir que es un método eficaz para prolongar la vida útil de los productos mencionados. Figura 1. Cinética de muerte típica de L. monocytogenes frente a tratamientos con E-beam (izquierda) y altas presiones hidrostáticas (derecha). 3. Combinación de estrategias basadas en la utilización de cultivos protectores de mohos no toxigénicos y de técnicas de control de la implantación de estos mohos en los pro- ductos cárnicos Durante el proceso de elaboración de los productos cárnicos madurados, las condiciones de temperatura y humedad relativa que se alcanzan favorecen el desarrollo de una abundante población de mohos entre los cuales pueden encontrarse algunas cepas productoras de mico-
- 112. 112 A. Rodríguez, M. Rodríguez, V. Bernáldez, J. A. Risquez, L. Polo, C. Cabeza, R. García, J. J. Córdoba toxinas. En los productos cárnicos madurados se han aislado con frecuencia mohos productores de ocratoxina A (OTA) (Iacumin y col., 2009; Rodríguez y col., 2012a), micotoxina clasificada por la Agencia Internacional de Investigación sobre el Cáncer (IARC) en el grupo 2B como sustancia potencialmente carcinogénica para el ser humano (IARC, 1993). Además se ha demostrado que la presencia de estos mohos supone un peligro de acumulación de OTA en dichos productos (Rodríguez y col., 2012a; 2012b), con el consiguiente riesgo sanitario para la salud del consumi- dor. Además se ha demostrado en jamón curado que la presencia de mohos productores de aflatoxinas puede conducir también a la acumulación de alguna de estas micotoxinas (Rodríguez y col., 2012a). Para evitar la formación de OTA y aflatoxinas en este tipo de productos, se requieren estra- tegias específicas para reducir e incluso eliminar la incidencia de los mohos productores de estas micotoxinas durante el procesado. Entre estas estrategias, están las de biocontrol basada en la utilización de cultivos protectores de mohos no toxigénicos que inhiban el desarrollo de los mohos productores de micotoxinas. La utilización de estos cultivos protectores además de favorecer las características sensoriales del producto podría evitar el desarrollo en dichos pro- ductos cárnicos de una población de mohos no controlada y heterogénea entre la cual podrían encontrarse mohos productores de aflatoxinas y OTA (Ludemann y col., 2010). En este sentido, se han utilizado cepas no toxigénicas de las especies Penicillium nalgiovense y Penicillium chrysogenum como cultivos protectores en determinados productos cárnicos madurados (Pa- pagianni y Papamichael, 2007; Castellari y col., 2010). Sin embargo su utilización no es habitual en la elaboración de la mayoría de los productos cárnicos madurados. Entre las posibles causas del bajo índice de utilización de los cultivos protectores de mohos no toxigénicos está el hecho de que no está totalmente probada su efecto inhibidor sobre las cepas toxigénicas, especial- mente a nivel industrial, y la dificultad para poder cuantificar el grado de implantación de los cultivos protectores en los productos durante la maduración, utilizando los métodos tradiciona- les de cultivo en placa. Sin embargo, los avances obtenidos en el desarrollo de métodos de PCR en tiempo real (qPCR) para cuantificar mohos toxigénicos y mohos no toxigénicos utilizados como cultivos protectores, podrían ser una alternativa eficaz para cuantificar en la industria de forma precisa, sencilla y rápida, la implantación del cultivo protector y su eficiencia en el con- trol de los mohos toxigénicos (Rodríguez y col. 2011a, 2011b, 2012a, 2012b, 2012c, 2012d, 2012e, 2012f, 2012g y 2012h). Las industrias Cárnicas COVAP y FACCSA-PROLONGO han parti- cipado en el desarrollo y aplicación a nivel industrial en sus instalaciones de cultivos protecto- res de mohos no toxigénicos y en el control de su implantación mediante técnicas modernas (qPCR). 4. Estrategia de biocontrol de mohos toxigénicos en jamón curado mediante el uso de un cultivo protector de P. chrysogenum La mayoría de las cepas de P. chrysogenum que se han encontrado en el jamón curado a lo largo del proceso de maduración no son toxigénicas (Núñez y col. 1996). Además se ha demos- trado que dichas cepas favorecen el desarrollo del sabor y el aroma en el jamón curado (Martín y col., 2004, 2006). Incluso algunas de estas cepas no toxigénicas producen compuestos antifún- gicos que actúan inhibiendo el desarrollo de mohos toxigénicos. Este es el caso de la cepa RP42 de P. chrysogenum seleccionada por el grupo de Higiene y Seguridad Alimentaria de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Extremadura, que ha demostrado tener una gran actividad antifúngica (Rodríguez-Martín y col., 2010), por lo que puede ser de gran interés su utilidad como cultivo protector en el control de mohos productores de las micotoxinas más preocupan- tes en jamón curado como son OTA y aflatoxinas. Como proyecto de transferencia a la industria se ha evaluado el potencial de la cepa RP42C en el control de mohos productores de OTA y aflatoxinas en jamón curado a nivel industrial. Además se ha valorado la eficacia de un método de qPCR desarrollado para comprobar la im- plantación a lo largo del procesado de elaboración de jamón curado del cultivo protector.
- 113. Desarrollo de metodología y estrategias para garantizar la seguridad alimentaria... 113 4.1. Control de mohos productores de aflatoxinas El efecto protector del cultivo protector de P. chrysogenum RP42C se evaluó primero en condiciones controladas en lonchas de jamón curado donde se comprobó la implantación de P. chrysogenum RP42C sobre el crecimiento de la cepa de Aspergillus flavus CBS 573.65 producto- ra de aflatoxinas. Para ello, se inocularon por separado y conjuntamente ambas cepas a una concentración de 104 ufc/cm2 en dichas lonchas. A continuación, se incubaron durante 20 días, en condiciones de temperatura y humedad relativa similares a las del proceso de maduración de jamón curado (Figura 2). Con el objetivo de evaluar la implanta- ción en las lonchas de jamón de P. chryso- genum RP42C de forma sensible y rápida, se desarrolló un protocolo de qPCR múlti- ple que permitiera detectar simultáneamen- te al moho utilizado como cultivo protector (P. chrysogenum RP42C) y al moho toxigé- nico (A. flavus CBS 573.65). Para ello se procedió en primer lugar al diseño de ceba- dores y sondas (F-Pc/R-Pc y P-Pc) utilizan- do el programa Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, USA) a partir de la secuencia del gen pgafp que codifica para la proteína antifúngica PgAFP (Rodrí- guez-Martín y col., 2010) para amplificar la cepa de P. chrysogenum RP42C (Bernáldez y col., 2013b) (Tabla 1). También se ensayaron las parejas de ce- badores F-omt/R-omt y las sondas de hidró- lisis OMTprobe (Rodríguez y col., 2012f), para la amplificación de mohos productores de afla- toxinas. Finalmente, se utilizó un control interno de amplificación (IAC) no competitivo cuyos cebadores y sondas (TubF1/TubR1 y Tubprobe) están diseñados a partir del gen de la β-tubuli- na para cuantificar la presencia de población fúngica (Rodríguez y col., 2012c). A continuación, se optimizó el protocolo de qPCR triple basado en la metodología TaqMan, para la detección y cuantificación simultánea del cultivo protector y de mohos productores de aflatoxinas con un IAC no competitivo. Tabla 1. Secuencia de nucleótidos de los cebadores y sondas utilizadas para los ensayos de qPCR para detectar y cuantificar el gen pgafp de P. chrysogenum productor de pép- tidos antifúngicos. Se especifica también el tamaño del producto de qPCR esperado Nombre del cebador / sonda Secuencia de nucleótidos (5’-3’) Tamaño del producto (pb) Posición dentro del gena FPc CAGATCACCAGCATTGCCA 73 4 RPc CTCGGGCATCAAGATCGTCC 75 PPc [FAM]-CATCGCGAGGGAGTC-[TAMRA] 60 a posición en relación con la secuencia del gen pgafp de P. chrysogenum RP42C (Rodríguez-Martín y col., 2010; Bernáldez y col., 2013b) El método de qPCR demostró ser muy específico dado que sólo hubo amplificación de los cebadores específicos cuando se ensayaron las cepas productoras de aflatoxinas o la cepa de P. chrysogenum RP42C, observándose amplificación siempre por parte del IAC. En la determinación de la sensibilidad a partir de las lonchas de jamón curado inoculadas artificial- Figura 2. Lonchas de jamón curado una vez depositado el inóculo en recipientes previamente esterilizados. En el fondo del recipiente se introdujo una solución salina sobresaturada de cloruro potásico (aw = 0,84) para controlar con el recipiente cerrado la humedad relativa ambiental
- 114. 114 A. Rodríguez, M. Rodríguez, V. Bernáldez, J. A. Risquez, L. Polo, C. Cabeza, R. García, J. J. Córdoba mente, las curvas estándar mostraron pendientes de -3,16; -3,08 y -3,27 cuando se amplificó P. chrysogenum RP42C, mohos productores de aflatoxinas y el IAC no competitivo, respecti- vamente. Por tanto, el método mostró valores de eficiencia en el rango óptimo descrito por Fredlund y col. (2008) en métodos de qPCR utilizados en la cuantificación de mohos. El mé- todo mostró una alta sensibilidad dado que el límite de detección es de 102 ufc/cm2 para la cepa productora de péptidos antifúngicos y 103 ufc/cm2 para la cepa productora de aflatoxi- nas (Bernáldez y col., 2013b). El desarrollo del cultivo protector y de la cepa toxigénica de A. flavus en las lonchas de jamón se evaluó también mediante el recuento en placas de Agar Extracto de Malta para comparar con los resultados obtenidos mediante el método de qPCR múltiple desarrollado. Al evaluar el efecto de la cepa productora de péptidos antifúngicos P. chrysogenum RP42C frente a la cepa de A. flavus CBS 573.65 productora de aflatoxinas en lonchas de jamón inocula- das artificialmente, se observó un mayor crecimiento de la cepa protectora frente a la cepa pro- ductora de aflatoxinas (Figura 3), cuando ambas cepas fueron inoculadas conjuntamente (Ber- náldez y col., 2013b). Estos resultados confirman el efecto protector de la cepa P. chrysogenum RP42C frente a mohos productores de aflatoxinas. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Control Inoculadas con P. chrysogenum Inoculadas con A. flavus Inoculadas con P. chrysogenum y A. flavus Logufc/cm2 Lotes de lonchas de jamón Recuento total de mohos Recuentos de P. chrysogenum Recuentos de A. flavus Figura 3. Recuento en ufc/cm2 de las lonchas inoculadas con P. chrysogenum RP42C frente a A. flavus CBS 573.65 mediante el método qPCR múltiple desarrollado (Bernáldez y col., 2013b). Finalmente, el efecto del cultivo protector frente a mohos productores de aflatoxinas se ensayó a nivel industrial en jamón curado. Para ello, se utilizó un lote de 5000 jamones que estaban siguiendo su proceso de elaboración en la industria (final de post-salado). La mitad de estos jamones se inocularon con el cultivo protector de P. chrysogenum RP42C y la otra mitad de los jamones no se inoculó usándose como lote control. Ambos lotes se maduraron en las mismas condiciones siguiendo un procesado habitual de maduración de jamón de cerdo ibérico. Para controlar la implantación del cultivo protector se tomaron muestras de 25 jamones a los 9 meses de maduración de un área de 25 cm2 y 1 cm de profundidad utilizan- do una plantilla metálica estéril, esta porción de muestra incluía parte de los músculos Semi- membranoso y Gracilis. El micelio superficial de las muestras se recuperó en su totalidad con una cuchilla de acero estéril y se usó para la determinación del recuento de mohos en placa
- 115. Desarrollo de metodología y estrategias para garantizar la seguridad alimentaria... 115 (ufc/cm2 ) y la parte sin micelio se utilizó para la extracción de micotoxinas y la posterior cuantificación mediante HPLC-MS. En el muestreo realizado a los nueve meses se observó crecimiento fúngico superficial de- tectándose el cultivo protector en niveles próximos a 105 ufc/cm2 en los jamones inoculados. En los jamones control no inoculados también se detectó P. chrysogenum RP42C aunque en niveles inferiores a los jamones inoculados. Probablemente este hecho se deba a una contami- nación a partir del aire de la cámara de maduración, dado que los jamones control y los inocu- lados con el cultivo protector se maduraron en la misma cámara. No se detectaron mohos productores de aflatoxinas ni producción de aflatoxinas en ninguno de los jamones inoculados y controles analizados. El cultivo protector controla el desarrollo de mohos productores de aflatoxinas evitando la acumulación de estas micotoxinas. Incluso la presencia del cultivo pro- tector en los jamones controles como consecuencia de contaminación puede ser suficiente para inhibir a los mohos productores de aflatoxinas. 4.2. Control de mohos productores de OTA En los jamones inoculados con el cultivo protector P. chrysogenum RP42C a nivel in- dustrial anteriormente indicado se evaluó también el efecto de esta cepa sobre los mohos productores de OTA. El muestreo se realizó como se indica en el apartado anterior: el mi- celio superficial de las muestras se recuperó en su totalidad con una cuchilla de acero es- téril y se usó para la determinación del recuento de mohos en placa (ufc/g) y la parte sin micelio se utilizó para determinar OTA mediante HPLC-MS. La cuantificación de la implan- tación de P. chrysogenum RP42C se realizó mediante una qPCR basada en la metodología SYBR Green utilizando los cebadores diseñados a partir de la secuencia del gen pgafp que codifica para la proteína antifúngica PgAFP (Rodríguez-Martín y col., 2010) descritos en el apartado anterior. Para la cuantificación de la presencia de mohos productores de OTA se utilizó la técnica de qPCR diseñada por Rodríguez y col. (2011b), y para comprobar la pre- sencia de ADN fúngico (control positivo) se utilizó el ensayo de qPCR diseñado a partir del gen de la β-tubulina basado en la metodología SYBR Green tal y como describen Rodrí- guez y col. (2012b). En los jamones inoculados con el cultivo protector tras 9 meses de maduración se detec- taron mohos productores de OTA aunque en niveles bajos siempre inferiores al considerado como de riesgo de acumulación de OTA (Rodríguez y col., 2012b). De hecho en ninguno de los jamones inoculados con la cepa RP42C se detectó OTA. Sin embargo, en el lote control no inoculado los niveles de mohos productores de OTA alcanzaron el nivel de 105 ufc/cm2 , si bien en general no superaron este límite considerado como de riesgo por la posible acumulación de OTA, probablemente por la presencia de la cepa RP42C que llegó a estos jamones a través de contaminación de la cámara. Este hecho probablemente influyó para que sólo en 5 de los jamones control muestreados se detectara OTA, mientras que en ninguno de los jamones ino- culados se detectó esta micotoxina. La presencia de P. chrysogenum controla a los mohos productores de OTA, incluso en los jamones control no inoculados la presencia por contami- nación de P. chrysogenum limita a los mohos productores de OTA hasta prácticamente inhibir la producción de esta micotoxina. Por tanto, la inoculación del cultivo protector permite con- trolar de forma eficaz y sencilla el posible riesgo sanitario derivado de la presencia de OTA en jamón curado. 5. Estrategia de biocontrol de mohos toxigénicos en embutidos crudos-curados mediante cultivo protector de P. nalgiovense Como proyecto de transferencia a la industria se pretendió evaluar a nivel industrial el po- tencial de la cepa comercial de P. nalgiovense TEXEL® PN1 sobre el control de mohos produc- tores de OTA en embutidos crudos-curados y en la posible acumulación de esta micotoxina durante la maduración.
- 116. 116 A. Rodríguez, M. Rodríguez, V. Bernáldez, J. A. Risquez, L. Polo, C. Cabeza, R. García, J. J. Córdoba 5.1. Evaluación del control de mohos productores de OTA mediante P. nalgiovense en una matriz cárnica madurada (lonchas de salchichón) Se evaluó el efecto de la cepa comercial de P. nalgiovense sobre el crecimiento de un moho productor de OTA y su posterior producción de la toxina en una matriz cárnica madurada. Para ello, en primer lugar, se inocularon por separado y de forma conjunta ambas cepas a una concen- tración de 104 ufc/cm2 en lonchas de salchichón con una superficie de 25 cm2 y un peso aproxi- mado de 5 g como sistema modelo de un producto cárnico madurado. Estas lonchas inoculadas se introdujeron en recipientes estériles donde se mantuvo la humedad relativa constante mediante una disolución saturada de sulfato potásico (aw = 0,94). A continuación, se incubaron hasta un máximo de 20 días en condiciones controladas de humedad relativa, esterilidad y temperatura. También se analizaron controles negativos a partir de lonchas de salchichón sin inocular e incuba- dos y tratados de la misma forma que las lonchas inoculadas. Se tomaron muestras a los 10 y 20 días. En estas muestras se determinó el recuento de ambos tipos mohos en medios de cultivo Agar Extracto de Malta y la implantación del cultivo protector mediante un método de qPCR diseñado a partir de la región ITS1-5.8S-ITS2 del ADN ribosomal de P. nalgiovense. La cuantificación del moho productor de OTA se realizó mediante el método de qPCR previamente diseñado por Rodrí- guez y col. (2011b) y la producción de OTA mediante la técnica cromatográfica de HPLC-MS. Las lonchas de salchichón inoculadas individualmente con P. nalgiovense TEXEL ® PN1 o P. verrucosum Pc4 productor de OTA mostraron a los 20 días de incubación recuentos mediante qPCR superiores a log 7 ufc/cm2 (Bernáldez y col., 2013a). No hubo diferencias significativas entre los anteriores recuentos por qPCR y los encontrados tras su cultivo en Agar Extracto de Malta. Se deduce de estos resultados que el cultivo protector de P. nalgiovense TEXEL ® PN1 y la cepa toxi- génica se desarrollan adecuadamente en las lonchas de salchichón cuando son inoculadas indivi- dualmente. Sin embargo cuando las lonchas fueron inoculadas conjuntamente con estas dos cepas de mohos, los niveles de P. verrucosum no superaron el nivel de log 2,5 ufc/cm2 mientras que P. nalgiovense alcanzó recuentos de hasta log 4,5 ufc/cm2 después de 20 días de incubación, ob- servándose que el efecto protector del cultivo protector era mayor cuanto mayor era el tiempo de incubación (Figura 4). Es evidente que las condiciones de maduración ensayadas, favorecen el desarrollo del cultivo protector, frente a la cepa productora de OTA, lo que adquiere una extraor- 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Control Inoculación con P. nalgiovense Inoculación con P. verrucosum Inoculación con P. verrucosum y P. nalgiovense Control Inoculación con P. nalgiovense Inoculación con P. verrucosum Inoculación con P. verrucosum y P. nalgiovense 10 días 20 días Recuento(logufc/cm2 ) Tratamiento y tiempo de incubación (días) P. nalgiovense P. verrucosum Figura 4. Recuento en ufc/cm2 de las lonchas de salchichón inoculadas con P. nalgiovense TEXEL ® PN1 frente a P. verrucosum Pc4 mediante los métodos de qPCR para la cuantificación de P. nalgiovense a partir de la región ITS1-5.8S-ITS2 del ADN ribosomal y de mohos productores de OTA (Rodríguez y col., 2011b).
- 117. Desarrollo de metodología y estrategias para garantizar la seguridad alimentaria... 117 dinaria relevancia para demostrar la utilidad de este cultivo protector de P. nalgiovense TEXEL ® PN1 en el control de mohos productores de OTA. Además, el desarrollo del cultivo protector man- tiene a la cepa productora de OTA en niveles inferiores a los considerados como de riesgo mínimo de producción y acumulación de OTA (Rodríguez y col., 2012b). Cuando se analizó la producción de OTA en las lonchas inoculadas se observa acumulación de esta micotoxina en niveles superiores a 2 µg/Kg en las lonchas donde se inoculó sólo P. ve- rrucosum. Sin embargo no se detectó OTA en las lonchas de salchichón donde P. nalgiovense y P. verrucosum fueron inoculadas conjuntamente con el cultivo protector. Estos resultados confir- man la necesidad de la utilización de P. nalgiovense para el control de mohos productores de OTA en productos cárnicos madurados y muy especialmente para evitar la acumulación de OTA en los productos cárnicos (Bernáldez y col., 2013a). 5.2. Evaluación del control de mohos productores de OTA mediante P. nalgiovense en salchi- chón tipo “fuet” Se evaluó además la eficacia del cultivo protector P. nalgiovense TEXEL® PN1 para controlar los mohos productores de OTA en salchichón tipo “fuet” inoculados con una cepa de P. verru- cosum Pc4 productora de OTA aislada de productos cárnicos (Rodríguez y col., 2011b). Para ello, se utilizaron 20 salchichones tipo fuet elaborados en la industria y divididos en 4 lotes de cinco piezas (lote 1: muestras sin inocular “lote control”, lote 2: muestras inoculadas con P. nalgioven- se, lote 3: muestras inoculadas con P. verrucosum y lote 4: muestras inoculadas conjuntamente con P. nalgiovense y P. verrucosum productor de OTA). Los lotes 2, 3 y 4 fueron inoculados su- perficialmente con niveles de 6,6 106 ufc/cm2 esporas de cada una de ambas cepas correspon- dientes a cada lote. Todos lotes fueron madurados durante 15 días en las condiciones de madu- ración de los fuets proporcionadas por la empresa en una cámara de maduración en las instalaciones de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Extremadura. Se tomaron mues- tras al finalizar los 15 días de maduración de los salchichones tipo “fuet”, en donde se observó un importante crecimiento de mohos en la superficie de los mismos (Figura 5). En estas muestras al igual que en las lonchas de salchichón se determinó la carga fúngica total mediante recuento en placa y se evaluó la implantación del cultivo protector y la presencia del mohos productores de OTA mediante dos métodos de qPCR así como la producción de OTA en el interior de los salchichones tipo “fuet” analizados. Figura 5. Imágenes tomadas a los 15 días de incubación en las que se muestran los fuets control (sin inoculación) (1), los fuets inoculadas con P. nalgiovense (2), los fuets inoculados con P. verrucosum (3), y finalmente los inoculados con la mezcla formada por P. nalgiovense y P. verrucosum (4).
- 118. 118 A. Rodríguez, M. Rodríguez, V. Bernáldez, J. A. Risquez, L. Polo, C. Cabeza, R. García, J. J. Córdoba Los fuets inoculados exclusivamente con P. nalgiovense TEXEL ® PN1 mostraron recuentos por qPCR superiores a log 7 ufc/cm2 (Figura 6). Sin embargo, cuando los fuets fueron inoculados sólo con P. verrucosum Pc4 se alcanzaron niveles de log 4,5 ufc/cm2 . Cuando ambas cepas se inocularon conjuntamente P. nalgiovense superó el valor de log 7 ufc/cm2 , mientras P. verruco- sum se mantuvo en recuentos de log 4,4 ufc/cm2 . Es de destacar que los fuets control no inocu- lados con P. nalgiovense mostraron niveles elevados de cultivo protector (superiores a log 6 ufc/ cm2 en el lote control) y algo inferiores (log 4,5 ufc/cm2 ) en el lote inoculado sólo con P. verru- cosum (Figura 6). 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Control Inoculación con P. nalgiovense Inoculación con P. verrucosum Inoculación con P. verrucosum y P. nalgiovense logcfu/cm2 Fuets P. nalgiovense P. verrucosum Figura 6. Recuentos de mohos mediante qPCR en los fuets inoculados con el cultivo protector de P. nalgiovense y con P. verrucosum madurados durante 15 días siguiendo un procesado industrial. La presencia en niveles elevados de P. nalgiovense en los fuets no inoculados con este moho como es el caso del lote inoculado sólo con P. verrucosum o el lote control, puede deberse a contaminación a través del aire de la cámara de maduración, dado que si bien las inoculaciones se hicieron en lugares diferentes, la maduración de todos los lotes, incluidos el control se hizo en la misma cámara de maduración. Este hecho fue ya observado en otros lotes de salchichones inoculados con la misma cepa de P. nalgiovense utilizada en el presente trabajo y madurados en un mismo local de maduración (Bernáldez y col., 2013a). Además está demostrado que la mi- crobiota presente en el medio ambiente es la principal fuente de contaminación superficial fúngica de los productos cárnicos (Asefa et al., 2010; Battilani et al., 2007; Mizakovà et al., 2002; Sørensen y col., 2008). De estos resultados puede deducirse que el nivel de P. nalgiovense utili- zado para la implantación de este moho en el lote inoculado es suficiente para contaminar el resto de lotes a través del aire en la cámara de maduración, más aún si tenemos en cuenta que en ninguno de los lotes de fuets analizados, ni siquiera en el inoculado sólo con P. verrucosum, hubo acumulación de OTA. Este hecho es muy destacable si tenemos en cuenta que en las lon- chas de salchichón inoculadas sólo con P. verrucosum y en las que no hubo ningún desarrollo de P. nalgiovense, si hubo acumulación de OTA. Además, está demostrada la acumulación de OTA en embutidos crudos-curados cuando hay desarrollo en superficie de cepas productoras de OTA de P. verrucosum, P. nordicum y Aspergillus ochraceus (Cantoni y col., 2007; Iacumin y col., 2009; Pietri y col., 2006). Por tanto, parece que la presencia del cultivo protector de P. nalgiovense
- 119. Desarrollo de metodología y estrategias para garantizar la seguridad alimentaria... 119 limita el desarrollo de P. verrucosum productor de OTA por debajo de los niveles que supone un riesgo de acumulación de OTA (Rodríguez y col., 2012b), evitando que P. verrucosum pro- duzca esta micotoxina. En este trabajo queda demostrada también la facilidad de implantación y desarrollo de P. nalgiovense en los embutidos durante la maduración, muy por encima de otros mohos contaminantes, lo que hace que sea muy eficaz su utilización como cultivo protector para evitar la presencia de mohos toxigénicos. 6. Conclusiones En relación con la higienización de productos cárnicos RTE, puede concluirse que la aplica- ción de E-beam y APH son métodos muy eficaces para higienizar productos cárnicos RTE. Son tecnologías “limpias” (no generan residuos radiactivos) y relativamente baratas. La elección de un método u otro depende de cuestiones industriales teniendo en cuenta dos premisas: los E-beam requieren de autorización por la autoridad competente y las APH no trabajan en flujo continuo. Otras diferencias entre ambas tecnologías son de menor consideración. Por otra parte, el trabajo realizado ha permitido desarrollar estrategias de control de patógenos con industrias cárnicas españolas líderes en el sector cárnico e innovadoras en el control de patógenos y que han estado vinculadas al desarrollo del proyecto CARNISENUSA. Ha quedado demostrado que la simple utilización de cultivos protectores de mohos no toxigénicos controla de forma eficaz el posible la acumulación de micotoxinas en productos cárnicos. Además se han desarrollado herramientas sensibles y rápidas de control de la implantación de cultivos protectores basadas en la metodología qPCR. La aplicación de estas estrategias en estas industrias como consecuen- cia del desarrollo del proyecto CARNISENUSA supone un extraordinario avance en la innovación en el objetivo prioritario de garantizar la seguridad alimentaria de los productos que elaboran. Agradecimientos La investigación que recoge este capítulo ha sido llevada a cabo en el marco del Proyecto Consolider-Ingenio 2010 CARNISENUSA CSD2007-00016, en colaboración con las Industrias Cár- nicas COVAP (Córdoba) y Mataderos Industriales Soler S.A. (Prolongo)/Frigoríficos Andaluces de Conservas de Carne S.A. (FACCSA, Málaga) y con el Centro de Investigación y Calidad Agroali- mentaria del Valle de los Pedroches (CICAP, Córdoba). Los autores muestran también su agrade- cimiento a Ricardo Martín Rodríguez de la Empresa Mataderos Industriales Soler S.A. (Prolongo)/ Frigoríficos Andaluces de Conservas de Carne S.A. (FACCSA) por su colaboración y asistencia técnica en el desarrollo del trabajo en la industria. 7. Bibliografía Asefa, D.T., Kure C.F., Gjerde, R.O., Omer, M.K., Langsrud, S., Nesbakken, T., Skaar I. 2010 Fungal growth pattern, sources and factors of mould contamination in a dry-cured meat production facility. Interna- tional Journal of Food Microbiology, 140, 131-135. Battilani, P., Pietri, V.A., Giorni, P., Formenti, S., Bertuzzi, T., Virgili, R., Kozakiewicz Z. 2007 Penicillium populations in dry-cured ham manufacturing plants. Journal of Food Protection, 70, 975-980. Bernáldez, V., Córdoba, J.J., Rodríguez, M, Cordero, M., Polo, L., Rodríguez, A. 2013a. Effect of Penicillium nalgiovense as protective culture in processing of dry-fermented sausage “salchichón”. Food Control, 32, 69-76. Bernáldez, V, Rodríguez, A, Martín, A., Lozano, D., Córdoba, J.J. 2013b. Development of a multiplex qPCR method for simultaneous quantification in dry-cured ham of an antifungal-peptide P. chrysogenum strain used as protective culture and aflatoxin-producing moulds. Food Control. Aceptado. Cambero, M.I., García de Fernando, G.D., Medina, M. 2013. Uso de tecnologías emergentes para garantizar la seguridad alimentaria de carne y productos derivados. Capítulo VI de este libro. Cantoni, C., Comi, G., Chiesa, L., Iacumin, L. 2007. Muffe e Ocratossina A negli insaccati crudi stagionati. Industrie Alimentari., 46, 10-12.
- 120. 120 A. Rodríguez, M. Rodríguez, V. Bernáldez, J. A. Risquez, L. Polo, C. Cabeza, R. García, J. J. Córdoba Castellari, C., Quadrelli, A.M., Laich, F 2010 Surface mycobiota on Argentinean dry fermented sausages. International Journal of Food Microbiology, 142, 149-155. EDSA, 2013. The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in 2011. The EFSA Journal 11, 3129. Fredlund, E., Gidlund, A., Olsen, M., Börjesson, T., Spliid, N.H.H., Simonsson, M. 2008. Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 73, 33-40. García-Márquez, I., Cambero, M.I., Ordóñez, J.A., Cabeza, M.C. 2012a. Shelf-life extension and sanitation of fresh pork loin by E-beam treatment. Journal of Food Protection 75, 2179-2189. García-Márquez, I., Ordóñez, J.A., Cambero, M.I., Cabeza, M.C. 2012b. Use of E-beam for shelf-life exten- sion and sanitizing of marinated pork loin. International Journal of Microbiology 2012:962846 doi: 10.1155/2012/962846. Iacumin, L., Chiesa, L., Boscolo, D., Manzano, M., Cantoni, C., Orlic, S., Comi, G. 2009. Moulds and ochra- toxin A on surfaces of artisanal and industrial dry sausages. Food Microbiology, 26, 65-70. IARC (International Agency for Research on Cancer) 1993. Ochratoxin A. Some naturally occurring subs- tances: Food items and constituents, heterocyclic aromatic amines and mycotoxins. IARC Monograph on the evolution of carcinogenic risks to humans, 56, 489-521. Lizaso, G., Chasco, J., Beriain, M. J. 1999. Microbiological and biochemical changes during ripening of salchichón, a Spanish dry cured sausage. Food Microbiology, 16, 219-228. Ludemann, V., Greco, M., Rodríguez, M.P., Basílico, J.C.,Pardo, A. 2010 Conidial production by Penicillium nalgiovense for use as starter cultures in dry fermented sausage by solid state fermentation. LWT Food Science and Technology, 43, 315-318. Martín, A., Jurado, M., Rodríguez, M., Núñez, F., Córdoba, J.J. 2004. Characterization of molds from dry-cu- red meat products and their metabolites by micellar electrokinetic capillary electrophoresis and ran- dom amplified polymorphic DNA PCR. Journal of Food Protection, 67, 2234-2239. Martín, A., Córdoba, J.J., Aranda, E., Córdoba, M.G., Asensio, M.A. 2006. Contribution of a selected fungal population to the volatile compounds on dry-cured ham. International Journal of Food Microbiology, 110, 8-18. Mizakovà, A., Pipovà, M., Turek, P. 2002 The occurrence of moulds in fermented raw meat products. Czech Journal of Food Sciences, 3, 89-94. Núñez, F., Rodríguez, M. M., Bermúdez, E., Córdoba, J. J., Asensio, M. A. 1996. Composition and toxigenic potential of the mould population on dry-cured Iberian ham. International Journal of Food Microbio- logy, 32, 185–197. Papagianni, M., Papamichael, E.M. 2007 Modeling growth, substrate consumption and product formation of Penicillium nalgiovense grown on meat simulation medium in submerged batch culture. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 34, 225-231. Pietri, A., Bertuzzi, T., Gualla, A., Piva, G. 2006 Occurrence of ochratoxin A in raw ham muscles and in pork products from northern Italy Italian Journal of Food Science, 18, 99-106. Portocarrero, S.M., Newman, M., Mikel, B. 2002. Staphylococcus aureus survival, staphylococcal enteroto- xin production and shelf stability of country-cured hams manufactured under different processing procedures. Meat Science, 62, 267-273. Rodríguez, A., Córdoba J.J., Werning, M.L., Andrade, M.J., Rodríguez, M. 2012c. Duplex real-time PCR me- thod with internal amplification control for quantification of verrucosidin producing molds in dry-ri- pened foods. International Journal of Food Microbiology, 153, 85-91. Rodríguez, A., Córdoba J.J. Gordillo, R., Córdoba, M.G., Rodríguez, M. 2012h. Development of two quan- titative real-time PCR methods based on SYBR Green and TaqMan to quantify sterigmatocystin-pro- ducing molds in food. Food Analytical Methods, 5, 1514-1525. Rodríguez, A., Luque, M.I., Andrade, M.J., Rodríguez, M., Asensio, M.A., Córdoba J.J. 2011a. Development of real-time PCR methods to quantify patulin-producing molds in food products. Food Microbiology, 28, 1190-1199. Rodríguez, A., Rodríguez, M., Andrade, M.J., Córdoba J.J. 2012e. Development of a multiplex real-time PCR to quantify aflatoxin, ochratoxin A and patulin producing molds in foods. International. Journal. of Food Microbiology, 155, 10-18. Rodríguez, A., Rodríguez, M., Luque, M.I., Justensen, A.F., Córdoba, J.J. 2011b. Quantification of ochratoxin A-producing molds in food products by SYBR Green and TaqMan real-time PCR methods. Internatio- nal. Journal. of Food Microbiology, 149, 226-235.
- 121. Desarrollo de metodología y estrategias para garantizar la seguridad alimentaria... 121 Rodríguez, A., Rodríguez, M., Luque, M.I., Justesen, A.F., Córdoba J.J. 2012d. A comparative study of DNA extraction methods to be used in real-time PCR based quantification of ochratoxin A-producing molds in food products. Food Control, 25, 666-672. Rodríguez, A., Rodríguez, M., Luque, M.I., Martín, A., Córdoba J.J. 2012f Real-time PCR assays for detection and quantification of aflatoxin-producing molds in foods. Food Microbiology, 31, 89-99. Rodríguez, A., Rodríguez, M., Martín, A., Delgado, J., Córdoba, J.J. 2012a. Presence of ochratoxin A on the surface of dry-cured Iberian ham after initial fungal growth in the drying stage. Meat Science, 92, 728-734. Rodríguez, A., Rodríguez, M., Martín, A., Núñez, F., Córdoba, J.J. 2012b. Evaluation of hazard of aflatoxin B1, ochratoxin A and patulin production in dry-cured ham and early detection of producing moulds by qPCR. Food Control, 27, 118-126. Rodríguez, A., Werning, M.L., Rodríguez, M., Bermúdez, E., Córdoba J.J. 2012g. Quantitative real-time PCR method with internal amplification control to quantify cyclopiazonic acid-producing molds in foods. Food Microbiology, 32, 397-405. Rodríguez-Martín, A. Acosta, R., Liddell, S., Núñez, F., Benito, M.J. Asensio, M. A. 2010. Characterization of the novel antifungal protein PgAFP and the encoding gene of Penicillium chrysogenum. Peptides, 31, 541-547. Sørensen, L.M., Mogensen, J., Nielsen, K.F. 2010. Simultaneous determination of ochratoxin A, mycophe- nolic acid and fumonisin B2 in meat products. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 398, 1535-1542. Sosa, M. J., Córdoba, J. J., Díaz, C., Rodríguez, M., Bérmudez, E., Asensio, M. A., Núñez, 2002. Production of cyclopiazonic acid by Penicillium commune isolated from dry-cured ham on a meat extract-based substrate. Journal of Food Protection, 65, 988-992. Zhu, M.J., Du, M., Cordray, J., and Ahn, D.U. 2005. Control of Listeria monocytogenes contamination in ready-to-eat meat products. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 4, 34-42.
- 123. CAPÍTULO IX Posters presentados en las Sesiones Plenarias
- 124. 124 Detrapat
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- 185. CAPITULO X Indicadores de calidad y producción de I+D+i de CARNISENUSA Lluís Salvà Gestor del proyecto Institut de Recerca i Tecnologies Agroalimentàries (IRTA). Monells 1. Introducción Como se recoge en el Convenio de Ejecución firmado con el, por aquel entonces, Ministerio de Educación y Ciencia (MEC), la Entidad Gestora, en representación del equipo investigador del proyecto Consolider CARNISENUSA, ha sido el organismo encargado del seguimiento, cuantifi- cación y control de CARNISENUSA, cuyo rendimiento deriva del esfuerzo y dedicación de los investigadores integrantes en el proyecto. La cláusula octava de dicho convenio (“Evaluación, control y seguimiento científico-técnico”) señala una serie de indicadores a cumplir de acuerdo con el compromiso firmado en su día con el Ministerio al que le ha permitido realizar una eva- luación continua y objetiva de la evolución del proyecto. En este capítulo se describe el rendimiento científico-técnico global obtenido en CARNI- SENUSA en el que, tomando siempre como referencia los indicadores consensuados, se resaltan las cotas alcanzadas en el proyecto, ahora que éste llega a su fin. De todas formas, será difícil que este capítulo repleto de “fríos” números y datos objetivos pueda poner de manifiesto el efecto que las sinergias y colaboraciones entre los grupos ha ejercido en los investigadores que, en muchos casos, ha derivado en una magnífica relación personal. 2. Publicaciones La calidad científico-técnica de cualquier proyecto de investigación viene determinada, por lo general, por el número y sobre todo por la calidad de las publicaciones. El proyecto CARNI- SENUSA no podía ser menos, y por este motivo, uno de los principales indicadores utilizados es el número y la relevancia de los artículos publicados por los distintos miembros del grupo investigador del proyecto. La evaluación de la calidad de las publicaciones se basa en el ran- king establecido por el Journal Citation Reports que, dentro del ámbito de Food Science and Technology (y otras áreas temáticas utilizadas por los investigadores), se han dividido en cuatro grupos de los cuales tres de ellos, los de más relevancia por su factor de impacto, se recogen en la tabla 1. Para mayor información, el lector puede consultar el Anexo I donde figura una relación de los artículos publicados. El total de publicaciones comprometidas con el Ministerio (Tabla 1), era de un centenar, una cantidad nada despreciable, que suponía una media de 25 anuales. Esta cifra, sin embargo, se ha superado ampliamente alcanzando un total de 233 publicaciones, lo que significa más del doble de lo comprometido. Este resultado es ya de por si revelador de la gran actividad inves- tigadora llevada a cabo durante el proyecto. Sin embargo, la dimensión real de las aportaciones del mismo queda reflejada sobre todo en la calidad de las publicaciones. Tomando como refe- rencia el indicador recogido en el Convenio de Ejecución (Tabla 1), se observa que el número
- 186. 186 Lluis Salvà total de artículos del primer cuartil comprometidos fue de 39. A unos meses de finalizar el proyecto el número de trabajos dentro del primer cuartil es de 207, lo que supone más de un 90% de las publicaciones realizadas. Este contundente dato permite acreditar el avance cientí- fico que ha supuesto el proyecto CARNISENUSA en la Ciencia y Tecnología de la Carne y Pro- ductos Cárnicos. Además de las publicaciones en revistas científicas se han redactado 45 capítulos de libros (entre ellos los incluidos en la primera edición de este libro) y de artículos de divulgación, fun- damentalmente en revistas de interés para el sector cárnico. Todo ello con el propósito de difun- dir los avances obtenidos y dar visibilidad a los principales hallazgos publicados en revistas científicas. 3. Índice h (Hirsch) En los últimos años, la comunidad científica viene aceptando el indicador desarrollado por el Dr. Jorge Hirsch como una herramienta satisfactoria para evaluar el historial científico de los investigadores que se fundamenta en el número de veces que los artículos de un autor son citados en las publicaciones de otros autores, mostrando así la relevancia de los resultados; es un parámetro sencillo que refleja de forma excepcional el éxito de un investigador y la evolu- ción de su trabajo. Basándose en este criterio, se consideró como indicador global del índice h, la media calculada a partir del valor del índice h individual de los 26 investigadores más consolidados del proyecto. El valor al inicio del proyecto (2007) era de 14 y se propuso al MEC un incremento del 15% al finalizar el proyecto que fue aceptado y así se hizo constar en el Convenio de Ejecución. Este aumento equivalía a alcanzar la cifra de 16. En la tabla 2 se reco- gen los valores h actuales de los citados investigadores, resultando un valor medio de 20,96, lo que supone un aumento muy superior (50%) al comprometido (15%) en el Convenio de Ejecución. Conviene decir que no todas las ciencias y tecnologías son comparables y, por tanto, la calidad de los artículos de los investigadores depende de la rama de la Ciencia que cultive un determinado investigador. Rodríguez Navarro y Juan Imperial Ródenas (Índice “h”: guía para la evaluación de la investigación española en ciencia y tecnología utilizando el índice “h” 2007 Vol. 33 de Mi+d. www.madridmasd.org) han analizado profundamente el significado y alcance del índice h como forma de evaluar la calidad de la investigación y han clasificado los campos científicos en 5 categorías atendiendo al factor de impacto que figura en el Journal Citation Reports. Las ciencias aplicadas en general, como la Ciencia y Tecnología de los Alimentos en el cuarto grupo donde un índice h entre 10 y 20 equivale a una calidad alta y a partir de 20 cae ya en la categoría de excelente. El índice h medio de los 26 científicos consolidados de CARNISENUSA (tabla 2) partía en 2007 con un índice h de 14 (de alta calidad científica) y en Tabla 1. Número de artículos científicos clasificados según su factor de impacto (JCR 2006-11) generados por el proyecto CARNISENUSA Factor de impacto Número de publicaciones 2008 2009 2010 2011 2012 2013 TOTAL C P C P C P C P C P C P C P 1er cuartil ( 1.579) 4 10 5 34 10 32 20 41 0 51 0 39 39 207 2º y 3er cuartil (1,578) 11 2 15 6 15 3 20 8 0 5 0 2 61 26 TOTAL 15 12 20 40 25 35 40 49 0 56 0 41 100 233 C: Comprometidas según consta en el Convenio de Ejecución firmado con el MEC P: Artículos publicados
- 187. Indicadores de calidad y producción de I+D+i de CARNISENUSA 187 los seis años que ha estado “vivo” el proyecto han superado el umbral de 20 y, por tanto, han pasado al nivel de excelencia. Tabla 2. Relación de los índices h de los 26 investigadores más consolidados participantes en el proyecto a la fecha de edición de este libro Dr. Juan A. Ordóñez 30 Dr. José Carballo 19 Dr. Juan José Córdoba 21 Dra. Carmen Sárraga 13 Dr. Jacinto Arnau 22 Dr. Jorge Ruiz 25 Dr. F. Jiménez Colmenero 23 Dra. M.L. García 18 Dr. Antoni Mulet 26 Dra. M. Isabel Cambero 16 Dr. Manuel Núñez 33 Dr. José A. García Regueiro 16 Dr. Josep Mª Monfort 19 Dra. Manuela Fernández 16 Dr. Albert Bosch 27 Dra. Mª Dolores Selgas 17 Dr. G. García de Fernando 11 Dra. Iciar Astiasaran 26 Dr. Andrés Otero 17 Dr. Jesús Ventanas 29 Dra. Teresa Aymerich 23 Dra. Margarita Medina 30 Dra. Mª Mar Rodríguez 14 Dra. Eva Hierro 12 Dr. Pedro Roncalés 21 4. Contratos con empresas A pesar de ser un proyecto de carácter netamente científico, el proyecto CARNISENUSA no se entendería sin el apoyo del sector cárnico español. Aunque las bases de la convocato- ria Consolider – Ingenio 2010 dejaban claro que únicamente podían recibir financiación los organismos públicos de investigación (OPIs), desde el inicio se implicaron en el consorcio algunas de las principales empresas y asociaciones del sector cárnico. Dichas empresas y asociaciones son: • El Pozo Alimentación S.A. • Cooperativa Andaluza Ganadera del Valle de los Pedroches (COVAP) • Frigoríficos Andaluces de Conservas de Carne (FACCSA-Prolongo) • Campofrío S.A • Federación Española de Industrias de Alimentación y Bebidas (FIAB) • Asociación Nacional de Industrias de la Carne de España (ANICE-CONFECARNE) La investigación llevada a cabo en el proyecto CARNISENUSA ha sido fundamentalmente orientada a la industria cárnica. Por ello, siempre se ha tenido presente el usuario final a la hora de generar conocimientos para su transferencia al sector cárnico español, aunque, como los resultados están publicados en revistas internacionales, su disponibilidad transciende también a la comunidad científica mundial. Otro de los indicadores acordados con el Ministerio se basaba precisamente en la interacción OPIs-industria. Según se recogía en el Convenio de Ejecución, el objetivo previsto era, a partir del segundo año de proyecto, incrementar un 10% anual el nivel de acuerdos económicos entre ambas organizaciones. Por otra parte, la difusión de las actividades realizadas durante el desarrollo de CARNI- SENUSA es, en cierto modo, una forma de rendir cuentas de los fondos proporcionados por los presupuestos nacionales. Parte de estas actividades han correspondido a las acciones aco- metidas conjuntamente con empresas que pueden visualizarse utilizando como indicador in-
- 188. 188 Lluis Salvà directo los aumentos que ha habido respecto a lo previsto. La relación, cooperación y contac- to de los grupos de investigación con las empresas del sector cárnico español se muestran en la tabla 3 donde se refleja una relación anual de los contratos con empresas y el incremento teórico del 10% comprometido con el Ministerio así como el incremento real respecto al por- centaje anterior. El incremento medio fue ligeramente superior al 50%, destacando un 75% el año 2010. Realmente, en todos los años se superó el 10% prefijado, excepto en 2013 que se produjo un descenso de un 15%, lo que se justifica al estar programada la finalización del proyecto para 2012 y, sin embargo, se prorrogó por un año de forma administrativa (no eco- nómica) y, por tanto, no hubo ninguna reposición de fondos y en 2013 solo quedaban restos del ejercicio anterior. Por otra parte, los contratos firmados con las empresas en 2013 no pue- den considerarse dentro de ese año ya no era posible firmar ningún acuerdo con las empresas bajo el marco de CARNISENUSA. Estos resultados reflejan no sólo el interés que suscitan en el sector cárnico español los avan- ces científicos conseguidos en el proyecto sino además la inquietud y el giro de un sector histó- ricamente tradicional y comedido en lo que a las innovaciones se refiere así como la confianza en la actividad de los OPIs y la percepción de la industria que cada vez ve con mayor nitidez percata que la investigación y la innovación pueden ser un pilar básico para su desarrollo. Tabla 3. Relación de los importes contratados con las empresas para el desarrollo de diver- sos trabajos tecnológicos Contratos 2008 2009 2010 2011 2012 2013 Número de contratos 14 22 15 23 34 8 Contribución Económica 241.821€ 398.364€ 309.375€ 443.296€ 564.272€ 298.975€ Incremento anual del 10% (comprometido con el MEC) 241.821 266.003 292.603 321.863 354.049 389.454 Incremento real respecto al teórico (%) 0 64,73 16,30 51,50 75,31 -15,55 Además del indicador en su día firmado con el Ministerio, otro parámetro que puede ser interesante en relación con la transferencia de resultados de la investigación a las empresas son las nueve patentes obtenidas durante la evolución del proyecto por los distintos grupos investigadores: • A. Bosch R.M. Pintó. “Standardized method and kit for the quantification of Hepatitis A vi- rus”. Reference: CT/EP2007/055402: WO 2008/145196. International PCT USA, 2007. Date: 04/12/2008 (In exploitation, Ceeram, 2009). • A. Bosch R.M. Pintó. “Control for assays based on reverse-transcription polymerase chain reaction”. Reference: PCT/EP2007/055407:WO 2008/145197. International PCT USA, 2007. Date: 04/12/2008 (In exploitation, Ceeram, 2009). • C. Rodríguez, M.M., Rodríguez Castillo, M.J., Santa-María Blanco, J.G., Selgas Cortecero, M.D. García Sanz, M.L. “Productos cárnicos y de la pesca enriquecidos en licopeno mediante la adición de piel de tomate”. Application: P200701670. Spain. Date: 18th of June of 2007. • D. Morcuende, J. Ventanas, R. Ganhao, M. Estévez. “Empleo de un extracto de madroño en la elaboración de productos alimenticios”. Application: P201030173 -2010. Spain. Date: 09/02/2010. • D. Morcuende, J. Ventanas, R. Ganhao, M. Estévez. “Empleo de un extracto de Rosa canina L. en la elaboración de productos alimenticios”. Application: P201030175-2010. Spain. Date: 09/02/2010.
- 189. Indicadores de calidad y producción de I+D+i de CARNISENUSA 189 • M. Estévez, D. Morcuende, J. Ventanas, J. G. Rodriguez. “Empleo de un extracto de piel de aguacate en la elaboración de productos alimenticios”. Application: P201031390. Spain. Date: 17/09/2010. • M. Estévez, D. Morcuende, J. Ventanas, J. G. Rodriguez. “Empleo de un extracto de semilla de aguacate en la elaboración de productos alimenticios”. Application: P201031391. Spain. Date: 17/09/2010. • Cofrades, S., López López, I., Ruiz-Capillas, C., Jiménez Colmenero, F. “Procedimiento de ob- tención de productos cárnicos saludables con algas”. Application: P201030390. Reference: ES1641.716. Spain. Date: 17/03/2010. • Benedito, J. J., Martínez-Pastor, M.T., Mulet, A., Ortuño, C., Peña, R. “Procedure of microbial inactivation by the combination of supercritical fluids and ultrasound”. Application: P201131099. Spain. Date: 29/06/2011. 5. Tesis doctorales Uno de los principales objetivos del proyecto, además de la excelencia investigadora (reflejada por las publicaciones e índice h) y el interés industrial (contratos con empresas y patentes), es la formación de jóvenes investigadores que, no cabe duda, es una actividad prioritaria e imprescindible para asegurar la continuidad del conocimiento. Las tesis docto- rales realizadas es, quizás, el mejor medio que puede emplearse para evaluar el grado de formación de científicos, sin olvidar los programas docentes de másters y cursos. La tabla 4 refleja el número de tesis defendidas, las que únicamente queda ultimar algunos detalles y se van a defender de forma inminente (en 2013) pero también se han recogido las que está previsto se defiendan en 2014, ya que una tesis doctoral es una labor de varios años y, por tanto, las que se defiendan en 2014 se han realizado mayoritariamente en años anteriores, cuando el proyecto estaba en pleno desarrollo. En el momento de la edición de este libro había ya 18 tesis defendidas, sólo faltaban dos para cumplir lo que se especificaba en el Convenio de Ejecución según el cual, a la conclusión del proyecto se deberían haber defen- dido alrededor de 20 tesis. Teniendo en cuenta las tesis defendidas (18) y las que con la máxima certeza se defenderán en 2013 (11) se llegará al final del proyecto (diciembre 2013) con un total de 29 tesis realizadas, aproximadamente un 50% más de las comprometidas con el Ministerio. A este valor se le debería añadir las tesis (9) que, aunque defendidas una vez finalizado el proyecto (2014) su contenido y resultados básicamente derivan, como se ha in- dicado anteriormente, de la investigación realizada por el doctorando/a durante la ejecución del proyecto CARNISENUSA, completándose un total de 38 tesis doctorales relacionadas con el proyecto CARNISENUSA. Tabla 4. Relación nominal de tesis finalizadas, o de defensa inminente, relacionadas con el proyecto CARNISENUSA Tesis defendidas 18 Tesis a defender durante 2013 11 Tesis a defender durante 2014 9 TOTAL 38 A continuación de describe una relación detallada de las tesis defendidas o en proceso de defenderse durante 2013 o 2014:
- 190. 190 Lluis Salvà Tesis doctorales finalizadas Nombre Título Director Izaskun Berasa- tegui Zabalza Nuevas fuentes lipídicas en la elaboración de productos cárnicos cocidos enriquecidos en omega-3 Iciar Astiasarán y Diana Ansorena Idoya Valencia Redín Meat products enriched in n-3 polyunsaturated fatty acids: technological, healthy and sensory aspects. Excelente cum laude Iciar Astiasarán y Diana Ansorena A. Bocanegra de Juana. Utilización nutricional de Nori y Konbu. Efectos sobre la defensa antioxidante y metabolismo lipoproteico en ratas. Excelente cum laude Francisco Sánchez-Mu- niz, Sara Bastida y Juana Benedí Lluís Aragonès Marimon El virus de la hepatitis A y su código genético. Excelente cum laude Rosa Mª Pintó y Albert Bosch Inés López- López Algas (Himantalia elongata, Undaria pinnatifida y Porphyra umbilicalis) como ingrediente funcional en productos cárnicos: aspectos nutricionales y tecnológi- cos. Excelente cum laude Susana Cofrades y Francisco Jiménez Colmenero Ana Rivas Cañedo Influence of high pressure treatment of meat products on the formation of volatile compounds. Excelente cum laude Estrella Fernández y Manuel Nuñez Raquel Montiel Moreno Listeria monocytogenes in smoked salmon: detection at the industry and elimination in the product by means of high pressure and biopreservation. Excelente cum laude Margarita Medina y Daniel Bravo Unai Pérez Sautu Epidemiología molecular de virus causantes de gas- troenteritis y hepatitis A en Cataluña. Excelente cum laude Albert Bosch Mikel García de Ciriano Design and development of functional meat products. Excelente cum laude Iciar Astiasarán y Diana Ansorena Irene Galán Trigo Estudio de la biodisponibilidad del ácido fólico como ingrediente funcional en productos cárnicos. Excelente cum laude Mª Dolores Selgas y Mª Luisa García Gonzalo Delgado Pando Diseño y desarrollo de productos cárnicos con perfil lipídico optimizado. Excelente cum laude Francisco Jiménez Colmenero, Begoña Olmedilla y Francisco Sánchez Muniz Juan Aguirre García Variabilidad de la inactivación microbiana y de la fase de latencia de los microorganismos supervivientes a distintos tratamientos conservantes de alimentos. Excelente cum laude Gonzalo García de Fernando Diego Gómez Lozano Listeria monocytogenes en la industria de productos cárnicos: presencia en ambiente y en productos listos para el consumo (LPC). Excelente cum laude. Mención Internacional. Javier Yangüela y Agustín Ariño Teresa Pérez Beriain Repercusión de las variaciones en el procesado tecnoló- gico del jamón D.O. Teruel en su calidad. Excelente cum laude Pedro Roncalés Mª Isabel Luque Caballero Desarrollo de métodos de PCR convencional para la detección de mohos productores de micotoxinas en alimentos madurados Juan José Córdoba y Mª Jesús Andrade
- 191. Indicadores de calidad y producción de I+D+i de CARNISENUSA 191 Nombre Título Director Alicia Rodrí- guez Jimenez Métodos de PCR en tiempo real para detectar mohos productores de micotoxinas en alimentos Juan José Córdoba y Mar Rodríguez Jovita Ana Del Olmo Sánchez Evaluación del efecto antimicrobiano de la lactoferrina bovina y sus derivados, y su combinación con altas presiones, sobre patógenos y alterantes de la carne y los productos cárnicos. Excelente cum laude Manuel Nuñez Julián Gómez Salazar Modelización de la difusión de nitratos y nitritos en el curado de carne”. Enero 2012. Universidad Politécnica de Valencia. Excelente cum laude Neus Sanjuán y Gabriela Clemente Tesis que se defenderán en 2013 Nombre Título Director Anna Hereu Soms Les altes pressions i la bioconservació com a estratègies de control de Listeria monocytogenes en productes carnis llestos pel consum Teresa Aymerich y Sara Bover-Cid Carmina Ortuño Cases Optimización del proceso de extracción de compuestos naturales con capacidad antioxidante y antimicrobiana José Bon y José Benedito Elsa Iglesias Collar Evaluación del riesgo asociado a la presencia de bacte- rias patógenas en productos cárnicos comercializados en la ciudad de León Andrés Otero María de Alba Ortega Altas presiones y bioconservación en la eliminación de patógenos en productos cárnicos Margarita Medina y Daniel Bravo Mª Dolores Romero de Ávila Hidalgo Empleo de sistemas de cohesión en frío para la elabora- ción de jamón deshuesado curado Juna A. Ordóñez, Mª Isabel Cambero y Lorenzo de la Hoz (†) Ruben Gordillo Duran Desarrollo de Métodos de PCR convencional y en tiempo real para detectar E. coli O157:H7 y S. aureus enterotoxigénico en productos cárnicos Mar Rodríguez Jovita y Elena Bermúdez Jader Rodríguez Cortina Contribucion al estudio de la intensificacion del proceso de secado de tomillo (thymus vulgaris l.): aplicación de ultrasonidos de potencia y secado intermitente. José Bon y Antonio Mulet Irene García Márquez Ampliación de la vida útil de lomo fresco y adobado mediante la aplicación de electrones acelerados Mª Dolores Selgas Medhi Triki Aminas biógenas en productos cárnicos más saludables en base a su contenido lipídico Claudia Ruiz-Capillas, Ana M. Herrero y Francisco Jimenez- Colmenero Julia Calvarro Labrador Estudio de la influencia de la concentración de nitratos y nitritos en el olor y la formación de nitrosaminas en productos cárnicos crudos curados Jorge Ruiz y Carmen García González Ana Mª Soto Carrión Productos cárnicos enriquecidos con calcio. Estudio de la biodisponibilidad Mª Dolores Selgas y Mª Luisa García
- 192. 192 Lluis Salvà Tesis que se defenderán en 2014 Nombre Título Director Xavier Fernández Hospital Efecto de la reducción del contenido de nitratos y nitritos en la generación de compuestos volátiles y en la microbiota típica de los productos cárnicos curados Manuela Fernández y Eva Hierro Raquel Velasco de Diego Uso de electrones acelerados para el control de Clostridium tyrobutyricum y Listeria monocytogenes en queso Juna A. Ordóñez, Mª Isabel Cambero y Mª Concepción Cabeza Alberto Lorés Guerrero Implicaciones en el color de la reducción de nitrificantes en productos cárnicos Pedro Roncalés Candelaria Poyato Aledo Viabilidad de emulsiones múltiples como vehículo de compuestos bioactivos para productos cárnicos Iciar Astiasarán y Diana Ansorena Lorena Salcedo Sandoval Desarrollo de productos cárnicos con reducido contenido en grasa en base a la utilización de konjac glucomanano Susana Cofrades y Claudia Ruiz-Capillas Mª Rosa Rodríguez Vargas Variabilidad de la inactivación microbiana y de la fase de latencia de los microorganismos supervivientes a distintos tratamientos de acidificación de alimentos Gonzalo García de Fernando Mª Carmen Gámez Losada El licopeno como ingredientes funcionales en productos cárnicos listos para el consumo Mª Dolores Selgas, Mª Luisa García y Marta Mª Calvo 6. Conclusiones Uno de los requisitos de la convocatoria del programa Consolider Ingenio 2010 era, aparte del seguimiento por evaluadores seleccionados por el Ministerio y de los informes anuales pre- ceptivos, la firma de un Convenio de Ejecución con el entonces Ministerio de Educación y Cien- cia en el que los investigadores responsables de los proyectos concedidos deberían proponer los objetivos que se pretendían alcanzar al finalizar el proyecto, a través de una serie de indicadores que permitieran evaluar los avances y logros del mismo. En el presente capítulo se ofrece un resumen de los indicadores de mayor transcendencia. Puede concluirse que se han superado todos los indicadores que se fijaron, y fueron admitidos, por las autoridades competentes del MEC. Así, se ha superado la duplicación del número de artículos científicos publicados en revis- tas de difusión internacional y se ha redactado un buen número monografías, artículos de divul- gación científica y capítulos de libros por diversos investigadores del proyecto CARNISENUSA. Otros indicadores (índice h de los 26 investigadores más consolidados, importe de contratos con empresas y tesis doctorales realizadas bajo el marco del proyecto) aumentaron en torno al 50%, o superaron este valor, en relación con lo fijado en el Convenio de Ejecución. El firmante de este capítulo, gestor de CARNISENUSA, considera que ampliamente se han cumplido todas las cláusulas recogidas en el Convenio de Ejecución que el Coordinador Gene- ral, en nombre de todos los investigadores, firmó con el Ministerio y estima que los participantes en el proyecto pueden sentirse satisfechos de haber gestionado con eficacia los recursos públi- cos que el MEC puso a su disposición. Nota final: deseo agradecer al Comité de Gestión la posibilidad de participar en el proyecto CARNISENUSA encargándome de su gestión. Ha sido una experiencia muy fructífera en relación con mi perfeccionamiento en las actividades propias del cometido que conlleva una tarea de esta naturaleza y, al tiempo, me ha permitido obtener un mayor conocimiento de la ciencia y tecnología de los productos cárnicos. Por último quisiera agradecer a los investigadores integran- tes del proyecto su colaboración y disponibilidad facilitándome en todo momento el trabajo de gestión. Muchas gracias a todos.
- 193. Apéndice I Lista oficial de participantes en el proyecto Investigador E-mail Organización Subproyecto/s Aguirre García, Juan salvador [email protected] Universidad Complutense de Madrid (UCM) PROCARTE Altisent Gómez, Anna [email protected] Universitat de Barcelona (UB) PROCARTE Andrade Gracia, María Jesús [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) DETRAPAT Andrés Nieto, Ana Isabel [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) NITRARED Ansorena Artieda, Diana [email protected] Universidad de Navarra (UN) FUNCIOCA Antequera Rojas, Mª Teresa [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) NITRARED Aranda Medina, Emilio [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) DETRAPAT Ariño Moneva, Agustín [email protected] Universidad de Zaragoza (UZ) DETRAPAT Arnau Arboix, Jacint [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) NITRARED Asensio Pérez, Miguel Ángel [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) DETRAPAT Astiasarán Anchía, Iciar [email protected] Universidad de Navarra (UN) FUNCIOCA Aymerich Calvet, Teresa [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) DETRAPAT y PROCARTE Bastida Codina, Sara [email protected] Universidad Complutense de Madrid (UCM) FUNCIOCA Beguiristain Celayeta, Nerea [email protected] Universitat de Barcelona (UB) PROCARTE Beltran García, José Antonio [email protected] Universidad de Zaragoza (UZ) NITRARED Benedí González, Juana [email protected] Universidad Complutense de Madrid (UCM) FUNCIOCA Benedito Fort, José Javier [email protected] Universidad Politécnica de Valencia (UPV) PROCARTE Benito Bernaldez, Mª José [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) DETRAPAT Bermúdez Polo, Mª Elena [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) DETRAPAT Bon Corbin, José [email protected] Universidad Politécnica de Valencia (UPV) FUNCIOCA Bosch Navarro, Albert [email protected] Universitat de Barcelona (UB) PROCARTE Bover Cid, Sara [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) DETRAPAT y PROCARTE Cabeza Briales, Mª Concepción [email protected] Universidad Complutense de Madrid (UCM) PROCARTE Calvarro Labrador, Julia [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) NITRARED
- 194. 194 Apéndice I. Participantes en el proyecto Investigador E-mail Organización Subproyecto/s Calvo Rodríguez, Marta Mª [email protected] Instituto de Ciencia y tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN-CSIC) FUNCIOCA Calzada Gómez, Javier [email protected] Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaría (INIA) PROCARTE Cambero Rodríguez, Mª Isabel [email protected] Universidad Complutense de Madrid (UCM) PROCARTE Cañeque Martínez, Vicente Jubilado Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaría (INIA) FUNCIOCA Carballo Santaolalla, José [email protected] Instituto de Ciencia y tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN-CSIC) NITRARED Carbonell Izquierdo, Vicente Fco. [email protected] Centro Tecnológico ainia (ainia) DETRAPAT Cárcel Carrión, Juan Andrés [email protected] Universidad Politécnica de Valencia (UPV) PROCARTE, NITRARED y FUNCIOCA Carramiña Esteban, Juan José [email protected] Universidad de Zaragoza (UZ) DETRAPAT Carrasco Manzano, Juan Atanasio Jubilado Instituto de Ciencia y tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN-CSIC) FUNCIOCA Carraspiso Martínez, Ana Isabel [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) NITRARED Carreras Malonda, José Enrique [email protected] Centro Tecnológico ainia (ainia) DETRAPAT Castellari, Massimo [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) DETRAPAT Claret Coma, Anna [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) NITRARED Clemente Polo, Gabriela [email protected] Universidad Politécnica de Valencia (UPV) NITRARED, FUNCIOCA Cofrades Barbero, Susana [email protected] Instituto de Ciencia y tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN-CSIC) FUNCIOCA Comaposada Beringues, Josep [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) NITRARED Córdoba Ramos, Juan José [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) DETRAPAT Córdoba Ramos, Mª de Guía [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) DETRAPAT Dalmau Bueno, Antoni [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) DETRAPAT del Olmo Sánchez, Ana [email protected] Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaría (INIA) PROCARTE Delgado Pando, Gonzalo Finalizada su vinculación con ICTAN Instituto de Ciencia y tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN-CSIC) FUNCIOCA Díaz López, Isabel [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) FUNCIOCA Escudero Portugués, Rosa [email protected] Universidad Complutense de Madrid (UCM) PROCARTE Estévez García, Mario [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) NITRARED
- 195. Apéndice I. Participantes en el proyecto 195 Investigador E-mail Organización Subproyecto/s Fabrega Romans, Emma [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) PROCARTE Felipe Cuyas, Xavier [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) NITRARED Fernández Álvarez, Manuela [email protected] Universidad Complutense de Madrid (UCM) NITRARED y PROCARTE Fernández García, Estrella [email protected] Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaría (INIA) PROCARTE Fernández Hospital, Xavier [email protected] Universidad Complutense de Madrid (UCM) NITRARED Font Furnols, Maria [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) PROCARTE Fuentes Pardo, Cristina [email protected] Universitat de Barcelona (UB) PROCARTE Galán Trigo, Irene [email protected] Universidad Complutense de Madrid (UCM) FUNCIOCA Gámez Losada, Mª Carmen [email protected] Universidad Complutense de Madrid (UCM) FUNCIOCA Gañán Martínez-Ballesta, Mónica [email protected] Universidad Complutense de Madrid (UCM) PROCARTE García de Fernando Minguillón, Gonzalo D. [email protected] Universidad Complutense de Madrid (UCM) PROCARTE García González, Carmen [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) NITRARED García Iñiguez de Ciriano, Mikel [email protected] Universidad de Navarra (UN) FUNCIOCA García López, Mª Luisa [email protected] Universidad de León (ULE) DETRAPAT García Márquez, Irene [email protected] Universidad Complutense de Madrid (UCM) PROCARTE García Pérez, José Vicente [email protected] Universidad Politécnica de Valencia (UPV) PROCARTE, NITRARED García Regueiro, José Antonio [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) FUNCIOCA y NITRARED García Sanz, Mª Luisa [email protected] Universidad Complutense de Madrid (UCM) FUNCIOCA Garriga Turón, Margarita margarita.turó[email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) DETRAPAT y PROCARTE Gaya Sicilia, Pilar [email protected] Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaría (INIA) PROCARTE Gil Farre, Marta [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) FUNCIOCA Gisbert Viguer, Marta [email protected] Centro Tecnológico ainia (ainia) NITRARED Gispert Martinell, Marina [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) NITRARED Gómez Lozano, Diego [email protected] Universidad de Zaragoza (UZ) DETRAPAT Gómez Salazar, Julián Andrés [email protected] Universidad Politécnica de Valencia (UPV) NITRARED Gonzalez Armangué, Joel [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) NITRARED
- 196. 196 Apéndice I. Participantes en el proyecto Investigador E-mail Organización Subproyecto/s Gordillo Durán, Rubén [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) DETRAPAT Gou Botó, Pere [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) NITRARED Granado Lorencio, Fernando fgranado.hpth@salud. madrid.org Hospital Universitario Puerta de Hierro (HUPH) FUNCIOCA Gratacós Curbasí, Marta [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) NITRARED y FUNCIOCA Guàrdia Gasull, Dolors [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) NITRARED Guerrero Asorey, Luis [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) NITRARED Guix Arnau, Susana [email protected] Universitat de Barcelona (UB) PROCARTE Hereu Soms, Anna [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) DETRAPAT y PROCARTE Herraiz Carasa , Marta [email protected] Instituto de Ciencia y tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN-CSIC) FUNCIOCA Herrero Herranz, Ana Mª [email protected] Instituto de Ciencia y tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN-CSIC) FUNCIOCA Hierro Paredes, Eva [email protected] Universidad Complutense de Madrid (UCM) NITRARED y PROCARTE Hortós Bahí, Maria [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) FUNCIOCA Iglesias Collar, Elsa [email protected] Universidad de León (ULE) DETRAPAT Jiménez Colmenero, Francisco [email protected] Instituto de Ciencia y tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN-CSIC) FUNCIOCA Jofré Fradera, Anna [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) DETRAPAT y PROCARTE León Sanz, Miguel [email protected] Hospital 12 de Octubre FUNCIOCA Lloret Fortuny, Elsa [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) NITRARED Lobo Cartagena, Fernando [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) NITRARED y DETRAPAT Locatelli, Martina Universidad de Milán PROCARTE Lorente Lamas, María [email protected] Centro Tecnológico ainia (ainia) NITRARED Lorés Guerrero, Alberto [email protected] Universidad de Zaragoza (UZ) NITRARED Luque Caballero, María Isabel [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) DETRAPAT Manzano Jiménez, Susana [email protected] Universidad Complutense de Madrid (UCM) PROCARTE Martin Cáceres, Lourdes [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) NITRARED Martín González, Alberto [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) DETRAPAT Martín Juárez, Belen [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) DETRAPAT y PROCARTE Martínez Suárez, Joaquin V. [email protected] Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaría (INIA) PROCARTE Martinez Trias, Brigitte [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) NITRARED
- 197. Apéndice I. Participantes en el proyecto 197 Investigador E-mail Organización Subproyecto/s Medina Fernández-Regati- llo, Margarita [email protected] Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaría (INIA) PROCARTE Mir Figueras, Dolors [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) NITRARED Monfort Bolívar, Josep Mª [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) DETRAPAT y PROCARTE Morcuende Sánchez, David [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) NITRARED Moreno Barber, Amelia [email protected] Centro Tecnológico ainia (ainia) DETRAPAT Mulet Pons, Antoni [email protected] Universidad Politécnica de Valencia (UPV) PROCARTE, FUNCIOCA Muñoz Moreno, Israel [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) NITRARED Navarro Blasco, Iñigo [email protected] Universidad de Navarra (UN) FUNCIOCA Navarro Fayos, Mª Teresa [email protected] Centro Tecnológico ainia (ainia) FUNCIOCA Núñez Breña, Félix [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) DETRAPAT Núñez Gutiérrez, Manuel [email protected] Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaría (INIA) PROCARTE Oliver Pratsevall, Mª Angels [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) PROCARTE Olmedilla Alonso, Begoña [email protected] Instituto de Ciencia y tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN-CSIC) FUNCIOCA Ordóñez Pereda, Juan Antonio [email protected] Universidad Complutense de Madrid (UCM) COORDINA- DOR DEL PROYECTO Ortuño Cases, Carmina [email protected] Universidad Politécnica de Valencia (UPV) PROCARTE Otero Carballeira, Andrés [email protected] Universidad de León (ULE) DETRAPAT Pérez Beriain, Teresa [email protected] Universidad de Zaragoza (UZ) NITRARED Pérez Nevado, Francisco [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) DETRAPAT Petrón Testón, Mª Jesús [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) NITRARED Picón Gálvez, Antonia Mª [email protected] Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaría (INIA) PROCARTE Picouet, Pierre [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) NITRARED Pinto Solé, Rosa Mª [email protected] Universitat de Barcelona (UB) PROCARTE Realini Cujó, Carolina [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) NITRARED Rodrígo Gil, Alejandro [email protected] Centro Tecnológico ainia (ainia) DETRAPAT Rodríguez Calleja, José Mª [email protected] Universidad de León (ULE) DETRAPAT Rodríguez Jiménez, Alicia [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) DETRAPAT Rodríguez Jovita, Mª del Mar [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) DETRAPAT Rodríguez Mínguez, Eva [email protected] Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaría (INIA) PROCARTE
- 198. 198 Apéndice I. Participantes en el proyecto Investigador E-mail Organización Subproyecto/s Rodríguez Salas, Lorena lorena.rodriguez@ictan. csic.es Instituto de Ciencia y tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN-CSIC) FUNCIOCA Rodríguez Vargas, Mª Rosa [email protected] Universidad Complutense de Madrid (UCM) PROCARTE Romero de Ávila Hidalgo, Mª Dolores [email protected] Universidad Complutense de Madrid (UCM) PROCARTE Roncalés Rabinal, Pedro [email protected] Universidad de Zaragoza (UZ) NITRARED Rota García, Mª Carmen [email protected] Universidad de Zaragoza (UZ) DETRAPAT Ruiz Carrascal, Jorge [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) NITRARED Ruiz-Capillas Pérez, Claudia [email protected] Instituto de Ciencia y tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN-CSIC) FUNCIOCA Salvà Vila, Lluís [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) GESTOR DEL PROYECTO Sanchez Climent, Mª José [email protected] Centro Tecnológico ainia (ainia) NITRARED Sanchez Molinero, Filiberto [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) NITRARED Sanchez Muniz, Francisco Javier [email protected] Universidad Complutense de Madrid (UCM) FUNCIOCA Sanjuán Martínez, Rosa [email protected] Centro Tecnológico ainia (ainia) NITRARED Sanjuán Pellicer, Neus [email protected] Universidad Politécnica de Valencia (UPV) NITRARED Santamaría Blanco, Guillermo [email protected] Instituto de Ciencia y tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN-CSIC) FUNCIOCA Santos Buelga, Jesús Ángel [email protected] Universidad de León (ULE) DETRAPAT Sárraga Escolano, Carmen [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) NITRARED y FUNCIOCA Selgas Cortecero, Mª Dolores [email protected] Universidad Complutense de Madrid (UCM) FUNCIOCA Serra Dalmau, Xavier [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) NITRARED Serrano Brocas, Carmen T. [email protected] Centro Tecnológico ainia (ainia) NITRARED Sola Alados, Mª Teresa [email protected] Universidad Complutense de Madrid (UCM) FUNCIOCA Soto Carrión, Ana Mª [email protected] Universidad Complutense de Madrid (UCM) FUNCIOCA Tejada Sereno, Juan Florencio [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) NITRARED Timón Aranda, Mª Luisa [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) NITRARED Timón Aranda, Mª Luisa [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) NITRARED Tomás Fornés, David [email protected] Centro Tecnológico ainia (ainia) DETRAPAT Valero Pamplona, Angel [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) NITRARED y FUNCIOCA Velarde Calvo, Antoni [email protected] Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) DETRAPAT Velasco Diego, Raquel [email protected] Universidad Complutense de Madrid (UCM) PROCARTE
- 199. Apéndice I. Participantes en el proyecto 199 Investigador E-mail Organización Subproyecto/s Ventanas Barroso, Jesús [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) COORDINADOR DEL PROGRAMA DE FORMACIÓN Ventanas Canillas, Sonia [email protected] Universidad de Extremadura (UEx) NITRARED Viadel Crespo, Blanca [email protected] Centro Tecnológico ainia (ainia) FUNCIOCA Villegas Pascual, Beatriz [email protected] Centro Tecnológico ainia (ainia) NITRARED Yangüela Martínez, Javier [email protected] Universidad de Zaragoza (UZ) DETRAPAT
- 200. Participantes en la reunión anual de 2009 (Pamplona)
- 201. Participantes en la reunión anual de 2012 (Valencia)
- 203. Apéndice II Publicaciones Este apéndice contiene la lista de capítulos de libro, artículos científicos y de divulgación publicados en relación al proyecto CARNISENUSA des de su inicio hasta la fecha de edición de este libro: Capítulos de libro Fernández, M., Hospital, X.F. y Hierro, E. (2011). Influencia de la concentración de nitratos y nitritos en la microbiota de los productos cárnicos crudos curados. En: “Productos cárnicos para el siglo XXI. Se- guros, nutritivos y saludables” pág. 159-166. Ed: J.A. Ordóñez, J.J. Córdoba, y J. Ventanas. Servicio de Publicaciones de la Universidad de Extremadura, Cáceres. ISBN: 978-84-7723-949-9. Hierro, E., Hospital, X.F., Fernández, M., Villegas, B., Lorente, M., Sánchez, M.J., García, C., Calvario, J., Sánchez del Pulgar, J., Gratacós-Cubarsí, M. y García-Regueiro, J.A. (2011). Calidad sensorial de pro- ductos cárnicos madurados elaborados con distintas concentraciones de nitrificantes. En: “Productos cárnicos para el siglo XXI. Seguros, nutritivos y saludables” pág. 145-157. Ed: J.A. Ordóñez, J.J. Cór- doba, y J. Ventanas. Servicio de Publicaciones de la Universidad de Extremadura, Cáceres. ISBN: 978- 84-7723-949-9. C. Ortuño, R. Rocha, J. Bon, J.A. Cárcel, J. Benedito. (2011). Efecto de la temperatura de secado sobre la capacidad antimicrobiana de extractos de tomillo obtenido mediante fluidos supercríticos. En: “Pro- ductos cárnicos para el siglo XXI: seguros, nutritivos y saludables” pág. 330. Ed: J.A. Ordóñez, Córdo- ba, y J. Ventanas, J., Universidad de Extremadura. Servicio de Publicaciones. ISBN, ISSN: 978-84-7723- 949-9. C. Ortuño, J. Bon, J. Benedito (2011). Obtención de extractos de tomillo (Thymus zygis) con capacidad antimicrobiana mediante fluidos supercríticos asistidos por ultrasonidos. En: “Productos cárnicos para el siglo XXI: seguros, nutritivos y saludables” pág. 340. Ed: J.A. Ordóñez, Córdoba, y J. Ventanas, J., Universidad de Extremadura. Servicio de Publicaciones. Ref. ISBN, ISSN: 978-84-7723-949-9. J. Benedito, M.I. Cambero, C. Ortuño, M.C. Cabeza, J.A. Ordóñez, and L. de la Hoz. (2011). Modelling Ki- netics of sensory changes and shelf-life in e-beam treated cooked ham. En: “Productos cárnicos para el siglo XXI: seguros, nutritivos y saludables” págs. 221-225. Ed: J.A. Ordóñez, Córdoba, y J. Ventanas, J., Universidad de Extremadura. Servicio de Publicaciones. ISBN, ISSN: 978-84-7723-949-9. C. Ortuño, M. Martínez, A. Mulet, J. Benedito (2011). Efecto del estado de crecimiento en las cinéticas de inactivación de Escherichia coli usando CO2 supercrítico. En: “Productos cárnicos para el siglo XXI: seguros, nutritivos y saludables” págs. 335-339 Ed: J.A. Ordóñez, Córdoba, y J. Ventanas, J., Universi- dad de Extremadura. Servicio de Publicaciones. ISBN, ISSN: 978-84-7723-949-9. Ordóñez, J.A. 2011. Productos cárnicos para el siglo XXI: seguros, nutritivos y saludables (CARNISENUSA). En: “Productos cárnicos para el siglo XXI: seguros, nutritivos y saludables” págs. 25-29. Eds.: J.A. Or- dóñez, J.J. Córdoba, y J. Ventanas, J. Universidad de Extremadura. Servicio de Publicaciones. ISBN, ISSN: 978-84-7723-949-9. De la Hoz, L.; Cambero, M.I. y Ordoñez, J.A. (2011). Subproyecto PROCARTE: Uso de tecnologías emer- gentes para garantizar la seguridad alimentaria de productos cárnicos listos para su consumo (RTE). En: “Productos cárnicos para el siglo XXI: seguros, nutritivos y saludables” págs. 55-61. Eds.: J.A. Ordóñez, J.J. Córdoba, y J. Ventanas, J. Universidad de Extremadura. Servicio de Publicaciones. ISBN, ISSN: 978-84-7723-949-9. Cabeza, C.; de la Hoz, L.; Cambero, M.I.; Velasco; García-Márquez, I; Manzano, S. y Ordoñez, J.A. (2011). Higienización y vida útil de alimentos listos para su consumo (RTE) Tratados con electrones acelera- dos. En: “Productos cárnicos para el siglo XXI: seguros, nutritivos y saludables” págs. 167-177. Eds.: J.A. Ordóñez, Córdoba, y J. Ventanas, J. Universidad de Extremadura. Servicio de Publicaciones. ISBN, ISSN: 978-84-7723-949-9.
- 204. 204 Apéndice II. Publicaciones Cambero, M.I.; de la Hoz, L. Cabeza, C.; y Ordoñez, J.A. 2011. Empleo de técnicas espectroscópicas avan- zadas (Raman, IRM electrones acelerados en productos derivados de miosistemas. En: “Productos cárnicos para el siglo XXI: seguros, nutritivos y saludables” págs. 185-191. Eds.: J.A. Ordóñez, J.J. Córdoba, y J. Ventanas, J. Universidad de Extremadura. Servicio de Publicaciones. ISBN, ISSN: 978-84- 7723-949-9. Fernández, M., de la Hoz, L., Ordóñez, J.A, y Hierro, E. 2011. Utilización de pulsos de luz para la descon- taminación de productos cárnicos listos parea su consumo. En: “Productos cárnicos para el siglo XXI: seguros, nutritivos y saludables” págs. 179-183. Eds.: J.A. Ordóñez, J.J. Córdoba, y J. Ventanas, J. Uni- versidad de Extremadura. Servicio de Publicaciones. ISBN, ISSN: 978-84-7723-949-9. Ordoñez, J.A., Cambero, M.I., García, M.L. and Cabeza, M.C. 2011. Hazard of Salmonella in the intact she- ll egg and its possible removal from it. En “Salmonella: Classification, Genetics and Disease Out- breaks”. S. Monte and P. E. de Santos. Nova Science Publishers, Inc. New York. Aymerich T., Jofré A., Stollewerk K., Rubio R., Comaposada J., Garriga M. (2011). Improving fermented sausages production to meet consumer demands. En: “Libro de abstracts”. Ed: TUBITAK-MAM 4th International Congress on Food and Nutrition and SAFE Consortium 3rd International Congress on Food Safety. Jiménez Colmenero F., Herrero A., Cofrades S., Ruiz-Capillas C. (2011). Handbook of Meat and Meat Pro- cessing / Meat and functional foods. Ed: John Wiley Son, Inc. Cap. 11, 225-248. Ruiz-Capillas, C, Herrero, A.M., Jiménez-Colmenero, F (2011). Natural Antimicrobials in Food Safety and Quality / Reduction of Biogenic Amines in Meat and Meat Products. Ed: M. Rai y M. Chikindas, CAB International. Cap. 11, 154-166. Cofrades, S., López-López, I., and Jiménez Colmenero, F. (2011). Handbook of Marine Macroalgae: Biote- chnology and Applied Phycology / Applications of seaweed in meat-based functional foods. Ed: Kim S-K, John Wiley Son. Inc. Cap. 32, 491-499. ISBN 978-0-470-97918-1. Aymerich T., Garriga M., Monfort J.M. (2011). Applications of protective cultures, bacteriocins and bacte- riophages in fermented meat products. Woodhead publishing limited. Ansorena D., Astiasarán I., (2012). Formulations for Fermented Sausages with Health Attributes”. En Han- dbook of Animal-Based Fermented Food and Beverage Technology, Second Edition. Ed: Y. H. Hui and E . Özgül . Evranuz. CRC Press 2012. Pages 623-636. Córdoba J.J., Aranda E., Córdoba M.G., Benito M.J. and M. Rodríguez. (2011). “Molecular detection of Clostridium” en: Molecular detection of human bacterial pathogen. Capítulo 33, Páginas: 367-376. Ed: Taylor and Francis. ISBN: 978-1-4398-1239-6 Andrade M.J, Rodríguez M., Bermúdez E., Núñez F, Asensio M.A and Córdoba J.J. (2011). “Molecular de- tection of Debaryomyces” en: Molecular detection of human fungal pathogen. Capítulo 65, Páginas: 569-581. Ed: Taylor and Francis. ISBN: 978-14398-1240-2 Ansorena, D., Navarro, I., García-Iñiguez de Ciriano, M., Berasategi, I., Astiasarán, I. Utilización de extrac- tos vegetales con capacidad antioxidante en la elaboración de productos cárnicos ricos en ácidos grasos poliinsaturados. En: “Productos cárnicos para el siglo XXI: seguros, nutritivos y saludables” págs. 113-120. Eds.: J.A. Ordóñez, J.J. Córdoba, y J. Ventanas, J. Universidad de Extremadura. Servicio de Publicaciones. ISBN, ISSN: 978-84-7723-949-9. Aguirre, J.S., Rodríguez, M.R, García de Fernando, G.D. (2011). Variabilidad de la inactivación micro- biana y de la fase de latencia de microorganismos supervivientes a tratamientos conservantes de los alimentos. En: Productos cárnicos para el siglo XXI. Seguros, nutritivos y saludables. Ordóñez, J.A., Córdoba, J.J. y Ventanas, J. (eds.). ISBN: 978-84-7723-949-9. Universidad de Extremadura. pp. 215-220. Gómez, D., Ariño, A., Carramiñana, J.J., Rota, C. y Yangüela, J. (2011). Comparación de técnicas de mues- treo en superficies de acero inoxidable contaminadas con Listeria monocytogenes. En: “Productos cárnicos para el siglo XXI. Seguros, nutritivos y saludables” pág. 81-84. Ed: J.A. Ordóñez, J.J. Córdoba, y J. Ventanas. Servicio de Publicaciones de la Universidad de Extremadura, Cáceres. ISBN: 978-84- 7723-949-9. Jiménez Colmenero, F. 2011. Diseño y desarrollo de productos cárnicos funcionales. En “ Productos cár- nicos para el siglo XXI: seguros, nutritivos y saludables”, págs. 41-48. Eds: Ordóñez, J.A., Ventanas, J. y Córdoba, J.J. Universidad de Extremadura (Servicio de Publicaciones). Cáceres. ISBN: 978-84-7723- 949-9. Cofrades, S., López-López, I., Ruiz Capillas, C., Jiménez Colmenero, F. 2011. Algas como ingrediente fun- cional en productos cárnicos: aspectos nutricionales y tecnológicos. En “ Productos cárnicos para el
- 205. Apéndice II. Publicaciones 205 siglo XXI: seguros, nutritivos y saludables”, págs. 107-111. Eds: Ordóñez, J.A., Ventanas, J. y Córdoba, J.J. Universidad de Extremadura (Servicio de Publicaciones). Cáceres. ISBN: 978-84-7723-949-9. Jiménez Colmenero F., Herrero A., Cofrades S., Ruiz-Capillas C. (2012). Meat and functional foods. En “Handbook of Meat and Meat Processing” Ed: John Wiley Son, Inc. Cap. 11, págs. 225-248. Ruiz-Capillas, C, Herrero, A.M., Jiménez-Colmenero, F (2011). Reduction of Biogenic Amines in Meat and Meat Products. En “Natural Antimicrobials in Food Safety and Quality”. Ed: M. Rai y M. Chikindas, CAB International. Cap. 11, 154-166. Cofrades, S., López-López, I., and Jiménez Colmenero, F. (2011). Applications of seaweed in meat-based functional foods. En: Handbook of Marine Macroalgae: Biotechnology and Applied Phycology. Eds: Kim S-K, John Wiley Son. Inc. Cap. 32, 491-499. ISBN 978-0-470-97918-1. Sánchez-Muniz, F.J.; Benedí, J.; Bastida, S.; Olivero-David, R. y González-Muñoz, M.J. “Enzymes and ther- mally oxidized oils and fats”. Capítulo 5. En: “Frying of foods: Oxidation, Nutrient and Non-Nutrient Antioxidants, Biologically Active Compounds and High Temperatures, Second edition” CAT K10348, pp. 105-155.Boskou, D. and Elmadfa, I.Taylor and Francis Group LLC. (2011). Sánchez-Muniz, F.J.; Bocanegra, A.; Benedí, J. y Bastida, S. “Algae and cardiovascular health”. Parte II. Bio- logical properties of algae and algal components. Capítulo 13. En: “Functional ingredients from algae for foods and nutraceuticals”. Ed: Domínguez HWoodhead Publishing. (con el editor). Sánchez-Muniz, F.J. y Bastida, S. “Lípidos”. Capítulo II.2 En: Módulo II. “Ingestas de energía, nutrientes, y otros componentes de la dieta. estatus”. Agencia Española de Seguridad Alimentaria y Nutrición (AE- SAN) y Fundación Española de la Nutrición (FEN)Agencia Española de Seguridad Alimentaria y Nu- trición (AESAN) y Fundación Española de la Nutrición (FEN). (2012). En prensa Jiménez-Colmenero, F Delgado-Pando, G. Fibre-enriched meat products. En: Wholegrain and fibre en- riched foods: improving quality. Delcour Poutanen (Eds) Woodhead Publishing. (con el editor). Cofrades, S, Serdarog˘lu, M., Jiménez Colmenero, F. Design of foods and beverages containing whole algae. En: Functional ingredients from algae for foods and nutraceuticals. Dominguez (Ed). Wo o d h e a d Publishing (con el editor). Jiménez Colmenero, F. Chemistry and Physics of Comminuted Meat Products. Non-meat proteins. En: En- cyclopedia of Meat Sciences. 2ª Ed. Elsevier: Oxford (con el editor). Nuñez M., Medina M. (2012). Elimination of pathogenic bacteria in cheese by high pressure processing. Handbook of Cheese in Health: Production, Nutrition and Medical Sciences. Wageningen Academic Publishers (in press). Guix, S., Bosch, A. and Pintó, R.M. Astrovirus taxonomy. En: Astrovirus research, S. Schultz-Cheery (Ed.). Elsevier (in press). López-Campos G, Martínez-Suárez J V, Aguado-Urda M, López-Alonso V (2012). Microarray detection and characterization of bacterial foodborne pathogens. SpringerBriefs in Food, Health, and Nutrition Series. ISBN 978-1-4614-3249-4, 126 pág. Springer New York. Springer Science+Business Media, LLC 2012 A.Bosch, S. Guix R.M. Pintó. Epidemiology of Human Astroviruses. En: Astrovirus Research: Essential Ideas, Everyday Impacts, Future Directions. 2013. S. Schultz-Cherry (Ed.), Springer Science+Business Media, New York, 2013, pp 1-18, DOI 10.1007/978-1-4614-4735-1_6. Cabeza, M.C. Pasteurización de tortilla española mediante ionización electrónica. En “Avances en Micro- biología de Alimentos” Ed.: E. Gonzáles-Fandos. Universidad de la Rioja Carballo J. (2011). Productos cárnicos para el siglo XXI: seguros, nutritivos y saludables” págs. 135-138. Eds: Ordóñez, J.A., Ventanas, J. y Córdoba, J.J. Universidad de Extremadura (Servicio de Publicacio- nes). Cáceres. ISBN: 978-84-7723-949-9. Yangüela, J. (2011). Productos cárnicos para el siglo XXI. Seguros, nutritivos y saludables. Pág. 81-84. Eds: Ordóñez, J.A., Ventanas, J. y Córdoba, J.J. Universidad de Extremadura (Servicio de Publicaciones). Cáceres. ISBN: 978-84-7723-949-9. Herrero, A., Carmona P, Jiménez-Colmenero F, Ruiz-Capillas C. Application of vibrational spectroscopy to study protein structural changes in muscle and meat batter systems/ Applications of Vibrational Spec- troscopy in Food Science. Ed: Li-Chan, E., Chalmers, J. y Griffiths P. John Wiley Sons, Ltd. pp 315- 328. 2010. ISBN: 978-0-470-74299-0. Ortuño, C., Martínez-Pastor, M. Mulet, A., Peña, R., Benedito, J. (2012). Ultrasonic enhanced microbial in- activation using supercritical carbon dioxide. Proceedings 2nd workshop on Food Safety. Valencia. Ruiz J. y Calvarro, J. (2011) Estudio de nitrosaminas en productos cárnicos mediante microextracción en fase sólida (SPME) Productos cárnicos para el siglo XXI: Seguros, nutritivos y saludables pp: 133-137. Servicio de Publicaciones UEx. (ISBN: 84-95872-57-9)
- 206. 206 Apéndice II. Publicaciones Carballo, J. (2012). Empleo de nitratos y nitritos en productos cárnicos. Anales de la Real Academia de Ciencias Veterinarias. Editado por RACVE. Madrid (España). Volumen XX, número 20, pg. 101-120 (ISSN 1135-2795) (Depósito legal M-10.620-1995) Carballo, J. (2013). Empleo de nitratos y nitritos en productos cárnicos. En Anales de la Real Academia de Ciencias Veterinarias. Editado por RACVE. Madrid (España). Volumen XX, número 20, pg. 101-119 (ISSN 1135-2795)(Depósito legal M-10.620-1995). Artículos científicos El número de publicaciones por año y con índice de impacto superior a 0,500 realizadas por el total de los investigadores del proyecto es el siguiente: Factor de impacto Número de publicaciones 2008 2009 2010 2011 2012 2013 TOTAL C P C P C P C P C P C P C P 1er cuartil ( 1.579) 4 10 5 34 10 32 20 41 0 51 0 39 39 207 2º y 3er cuartil (1,578) 11 2 15 6 15 3 20 8 0 5 0 2 61 26 TOTAL 15 12 20 40 25 35 40 49 0 56 0 41 100 233 C: Comprometidas según consta en el Convenio de Ejecución firmado con el MEC. P: Artículos publicados. * Publicadas, DOI, en prensa. ** Enviados, en evaluación y en preparación. Publicaciones 2008 Cáceres, E., García, M.L. and Selgas, M.D. 2008. Conventional and reduced-fat cooked meat sausages en- riched with folic acid. Fleischwirtschaft 23 (5), 58-60. Cáceres, E., García, M.L. and Selgas, M.D. 2008. Effect of pre-emulsified fish oil – as source of PUFA n-3 – on microstructure and sensory properties of mortadella, a Spanish bologna-type sausage. Meat Science 80, 183-193. Calvo, M.M and Santa-María, G. 2008 Effect of illumination and chlorophylls on stability of tomato carote- noids. Food Chemistry 107, 1365-1370. Calvo, M.M., Garcia, M.L. and Selgas, M.D. 2008 Dry fermented sausages enriched with lycopene from tomato peel. Meat Science 80, 167-172. Herrero, A.M., Carmona, P, Cofrades, S, Jiménez-Colmenero, F. 2008. Raman spectroscopic determination of structural changes in meat batters upon soy protein addition and heat treatment. Food Research International 41, 765-772. Herrero, A.M., Carmona, P., López-López, I., Jiménez-Colmenero, F. 2008. Raman spectroscopic evaluation of meat batter structural changes induced by thermal treatment and salt addition. Journal of Agriultu- ral and Food Chemistry 58, 7119-7124. Hoz, L., Cambero, M.I., Cabeza, M.C., Herrero, A. M. y J. A. Ordóñez. 2008. Elimination of Listeria mono- cytogenes from vacuum-packed dry-cured ham by E-beam irradiation. Journal of Food Protection. 71, 2001-2006. Jofré A., Aymerich T, Monfort J.M, Garriga M. 2008. Application of enterocins A and B, sakacin K and nisin to extend the safe shelf-life of pressurized ready to eat meat products. European Food Research Te- chnology 228:159-162. Morales P., Calzada J., Ávila M., Nuñez M. 2008. Inactivation of Escherichia coli O157:H7 in ground beef by single-cycle and multiple-cycle high pressure treatments. Journal of Food Protection 71, 811-815. Olmo A., Morales P., Nuñez M. 2008. Bactericidal effect of lactoferrin and its amidated and pepsin digested derivatives on Pseudomonas fluorescens: influence of environmental and physiological factors. Jour- nal of Food Protection 71, 2468-2474.
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- 221. Avances en la producción de elaborados cárnicos Seguros y saludables Instituciones participantes en CARNISENUSA Avancesenlaproduccióndeelaboradoscárnicos Segurosysaludables Editores: Juan Antonio Ordóñez Pereda, Francisco Jiménez Colmenero, Jacint Arnau Arboix JuanAntonioOrdóñezPereda, FranciscoJiménezColmenero, JacintArnauArboix Centros: Industrias: El Pozo, Campofrio, COVAP, FACCSA-PROLONGO y CONFECARNE Patrocinadores de la edición: Universidad Complutense de Madrid (UCM) Coordinador Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA) Universidad de Navarra (UN) Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (IRTA) Gestor Universidad de Barcelona (UB) Universidad Politécnica de Valencia (UPV) Centro Tecnológico AINIA Universidad de Extremadura (UEX) Universidad de Zaragoza (UNIZAR) Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN-CSIC) Universidad de León (ULE)