Fernandez lorenzo. biofilm
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Este documento trata sobre el control de la formación de biofilms sobre biomateriales. Resume que las infecciones asociadas a la formación de biofilms son un problema creciente debido al aumento en el uso de prótesis e implantes. Explica que los biofilms son difíciles de tratar debido a su estructura tridimensional que protege a las bacterias de los antibióticos y el sistema inmune. Propone varias estrategias para inhibir la formación de biofilms como el uso de agentes antimicrobianos, superficies con propiedades antiadherentes y
Fernandez lorenzo. biofilm
- 1. CONTROL DE LA FORMACION DE BIOFILMS SOBRE BIOMATERRALES V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES 9, 10 y 11 de octubre de 2012 Mónica Fernández Lorenzo INIFTA. CONICET, UNLP Facultad de Ingeniería, UNLP
- 2. INFECCIONES ASOCIADAS A LA FORMACIÓN DE BIOFILMS Catéter intravascular Implante de mama Válvula cardíaca Marcapasos Cable en endocarditis Stent en vena cava Stent urinario Prótesis de cadera Catéter Peritoneal Stent biliar modified from Clinical Pharmacology & Therapeutics 82, 204-209,2007
- 3. LONGEVIDAD Y OBESIDAD INCREMENTO DE DEMANDA DE PRÓTESIS ORTOPÉDICAS INCREMENTO DE INFECCIONES ASOCIADAS A BIOFILMS •Reemplazo de articulaciones totales Incremento de la demanda de prótesis de cadera 2030: 174% Incremento de la demanda de prótesis de rodilla 2030: 673% Biofilm de Staphylococcus sobre una prótesis metálica
- 4. Biofilms mixtos y de una única especie Biofilms mixtos: prótesis dental dental Banda de ortodoncia Biofilms de una especie única: No-móviles: Móviles: Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa
- 5. Microorganismos que están asociados a la formación de biofilms sobre prótesis Prótesis de Elementos de fijación cadera y rodilla externa Datos de 242 pacientes
- 6. Interacciones del biofilm con biomateriales y células durante el tratamiento antimicrobiano Biomaterial Agente Antimicrobial antimicrobiano Agent Biofilm Células
- 7. ¿Por qué es dificil controlar las infecciones asociadas a la formación de biofilms? La estructura tridimensional del biofilm juega un importante papel resistivo en: Protección de las células internas del ambiente agresivo y de la defensa contra el sistema inmune. Creación de barreras difusionales para macromoléculas y secuestro de sustancias antibacterianas. Inducción de gradientes de oxígeno dentro del biofilm Reducción del metabolismo en las células internas. Generación de fenotipos heterogéneos dentro de la estructura del biofilm
- 8. Etapas de formación de biofilms de bacterias no-móviles Ej: Staphylococcus aureus Dispersión de bacterias plactónicas Colonización de la superficie Acumulación en Desprendimient Adhesión Adhesión irreversible colonias 3D con o de bacterias reversible matriz polimérica modified from
- 9. Formación de un biofilm de bacterias móviles Dispersión Maduración Bacterias planctónicas dispersas Matriz extracelular Adhesión Adhesión irreversible y reversible movimiento superficial. Microcolonias 2D
- 10. ¿Cómo inhibir la formación de un biofilm? Dispersión Limitar los mecanismos Maduración que conducen a la forma sésil Bacterias planctónicas dispersas Matriz Limitar la adhesión extracelular e interacción Limitar la movilidad superficial Adhesión y el crecimiento 3D reversible Adhesión irreversible y movimiento superficial. Microcolonias 2D
- 11. Las bacterias se unen entre ellas y al sustrato mediante el MPE Estrategia: limitar la agregación microbiana Pseudomonas sp Staphylococcus sp
- 12. Estrategias de inhibición de las etapas tempranas del crecimiento del biofilm Tratamiento con agentes antimicrobianos (A) Superficies con propiedades químicas antiadherentes (AA) Superficies microestructuradas (MS) Estrategia combinada: AT + MS +
- 13. Estrategias de inhibición de las etapas tempranas del crecimiento del biofilm Tratamiento con agentes antimicrobianos (A) Superficies con propiedades físicoquímicas antiadherentes (AA) Superficies microestructuradas (MS) Estrategia combinada: A + MS +
- 14. Efecto del tratamiento con antibióticos (AT) sobre bacterias plactónicas y sobre el biofilm Células planctónicas Minimim Inhibitory concentration MIC=4mg/L Minimum biocidal concentration MBC=8mg/L Biofilms on NS Streptomycin (ST) 105 Más de 104/cm2 bacteria permanecen vivas con CFU 4mg/L ST 101 0 1mg/L 2mg/L 4mg/L
- 15. Nanopartículas de ZnO como agentes antimicrobianos en periimplantitis
- 16. Concentración mínima inhibitoria y concentración mínima bacteriostática para distintas concentraciones de nanopartículas de Ag, CuO, Cu2O, ZnO, WO3, TiO2, Ag+CuO, Ag+ZnO
- 17. Estrategias de inhibición de las etapas tempranas del crecimiento del biofilm Tratamiento con agentes antimicrobianos (A) Superficies con propiedades fisicoquímicas antiadherentes (AA) Superficies microestructuradas (MS) Estrategia combinada: A + MS +
- 18. Efecto del ZnO agregado al PVC (catéteres)
- 19. Formación de monocapas autoensambladas (películas de moléculas ordenadas y ensambladas) derivatizadas con gramicidina
- 20. Adhesión de bacterias Gram positivas a superficies sin y con gramicidina Listeria ivanovii Sin gramicidina Bacterias vivas en verde Bacterias muertas en rojo Con gramicidina
- 21. Reducción de las bacterias adheridas sobre películas poliméricas con clorhexidina PBA: Polybenzyl acrilato Cortizo et al, J of Dentistry, 2012
- 22. Composición de las superficies Uso de coberturas con heparina como anticoagulante (en los catéteres). Aumento de adhesión bacteriana Formación de biofilms se S. aureus sobre PVC con y sin coberturas que contengan heparina (1000U/mL)
- 23. Modificación de las superficies de los biomateriales: Superficies antiadherentes con nanotubos con y sin monocapas de PTES. Cambio de hidrofilicidad NT NT: film de nanotubos NTS: con monocapa de 2H-perfluorooctyl triethoxisilane (PTES) NTS TiS TiS: Ti + PTES
- 24. Superficies con tratamientos de PTES con y sin nanotubos de TiO2 Sésiles Planctónicas NT-2h NTS-2h 2h 4h TiS-2h NT-4h NTS- TiS-4h 4h PTES=2H-perfluorooctyl triethoxisilane
- 25. Estrategias de inhibición de las etapas tempranas del crecimiento del biofilm Tratamiento con agentes antimicrobianos (A) Superficies con propiedades fisicoquímicas antiadherentes (AA) Superficies microestructuradas (MS) Estrategia combinada: A + MS +
- 26. Variación de la adhesión de S. aureus con el tiempo en sustratos lisos y rugosos 0 2 7 14 21 días
- 27. Retención de bacterias aisladas S. aureus Liso S. aureus Fácil Posible interpretación remoción S. Aureus Rugoso dificultad en la remoción Difícil remoción P. aeruginosa Liso P. Aeruginosa Discontinuidad debilita la fuerza de adherencia Difícil remoción P. aeruginosa Rugoso Fácil remoción
- 28. Sustratos lisos y microestructurados control (NS) Microstruturado (MS) Sustratos: Oro 100 20.0 nm nm Polyisobutilcianoacrilato(PBCA) 0 0 Long de onda 250 nm y 20 nm -20.0 -100 0 2.5 5.0 7.5 10.0 0 2.5 5.0 7.5 10.0 Cobre de amplitud. m m Wide= 750 nm + 550nm Ripples: ancho= 40 nm deep = 120 nm profundidad=4 nm 70.0 Au evaporated, 200 nm thickness, (II) Cr-coated glass. Canales de ancho similar al díámetro de las bacterias nm 0 Grains: 50-100 nm, w=2-3 nm -70.0 Wave length 100-200 nm 0 2.5 5.0 7.5 10.0 m
- 29. Bacterias no-móviles Staphylococcus aureus (AFM images) Redes 2D Bacterias aisladas atrapadas Se inhibe la formación de agregados
- 30. Colonización bacteriana de bacterias móviles sobre sustratos lisos y microestructurados (MS) NS: Redes 2D MS:Bacterias aisladas 4 m 4 m
- 31. NS MS 2 m 2 m (a) (b) Pseudomonas fluorescens Lisos= agregados 2D (rafts) MS= Bacterias atrapadas
- 32. Bacterias Móviles (Pseudomonas) Rafts de bacterias más MS: Bacterias atrapadas en largas los canales flagelo flagelo 5 m 5 m
- 33. Biofilms de Pseudomonas sobre NS and MS Las superficies MS disminuyen la adhesión, independientemente de su composición Oro Polyisobutylcyanoacrilate(PBCA) Cobre Adhesión 6 veces menor NS MS
- 34. MOVIMIENTO SUPERFICIAL DE LAS BACTERIAS: COLONIZACIÓN DE SUPERFICIES LISAS POR BACTERIAS SÉSILES (swarming) Frente de avance Colonización del sustrato
- 35. Colonización bacteriana oro liso Distribuciones de tamaños de bacterias en el frente de avance según el rol de las bacterias •10% de las células: tamaños mayores a 2,5 micras. •87% de las células: tamaños mayores a 2,5 micras
- 36. Densidad superficial der bacterias sobre superficies lisas y con canales
- 37. Imágenes de AFM y microscopía de epifluorescencia de sustratos lisos y MS LIVE/DEAD BacLightTM Viability Kit. Green, live bacteria
- 38. Efecto de la microestructura superficial Las microestructuras superficiales cuyas dimensiones características son similares al diámetro de las bacterias: Inhiben la formación de agregados bacterianos Disminuyen el desplazamiento de las bacterias móviles Inhiben la colonización bacteriana de la superficie
- 39. Estrategias de inhibición de las etapas tempranas del crecimiento del biofilm Tratamiento con agentes antimicrobianos (A) Superficies con propiedades fisicoquímicas antiadherentes (AA) Superficies microestructuradas (MS) Estrategia combinada: A + MS +
- 40. Efecto del tratamiento con antibióticos sobre las bacterias planctónicas y sobre los biofilms formados sobre superficies lisas NS Biofilms on NS Streptomycin (ST) 105 Más de 104/cm2 bacterias permanecen vivas con CFU 4mg/L ST 101 0 1mg/L 2mg/L 4mg/L
- 41. Tratamiento con antibióticos de superficies lisas y MS 105 CFU 101 1mg/L 2mg/L 4mg/L Importantes agregados microbianos Débil efecto de los antibióticos Agregados pequeños Mayor efecto de los antibióticos sobre las superficies MS (a) Number of viable bacteria after AA on NS and MS substrates (area: 0.25 cm2). Epifluorescence image (Live/Dead kit) of P. fluorescens on (b,c) NS substrate (d,e) MS substrate after 2 h of ST. Green: live bacteria; red: dead bacteria
- 42. Imágenes de microscopía de epifluorescencia de biofilms de bacterias móviles y no móviles sobre sustratos lisos (NS) y microestructurados (MS) tratados con antibióticos (AT). Importante efecto MS + AT LIVE/DEAD BacLightTM Viability Kit. Verdes:vivas, rojas: muertas
- 43. CFU NS MS CFU Pf Sa Pf Sa Pf Sa Pf Sa Without AT 1 mg/L 2 mg/L 4 mg/L AT: Streptomycin Número de bacterias viables (Pseudomonas y Staphylococcus) después del tratamiento con estreptomicina sobre superficies MS y lisas CFU, colony-forming units.
- 44. Efecto sinérgico MS+A. MS + AT MS AT MS+AT control NS MS+ MS Decrease in survival cells AT SM AT Efecto sinérgico Estrategias y su efecto MS (decrecimiento de 1 orden en el número de bacterias A Decrecimiento de 2 órdenes en el número de bacterias Estrategia combinada MS + AT : decrecimiento de 5 ordenes en el número de bacterias
- 45. Efecto del tratamiento con antibióticos sobre bacterias en agregados de sustratos lisos y sobre sustratos MS NS MS Incremento de la rugosidad
- 46. Incremento de la rugosidad en la membrana celular MS+AT
- 47. Interacciones del biofilm con biomateriales y células durante el tratamiento antimicrobiano Biomaterial Agente Antimicrobial antimicrobiano Agent Biofilm Células
- 48. Influencia de la liberación de antibióticos desde películas poliméricas sobre el metabolismo celular Efecto antibacteriano Efecto sobre las células Cortizo et al, J of Dentistry, 2012 Disminución de la supervivencia celular y de la actividad fosfatasa alcalina
- 49. Efecto de la liberación de agentes antimicrobianos sobre las células aledañas Control células Ti Ti - PBA Ti – PBA – CLH 0,35% Ti – PBA – CLH 0,7% Ti – PBA – CLH 1,4% Dosis creciente de clorhexidina Cortizo et al, J of Dentistry, 2012
- 50. Conclusiones: La adecuada modificación de las características del sustrato (fisicoquímica y microestructural) puede ser una estrategia efectiva para inhibir la adherencia de bacterias. Las superficies microestructuradas con patrones de dimensión similar al diámetro de las bacterias inhiben la adhesión de microorganismos y evitan la formación de agregados microbianos y la colonización de superficies. La acción antibiótica aumenta si las bacterias están aisladas. Efecto sinérgico: Antibiótico + MS para bacterias móviles (P. aeruginosa and P. fluorescens) and non-móviles (S. aereus). La estrategia combinada es adecuada para aumentar el efecto antimicrobiano con una reducción de 5 órdenes en el número de bacterias adheridas al biomaterial Lás células de tejidos aledaños pueden ser afectadas por los agentes antimicrobianos y debe determinarse la concentración máxima de antibiótico en las películas para liberación controlada de agentes antimicrobianos.
- 51. Biomaterial Antibiótico Biofilm Tejido
- 52. Acknowledgements Dra. Carolina Díaz Dr. Alejandro Miñán Dra. Patricia Schilardi Dra Cecilia Cortizo
- 55. S1 S2
- 56. Comparación de la colonización sobre: • Sustratos lisos • Sustratos con MS orientación paralela • Sustratos con MS orientación perpendicular
- 57. SWARMING Oro liso GLIDING
- 58. Orientación bacteriana sobre sustratos con canales paralelos a la dirección del desplazamiento Agregados celulares en forma oblicua a la dirección de la submicro-estructura • Avance bacteriano oblicuo con respecto a la dirección de la microestructura superficial evita que las bacterias queden atrapadas. • Las bacterias oblicuas empujan a las que están atrapadas; gran demanda de energía.
- 59. Estrategias de colonización superficies MS Alargamiento de células Material polim. extrac y surfactantes fimbrias Duplicación Flagelos orientados Bacterias deformadas por empuje y salida de los canales
- 60. Orientación bacteriana sobre superficies con canales perpendiculares a la dirección de avance Las orientaciones de las bacterias no son aleatorias, dependen de la posición y de la dirección de la submicro-estructura
- 61. Influencia de la orientación del sustrato sobre la longitud y dirección de las bacterias Liso 18 (a) Pe Pa 15 Relative frequency (%) 12 9 6 3 0 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 Size ( m) Longitud Pe Pa Angulo
- 62. Antibióticos, macrófagos y biofilms d d. Las enzimas fagocíticas dañan los tejidos circundantes y se liberan bacterias desde el biofilm c c. Los fagocitos son atraídos por el biofilm b b. Las bacterias de los biofilms son resistentes a los antibióticos a a.Las bacterias planctónicas pueden ser fagocitadas por los fagocitos y son sensibles a los antibióticos