EFECTO DE LA APLICACIÓN DE FITOHORMONAS EN EL CULTIVO IN VITRO DE FRESA (Fragaria x ananassa var. Chandler)
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Este documento describe un experimento para evaluar el efecto de diferentes fitohormonas en el cultivo in vitro de explantes de fresa. Se cultivaron explantes en medios suplementados con ácido 2,4-diclorofenoxiacético, kinetina e indolbutirico más benciladenina. La suplementación permitió la formación de callos friables y el desarrollo de brotes viables para la regeneración y multiplicación del tejido vegetal. El cultivo in vitro es una alternativa para la propagación de plantas sanas de fresa y su mejoramiento genético.
EFECTO DE LA APLICACIÓN DE FITOHORMONAS EN EL CULTIVO IN VITRO DE FRESA (Fragaria x ananassa var. Chandler)
- 1. UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL DEL TÁCHIRA VICERRECTORADO ACADÉMICO - DECANATO DE POSTGRADO MAESTRÍA EN AGRONOMÍA PRODUCCIÓN VEGETAL Técnicas Avanzadas de Laboratorio 2016-B EFECTO DE LA APLICACIÓN DE FITOHORMONAS EN EL CULTIVO IN VITRO DE FRESA (Fragaria x ananassa var. Chandler) Vázquez Chacón Jose Yvanosky. Laboratorio de Investigaciones Genéticas. UNET. RESUMEN La ciencia del cultivo de tejidos in vitro debe su origen a la investigación sobre las hormonas que controlan el crecimiento y desarrollo vegetal. Este conocimiento se organizó con las técnicas básicas de microbiología, por las cuales los microorganismos se hacen crecer en medios estériles para su multiplicación e identificación. Desde esta perspectiva se ha desarrollado la tecnología por la cual las plantas se pueden propagar en gran número, haciendo crecer pequeños trozos de tejido vegetal o explantes, sobre una fórmula precisa de nutrientes en un recipiente estéril. A tal efecto, usando un medio de cultivo MS (Murashige y Skoog), se evaluó el efecto de la aplicación de reguladores de crecimiento: auxinas (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) para la inducción de callos, kinetina (KIN) para la elongación celular, y la mezcla de IBA (ácido indolbutirico) con BA (benciladenina) para la multiplicación vegetativa y generación de brotes, sobre el crecimiento de explantes de fresa (Fragaria x ananassa var. Chandler). La suplementación de las diferentes hormonas en el cultivo in vitro permitió la formación de callos friables y desarrollo de brotes viables para la regeneración y multiplicación del tejido vegetal en estudio. Palabras clave: Cultivo de tejidos, embriogénesis, “in vitro”, fitohormonas, fragaria sp. INTRODUCCIÓN El cultivo de células y tejidos vegetales se refiere al conjunto de técnicas usadas para crecer células, tejidos u órganos vegetales in vitro, bajo condiciones asépticas, controladas y libres de microorganismos (Street, 1977; Calva & Ríos, 1999). Se basa en el principio de totipotencia, que indica que cualquier célula vegetal contiene una copia íntegra del material genético de la planta a la que pertenece sin importar su función o posición en ella, y por lo tanto tiene el potencial para regenerar una nueva planta completa (Ferl & Paul, 2000). La aplicación de los cultivos in vitro se puede resumir en los estudios básicos de fisiología, genética, bioquímica y ciencias afines; la bioconversión y producción de
- 2. compuestos útiles; el incremento de la variabilidad genética; la obtención de plantas libres de patógenos; la propagación de plantas; y la conservación e intercambio de germoplasma (Mroginski & Roca, 1991). Para crecer, los explantes requieren una variedad de nutrientes orgánicos e inorgánicos que deben ser suministrados por un medio nutritivo adecuado para su desarrollo. Generalmente, las células en crecimiento pueden fabricar sus proteínas a partir de fuentes adecuadas de nitrógeno y carbohidratos suministrados por el medio de cultivo; sin embargo, existe además una cantidad de sustancias orgánicas adicionales que se requieren en cantidades mínimas y que son muy activas en el crecimiento (Krikorian, 1991), como las hormonas reguladoras del crecimiento. De acuerdo con Jordán & Casareto (2006) la presencia de hormonas en diferentes niveles en las plantas y sus células, permite que éstas desarrollen caminos morfogénicos alternativos muy distintos, los cuales pueden darse todos de acuerdo al grado de ontogenia. Lo más general es que las células en crecimiento por acción de varias hormonas expresen división y elongación celular; sin embargo, y especialmente bajo condiciones in vitro, se ha observado que tales células inician procesos de diferenciación bajo ciertos niveles hormonales, por ejemplo, generación de elementos xilemáticos. Esta propiedad se ha usado en ciencia y tecnología permitiendo regenerar plantas fértiles en forma masiva in vitro a partir de células y a la vez, lograr los avances en ingeniería genética. Al respecto, cultivos como la fresa (Fragaria sp.), planta perteneciente a la familia Rosácea, de alto valor nutritivo, por su contenido de vitamina C, taninos, flavonoides, antocianinas, catequina, quercetina, kaempferol y ácidos orgánicos (cítrico, málico, oxálico) (Hannum, 2004), es ampliamente usada en programas de mejoramiento genético encaminados a obtener variedades de días cortos de porte intermedio y elevada productividad, resistentes a enfermedades de mayor incidencia, con frutos de buen sabor y aroma y de color rojo brillante (Bartual, 2000), a la vez se han aplicado diversas técnicas in vitro como la embriogénesis somática, el cultivo de meristemos y la variación somaclonal que han favorecido la obtención de plantas de mayor vigor y número de estolones. Además, con los avances en la biología molecular se han implementado una serie de herramientas que han permitido de forma rápida y eficiente analizar la diversidad genética existente entre los cultivares de fresa y la caracterización de genes (Kessel, 2012). En efecto, el objetivo de la presente actividad de laboratorio consistió en evaluar la acción de diversos reguladores del crecimiento en el cultivo de tejidos in
- 3. vitro de explantes de fresa (Fragaria x ananassa var. Chandler). MATERIALES Y MÉTODOS Material Vegetal Se utilizaron explantes de fresa (Fragaria x ananassa var. Chandler) procedentes de cultivos y sub-cultivos de tejidos realizados por personal del Laboratorio de Investigaciones Genéticos de la UNET. Al respecto, la variedad Chandler, de origen californiano, se caracteriza por presentar frutos de forma cónica, alargados y un poco planos, con pulpa roja y aromática, robusta y particularmente resistente al transporte (Téllez & Salmerón, 2007). En este contexto, el cultivo de fresa, a nivel nacional, enfrenta inconvenientes a nivel de mejoramiento convencional, debido a la lentitud y alto costo, ya que se requieren entre 10 a 15 años para la creación de una nueva variedad. Aunado a la presencia de enfermedades de tipo viral, el uso de cultivos continuos propagados muchas veces de plantas enfermas, y el costo de adquirir nuevas plantas o semillas, limitan sus niveles de productividad. Una alternativa de solución son las técnicas de cultivos de tejido in vitro, la cual permite una propagación clonal rápida de un gran número de plantas sanas en un periodo breve de tiempo (Valderrama et al., 2008). Medios de Cultivo El medio nutritivo base fue el MS (Murashige & Skoog, 1962), Se suplemento el MS con reguladores de crecimientos: ácido 2,4-dicloro fenoxiacético (2,4-D) para inducir callos, kinetina (KIN) para la elongación celular, y la mezcla de ácido indolbutirico (IBA) y benciladenina (BA) para la multiplicación vegetativa y generación de brotes. Todos los medios fueron preparados siguiendo las medidas de asepsia del laboratorio y cámara de flujo laminar, controlando contenido nutritivo y pH del medio. Una vez preparados fueron esterilizados en autoclave. Proceso de siembra in vitro El procedimiento general consistió en inocular un medio de cultivo gelificado (generalmente con agar, Gelrite o Phytagel®) con un fragmento de tejido u órgano vegetal, llamado explante, previamente tratado para eliminar todo organismo que se encuentre en su superficie (desinfestación). El cultivo se incubo bajo condiciones ambientales de luz, temperatura y humedad controladas, que junto con las físico-químicas y nutricionales conducirán el desarrollo del explante hacia la formación de una masa celular amorfa denominada callo, o hacia la diferenciación en un tejido organizado que producirá órganos o embriones. Los
- 4. callos obtenidos mediante este procedimiento pueden subcultivarse para su mantenimiento y propagación o inducir su diferenciación para formar órganos (organogénesis), embriones (embriogénesis) o pasarse a un medio de cultivo líquido para obtener células y pequeños agregados en suspensión (Calva & Pérez, 2005). Se tomaron explantes de fresa (Fragaria sp.) var Chandler sub-cultivados en el Laboratorio de Investigaciones Genéticas de la UNET, los cuales fueron sembrados (23/02/2016) en medio de cultivo básico MS suplementados con 2,4-D, KIN, y IBA + BA. Se realizaron cuatro tratamientos con tres repeticiones. (1) MS, (2) MS + 2,4-D, (3) MS + KIN, y (4) MS + IBA + BA (Fig. Nº 1). Los cultivos se mantuvieron bajo condiciones ambientales controladas: 25-28 ºC, pH entre 5,2 y 6,5, y radiación promedio a 12.000 lux. Fig. Nº 1. Siembra de explantes de fresa (Fragaria sp.) var Chandler. En relación con la dosificación de los reguladores de crecimiento, estudios realizados por Matos & Sánchez (2011), para la inducción de callos a partir de hojas de plantas silvestres de A. vera, se añadieron al medio de cultivo MS diferentes combinaciones de auxinas (ANA y AIA) 0,1; 0,5; 1 y 2 mgL-1 , y citoquininas (BA y KIN) 0,1; 0,5; 1; 2; 3 y 5 mgL-1 . También se probaron las auxinas y las citoquininas solas en concentraciones de 0,1; 0,5; 1; 2; 3 y 5 mgL-1 . Como control, se sembraron explantes de hojas en medio de MS sin hormonas. La formación de callos resulto variable dependiendo de la concentración y tipo de hormona. En otras experiencias utilizaron la combinación de 2,4-D (1,0 mg/l), BAP (0,5 mg/l) y 50% prolina obteniendo altos porcentajes de cultivos con embriones somáticos (Valderrama et al., 2008). Según Calva & Pérez (2005), las plantas jóvenes o en desarrollo con tejidos meristemáticos y crecimiento vegetativo vigoroso son la mejor fuente de explantes. Aunque en una misma planta se pueden encontrar tejidos de crecimiento juvenil como adulto, los primeros se caracterizan por ser activos y la ausencia de estructuras reproductoras. Además, las plantas adultas pueden haber acumulado mayor cantidad de microorganismos en sus tejidos y contener menos células meristemáticas, necesarias para establecer cultivos de tejidos.
- 5. El éxito de la inducción y establecimiento de cultivos de callos, y en consecuencia la subsiguiente regeneración de tejidos y plantas, son función de la calidad del explante usado, que a su vez depende de la planta madre o del tejido del que se inició el cultivo. De manera tal, para el inicio de los cultivos se prefieren los tejidos que contengan células meristemáticas, las cuales se diferencian rápidamente en respuesta a estímulos organogenéticos como variación en el tipo y concentración de reguladores del crecimiento vegetal (Doerner, 2000). RESULTADOS Y DISCUSIONES Al suplementar un medio de cultivo base (MS) con auxinas y citoquininas, solas o en combinación, los resultados en cuanto a la inducción de callo y regeneración de brotes en los explantes de Fragaria x ananassa var. Chandler, fueron variables. La observación se realizó a los 54 días de iniciado el proceso de cultivo in vitro. Las muestras fueron mantenidas en cámara de incubación durante el transcurso del ensayo. Cuando los explantes de hojas se cultivaron en medio MS sin hormonas (control), la formación de callos fue nula (Fig. Nº 2.1), los explantes se mantuvieron en el medio sin desarrollar ningún tipo de estructura especial, ya sea callos, generación de brotes o elongación celular, esto debido a que, por sus características, contenido de macro y micronutrientes esenciales para la supervivencia de la planta, y nutrientes (hidratos de carbono, vitaminas), el medio de cultivo MS constituye solo un medio de mantenimiento. Fig. Nº 2. (1) Medio de cultivo base (MS), (2) Medio de cultivo MS suplementado con ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), (3) MS + kinetina (KIN), (4) MS + ácido indolbutirico (IBA) y benciladenina (BA). En cuanto a la reacción del explante al entrar en contacto con el 2,4-D (Fig. Nº 2.2), se observa que las células comienzan a dividirse muy rápido y aumentan su volumen desorganizadamente. Con el
- 6. tiempo, el proceso va tomando cuerpo hasta convertirse en callo. La característica del callo está en función de la viabilidad de los brotes que puede generar posteriormente para la inducción y generación de brotes múltiples. En la inducción de callos, se presentan dos tipos: compacto y friable. Un callo compacto es de preferencia color verde, café, cremoso, nodular, firme y organizado, con tendencia a convertirse en un callo no embriogénico. En cambio, el callo blanco, de tipo friable y blando, tiene todas las características de un callo embriogénico, con alta capacidad de regeneración por un largo periodo de tiempo y fuerte tendencia a la diferenciación (Valderrama et al., 2008). El callo observado en el presente ensayo presenta coloración amarillenta opaca, característico de la presencia de antocianinas, de apariencia compacta, piloso y con pequeños brotes débiles, en general apariencia inferior, posiblemente debido al estrés ocasionado por las condiciones ambientales del medio y al tiempo del ensayo. La suplementación de Kinetina (KIN) al medio MS (Fig. Nº 2.3), se muestra promisoria para el proceso de elongación celular. La cantidad de citoquinina endógena en los meristemos y ápices es baja, debido a que el principal sitio de síntesis son las raíces, por lo que en estos casos la adición exógena de citoquinina en los medios de cultivo es una práctica generalizada (Vilchez et al., 2009). El medio de cultivo suplementado con kinetina (KIN) generó una amplia inducción de yemas axilares, provocando la elongación de los explantes de fresa. La interacción entre IBA + BA (Fig. Nº 2.4), permitió la inducción de callo y la presencia de brotes generados del callo inicial. Estos brotes pudiesen ser viables para ser sub-cultivados para la propagación de la variedad de fresa. Las citoquininas, junto a las auxinas, promueven la producción de tejidos no organizados denominados callos, de los cuales es también posible inducir la formación de brotes y/o raíces, como también de embriones somáticos conducentes a plantas. Gran parte de las respuestas de totipotencia celular, de morfogénesis in vitro y de regeneración de plantas, ocurre en presencia de niveles apropiados de citoquininas vs. auxinas (Jordán & Casareto, 2006) Específicamente, la acción de las auxinas depende de su concentración y de sus interacciones con otro regulador para la formación de los embriones, y esta relación debe ser igual o mayor en algunas de ellas, también se deben tener en cuenta el estado fisiológico del tallo primario. Las auxinas son una de las sustancias más usadas como agente mediador en la transición de las células embriogénicas (Valderrama et al., 2008).
- 7. Experiencias de cultivos in vitro han permitido determinar que la variación somaclonal ha sido una de las técnicas biotecnológicas que se ha empleado para el mejoramiento genético de variedades en diversos cultivos, debido a que constituye una forma rápida de generar variabilidad genética, particularmente para cultivos con base genética estrecha y que son difíciles de mejorar a través de técnicas tradicionales. Igualmente es exitosa para eliminar uno o pocos defectos en cultivares bien adaptados y puede utilizarse para mejorar especies de propagación sexual y vegetativa. Sobre la fresa se han reportado diferentes estudios donde a partir de la inducción de callos y la regeneración se han obtenido variantes somaclonales (Saavedra, 2005). CONCLUSIONES En la presente investigación se evaluó el efecto de varios reguladores del crecimiento vegetal en la respuesta in vitro de explantes de fresa. El medio MS suplementado con 2,4-D fue el método más eficiente en la formación y el desarrollo de callos, y las combinaciones de IBA+BA, permitieron obtener un alto porcentaje de inducción vegetativa y regeneración de múltiples brotes. La adición de kinetina (KIN) como suplemento al medio MS afecto la elongación celular descontrolada de los explantes de fresa. Es preciso definir la dosificación adecuada de cada regulador del crecimiento, ya que la cantidad aplicada va en función de la inducción o inhibición del crecimiento celular. Las técnicas in vitro constituyen una alternativa eficiente para la adecuación de nuevas tecnologías en la propagación del cultivo de fresa (Fragaria x ananassa var. Chandler). REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Bartual, R.; Marsal, J. I. y López-Aranda, J. M. Andana y Carisma dos nuevas variedades de fresa que ofrecen una gran capacidad productiva. Vida Rural, 2000, no. 105, 54- 57. Calva C. G., Ríos L. E. (1999). Cultivo de callos y acumulación de metabolitos secundarios. En: Rodríguez V. R., Calva C. G., Ramos R. E. G., Salazar M. A. (Eds.) Aspectos aplicados de la biotecnología. pp 267-301. Calva-Calva, G., Pérez, J. (2005) Cultivo de células y tejidos vegetales: fuente de alimentos para el fututo. Revista Digital Universitaria. 6(11). 1-16. Cuevas, M. C. S., & Salaverría, J. L. (2004). Control de la oxidación y la contaminación en el cultivo in vitro de fresa (Fragaria X ananassa Duch.). Revista Científica UDO Agrícola, 4(1), 21-26. Doerner, P. (2000) Cell división regulation: En: Calva-Calva, G., Pérez, J. (2005) Cultivo de células y tejidos vegetales: fuente de
- 8. alimentos para el fututo. Revista Digital Universitaria. 6(11). 1-16. Ferl, R., Paul A. L. (2000). Genome organization and expression. En: Buchanan B., Gruissem W., Jones R. (eds.) Biochemistry and Molecular Biology of Plants. USA: American Society of Plant Physiologists, pp. 312-357. Hannum, S. M. Potential impact of strawberries on human health: A review of the science. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2004, vol. 44, p. 1-17. Jordán, M., & Casaretto, J. (2006). Hormonas y Reguladores del Crecimiento: Auxinas, Giberelinas y Citocininas. En: Fisiología Vegetal. FA Squeo, L. Cardemil. La Serena, Chile. Ediciones Universidad de La Serena. Cap, 15. Kessel Domini, A. (2012). Mejora genética de la fresa (Fragaria ananassa Duch.), a través de métodos biotecnológicos. Cultivos Tropicales, 33(3), 34-41. Krikorian, A. D. (1991). Medios de cultivo: generalidades, composición y preparación. Cultivo de tejidos en la agricultura: fundamentos y aplicaciones. Cali: CIAT, 41-77. Matos A., A. Sánchez, A. (2011) Evaluación de reguladores de crecimiento para la inducción de callo en Aloe vera L. Multiciencias, Vol. Nº 11. Pp. 7-14. Universidad del Zulia. Venezuela. Mroginski, L. A., & Roca, W. M. (1991). Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales in vitro. Cultivo de tejidos en la agricultura: Fundamentos y Aplicaciones. En: Control de la oxidación y la contaminación en el cultivo in vitro de fresa (Fragaria x ananassa Duch.). Cuevas, M. C. S., & Salaverría, J. L. (2004). Saavedra, A. Producción de plántulas in vitro de frutillas (Fragaria chiloensis D.) libre de patógenos. Andenes, 2005. Vol. 3 Nº 5. Pp. 16-17. En: Mejora genética de la fresa (Fragaria ananassa Duch.), a través de métodos biotecnológicos. Kessel Domini, A. (2012). Street H. E. (1977). Cell (suspension) cultures techniques. En: Street H. E. (Ed). Plant tissue and cell culture. Blackwell Scientific Publishing., Oxford., England. pp. 61-102. Téllez L., F., Salmerón D., L. (2007) Efecto de cuatro niveles de fertilización orgánica sobre tres variedades de fresa (Fragaria spp.) en las Sabanas, Madríz. (Tesis de Grado) Universidad Nacional Agraria. Facultad de Agronomía. Escuela de Producción Vegetal. Managua, Nicaragua. Valderrama-Alfaro, Shirley, Chico-Ruiz, Julio, Tejada-Castillo, Jésica y Vega- Anhuamán, Amelia (2008) Regeneración de plántulas, vía embriogénesis somática, a partir de hojas de fresa, Fragaria virginiana, utilizando ANA y BAP. REBIOL. Vol. 28, Nº 2. Vilchez, J., Rivas, Y., Albany, N., Molina, M., & Martínez, L. (2009). Efecto de la N6 - bencilaminopurina sobre la multiplicación in vitro de ocumo criollo (Xanthosoma sagittifolium L. Schott). Revista de la Facultad de Agronomía, 26(2). Villalobos V.M. y M.G. Pérez. 1979. Alta producción de plantas de fresa libres de virus a partir del cultivo de meristemos. Proc. Tropical Región ASHS 23:70-72. En: Control de la oxidación y la contaminación en el cultivo in vitro de fresa (Fragaria x ananassa Duch.). Cuevas, M. C. S., & Salaverría, J. L. (2004). Villegas, M, A. 1990. Micropropagación de fresa (Fragaria x ananassa Duch.) En: Control de la oxidación y la contaminación en el cultivo in vitro de fresa (Fragaria x ananassa Duch.). Cuevas, M. C. S., & Salaverría, J. L. (2004).