Deteccion de mutaciones con tecnicas de genetica

Detección de Mutaciones
Detección de Mutaciones

Definición
 Cualquier cambio heredable del genoma
 Los cambios pueden ser a diferentes niveles:
 A nivel de genes: mutaciones génicas o
puntuales
 A nivel de cromosomas: cambio en un
segmento de un cromosomas, un cromosoma
entero o inclusive un grupo completo de
cromosomas

Definición de Mutacion:

Es un cambio en una secuencia de DNA comparada con una
secuencia de referencia. Estos cambios pueden ser:

Sustitución de bases

Deleción

Inserción

rearreglos

No necesariamente son “patogénicas”

Y cuando este es el caso, se les conoce
como polimorfismos, por ejemplo los SNPs

Causas
 Espontáneas:
 P.e. errores de al DNA polimerasa
durante la replicación del DNA
(mismatches)

Inducidas
 por agentes mutagénicos
 causan un cambio estructural que
afecta una de las cadenas de la doble
hélice

Lugar
Lugar
 SOMÁTICA
Si la mutación ocurre en una célula que desarrolla
un tejido somático, dará origen a una población de
células mutantes idénticas. Las células idénticas
de una población originada por mitosis a partir de
una sola célula progenitora se denominan clones.
-GERMINAL. Células sexuales

Dominante/Recesiva
 Si la mutación es dominante se expresará en
el fenotipo de aquellos organismos diploides
Si es recesiva no se expresará ya que quedará
enmascarada por el alelo salvajeo silvestre
(dominante), una segunda mutación puede
crear una mutación homocigota recesiva,
pero es un evento raro

¿Son heredables?
 por definición NO SE HEREDAN, ya
que las células somáticas son aquellas
que no origina progenie

Consecuencias en un
organismo multicelular
 Ejemplo. Cáncer
cuando ciertos genes (proto-
oncogenes) sufren una mutación
las células inician una secuencia
descontrolada de divisiones
celulares resultando en una masa de
células denominada tumor.

MUTACIÓN DE LA LÍNEA
GERMINAL
 si la mutación se produce en una
de las células sexuales
inevitablemente pasará a la
descendencia (en tanto ésta
participe de la fecundación)

 Un fenotipo completamente
normal puede tener células
mutantes en su línea germinal y
solo se detectará en su
descendencia

Introducción
Los métodos actuales son tanto fáciles como
sensibles (SSCP,DGGE)
No fueron diseñados para una mutación o un
sistema particular
Existen ya adaptaciones semiautomatizadas

R347H
1154insTC
1058delC
A349V
1078delT
R334W
wild type
F-SSCP

¿Tipos de detección?
 Detección o exclusión de mutaciones
específicas
“Mutation testing” o “genotyping”
 Detección o exclusión de todas las
mutaciones
“Mutation scanning”
 Toda la secuencia
 “scanning” del genoma completo
 Tamizaje en la población

Detección de mutaciones
Pruebas para mutaciones
específicas,
o “genotipificación”

Análisis de mutaciones
Por hibridación: ASO,Molecular Beacons,
Chips
Enzimáticos: RFLP

Oligonucleotidos Alelo-specíficos
dot-blot reverso en el
locus CFTR.

“Arrayed DNA” (“Chips de DNA”)
Se justifica su elaboración cuando
existan las mutaciones en
muchos individuos de una población

Genetic Bit Analysis (Orchid)
SNPstream procesa
continuamente 25 placas
por dia, lo que equivale a
30,000 genotipos por dia
Chip modular con un
“micoarreglador” (reactor arrays) de
96, 384, 1536 and 12,288 (8 x 1536)
que coloca 100-800 nanolitros por
muestra. Este sistema genotipifica
SNPs en rangos de un millos al dia.

In development:
Dot-matrix driven array synthesis (Hewlett-Packard)
“Liquid-phase” arrays (Luminex)

Comparación de las técnicas
SSCP tiene limitaciones técnicas.
a) La sensibilidad es del 70%
b) El tamaño optimo de los fragmentos es 300 pb
c) Condiciones electroforéticas controladas
d) PAGE sin agente desnaturalizante
DGGE
a) Detecta mutaciones heterocigotas y homocigotas
b) La sensibilidad es del 90% y en la variante automatizada 100%
c) Existe software de apoyo

Dosis Génica: Duplicaciones y
deleciones

Multiplex Amplifiable Probe Hybridization
John Armour

CGH
Vysis array scanner
Slides and reagents

PCR semicuantitativo
 Deleciones y duplicaciones del gen de la distrofina
 BRCA1 deleciones y duplicaciones
 APC deleciones
 FRAXA número de copias
 Pérdida o ganancia de alelos en tumore

Tamizaje del genoma completo

Secuenciación
 Totalmente sensible y específico
 Puede compararse el costo $/tiempo
con los métodos de “scaning”?

“GC-clamp”
 Adición de “colas” GC de aproximadamente
50 bases a uno de los primers en el extremo
5’
 Altera la temperatura de desnaturalización
(“melting”)
 GC es un termoestable, por lo que sirve
como el dominio de “sujeción” de la molécula
 Se detecta el100% de moléculas variantes

Nomenclatura
 g se refiere a secuencia genómica
 c cDNA
 m mitocondrial
 r RNA
 p proteina
Dunen T and Antonarakis E. 2001. Hum Genet 109:121-124

  sustitución
 P.e. 76A C
 76A/G
 del
 76_78del o 76_78delACT
 dup
 76_78dup o 76_78dupACT
 ins
 76_77insT
 

SNPs
SNPs Polimorfismos de un solo nucleótido
 Son variaciones de un nucleótido entre las
secuencias de DNA de los individuos
 Esta presente 1 por cada Kb
 Se encuentran en regiones codificantes y
no codificantes
 Puede transmitirse de padres a hijos
 El promedio de mutación por generación
es bajo
 Se utilizan como marcadores genéticos
 Utiles en Farmacogenómica

Ejemplos
 NAT-2 alta incidencia de neuropatia
periférica al tomar isoniazida
 Promotor del gen ALOX5 mala
respuesta al tratamiento con drogas
que actuan en la ruta de 5LO

Desarrollo de un marcador SNP
 Obtención de la secuencia de DNA cercana al
SNP
 Desarrollo de ensayos de PCR para identificar los
segmentos de DNA que contienen el SNP
 Identificación del SNP
 Mapeo del SNP, colocarlo en una posición única
en el genoma
 Determinación de la frecuencia de alelos del SNP
 Desarrollo de una prueba de genotipificación

Métodos utilizados para detectar SNPs
 Computacionales
 Cromatografìa
 Hibridación
 RFLPs
 SSCPs
 Secuenciación

Poblaciones de Referencia
 Asia Central
 Africa Central y del Sur
 América Central y del Sur
 Asia del Este
 Europa
 América del Norte
 Africa del Norte
 Pacífico
 Africa del Oeste
 Multinacional

Organismos estudiados
 Homo sapiens
 Arabidopsis thaliana
 Caenorhabditis elegans
 Ficedula albicollis
 Ficedula hypoleuca
 Gallus gallus
 Mus musculus
 Pan troglodytes
 Plasmodium falciparum
 Rattus norvegicus

Cancer Genome Anatomy
Project
NCI > CGAP > GAI > SNP Maps > Chr 11 > Distribution of SNPs by Chromosome
View Locations of Chromosome 11 Confirmed SNPs
Chromosome:
Tissue: [ ? ]
Histology: [ ? ]
11
kidney
any
Submit
Reset

Multiple sequences were returned for the query "WT1"
Accessio
n
Nucleoti
des
UniGen
e
Gen
e
Description
Motif
s
AA
Chan
ge
NM_00258
3.1
[view]
1719
Hs.176
090
PAW
R
PRKC, apoptosis, WT1,
regulator
none yes
BC007018
.1
[view]
1828
Hs.176
090
PAW
R
PRKC, apoptosis, WT1,
regulator
none yes
NM_00037
8.2
[view]
2970
Hs.114
5
WT1 Wilms tumor 1
WT1
zf-
C2H2
yes
NM_02442
4.1
[view]
3021
Hs.114
5
WT1 Wilms tumor 1
WT1
zf-
C2H2
no
NM_02442
5.1 2979
Hs.114
5
WT1 Wilms tumor 1
WT1
zf-
C2H2
no
View SNPs in the Context of Transcripts, ORFs and Protein Motifs [ more info... ]
Search by:
Search by nucleotide similarity (via BLAST)
[ help ]
genename/description
WT1
Submit
Reset

To view protein sequence alignments, statistics about how SNPs affect the fit of protein
domains to motif models, and three-dimensional structures of motifs (if known), click here.
mRNA: NM_000378.2
UniGene: Hs.1145 (build 156) [ CGAP Gene Info ] [ CGAP SNP Summary ]
Description: Wilms tumor 1
Gene symbol: WT1
LocusLink ID: 7490
See also: NM_024424.1 . NM_024425.1 . NM_024426.1
SNP ID CGAP SNP? Nucleotide cds SNP? Status Primer Set
ss3182143 no 352 no - -
ss3182144 no 384 no - -
ss2419976 no 516 Pro42Pro - -
ss3182145 no 780 Asn130Asn - -
ss3182146 no 931 Pro181Ser - -
ss3182153 no 1194 Gln268Gln - -
ss19159 no 1242 Arg284Arg - -
ss3208469 no 1242 Arg284Arg - -
ss3182158 no 1696 no - -
CGAP-C-889953 yes 1947 no candidate -

L
me Page
ce Primer
ments
mmary
ER
Started
y
est
ENTATION
bmit
mmary Info
chema
s
sity computatio
y
er
es

Submitted SNP(ss) Details
SNP: Handle|local_snp_id: GENAISSANCE | GEN3826 NCBI Assay
Id(ss#): 3182143 Reference SNP Id(rs#): 2234581 STS Information: Not
submitted Batch Detail: Submitter Handle: GENAISSANCE Submitter
Batch ID: 010601 Release Date: Jul 19 2001 10:23AM Molecular type:
Genomic No. of Chromosomes sampled: Not available-Origin Publication
Synonym defined: Organism: Homo Sapiens Population:
GENAISSANCE_POP Submitter Method ID: Sequencing Citation:
Haplotype Variation and Linkage Disequilibrium in 313 Human Genes
View citation details SubSNP Detail: NCBI Assay ID: 3182143 Submitter SNP ID: GEN3826
Synonyms: LOCUSID: Not available Submitter STS ID:
Not submitted STS Accession: not available GenBanK Accession:
AL138811.3 Comment: Variation [C/A] mapped to promoter at nucleotide
position 165496 in AL138811.3. Gene Name: WT1 Length: 201 Flanking
Sequence Information: 5' Assay: TGGGTGCCTA CAGCAGCCAG AGCAGCAGGG AGTCCGGGAC
CCGGGCGGCA TCTGGGCCAA GTTAGGCGCC GCCGAGGCCA GCGCTGAACG TCTCCAGGGC
Observed: C/A 3' Assay: GGAGGAGCCG CGGGGCGTCC GGGTCTGAGC CGCAGCAAAT
GGGCTCCGAC GTGCGGGACC TGAACGCGCT GCTGCCCGCC GTCCCCTCCC TGGGTGGCGG

View Locations of Chromosome 11 Confirmed SNPs
Chromosome:
Tissue: [ ? ]
Histology: [ ? ]

Nomenclatura:
Tipos de polimorfismos
 het variación en la secuencia de un
solo alelo
 in/del ‘ ‘
 mnp polimorfismos en múltiples nt
 Sin variación
 snp verdaderos

Nomenclatura
Código IUPAC Significado
A A
C C
G G
T T
M A o C
R A o G
W A o T
S C o G
Y C o T
K G o T
V A o C o G
H A o C o T
D A o G o T
B C o G o T
N G o A o T o C

 Richard Redon1, Shumpei Ishikawa2,3, Karen R. Fitch4, Lars Feuk5,6,
George H. Perry7, T. Daniel Andrews1,
 Heike Fiegler1, Michael H. Shapero4, Andrew R. Carson5,6, Wenwei
Chen4, Eun Kyung Cho7, Stephanie Dallaire7,
 Jennifer L. Freeman7, Juan R. Gonza´lez8, Mo`nica Grataco`s8, Jing
Huang4, Dimitrios Kalaitzopoulos1,
 Daisuke Komura3, Jeffrey R. MacDonald5, Christian R. Marshall5,6,
Rui Mei4, Lyndal Montgomery1,
 Kunihiro Nishimura2, Kohji Okamura5,6, Fan Shen4, Martin J.
Somerville9, Joelle Tchinda7, Armand Valsesia1,
 Cara Woodwark1, Fengtang Yang1, Junjun Zhang5, Tatiana Zerjal1,
Jane Zhang4, Lluis Armengol8,
 Donald F. Conrad10, Xavier Estivill8,11, Chris Tyler-Smith1, Nigel P.
Carter1, Hiroyuki Aburatani2,12, Charles Lee7,13,
 Keith W. Jones4, Stephen W. Scherer5,6 & Matthew E. Hurles1
Global variation in copy number in the
Global variation in copy number in the
human genome
human genome
Vol 444|23 November 2006| doi:10.1038/nature05329
Vol 444|23 November 2006| doi:10.1038/nature05329

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