Biología molecular parte i
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Este documento resume los principales avances en el desarrollo de la biología molecular desde finales del siglo XIX hasta la actualidad. Describe hitos clave como el aislamiento del ADN, el descubrimiento de su estructura de doble hélice por Watson y Crick, y el desarrollo de métodos como la reacción en cadena de la polimerasa, la secuenciación del ADN y la ingeniería genética. Estos avances han permitido estudiar agentes infecciosos a nivel molecular y desarrollar nuevas técnicas para el diagn
Biología molecular parte i
- 1. 14 Rev Chil Infect (2002); 19 (1): 14-24 INFECTOLOGÍA AL DÍA Biología molecular en Infectología Parte I: Desarrollo y metodologías ALEJANDRO CORVALÁN R.* MOLECULAR BIOLOGY IN INFECTIOUS DISEASES. PART I. DEVELOPMENT AND METHODOLOGIES Eventhough Molecular Biology was iniciated at the end of the XIX century, the discovery of the structure of DNA is considered the beginning of this field. Advances during 1960-1970 produced methods and technologies to study microorganisms at molecular level. In particular, the discovery of DNA polymerase and the specificity of DNA reanaturation are the bases for Polymerase Chain Reaction, Transcription Mediated Amplification, and Branched DNA methods useful for diagnosis and direct quantitation of infectious agents. Finally, the complete genome sequence should ultimately result in new methods for diagnosing and treating infectious diseases. Key words: Infectious diseases, Molecular biology, Molecular methods. * Laboratorio de Biología Molecular Clínica Las Condes, Unidad de Desarrollo Instituto de Salud Publica de Chile e Instituto Chileno Japonés de Enfermedades Digestivas Hospital Clínico San Borja-Arriarán. Financiamiento: Proyecto Métodos de Vigilancia Epidemiológica, Subdirección Académica Clínica Las Condes 2000. INTRODUCCIÓN La biología molecular es una disciplina de la bioquímica que estudia, entre otras, las molécu- las de ácidos nucleicos, el ácido desoxirribonu- cleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN). Los orígenes de la biología molecular se pueden rastrear hasta el siglo pasado pero histórica- mente se considera la descripción de la estruc- tura de doble hebra del ADN como el origen de esta disciplina.1 Los avances más relevantes de la biología molecular se muestran en la Tabla 1. Se observa que a partir de la descripción de Watson y Crick se produjo una creciente acu- mulación de descubrimientos, especialmente en la década de 1960, que nos permiten hoy tener las herramientas necesarias para estudiar agen- tes infecciosos a nivel molecular.2 Hitos en el desarrollo de la biología molecular El aislamiento de la molécula de ADN se realizó por primera vez en 1869, a partir de núcleos aislados de linfocitos humanos y se denominó “nucleina”.3 Diez años más tarde Koseel demostró que la nucleina estaba com- puesta por 4 bases orgánicas, adenina, guanina, timina y citosina y, en 1924, Fuegel desarrolló un marcador químico para demostrar por microscopia de luz que el ADN estaba en el núcleo de todas las células de distintas espe- cies.3 En 1944 Avery, MacLeod y McCarty
- 2. 15 demostraron que en el ADN estaba la informa- ción responsable de la herencia.4 Sin embargo, este descubrimiento no tuvo mayor impacto en su época ya que en ese momento se creía que el contenido de las cuatro bases era similar en todas las moléculas de ADN y por lo tanto no explicaba la diversidad genética.3 En 1950 Chargaff demostró que la composición química del ADN variaba enormemente entre un orga- nismo y otro, y que a pesar de ello, siempre existía una concentración molar equivalente en- tre adenina - timina y citosina - guanina.5 En 1953, basándose en este descubrimiento y utili- zando datos de difracción de rayos X, Watson y Crick propusieron el modelo de doble hebra para la estructura del ADN.1,6 En este modelo las bases nitrogenadas de cada hebra forman una cadena unidas por grupos fosfatos externos e internamente las bases interactúan con bases complementarias (adenina - timina y citosina - guanina) de la otra hebra a través de enlaces de hidrógeno. El descubrimiento de Watson y Crick permitió conocer la estructura del ADN y com- prender el mecanismo de la herencia, en el que cada hebra sirve de molde para su propia replicación (replicación semiconservativa) y es considerado como el inicio de la biología molecular.6 En 1960, Kronberg aisló y purificó la enzima responsable de la replicación del ADN, la ADN polimerasa.7 El descubrimiento de esta enzima permitió definir elementos críticos para la síntesis de la molécula de ADN, en particular el sitio de inicio de la síntesis formado por ADN de doble hebra. Este descubrimiento es la base para todos los métodos de síntesis de ADN in vitro como la reacción de polimerasa en cade- na. Ese mismo año, Doty et al8 descubrieron las propiedades de hibridación del ADN. Contra- riamente a lo pensado en esa época, que la separación por calor del ADN doble hebra (denaturación) era un fenómeno irreversible, estos investigadores observaron que si el ADN Biología molecular en Infectología - A. Corvalán R. Tabla 1. Principales avances de la biología molecular Año Avance Autor 1869 Aislamiento de la molécula de ADN Meisher 1944 El ADN es la molécula de la información genética Avery 1953 Modelo de doble hebra del ADN Watson y Crick 1957 Aislamiento y purificación de la enzima ADN polimerasa Kornberg 1961 Descubrimiento de la denaturación y renaturación del ADN Doty y Marmur 1962 Aislamiento y purificación de las enzimas de restricción Arber 1966 Descubrimiento del código genético Niremberg, Ochoa y Khorana 1967 Aislamiento y purificación de la enzima ADN ligasa Gellert 1972 Desarrollo de las técnicas de clonación de ADN Boyer, Cohen y Berg 1975 Hibridación de ADN con sondas secuencia específica Southern 1977 Métodos de secuenciación de ADN Sanger y Barrel Maxam y Gilbert 1981 Primeros animales transgénicos Palmiter y Brinster 1985 Invención de la reacción de polimerasa en cadena Mullis 1997 Secuenciación de genomas bacterianos completos Tomb, Cole y Parkill 2001 Secuenciación del genoma humano Venter y Collins
- 3. 16 denaturado era llevado a 65o C, se volvía a formarADNdoblehebra.Estosautoresdenomi- naronestefenómenorenaturaciónohibridación del ADN8 y incluso demostraron que podía ocurrirentremoléculasdeADNyARNconuna sensibilidadde1:100.000.Eldescubrimientode Dotyetalsentólasbasesparatodoslosmétodos de hibridación utilizados actualmente con la única diferencia de que en los métodos actuales se introduce un fragmento de hebra simple, denominado “sonda”, el que al estar en una concentración mayor al ADN doble hebra y producirse la renaturación, forma un híbrido “sonda:ADN”.7 En 1962, Arber aisló y purificó enzimas que cortaban el ADN en secuencias específicas.9 Estasenzimasteníanlaparticulari- daddereconocersecuenciaspalindrómicasenel genoma y cortar ambas hebras. La función de estas enzimas es proteger a las bacterias de infecciones virales degradando el ADN viral.10 La utilización de estas enzimas en análisis de ADN permitió cortar esta gran molécula en fragmentos mas pequeños y específicos y así estudiarlaenregionesdiscretas.Posteriormente, el descubrimiento de enzimas con capacidad de unir fragmentos de ADN, la ADN ligasa11 dio origen a moléculas de ADN recombinante. Al combinar el corte con enzimas de restricción en dosmoléculasdiferentesyreunirlosfragmentos generados utilizando la ADN ligasa, se crearon las primeras moléculas de ADN recombinante dando origen a la ingeniería genética.11 En 1975, Southern12 desarrolló un método para fijar ADN digerido por enzimas de restric- ción a un soporte sólido y realizar en él, la hibridación con sondas específicas. Esta técni- ca se basa en la separación del ADN por migra- ción electroforética a través de un polímero, usualmente agarosa, y posteriormente transfe- rirlo y fijarlo a una membrana de nitrocelulosa. La técnica desarrollada se llamó Southern-blot y la extensión de esta metodología a ARN se denominó Northern-blot y a proteínas, Western- blot.7 Otras variaciones de este método, que no utilizan la separación electroforética, se deno- minan dot-blot o slot-blot.7 Entre 1975 y 1977 dos grupos, Sanger et al13 y Maxam y Gilbert,7 desarrollaron métodos de secuenciación del ADN. Ambos métodos difieren en que uno per- mite leer el código genético rompiendo la molé- cula de ADN en nucleótidos específicos y el otro, incorporando nucleótidos que bloquean la extensión de la síntesis de ADN7 (Figura 1) Este último método es el más utilizado actual- mente, en particular, en los métodos de secuenciación automática Taq polimerasa Taq polimerasa Taq polimerasa Taq polimerasa templado templado templado templado partidor partidor partidor partidor dATP dCTP dATP, dCTP dATP, dCTP dATP dGTP dGTP dTTP dGTP dTTP dGTP, dTTP dGTP dTTP ddATP ddCTP ddGTP ddTTP CGTATA CGTATAC CGTATACAG CGTAT CGTATACA CGTATACAGTC CGTATACAGTCAG CGTATACAGT CGTATACAGTCA CGTATACAGTCAGGTC CGTATACAGTCAGG CGTATACAGTCAGGT A C G T Figura 1. Método de secuenciación de Maxam y Gilbert. La secuencia (CTGCATGGGCGGC- ATGAACCG) será la utilizada como templado, el partidor (CTCGAT) definirá la región a amplificar, los reactivos dNTP son los cuatro deoxinucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) utilizados en la reacción de secuenciación, los reactivos ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP son los cuatro dideoxinucleótidos que se incorporan en forma única en cada tubo de reacción y que bloquean la extension de la reacción de secuenciación al no permitir la incorporación de nuevos dNTP. Biología molecular en Infectología - A. Corvalán R.
- 4. 17 * Nota del Editor: PCR sigla utilizada en este artículo y universalizada en la literatura científica aunque en español se había acuñado con anterioridad con otra acepción indicada en el listado de abreviaturas de esta publicación. templado 1 templado 2 alineamiento denaturación extensión (ADN polimerasa) amplificación exponencial templado 1 templado 2 templado 3 templado 4 partidor partidor Figura 2. Reacción de polimerasa en cadena. Cada hebra de ADN (templado) sirve como molde para la amplificación y sólo la región comprendida entre ambos partidores será amplificada en forma exponencial. Cada ciclo se divide en tres etapas: denaturación, alineamiento y extensión, al final de las cuales se generan nuevos templados los que son utilizados en el ciclo siguiente. En 1985, Mullis reunió algunas de las metodo- logías mencionadas para realizar síntesis de ADN in vitro en forma exponencial, denomi- nando este método reacción de polimerasa en cadena (en inglés Polymerase Chain Reaction: PCR*).14 Esta metodología es considerada como una revolución dentro la biología molecular ya que con la amplificación exponencial es posible el análisis de moléculas de ADN o ARN, a partir de mínimas cantidades de muestras. Métodos de biología molecular Reacción de polimerasa en cadena El método de PCR se basa en ciclos de am- plificación exponencial de un fragmento especi- fico de ADN. Este fragmento está determinado por secuencias introducidas en la reacción, de- nominadas “partidores”, y a partir de los cuales la enzima ADN polimerasa, realiza la síntesis exponencial (Figura 2). Cada ciclo de amplifi- cación consta de tres etapas: denaturación, ali- neamiento y extensión. La denaturación se rea- liza a 95o C y la separación conseguida permiti- rá que cada hebra sirva como molde o templado para la síntesis de una nueva molécula de ADN. El tiempo de denaturación depende del largo del templado, y generalmente dura entre 30 segun- dos y 1 minuto. Debido a que al comienzo de la amplificación es necesario separar todo el ADN de la muestra analizada, inicialmente se realiza una incubación de 5 minutos a 95o C por una sola vez. Después de la denaturación sigue la etapa de alineamiento entre el ADN templado y los partidores. Esta etapa se basa en el principio de la renaturación de Doty et al8 ya que ocurre al llevar la reacción a 45o C - 60o C. Sin embar- Biología molecular en Infectología - A. Corvalán R.
- 5. 18 go, dado que los partidores están en mayor concentración que el templado, se favorecerá el alineamiento entre templado: partidor por sobre templado: templado. El ADN doble hebra for- mado (templado: partidor) definirá el sitio de acción de la ADN polimerasa o extensión, eta- pa en la cual esta enzima unirá nucleótidos libres en forma complementaria a la secuencia del templado. La extensión ocurre a 72o C que es la temperatura de máxima eficiencia de la enzima y el tiempo de la extensión dependerá de la distancia de los partidores entre sí. En gene- ral se ha calculado que la ADN polimerasa es capaz de incorporar 60 nucleótidos por segun- do a 70o C,15 por lo que un minuto es tiempo suficiente para incorporar alrededor de 1.000 pares de bases. Ya que se ocupan dos partidores en la reacción, uno para cada hebra, y que estos quedan a una distancia de entrecruzamiento durante la síntesis de ADN, el segmento defini- do será amplificado en forma exponencial (Fi- gura 2). Esto significa que en cada ciclo de amplificación se producirá una número de co- pias equivalente al exponente del número de hebras de ADN templado. Así por ejemplo, si al momento de iniciarse la amplificación sólo hay una molécula de ADN doble hebra (2 templa- dos), después de 30 ciclos de amplificación se habrán generado 230 copias de ADN. Este nú- mero corresponde a 1,097,736,000 copias del segmento flanqueado por los partidores. El ele- mento mas crítico de la amplificación por PCR es el alineamiento. Dado que este fenómeno se basa en la complementariedad entre las bases nitrogenadas del templado y del partidor, ésta es una unión alterada por varios factores, entre otros la temperatura (Figura 3). La figura mues- tra el impacto de la variación de 5o C con rela- ción a la cantidad de templado en la especifici- dad de la reacción. La importancia de la ampli- ficación por PCR en Infectología se basa en que con esta magnitud de amplificación es posible el análisis de moléculas de ADN o ARN, a partir de mínimas cantidades de muestras. Así por ejemplo, si consideramos que una bacteria contiene 1 fg (10-9 g) de ADN, la amplificación por PCR permitirá generar alrededor de 0,1 µg (10-6 g) de una región especifica de ADN bacteriano. En la práctica, este método permite identificar secuencias presentes entre 10 y 50 copias en una muestra clínica y sin condiciones especiales de mantención. Aunque la PCR per- mite la amplificación de ácidos nucleicos, la visualización del producto amplificado requiere de otras metodologías posteriores a la amplifi- cación. El método más utilizado es la electroforesis de agarosa, técnica descrita por Southern12 en el que el producto, sometido a corriente eléctrica, migrará de acuerdo a su tamaño. Sin embargo, este es un método indi- recto, porque sólo indica el tamaño del amplifi- cado. La visualización directa requiere de mé- todos que “lean” la secuencia del amplificado. Entre estos métodos están cortes con enzimas de restricción, hibridación con sondas específi- cas (Southern-blot) o secuenciación del pro- ducto de PCR. El corte con enzima de restric- ción consiste en incubar el producto con enzimas de restricción que reconozcan secuencias palindrómicas dentro del producto amplificado y luego visualizarlo por electroforesis. Después de la digestión se observarán dos fragmentos, los que sumados equivaldrán al fragmento del producto sin digestión. La hibridación con son- das es el más utilizado en los kits comerciales y aunque tradicionalmente consiste en la técnica de Southern-blot, en los métodos comerciales se utiliza el formato ELISA, en el que la sonda esta fijada en los pocillos de la microplaca Biología molecular en Infectología - A. Corvalán R. 63C 65C 68C amplificación específica amplificación inespecífica Figura 3. Efecto de la temperatura de alineamiento en la especificidad de la reacción de polimerasa en cadena. La amplificación se realizó para citomegalovirus (100 co- pias) en tres condiciones de alineamiento (63, 65 y 68° C). Se observa que a mayor temperatura desapare- cen las amplificaciones inespecíficas, quedando sólo la banda específica de citomegalovirus. 63°C 65°C 68°C
- 6. 19 (Figura 4). La secuenciación (ver más adelante) sólo se ocupa como método de referencia. Uno de los mayores problemas de la amplificación por PCR es la inhibición, esto porque existen numerosos factores que anulan la actividad de la ADN polimerasa.16 En general la proporción de inhibición reportado es de alrededor del 5%, sin embargo, esta varía desde 3% para mues- tras de sangre periférica hasta 18,5% para mues- tras de anatomía patológica (tejido fijado en formalina e incluido en parafina) (Tabla 2). Una variación y automatización de la PCR es la amplificación en tiempo real o Light-Cycler System. Esta tecnología desarrollada en 199617, 18 se basa en la emisión de fluorescencia durante la extensión de la ADN polimerasa,19 lo cual permite el monitoreo continuo en cada ciclo de amplificación (Figura 5). Dado que la cantidad de fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de amplificación, este método es ideal para la cuantificación de ADN y ARN. Además Biología molecular en Infectología - A. Corvalán R. una vez generado el producto, es posible monitorear su secuencia dado que la cinética de denaturación / renaturación del producto es se- cuencia dependiente y por lo tanto no son nece- sarios métodos adicionales para su visualiza- ción.19 En este método también es posible intro- ducir sondas específicas para confirmar el pro- ducto amplificado lo cual aumenta su especifi- cidad. Dado que este sistema utiliza tubos capi- lares, cada etapa de amplificación es significa- tivamente más corta que en la amplificación convencional, reduciendo el tiempo total de am- plificación a sólo 30 minutos.20 Amplificación isotérmica La amplificación isotérmica consiste en con- vertir, en forma cíclica, una molécula de ARN a ADN doble hebra y a partir de ella, realizar la transcripción a ARN, el cual sirve de templado Figura 4. Hibridación en microplaca tipo ELISA. Este método de confirmación de la reacción de polimerasa en cadena se basa en etapa 1: unión de la sonda marcada con biotina (B) al pocillo de ELISA a traves de streptoavidina (S), etapa 2: hibridación, del producto amplificado marcado con digoxigenina (D) a la sonda, etapa 3: inmunodetección del producto amplificado por anticuerpos antidigoxigenina conjugados con fosfatasa alcalina (E) y etapa 4: revelado, en el que se agrega un sustrato el cual precipita generando un color que es visualizado por lectura espectrofotométrica. (Cortesía BIOS-Chile I.G.S.A.) SS BB 1.- Unión de sonda al pocillo1.- Unión de sonda al pocillo SS BB DD AmplificadoAmplificado marcadomarcado 2.- Hibridación2.- Hibridación DD 3.-3.- InmunodetecciónInmunodetección SS BB DD EE DD EE 4.- Revelado4.- Revelado SustratoSustrato ColorColor SS BB DD EE DD EE
- 7. 20 Tabla 2. Inhibiciones en amplificación por reacción de polimerasa en cadena Exámenes Inhibiciones Muestra N % N % Sangre periférica 398 62,9 12 3,0 Inclusión en parafina 54 8,5 10 18,5 Líquido cefalorraquídeo 53 8,4 2 3,8 Tejido fresco 32 5,1 3 9,4 Secreción bronquial 22 3,5 1 4,5 Lavado broncoalveolar 16 2,5 2 12,5 Aspirado nasofaríngeo 7 1,1 0 0,0 Orina 3 0,5 0 0,0 Otros 48 4,1 4 8,3 Total 633 100,0 34 5,4 Figura 5. Método de amplificación en tiempo real. Este sistema se caracteriza por la presencia de una sonda doblemente marcada en 5‘ con un fluoróforo de reporte y en 3‘ con un fluoróforo de ocultamiento (etapa 1). Durante la extensión, la ADN polimerasa hidroliza esta sonda liberando el fluoróforo de reporte (etapa 2). La cantidad de fluoróforo liberado es proporcional a la cantidad de producto de PCR amplificado. para un nuevo ciclo de amplificación21,22 (Figu- ra 6). En la amplificación isotérmica se requie- ren dos partidores, que definen el ARN mensa- jero a amplificar, y uno además contiene una secuencia denominada “promotora” para la en- zima que realiza la transcripción (ARN polimerasa). Además de la ARN polimerasa participan otras dos enzimas, la transcriptasa reversa y la ARNasa H (Figura 6). Este método sólo amplifica ARN y su principal aplicación clínica está en el diagnóstico de agentes infec- ciosos23,24 y la cuantificación de la carga viral de virus ARN (VHB, VHC y VHI).25,26 La cuantificación de ARN se realiza co-amplifi- cando el ARN de la muestra en forma conjunta con calibradores internos o ARN de concentra- ción conocida y se mide mediante electroquimio- luminiscencia.27 Biología molecular en Infectología - A. Corvalán R. sonda con marcación partidor doble templado partidor fluoróforo liberado durante partidor la extensión templado partidor 5` 3` 5` 3` etapa 1 etapa 2
- 8. 21 Hibridación de ADN ramificado (Branched DNA) La metodología de hibridación con ADN ra- mificado o branched DNA (bDNA) se basa en hibridaciones consecutivas de sondas que reco- nocen por una parte la secuencia de ADN o ARN en estudio y por otra, secuencias introdu- cidas a la reacción para amplificar la señal de hibridación (Figura 7).28 En este método la vi- sualización del ADN blanco no depende de un proceso enzimático, como en la reacción de polimerasa en cadena, sino de la amplificación de la señal de hibridación. Esta metodología es altamente reproducible y se utiliza clínicamente en la cuantificación de carga génica en pacien- tes portadores del VIH, VHB y VHC.30, 31 cDNA microarray LatecnologíadecDNAmicroarraysebasaen la incorporación en un chip, similar al utilizado en computación, de 5.000 a 8.000 sondas que representanlatotalidaddelosgenesexpresados por un microorganismo.32,33 De este modo se puede identificar los patrones de expresión bacteriana de acuerdo a distintas condiciones fisiológicasopatológicas.ElprincipiodecDNA microarray es la hibridación, pero a diferencia de los métodos tradicionales, se utilizan múlti- ples sondas, las que unidas a un sistema cuanti- tativo de análisis, permiten identificar patrones deexpresióngénica.33 Estametodología,aunque aún se encuentra a nivel experimental, tiene una proyección tan importante en clínica como la PCR. Biología molecular en Infectología - A. Corvalán R. Figura 6. Método de amplificación isotérmica. En este método, el proceso comienza con la hibridación entre el ARN en estudio y el partidor 1, que contiene el sitio promotor para la ARN polimerasa (etapa 1). A partir de esta hibridación, la transcriptasa reversa genera una hebra simple de ADN, denominado ADN copia (cADN), creando un híbrido ARN: cADN (etapa 2). El ARN de este híbrido es degradado por la ARNasa H, quedando el cADN hebra simple, el cual se une al partidor 2 (etapa 3). A partir de este partidor y por acción de la transcriptasa reversa se produce la hebra complementaria generando ADN doble hebra. A partir del sitio promotor contenido en el partidor 1, se realiza la transcripción a ARN por la ARN polimerasa (etapa 4) generando múltiples templados de ARN, los cuales son utilizados como templados para repetir el proceso. ARN ADN ARN ADN partidor 2 ADN ARN partidor 1 miles de copias de ARN transcriptasa reversa ARNase H transcriptasa reversa ARN polimerasa etapa 1 etapa 2 etapa 3 etapa 4 secuencia promotor para ARN polimerasa
- 9. 22 templado sonda de captura fase sólida sonda de amplificación sondasderevelado Figura 7. Método de ADN ramificado (branched DNA) para cuantificación de ácidos nucleicos. El proceso co- mienza con la hibridación de las sondas de captura a una fase sólida. A continuación se produce la reacción de hibridación entre las sondas de captura y el ADN o ARN en estudio, lo cual es seguido de la introducción de la sonda de amplificación que contiene múltiples sitios para las sondas de revelado. Estas últimas están conju- gadas con moléculas quimioluminiscentes de modo que la cantidad de luz emitida es proporcional a la cantidad de ADN o ARN hibridado. Figura 8. Potenciales aplicaciones clínicas de la secuenciación de genomas de microorganismos Secuenciación Los métodos de secuenciación permiten “leer” el código genético de un microorganismo. Las principales aplicaciones de la secuenciación en Infectología están en la identificación de nuevos patógenos, la caracterización de brotes epidé- micos y la identificación de patrones genéticos que determinan la resistencia a terapia.34 Específicamente, la resistencia de la transcrip- tasa reversa y proteasa a fármacos antivirales en pacientes VIH,35 resistencia a ganciclovir en citomegalovirus36 y resistencia a rifampicina en Mycobacterium tuberculosis,37 son algunas las aplicaciones clínicas más importantes de la secuenciación. Finalmente la secuenciación ha permitido conocer el genoma completo de microorganismos tales como Neisseria menin- gitidis,38 M. tuberculosis,39 Clostridium perfrin- gens,40 Streptococcus pyogenes41 y Helicobacter Biología molecular en Infectología - A. Corvalán R. microorganismo secuenciación genoma banco de genes bioinformática (análisis e identificación de genes y comparación con información genómica de otros microorganismos) desarrollo de nuevos agentes terapéuticos y/o vacunas pruebas en animales ensayos clínicos
- 10. 23 pylori.42 La posibilidad de analizar el genoma completo de micro-organismos está permitien- do estudiar las interacciones microorganismo- huésped y con la ayuda de herramientas computacionales (bioinformática) desarrollar nuevos agentes terapéuticos y vacunas.43 RESUMEN El origen de la biología molecular se puede rastrear hasta fines del siglo XIX; sin embargo, el descubrimiento de la estructura del ADN se considera como el inicio de esta disciplina. Los avances producidos por la biología molecular en la década del ´60 nos permiten contar hoy con herramientas para el estudio de microorga- nismos a nivel molecular. En particular, el des- cubrimiento de la ADN polimerasa y las pro- piedades de hibridación del ADN son algunos de los descubrimientos que aplicados hoy día en la reacción de polimerasa en cadena, la amplifi- cación isotérmica y la hibridación con ADN ramificado, se han transformado en herramien- tas útiles en el diagnóstico y cuantificación de agentes infecciosos. Finalmente la secuenciación de genomas bacterianos completos permitirá el desarrollo de nuevos métodos para el diagnósti- co y tratamiento de enfermedades infecciosas. BIBLIOGRAFÍA 1.- WATSON J D, CRICK F H C. A structure for Deo- xiribose Nucleic Acid. Nature 1953: 171; 737-8. 2.- CORVALAN, A. Biología Molecular Fundamentos y aplicaciones diagnosticas. Rev Méd Clínica Las Condes 1997; 8: 4-9. 3.- FREIFELDER D M. The DNA molecule Structure and Properties. WH Freeman, 1978 pp: 1-7. 4.- AVERY O, MACLEOD C, MCCARTY M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. J Exp Med 1944; 79: 137-57. 5.- CHARGAFF E. Chemical specificity of nucleic acids and mechanism of their enzymatic degradation. Experentia 1950; 6: 201-9. 6.- FIERRO A. Breve historia del descubrimiento de la estructura del ADN. Rev Méd Clínica Las Condes 2001; 20: 71-75. 7.- ALBERTS B, BRAY D, LEWIS J, RAFF M, ROBERTS K, WATSON J D. Recombinant DNA technology in:Molecular Biology of the Cell 3th Edition Gardland 1994 pp: 291-334. 8.- DOTY P, MARMUR J, EIGNER J, SCHILDKRAUT C. Strand separtation and specific recombination in deoxyribonucleic acids: physical chemical studies. Proc Natl Acad Sci USA 1960; 46: 461-76. 9.- WATSON J D, TOOZE J. The DNA story: A docu- mentary history of gene cloning. New York: WH Freeman, 1981 10. NATHANS D, SMITH H J O. Restricction endo- nucleases in the analysis and restructuring of DNA molecules. Ann Rev Biochem 1975: 44; 449-67. 11.- GILBERT W, VILLA-KOMAROFF L. Useful proteins from recombinant bacteria. Sci Am 1980; 242: 74-94. 12.- SOUTHERN E M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol 1975; 98: 503-17. 13.- SANGER F, NICKLEN S, COULSON A R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74: 5463-7. 14.- MULLIS K B. The unusual origin of the polymerase chain reaction. Sci Am 1990; 262: 56-61, 64-5. 15. INNIS M A, MYAMBO K B, GELFAND D H, BROW M A. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA. Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85: 9436-40. 16.- BEN-EZRA J, JOHNSON DA, ROSSI J, COOK N, WU A. Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction. J Histochem Cytochem 1991; 39: 351-4. 17.- GIBSON U E, HEID C A, WILLIAMS P M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res 1996; 6: 995-1001. 18.- HEID C A, STEVENS J, LIVAK K J, WILLIAMS P M. Real time quantitative PCR. Genome Res 1996; 6: 986-94. 19.- LIVAK K J, FLOOD S J, MARMARO J, GIUSTI W, DEETZ K. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Appl. 1995; 4: 357-62. 20.- JUNG R, SOONDRUM K, NEUMAIER M. Quanti- tative PCR. Clin Chem Lab Med. 2000; 38: 833-6. 21.- KIEVITS T, VAN GEMEN B, VAN STRIJP D, SCHUKKINK R et al. NASBA isothermal enzymatic in vitro nucleic acid amplification optimized for the diagnosis of HIV-1 infection. J Virol Methods 1991; 35: 273-86. 22.- ROMANO J W, VAN GEMEN B, KIEVITS T. NASBA: a novel, isothermal detection technology for qualitative and quantitative HIV-1 RNA measurements. Clin Lab Med 1996; 16: 89-103. 23.- MAHONY J B, SONG X, CHONG S, FAUGHT M, SALONGA T, KAPALA J. Evaluation of the Nucli- sens Basic Kit for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in genital tract specimens using nucleic acid sequence-based amplification of 16S rRNA. J Clin Microbiol 2001; 39: 1429-35. Biología molecular en Infectología - A. Corvalán R.
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