FertilizanteFoliarHidrolizado apartir de cascara de huevo.pdf

Trabajo de Investigación Para Optar al Título de Magister en Ciencias Farmacéuticas y
Alimentarias
OBTENCIÓN DE UN FERTILIZANTE FOLIAR A PARTIR DEL
HIDROLIZADO PROTEICO DE LA MEMBRANA DE LA CÁSCARA
DE HUEVO
Natalia Andrea Mendoza Isaza
Asesor:
Carlos Alberto Peláez Jaramillo
Grupo Interdisciplinario de Estudios Moleculares
Universidad de Antioquia
Medellín
2017

2
TABLA DE CONTENIDO
LISTA DE FIGURAS……………………………………………………………………...5
LISTA DE TABLAS……………………………………………………………………….7
1. RESUMEN..................................................................................................................... 8
2. ABSTRACT................................................................................................................. 10
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................... 12
4. HIPÓTESIS.................................................................................................................. 14
5. JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................ 15
6. OBJETIVOS ................................................................................................................ 16
6.1 Objetivo general .................................................................................................... 16
6.2 Objetivos específicos............................................................................................. 16
7. ANTECEDENTES....................................................................................................... 17
7.1 Residuo.................................................................................................................. 17
7.2 El reciclaje............................................................................................................. 18
7.3 Cáscara de huevo................................................................................................... 18
7.3.1 Capa de las membranas de la cáscara ............................................................ 19
7.3.2 Capa en empalizada........................................................................................ 20
7.4 Usos de la cáscara de huevo.................................................................................. 20
7.4.1 Calcio como suplemento nutricional.............................................................. 20
7.4.2 Cáscara de huevo en polvo............................................................................. 21
7.4.3 Uso de la cáscara de huevo como catalizador para síntesis ........................... 21
7.4.4 Hidroxiapatita................................................................................................. 21
7.4.5 Membrana de la cáscara de huevo ................................................................. 22
7.4.6 Remoción de metales pesados........................................................................ 22
7.5 Aminoácidos.......................................................................................................... 23
7.5.1 Clasificación de los aminoácidos................................................................... 23
7.6 Hidrólisis de proteínas........................................................................................... 24
7.6.1 Hidrólisis enzimática...................................................................................... 24
7.6.2 Hidrólisis ácida............................................................................................... 24

3
7.6.3 Hidrólisis básica............................................................................................. 25
7.7 Fertilizantes ........................................................................................................... 25
7.7.1 Clasificación de los fertilizantes según su forma de obtención ..................... 25
7.7.2 Clasificación de los fertilizantes según su forma de actuar ........................... 26
7.7.3 Fertilizantes a base de aminoácidos ............................................................... 26
7.7.4 Fertilización foliar.......................................................................................... 28
7.7.5 Factores que influyen la fertilización foliar ................................................... 29
7.7.6 Ventajas del uso de aminoácidos en la fertilización foliar............................. 31
7.8 Modelos................................................................................................................. 32
7.8.1 Modelo químico ............................................................................................. 32
7.8.2 Modelo biológico ........................................................................................... 33
8. METODOLOGIA ........................................................................................................ 37
8.1 Separación de la membrana de la cáscara de huevo.............................................. 37
La cáscara de huevo material de estudio para esta investigación, fue suministrada por
Avinal S.A. Medellín, Colombia....................................................................................... 37
8.2 Caracterización de la membrana ........................................................................... 38
8.3 Hidrólisis de proteína ............................................................................................ 39
8.4 Determinación del grado de hidrólisis................................................................... 40
8.5 Estudios de fitotoxicidad de los hidrolizados....................................................... 44
8.6 Cuantificación del contenido de aminoácidos libres............................................. 45
8.7 Formulación de fertilizante foliar líquido.............................................................. 46
8.8 Evaluación de la eficiencia del fertilizante formulado en un cultivo modelo ....... 48
9. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................. 51
9.1 Proceso de separación ........................................................................................... 51
9.2 Caracterización de la membrana ........................................................................... 51
9.3 Hidrólisis de proteína ............................................................................................ 52
9.4 Grado de hidrolisis ................................................................................................ 52
9.5 Pruebas de fitotoxicidad ........................................................................................ 57
9.6 Formulación del fertilizante foliar líquido ............................................................ 67
9.7 Evaluación de la eficiencia del fertilizante formulado en un cultivo modelo ....... 69

4
10. CONCLUSIONES .................................................................................................... 72
11. IMPACTO AMBIENTAL ........................................................................................ 74
12. BIBLIOGRAFIA ...................................................................................................... 75

5
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estructura de la cáscara ........................................................................................ 19
Figura 2. Estructura de un aminoácido ............................................................................... 23
Figura 3 . Fotografía de P. vulgaris. .................................................................................... 33
Figura 4. Fotografía de R. sativus: (a) semilla; (b) detalle de la plántula: 1, cotiledones; 2,
hipocótilo; 3, raíz embrionaria o radícula ............................................................................ 35
Figura 5 Mecanismo de la titulación con formol para la determinación de α-AN............... 41
Figura 6. Foto de matera plástica y sus dimensiones........................................................... 48
Figura 7. Condiciones de la fase experimental .................................................................... 49
Figura 8. Espectro de masas del hidrolizado con HCl ......................................................... 54
Figura 9. Espectro de masas de hidrolizado con H2SO4 ...................................................... 54
Figura 10. Espectro de masas del hidrolizado con H3PO4 ................................................... 54
Figura 11. Espectro de masas hidrolizado con HNO3.......................................................... 54
Figura 12. Placa Cromatográfica de todos los hidrolizados comparado con cada estándar de
aminoácido y una mezcla de la misma a 100 ppm............................................................... 55
Figura 13. Placa Cromatográfica de todos los hidrolizados a las diferentes concentraciones
comparado con una mezcla estándares de aminoácidos a 200 ppm..................................... 56
Figura 14. Germinación para hidrolizado con HCl 6 M (100 – 75 – 50 – 25 %) ................ 57
Figura 15. Germinación para hidrolizado con H2SO4 6 M (100 – 75 – 50 – 25 %) ............ 57
Figura 16. Germinación para hidrolizado con HCl 6 M (25 – 12.5 – 6.25 – 3.2 %) ........... 58
Figura 17. Germinación para hidrolizado con H2SO4 6 M (25 – 12.5 – 6.25 – 3.2 %) ....... 59
Figura 18. Germinación para hidrolizado con HCl 6 M (12.5 – 6.25 – 3.2 - 1.6 – 0.8 %). 60
Figura 19. Germinación para hidrolizado con H2SO4 6 M (6.25 – 3.2 – 1.6 – 0.8 – 0.4 %) 61
Figura 20. Efecto de los hidrolizados a diferentes concentraciones sobre R. sativus.......... 61
Figura 21. Germinación para hidrolizado con H2SO4 6 M (1.6 – 0.8 – 0.4 – 0.2 %) .......... 62
Figura 22. Germinación para hidrolizado con HCl 6 M (1.6 – 0.8 – 0.4 – 0.2 %) .............. 63
Figura 25. Curva de calibración para la cuantificación de aminoácidos.............................. 66

6
Figura 26. Biomasa total de cada tratamiento comparado con el control positivo (A-
MICSUR)............................................................................................................................. 69
MICSUR)............................................................................................................................. 70
Figura 28. Biomasa de los frutos para el tratamiento con HCl comparado con el control
positivo (A-MICSUR).......................................................................................................... 70
Figura 29. Biomasa de los frutos para el tratamiento con H2SO4 comparado con el control
positivo (A-MICSUR).......................................................................................................... 71

7
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Clasificación taxonómica de Phaseolus vulgaris................................................... 34
Tabla 2. Clasificación taxonómica del modelo R. sativus. .................................................. 36
Tabla 3. Condiciones de hidrólisis....................................................................................... 40
Tabla 4. Formulación de fertilizante.................................................................................... 47
Tabla 5. Composición del fertilizante comercial A-MICSUR............................................. 49
Tabla 6. Caracterización de la membrana............................................................................ 52
Tabla 7. Reconocimiento de aminoácidos y proteínas......................................................... 53
Tabla 8. Contenido de aminoácidos libres en hidrolizados.................................................. 66
Tabla 9. Fuente de componentes para la formulación del fertilizante foliar........................ 67
Tabla 10. Caracterización fisicoquímica de los fertilizantes foliares formulados ............... 68

8
1. RESUMEN
El huevo es considerado por la organización mundial de la salud, como la fuente de
proteína de mayor calidad y más económica del mercado mundial, el cual además se
consolida en el territorio nacional como producto de los hogares colombianos.
El consumo de huevo se ha visto impulsado en los últimos 40 años, así lo demuestran las
cifras de la Federación Nacional de Avicultores de Colombia (Fenavi), que indican que el
consumo per cápita anual pasó de 42 huevos en 1970 a 263 en el 2016 [1]. Por lo tanto el
alto consumo de huevo genera a su vez altas cantidades de cáscara, un residuo sólido que
de no ser dispuesto de una forma correcta facilitaría putrefacciones, trasmisión de olores
desagradables, mosquitos y microorganismos patógenos que pueden ocasionar riesgos
sanitarios y efectos adversos sobre el ambiente.
En los últimos años se han realizado diferentes investigaciones en pro de darle una
revalorización a los residuos en el sector de la producción de huevos. Como alternativas no
alimentarias humanas existe un abanico de posibilidades, entre los que se destaca el uso del
carbonato de calcio (CaCO3) proveniente de la cáscara de huevo para la fabricación de
envases ecológicos [2], el uso de la cáscara como catalizador en reacciones de síntesis [3-
4], conversión directa y síntesis de Hidroxiapatita a través de la cáscara de huevo [5-6],
remoción de metales pesados [7-10], entre otros.
Por otra parte la membrana de la cáscara de huevo es un material promisorio para diversas
aplicaciones debido a su contenido proteico, entre el que se destaca el colágeno de tipo I, V
y X, los cuales pueden ser usados en diferentes campos como la industria cosmética,
farmacéutica y bioquímica [11].
Teniendo en cuenta lo anterior, el presente trabajo tiene como objetivo principal, obtener un
hidrolizado proteico de la membrana de la cáscara de huevo para formular un fertilizante
foliar a través del cual se le pueda dar una correcta disposición y una valorización a las
cáscaras de huevo.
El presente texto se centra en primera instancia, en establecer un protocolo eficiente para la
separación de la membrana de los residuos de la cáscara de huevo, usando un método físico

9
y uno químico. Posterior a la separación, la membrana se caracterizo fisicoquímica. Por
otra parte, basados en los reportes de la literatura, se seleccionaron cuatro ácidos
inorgánicos para hidrolizar la proteína presente en la membrana, usando como referencia el
acido clorhídrico con el cual es el más usado en hidrólisis ácida.
Se evaluó la actividad fitotóxica de los hidrolizados a diferentes concentraciones, usando
como modelo biológico Rábano (Raphanus sativus). Se formuló un fertilizante foliar a
partir de los hidrolizados de la membrana y se determinó su eficiencia en un cultivo
modelo de Phaseolus vulgarias y se comparó con dos testigos, que incluyeron un
fertilizante foliar a base de aminoácidos libres y el otro sin el uso de fertilización.
Palabras clave: Cáscara de huevo, membrana, hidrolisis ácida, aminoácidos libres,
fertilizante foliar, Raphanus sativus, Phaseolus vulgarias.

10
2. ABSTRACT
The egg is considered by the world health organization as the highest quality and cheapest
source of protein on the world market, which also consolidates in the national territory as a
product of Colombian households.
Egg consumption has been boosted in the last 40 years, as shown by figures from the
National Poultry Federation of Colombia (Fenavi), which indicate that annual per capita
consumption rose from 42 eggs in 1970 to 225 in 2011 [1]. Therefore high egg
consumption generates high amounts of shell, a solid residue which, if not disposed of
correctly, would facilitate putrefaction, transmission of unpleasant odors, mosquitoes and
pathogenic microorganisms which may cause health risks and adverse effects on the
environment.
In the last years, several investigations have been carried out in order to give a revaluation
to the residues in the sector of the production of eggs. As a non food alternative there is a
wide range of possibilities, including the use of calcium carbonate (CaCO3) from the
eggshell for the production of organic packaging [2], the use of the shell as a catalyst in
reactions Of synthesis [3-4], direct conversion and synthesis of hydroxyapatite through the
eggshell [5-6], heavy metal removal [7-10], among others.
On the other hand the membrane of the eggshell is a promising material for diverse
applications due to its protein content, among which the type I, V and X collagen, which
can be used in different fields as the cosmetic industry , Pharmaceutical and biochemistry
[11].
Taking into account the above, the main objective of this work is to obtain a protein
hydrolyzate from the eggshell membrane in order to formulate a foliar fertilizer through
which it can be given a correct arrangement and a valorization to the shells of egg.
The present text focuses in the first instance, to establish an efficient protocol for the
separation of the membrane of the residues of the eggshell, using a physical and a chemical
method. After the separation, the physicochemical characterization of the membrane was
performed. On the other hand, based on the reports of the literature, four inorganic acids

11
were selected to hydrolyze the protein present in the membrane, using hydrochloric acid
with which it is reported as the most used in acid hydrolysis.
The phytotoxic activity of the hydrolysates was evaluated at different concentrations, using
as a biological model Radish (Raphanus sativus). A foliar fertilizer was formulated from
the membrane hydrolyzates and its efficiency in a model crop of Phaseolus vulgaris and
compared with two controls, which included a foliar fertilizer based on free amino acids
and the other without the use of fertilization.

12
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El huevo es un alimento de la canasta familiar, altamente nutricional. Representa una
fuente de proteínas de alta calidad a bajo costo y contiene muchos nutrientes, como ácido
fólico, colina, hierro, selenio y vitaminas A, B, D, E, K y también es fuente de
antioxidantes [10].
La cáscara es un residuo sólido procedente de las plantas de incubación, plantas
productoras de huevo comercial, fábricas de ovoproductos y uso doméstico, lo cual
conlleva a la generación de toneladas que deben disponerse correctamente de tal manera
que se excluyan los riesgos sanitarios y ambientales. Los desafíos asociados con la
disposición de la cáscara de huevo incluyen costo, disponibilidad y disposición de sitios,
olores, insectos y microorganismos. Estos desafíos son mitigados con los métodos
tradicionales para la disposición de este residuo, los cuales incluyen botaderos,
acondicionador de suelos ácidos en la agricultura, fuente de calcio para los animales, o a
través de la modificación de Carbonato de calcio (CaCO3) principal componente, en cal o
hidróxido de calcio (Ca(OH)2) sustituto o fertilizante.
Teniendo en cuenta que la membrana de la cáscara de huevo tiene un alto contenido de
componentes bioactivos, así como la propiedad de retener el agua y de ser biodegradable, la
hace una candidata para aplicaciones clínicas, cosméticas, nutracéuticas y de
nanotecnología [11]. La membrana de la cáscara de huevo está constituida por proteína
(69.2%), grasa (2.7%), humedad (1.5%) y cenizas (27.2%). El componente proteínico de la
membrana de la cáscara de huevo tiene un 10% de colágeno [9]. El colágeno es de tipo I,
V y X el cual puede ser utilizado en la producción cosmética.
La fertilización foliar es una práctica común e importante para los productores, porque
corrige las deficiencias de nutrientes en las plantas, favorece el buen desarrollo de los
cultivos y mejora el rendimiento y la calidad del producto. La fertilización foliar no
substituye a la fertilización radicular de los cultivos, pero sí es una práctica que sirve de
apoyo para completar los requerimientos nutricionales de un cultivo que no se pueden
abastecer mediante la fertilización común al suelo [12].

13
Los fertilizantes foliares a base de aminoácidos libres, actúan como activadores del
desarrollo vegetativo, mejoran el calibre y coloración de los frutos, etc. El aporte de
aminoácidos facilita que la planta ahorre energía en sintetizarlos, a la vez que facilita la
producción de proteínas, enzimas, hormonas, etc., compuestos importantes para todos los
procesos vitales de los vegetales [13].
Ante esta situación se presenta como alternativa el aprovechamiento de la membrana de la
cáscara de huevo, para la obtención de un hidrolizado proteico aprovechando el alto
porcentaje de este tipo de sustancias en el subproducto avícola para la formulación de un
fertilizante foliar a base de aminoácidos libres. Con esto se busca un valor agregado a la
producción de huevos.

14
4. HIPÓTESIS
Es posible obtener un fertilizante foliar de alto valor agregado a partir de la hidrolisis de la
membrana de la cáscara de huevo.

15
5. JUSTIFICACIÓN
En Colombia se consumen a diario toneladas de huevos procedentes de las fábricas de
ovoproductos y de consumo directo, los cuales a su vez producen un residuo sólido:
cáscara de huevo, que representa aproximadamente un 11% del peso de la composición del
huevo [14], este residuo también es generado en las incubadoras y en las plantas
productoras de huevo comercial como subproducto.
En el país se produjeron aproximadamente 11.247 millones de huevos en el año 2013, cifra
que refleja además la generación de una cantidad de residuos sólidos que si no se disponen
de una forma adecuada pueden ocasionar problemas ambientales y de salud pública.
A través del reúso de las cáscaras de huevo, surgen nuevas posibilidades de disposición y
aprovechamiento tanto de la fracción orgánica como de la inorgánica.
En los últimos años se ha venido estudiando la recuperación y reutilización de recursos
biológicos, entre las cuales se encuentra el aprovechamiento de la cáscara de huevo con el
fin de darle un valor agregado a la producción de huevos fértiles.
El abastecimiento de los nutrimentos a través del suelo está afectado por muchos factores
de diferentes tipos: origen del suelo, características físicas, químicas y biológicas,
humedad, plagas y enfermedades. Por consiguiente, habrá casos en que la fertilización
foliar sea más ventajosa y eficiente para ciertos elementos, que la fertilización al suelo [12].
Este trabajo busca darle un valor agregado a las cáscara de huevo por medio del
aprovechamiento de la membrana de la cáscara, usándola como fuente para la obtención de
un hidrolizado proteico con el fin de obtener aminoácidos libres presentes en esta, como
cisteína, histidina, triptófano, lisina, arginina, leucina, valina, ácido glutámico, prolina,
triptófano y β-hidroxilo, etc. [15]. Estos subproductos pueden ser aplicados a las plantas a
través del formulado de un fertilizante foliar, disminuyendo así la dependencia de
productos de síntesis en los distintos cultivos, lo cual convertiría a este fertilizante en una
alternativa fiable y sostenible en la agricultura.

16
6. OBJETIVOS
6.1 Objetivo general
Obtener un fertilizante foliar de alto valor agregado a partir del hidrolizado proteínico de la
6.2 Objetivos específicos
 Establecer un protocolo eficaz y eficiente para obtener la membrana proteínica de la
cáscara de huevo.
 Evaluar el mejor proceso para hidrolizar la proteína.
 Producir un fertilizante a partir del hidrolizado de proteína proveniente de la cáscara
de huevo.
 Determinar la eficacia del fertilizante formulado en cultivos modelo.

17
7. ANTECEDENTES
El proceso de producción de huevos, tanto en granja como a nivel industrial, genera una
cantidad importante de residuos, los cuales se deben de disponer de tal forma que no
generen un posible riesgo de contaminación ambiental. Por consiguiente, se requiere la
aplicación de estrategias de manejo de reciclaje, que contribuyan al correcto uso de
residuos y su forma de aprovechamiento.
Las técnicas existentes para el tratamiento de residuos, incluyen la reutilización y/o
transformación, convirtiéndolas así en las opciones con mayores posibilidades por ser
adecuadas técnicamente, viables económicamente y sustentables ecológicamente.
7.1 Residuo
Un residuo se describe como el material que pierde utilidad tras haber cumplido con su
misión o servicio para realizar un determinado trabajo. El concepto se emplea
inadecuadamente como sinónimo de basura por hacer referencia a los desechos que el
hombre ha producido. [16].
Un residuo, es todo elemento que está considerado como un desecho al cual hay que
disponer. Se supone, por lo tanto, que el residuo carece de valor económico. Pese a que los
residuos suelen ser acumulados en vertederos o enterrados para que complete allí el proceso
de descomposición sin afectar el entorno, en los últimos años han avanzado procesos como
volver a emplearse, que consiste en la recuperación de los residuos para transformarlos en
un objeto con nueva vida útil [16].
La clasificación de los residuos puede hacerse dependiendo de su proveniencia como
domiciliarios, comerciales, industriales, hospitalarios, etc.

18
7.2 El reciclaje
Es el proceso mediante el cual se transforma materiales usados, que de otro modo serian
simplemente desechos, en recursos valiosos [17].
El uso del reciclaje tiene ventajas importantes:
 Reduce la necesidad de vertederos y del proceso de incineración.
 Evita la contaminación causada por la fabricación de productos a partir de
materiales vírgenes.
 Ahorra energía, reduce la emisión de gases de efecto invernadero que contribuyen al
cambio climático y global.
 Ahorra en recursos naturales como son el uso de madera, agua y minerales.
 Ayuda a mantener y proteger el medio ambiente para las generaciones futuras.
El residuo cáscara de huevo obtenido de diferentes procesos industriales donde se usa el
huevo, representa una pérdida significativa para el procesador, ya que tradicionalmente las
cáscaras son inútiles. La mayoría de estos subproductos comúnmente se eliminan en un
vertedero sin tratamiento previo, esto definitivamente no es una práctica adecuada teniendo
la emisión de olores.
7.3 Cáscara de huevo
Es una biocerámica compuesta de una fase orgánica y otra inorgánica. Químicamente está
compuesta de 1,6% de agua, 93.57 % de minerales, 0,8% de carbonato de magnesio y
0,73% de fosfato tricálcico, y finalmente 3,3% de materia orgánica [18].
La Figura 1 muestra la composición de la cáscara de huevo con el respectivo espesor de
cada parte.

19
Figura 1. Estructura de la cáscara
Tomado de: “Eggshell membrane biomaterial as a platform for applications in materials science.,”
7.3.1 Capa de las membranas de la cáscara
Las membranas de la cáscara corresponden a la capa más interna de la cáscara del huevo y
están formadas por un entramado fibrilar. Las fibras que las componen pesan en conjunto
aproximadamente 145 mg, tienen un espesor de alrededor de 70 nm y consisten en un
núcleo central cubierto por un material amorfo llamado manto de diferente composición
química.
Las membranas de la cáscara se encuentran dispuestas en dos capas, una interna de 20 μm
de grosor que está en contacto con la albúmina y otra externa de 50 μm de grosor que está
situada entre la zona mineralizada de la cáscara y la membrana interna. Estas dos
membranas están en íntimo contacto en toda su extensión, excepto a nivel de la cámara de
aire donde se encuentran separadas.
La fracción orgánica de las membranas de la cáscara está constituida por 3% de lípidos, 2%
de azúcares y 95% de proteínas.
Por otra parte, la presencia de colágeno fue sugerida por el aislamiento de hidroxilisina de
las membranas de la cáscara. Posteriormente se inmunodetectó la presencia de colágeno
tipo I, predominantemente en las fibras gruesas de las membranas de la cáscara externa y
colágeno tipo V predominantemente en las fibras finas de la membrana. Más recientemente

20
se ha detectado colágeno tipo X como principal constituyente de las fibras de las
membranas [18].
7.3.2 Capa en empalizada
La capa en empalizada corresponde a la capa más gruesa de la cáscara de huevo (200-350
μm) y está constituida por componentes orgánicos e inorgánicos en forma integrada. El
componente inorgánico corresponde a carbonato de calcio en forma de calcita y el
componente orgánico (matriz de la cáscara), que corresponde al 2-5 % (peso seco) es en un
2 % proteico [18].
7.4 Usos de la cáscara de huevo
Las cáscaras de huevo son una gran fuente de minerales, las cuales pueden tener
potenciales usos en diferentes áreas como excipiente farmacéutico, material base para el
desarrollo de preparativos medicinales y dentales, suplemento de calcio y aditivo de
alimentos, componente de enmiendas para la agricultura y componente para implantes de
hueso [10].
7.4.1 Calcio como suplemento nutricional
El carbonato de calcio de la cáscara de huevo en su forma cruda, sin un previo tratamiento
acido tiene baja solubilidad pero puede ser usado como fuente de calcio para otras sales de
calcio tales como, citrato, fosfato, lactato y gluconato. El citrato de calcio obtenido desde la
cáscara de huevo puede ser usado para proveer solubilidad y alta biodisponibilidad de
calcio para usarlo como suplemento nutricional humano [10].

21
7.4.2 Cáscara de huevo en polvo
La ventaja de la cáscara de huevo en comparación con otras fuentes naturales de calcio es el
bajo nivel de sustancias tóxicas presentes. Ocasionalmente, parte de este residuo es usado
como fertilizante debido a su alto contenido de calcio y nitrógeno. Sin embargo, las
cáscaras de huevo son un residuo potencial de contaminación cuando no se gestionan
adecuadamente dado que son soporte de acción microbiana. Estudios enfocados en la
conversión de cáscara en alimento animal (particularmente para aves de corral)
recomiendan un pre tratamiento de aproximadamente 80°C para reducir la contaminación
microbiana de la cáscara en polvo [10]. La cáscara también se ha evaluado como fuente de
calcio para la alimentación humana[19].
7.4.3 Uso de la cáscara de huevo como catalizador para síntesis
El uso de la cáscara de huevo como catalizador ha sido evaluado en la conversión de aceite
de haba de soja a transesterificación en la producción de biodiesel. Analizando diferentes
condiciones del proceso, concluyendo que el CaO fue la fase activa derivada de la cáscara
[10]. A demás se ha evaluado en la síntesis de otros compuestos como aceite de de Girasol,
aceite de Palma Africana, Mostaza, etc., con resultados satisfactorios [3-4].
7.4.4 Hidroxiapatita
Se comparó la capacidad de regeneración de hueso en un conejo en el cual se usó
hidroxiapatita sintética y la obtenida a partir de cáscara de huevo. Encontrándose que se
logró una mayor formación de hueso con la hidroxiapatita obtenida a partir de cáscara [10].
También se obtuvo la hidroxiapatita a partir de conversión directa y síntesis a partir de la
cáscara de huevo [5-6].

22
7.4.5 Membrana de la cáscara de huevo
Algunas de las aplicaciones de la membrana de la cáscara de huevo incluyen el uso como
adsorbente de metales pesados y como una membrana semipermeable para el control de
transporte de partículas [20], se ha usado la proteína presente en la membrana para mejorar
las propiedades de los biomateriales utilizados en aplicaciones de ingeniería de tejidos [21],
Como sustrato natural para la inmovilización y detección de ADN [22], Capacidad de
absorción de colorantes textiles en la membrana [23], Preparación de nanopartículas de oro
[24], Soporte para la inmovilización de enzimas [25], Absorción selectiva de arseniato y
especies inorgánicas de arsénico [26] entre otras.
La membrana contiene cerca de 30% de queratina, la cual es separada por diferentes
métodos para diversas aplicaciones [27].
7.4.6 Remoción de metales pesados
Es reportado en algunos trabajos el uso de la cáscara de huevo como adsorbente de metales
pesados en los cuales se aprovecha la composición y estructura de este material [28], [7-
10].
Considerando los promisorios usos estudiados para el aprovechamiento de un residuo tan
común como lo es la cáscara de huevo, se propone como una nueva alternativa económica y
sencilla la valoración de la misma por medio del uso de la membrana de la cáscara como
fuente de proteína para la obtención de aminoácidos libres con el objetivo de formular un
fertilizante foliar.

23
7.5 Aminoácidos
Los aminoácidos son la unidad estructural de las proteínas. Un aminoácido posee dos
grupos funcionales característicos: un grupo –NH2 y un grupo carboxílico –COOH (de ahí
su nombre). En general, todos los aminoácidos de un hidrolizado de proteínas son del tipo
alfa, ver figura 2.
Figura 2. Estructura de un aminoácido
Tomado de: Tesis “Estudio de las propiedades físicas y funcionales de un hidrolizado enzimático de proteína de Chocho a escala piloto y
su aplicación como fertilizante” [13].
Donde R representa un sustituyente característico del aminoácido en cuestión y que es el
que le distingue de los demás [29].
7.5.1 Clasificación de los aminoácidos
Se pueden clasificar atendiendo a su carácter acido o básico. Así podrán ser:
 Neutros: alifáticos, aromáticos y azufrados.
 Básicos
 Ácidos

24
7.6 Hidrólisis de proteínas
En el proceso de hidrólisis se transforman moléculas de gran tamaño (estructura primaria)
en productos más sencillos y fácilmente degradables. La hidrólisis tiene como finalidad
fragmentar las proteínas en aminoácidos.
7.6.1 Hidrólisis enzimática
La hidrólisis enzimática de proteínas para el análisis de aminoácidos es raramente aplicada,
dado que esta hidrólisis no se desarrolla en una sola reacción. Se trata de un conjunto de
reacciones simultáneas de ruptura de enlaces, con distintas especies cargadas en equilibrio,
lo que da una gran complejidad a este tipo de procesos.
La ventaja de la hidrólisis enzimática es que permite la cuantificación de la asparraguina y
la glutamina y de otros residuos sensibles a la destrucción durante la hidrólisis ácida [30].
7.6.2 Hidrólisis ácida
La hidrólisis ácida con ácido clorhídrico (HCl) es reportada en la literatura como el método
más común de hidrólisis. Esto se debe a la conveniencia del uso de este reactivo, como
puede ser el uso en ambos modos en fase liquida-gaseosa y puede ser evaporado
posteriormente. El proceso puede ser realizado con pequeñas cantidades del sustrato, un
factor importante cuando se tiene pequeñas cantidades de proteína disponible.
La hidrólisis acida convencional es realizada con HCl 6 M por 20 o 24 horas a 110°C a
presión reducida. Bajo las condiciones de hidrólisis ácida convencional asparraguina y
glutamina son completamente hidrolizados a ácido aspártico y ácido glutámico,
respectivamente. El triptófano es completamente destruido [30].

25
7.6.3 Hidrólisis básica
La hidrólisis básica es casi exclusivamente usada para la determinación de triptófano el
cual es estable bajo estas condiciones. Este tipo de hidrólisis es también aplicada a
proteínas que contienen un gran porcentaje de carbohidratos, como es el caso con
alimentos y en la formulación de soluciones farmacéuticas proteicas, las cuales incluyen
alto porcentaje de monosacáridos.
La hidrólisis alcalina es usualmente realizada con NaOH, KOH [30].
7.7 Fertilizantes
Son sustancias que se aplican directa o indirectamente a las plantas, para favorecer su
crecimiento, aumentar su producción o mejorar su calidad [31].
La tendencia del mercado mundial está enfocada en el uso de fertilizantes de origen
orgánico, con el fin de obtener cultivos más limpios y sanos para el consumo humano. Por
esta razón los aminoácidos se ajustan como la principal fuente de selección en la
formulación de fertilizantes ya que son 100% de origen orgánico, además cumplen con una
función sustancial en el ahorro de energía en la elaboración de proteínas, permitiendo que
las plantas reaccionen de una forma inmediata, pues los nutrientes (aminoácidos libres) van
en su fase final para el aprovechamiento óptimo de las plantas [32].
7.7.1 Clasificación de los fertilizantes según su forma de obtención
El número de materiales usados como fertilizantes es muy alto; su composición y
procedencia son muy diversas y sus posibilidades de utilización son múltiples.
Muchos residuos son usados como fertilizantes desde el inicio de la agricultura; otros
fertilizantes sin embargo, son modernos productos de síntesis. Algunos fertilizantes se
producen y utilizan en la explotación agrícola, los demás se adquieren en el mercado.

26
 Fertilizantes naturales: son aquellos que se han formado por medios naturales y que
se utilizan con o sin ningún tipo de transformación. Por ejemplo el estiércol (fresco
o descompuesto), el follaje.
 Fertilizantes sintéticos: son producidos por medios técnicos, ya sea por
transformación química de productos naturales o por sistemas de síntesis de
materiales elementales.
7.7.2 Clasificación de los fertilizantes según su forma de actuar
 Fertilizantes de efecto directo (abonos para las plantas) contienen proporciones
importantes de sustancias nutritivas para las plantas, a las cuales abastecen
directamente; a este grupo pertenece, por ejemplo, la mayor parte de fertilizantes
comerciales N, P y K, y también el estiércol líquido y semilíquido.
 Fertilizantes de efecto indirecto (enmiendas del suelo) mejoran sobre todo el
sustrato nutritivo [31].
7.7.3 Fertilizantes a base de aminoácidos
Los aminoácidos intervienen en la regulación endógena del crecimiento y desarrollo
vegetal.
Las plantas sintetizan los aminoácidos a través de reacciones enzimáticas por medio de
procesos de animación y transaminación. Los productos con contenidos de aminoácidos
libres se caracterizan por ser capaces de mejorar el torrente circulatorio de la planta
evitando, por una parte, el gasto energético y formando, a su vez, parte de los componentes
de la planta.

27
7.7.3.1 Efectos de los aminoácidos en las plantas
 Resistencia al estrés: Las altas temperaturas, enfermedades, heladas, etc., repercuten
sobre las plantas. Los aminoácidos y principalmente la Prolina actúan reduciendo
este riesgo.
 Efecto sobre la fotosíntesis: Algunos aminoácidos como la Glicina y el ácido L -
Glutámico incrementan la concentración de clorofila en consecuencia aumenta la
fotosíntesis.
 Síntesis de proteínas: Los L- aminoácidos se unen para formar proteínas
 Efecto quelante: algunos aminoácidos como la Glicina y los ácidos Glutámico y
Aspártico que tienen carga negativa son capaces de retener cationes formando
quelatos.
 Efecto sobre la polinización y cuajado de frutos: Está demostrado que aminoácidos
como la Prolina, Glutámico y la Glicina, aumentan la germinación del grano de
polen alargando el tubo polínico.
 Apertura de estomas: Aminoácidos como la Prolina frenan la producción de ácido
abcísico y en forma conjunta con el Glutámico favorece la apertura de estomas [33].
7.7.3.2 Los aminoácidos como nutriente vegetal y colaborador en su crecimiento y
desarrollo.
La incorporación a las plantas de aminoácidos provenientes del medio externo puede
realizarse por dos vías: radicular y foliar.
En condiciones naturales la vía radicular es el mecanismo usual de ingreso de aminoácidos
externos. Los aminoácidos que se encuentran libres en la solución del suelo pueden acceder
al apoplasto radicular por difusión y/o transporte en masa y, de allí ser absorbidos por las
células epidérmicas y del parénquima cortical de la raíz. En condiciones normales, y dadas

28
las bajas concentraciones de los aminoácidos en la solución del suelo, esta absorción solo
aporta una muy pequeña parte del total del nitrógeno absorbido por la raíz. Si se aplican
disoluciones de aminoácidos al suelo la concentración de la solución en estos compuestos
aumenta, con lo que se estimula pasivamente su absorción. La eficiencia de esta vía de
administración es, no obstante muy variable debido también al aprovechamiento de los
microorganismos del suelo.
La vía de penetración foliar es muy utilizada en la agricultura para administrar distintas
sustancias a los cultivos (fitosanitarios, reguladores del crecimiento, herbicidas, fertilizantes
foliares, etc.). Esta forma de absorción conlleva la penetración de la solución aplicada, a
través de los estomas y/o de la cutícula de las hojas, hasta el apoplasto foliar. Al ser un
proceso pasivo no se produce modificación importante de la composición inicial de la
solución, salvo si se trata de algunas sustancias muy sensibles a la modificación química,
física o biológica. Como puede suponerse, la administración de soluciones de aminoácidos
por esta vía es generalmente mucho más eficiente a corto plazo que la radicular [32].
7.7.4 Fertilización foliar
La fertilización foliar es una técnica que permite la incorporación del fertilizante en la
planta a través de las hojas. De este modo se logra que el producto se encuentre disponible
para el cultivo inmediatamente sin necesidad de lluvia para la incorporación, factor
primordial en los fertilizantes sólidos ya que presentan absorción radicular.
7.7.4.1 Respuesta a la fertilización foliar.
Varios son los elementos a medir o estudiar luego de una fertilización foliar. En cultivos
extensivos se ve reflejado en: número de vainas, número de granos por vaina, el tamaño de
los granos, el color de la pigmentación de la planta y el desarrollo radicular [34].

29
7.7.5 Factores que influyen la fertilización foliar
Para el éxito de la fertilización foliar es necesario tomar en cuenta tres factores,
formulación foliar, ambiente y los de la planta.
7.7.5.1 Relacionados con la formulación foliar
La concentración de la sal portadora del nutriente, el pH de la solución, la adición de
coadyuvantes y el tamaño de la gota del fertilizante líquido al momento de la aplicación.
 pH de la solución: La característica de la solución por asperjar, es de primordial
importancia en una práctica de fertilización foliar. El pH de la solución y el ión
acompañante del nutrimento por aplicar influyen en la absorción de éste en la hoja.
 Surfactantes y adherentes: La adición de surfactantes y adherentes a la solución
favorece el aprovechamiento del fertilizante foliar. El mecanismo de acción de un
surfactante consiste en reducir la tensión superficial de las moléculas de agua,
permitiendo una mayor superficie de contacto con la hoja; un adherente permite una
mejor distribución del nutrimento en la superficie de la hoja evitando
concentraciones de este elemento en puntos aislados cuando la gota de agua se
evapora.
 Nutrimento y el ion acompañante en la aspersión: La absorción de nutrimentos está
relacionada con la capacidad de intercambio catiónico en la hoja, y la valencia del
ion, por lo tanto, los iones monovalentes penetran con mayor facilidad que los iones
con mayor número de valencias. Los iones más pequeños en su diámetro penetran
más rápidamente que los iones de mayor tamaño.

30
7.7.5.2 Relacionados con el ambiente
Se debe considerar la temperatura del aire, el viento, la luz, humedad relativa y la hora de
aplicación.
 Temperatura y humedad relativa: Con alta temperatura y baja humedad relativa, hay
mayor evaporación de la solución, provocando una concentración de sales que
puede llegar a niveles tóxicos y causar daños por quema de follaje. Aunque también
la humedad relativa favorece la penetración de los nutrimentos al mantener húmeda
la hoja. De esta manera se ha reportado la temperatura adecuada de aplicación de 18
– 25°C y la humedad relativa alrededor de un 70%.
 Luz y hora de aplicación: La luz es un factor importante en la fotosíntesis y para que
una planta pueda incorporar nutrientes y metabolitos se requiere de un proceso
fotosintéticamente activo en la planta. La hora de aplicación debe de practicarse o
muy temprano o en las tardes, según las condiciones de la región.
7.7.5.3 Relacionados con la planta
Se toma en cuenta la especie del cultivo, estado nutricional, etapa de desarrollo y edad de
las hojas.
 Edad de la planta y hoja: La aplicación foliar de nutrientes también está afectada por
el estado de desarrollo de la planta. Se indica, aunque existen pocos datos, que las
plantas y hojas jóvenes son las que tienen mayor capacidad de absorción de
nutrientes vía aspersión foliar y desde luego deben de tener las hojas un déficit de
esos nutrientes en su desarrollo [35].
En general la fertilización foliar reúne una serie de estrategias para el aporte de sustancias o
soluciones de elementos esenciales en la planta vía aérea encaminadas a mejorar

31
directamente los procesos de absorción, transporte y transformación de los nutrientes en la
hoja, tallos o frutos, donde se aprovecha los mecanismos de toma pasiva y activa que
ocurren en estos órganos.
De acuerdo a la reglamentación del Instituto Agropecuario ICA, un fertilizante foliar con
aminoácidos al ser analizado en las pruebas de registro, debe de cumplir para los
aminoácidos libres con una desviación admitida no mayor al 5 % del valor declarado en la
etiqueta.
Adicionalmente debe de cumplir con los siguientes valores mínimos de concentración:
Nitrógeno Total (N) 0.9 %
Nitrógeno Orgánico (N) 0.4 %
Fósforo asimilable (P) 0.9 %
Potasio soluble en agua (K) 0.9 %
La desviación admitida para los contenidos de materia orgánica será del 10% de la
composición garantizada en la etiqueta.
Como norma general para todos los productos con materia orgánica, se fijan además las
siguientes desviaciones en valores absolutos [32]:
Extracto húmico total 0.8 %
Ácidos húmicos 0.8 %
Carbono orgánico 5.0 %
7.7.6 Ventajas del uso de aminoácidos en la fertilización foliar
Los aminoácidos son utilizados por las plantas en su metabolismo y tienen un doble efecto:
por un lado, ahorran energía metabólica en la síntesis de los mismos y, por otro lado,
consiguen aportar osmolitos de efectos fisiológicos concretos. Favorecen la acumulación de
nutrientes esenciales como K+
, Ca2+
, N y P.

32
Además de la función nutricional, los aminoácidos pueden actuar como reguladores del
transporte de microelementos, ya que son capaces de formar complejos con metales. En
este sentido, diversas investigaciones dan cuenta de su función como agentes complejantes
para diversos elementos como el hierro, favoreciendo su transporte y penetración en el
interior de los tejidos vegetales.
Para que la planta pueda incorporar los aminoácidos en su metabolismo, es necesario que
sean aminoácidos libres o péptidos de muy bajo peso molecular. De esta forma, entrarán
fácilmente a la planta a través de las raíces o en aplicación foliar, penetrando en las hojas
por difusión, para ser posteriormente transportados a los órganos del vegetal donde se
requiere una mayor demanda de ellos [36].
7.8 Modelos
Los modelos son en algunos casos constructos conceptuales pero en otros son sistemas
fisicoquímicos y/o biológicos simples en los cuales se pueden definir y controlar de forma
efectiva un número finito de variables que hacen reproducible y confiable los resultados
obtenidos de la perturbación del sistema en estudio. Muchos de ellos son observados
directamente [37].
7.8.1 Modelo químico
El modelo químico se describe como imparcial, únicamente definido, y modelo teórico
uniformemente aplicable para predecir propiedades químicas de un sistema. Un modelo
químico consiste generalmente en la combinación de un método teórico y un sistema base.
Cada par único de un método con un sistema base representan una aproximación diferente a
la ecuación de Schrödinger [38].

33
7.8.2 Modelo biológico
Una gran parte de investigadores trabajan con organismo vivos llamados modelos, los
cuales son mantenidos y estudiados en condiciones de laboratorio con el fin de evaluar el
efecto de factores ambientales o sustancias químicas.
7.8.2.1 Phaseolus vulgaris
Comúnmente conocido como frijol, habichuelas, porotos, aluvias, judías y otros (Figura 2).
Es una planta dicotiledónea, herbácea intensamente cultivada desde la zona tropical hasta
las templadas. Es originario de América y su clasificación taxonómica se muestra en la
Tabla 1.
Figura 3 . Fotografía de P. vulgaris.

34
Tabla 1. Clasificación taxonómica de Phaseolus vulgaris
Clasificación taxonómica
Reino Plantae
División Magnoliosida
Orden Fabales
Familia Fabaceae
Genero Phaseolus
Especie Phaseolus vulgaris follardo
Es una planta muy estudiada por su valor nutricional, el género Phaseolus es una de las
bases para alimentación humana, ya que es la principal fuente de proteína; es rico en lisina
pero deficiente en aminoácidos como: metionina, cisteina y triptófano; por lo cual una dieta
adecuada en aminoácidos esenciales se logra al combinar con cereales (arroz, maíz, otros).
Las principales ventajas como modelo biológico son: tiempo de germinación y crecimiento
corto, se adapta bien desde 200 hasta 1.500 msnm. El pH óptimo para frijol está
comprendido entre 6,5 y 7,5 aunque es tolerante a pH entre 4,5 y 8,2 [39].
Phaseolus vulgarias, se caracteriza por su porte arbustivo, erecto con ramas laterales
cortas, flores blancas y su buena tolerancia a enfermedades, tales como Antracnosis, roya,
oídium, fusarium y mancha de la hoja, permitiendo un cultivo exitoso y competitivo. A
comparación con otras variedades, alcanza una altura entre 40 a 45 cm, por esta razón es
recomendable que la semilla se siembre de 2 a 3 cm de profundidad.

35
7.8.2.2 Raphanus sativus
Comúnmente conocido como rábano (Figura 3) es una dicotiledónea y posiblemente
derivada de Raphanus maritima de las costas del Mediterráneo, Se encuentra en varias
partes del mundo, sobre todo de clima subtropical, su clasificación taxonómica se muestra
en la Tabla 2.
a) b
Figura 4. Fotografía de R. sativus: (a) semilla; (b) detalle de la plántula: 1, cotiledones; 2,
hipocótilo; 3, raíz embrionaria o radícula

36
Tabla 2. Clasificación taxonómica del modelo R. sativus.
Clasificación Taxonómica
Phylum Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Capparales
Familia Brassicaceae
Género Raphanus
Nombre científico Raphanus sativus

37
8. METODOLOGIA
Para la formulación del fertilizante a partir de la membrana de la cáscara de huevo se
llevaron a cabo las siguientes etapas:
 Optimización del proceso para la separación de la membrana de la cáscara de huevo.
 Caracterización proximal de la membrana.
 Identificación del proceso de hidrólisis de proteínas para la obtención de los
aminoácidos libres.
 Determinación del grado de hidrólisis de la proteína.
 Cuantificación del contenido de aminoácidos.
 Formulación de fertilizante líquido.
 Evaluación de la eficiencia del fertilizante formulado en un cultivo modelo.
A continuación se detalla cada uno de los ítems.
8.1 Separación de la membrana de la cáscara de huevo
La cáscara de huevo material de estudio para esta investigación, fue suministrada por
Avinal S.A. Medellín, Colombia.
Una vez desechada la cáscara de huevo en la actividad productiva de Avinal, el material
debió de ser recogido en contenedores limpios y adecuados que se puedan mantener en
zonas refrigeradas y libres de microorganismos, con el fin de minimizar su crecimiento.
Luego de la recolección el producto en unas condiciones óptimas de seguridad y salubridad
se separaron los restos líquidos de la cáscara de huevo a través de un lavado con agua
potable, seguido de un tratamiento térmico para la pasteurización y neutralización de los
elementos bacterianos que contenga; para la separación de la membrana de la cáscara, se
tomo la cáscara previamente lavada, pasteurizada y seca.
La separación de la membrana de la cáscara de huevo es un proceso clave a la hora de
realizar un escalado industrial para obtener este biomaterial disponible, por lo tanto a esta
etapa se le ha atribuido significativa atención. En algunos de los reportes encontrados en la

38
literatura se encuentran métodos que implican la separación manual, el uso de tratamientos
ácidos entre los que se incluyen el ácido acético, ácido clorhídrico y EDTA. Los
tratamientos ácidos actúan principalmente en la superficie de la cáscara de huevo,
disolviendo el carbonato de calcio. El uso de ácidos en el proceso de separación tienen la
desventaja en este caso especifico de desnaturalizar el colágeno [21]. Recientemente se ha
desarrollado un método mecánico para la separación de la membrana por flotación en el
cual se pueden obtener porcentajes de recuperación de la membrana de hasta un 96 % y 99
% de carbonato de calcio presente en la cáscara en dos horas de operación [40].
El método utilizado para la separación de la membrana de la cáscara de huevo consistió en
un proceso de separación por flotación en el cual se molió la cáscara en húmedo y se
mantuvo en agitación constante. Conjuntamente se hizo pasar un flujo de aire a través de la
dispersión sólido-líquida, el cual arrastra en su movimiento ascendente la membrana por ser
el componente más liviano, mientras que el carbonato de calcio de la cáscara sedimenta en
el fondo del recipiente. Posteriormente la membrana y las partículas de carbonato de calcio
se recogieron por separado.
La separación de la membrana de la cáscara se obtuvo a través de la molienda en húmedo
de 300 g de cáscara de huevo pasteurizada y 1000 mL de agua potable, con agitación
constante, posteriormente se hizo pasar un flujo de aire para separar por flotación la
membrana de la cáscara y por último con el fin de purificar la membrana de cualquier
remanente de cáscara, se usó una solución de acido acético0.01 M, se lavó con potable y se
puso a secar en estufa a 50 °C.
8.2 Caracterización de la membrana
La membrana seca se pesó y se determinó el contenido de proteína por el método de
Kjeldahl, cenizas, humedad, grasas y capacidad de retención de agua. Esta caracterización
se realiza de acuerdo a los protocolos utilizados en el laboratorio Grupo interdisciplinario
de Estudios Moleculares (GIEM).

39
Para la determinación del contenido de proteína por el método de Kjeldahl se llevó a cabo
el siguiente procedimiento.
Se pesó en la balanza analítica entre 0,1 y 1,0 g de la membrana de la cáscara de huevo seca
y pasada por malla # 30.
Se trasfirió la muestra al tubo de prueba y se ubicó en la gradilla de la unidad de digestión.
Se Pesó el catalizador de Devarda sobre papel kraft y se transfirió al tubo de prueba.
Para iniciar la destilación, se procedió a seleccionar el método 02 DEVARDA al momento
de seleccionar el método, se adicionaron 50 mL de solución de ácido bórico al 2,0 % y 100
mL de agua destilada.
Se Adicionó al destilado 3 gotas de indicador de Tashiro (la solución se torna verde) y se
Tituló con ácido clorhídrico 0,1 M (previamente estandarizado) hasta cambio de color de
verde a azul/violáceo.
8.3 Hidrólisis de proteína
En la literatura se describen las condiciones detalladas de la hidrólisis acida. La hidrólisis
con acido clorhídrico (HCl) es el método más comúnmente empleado. La hidrólisis ácida
convencional usa HCl 6 M durante 20 a 24 horas a 110 °C en vacío [30].
Para la hidrólisis de la proteína presente en la membrana de la cáscara de huevo, se
evaluaron cuatro ácidos inorgánicos a tres concentraciones diferentes a una presión de 15
psi, una temperatura de 100 °C y 120 °C un tiempo de hidrólisis de 1 h, 2 h y 4 h. En la
Tabal 3 se muestran las condiciones de hidrólisis.

40
Tabla 3. Condiciones de hidrólisis
Ácido
Concentración
(M)
HCl 1.5, 3, 6
HNO3 1.5, 3, 6
H2SO4 1.5, 3, 6
H3PO4 1.5, 3, 6
La proporción de membrana seca y molida en proporción con el ácido fue de 1:2, 1:3 y 1:4.
En los ensayos se pesó la membrana seca, molida y pasada por malla # 30, se adicionó el
volumen del ácido a evaluar y se llevó a la autoclave bajo las condiciones establecidas.
8.4 Determinación del grado de hidrólisis
El grado de hidrólisis (GH) es definido como el porcentaje de aminoácidos libres separados
de la proteína, el cual fue calculado como la proporción entre los α-amino nitrógenos (AN)
y el nitrógeno total (NT). El AN fue determinado por el método de titulación con
formaldehido [41].
La titulación con formaldehido es un método rápido, preciso y conveniente para detectar el
grupo amino de los aminoácidos. El formaldehido es adicionado a la solución y reacciona
con el grupo amino de la cadena de la proteína, el cual libera una cantidad equivalente de
H+
, el cual puede ser estimado por titulación con NaOH. Este método se considera útil en la
determinación de la concentración de los α-AN.
Usando el método de titulación con formol (Figura 5), el aminoácido libre que contiene un
α-NH2- solo podrá reaccionar con una molécula de formol.

41
+ OH
O
N
R
O
R
N
O
H
O
O
N
H
O
R Na
OH
O
N OH
R
O
H
NaOH
Ó
Ó
NH2
R
OH
O
Aminoácido Formol
H H
O +
Figura 5 Mecanismo de la titulación con formol para la determinación de α-AN
Tomado de: Artículo “Comparison of Chromatographic and Titrimetric Methods for the Determination of the α-amino Nitrogen in
Standard Solution and Fish Protein Hydrolysates” [42]
Se tomaron 10 mL de hidrolizado de proteína y se le adicionaron 10 mL de agua destilada
se agitó y se ajustó el pH a 7.0 con una solución de NaOH 0.1 M, posteriormente se
adicionaron 10 mL de solución de formaldehido al 37 % (v/v) y se tituló con una solución
estándar de NaOH 0.1 M hasta pH 9.5 usando el pH-metro. El NT fue determinado por el
método de Kjeldahl. La concentración de α-AN fue calculada usando la siguiente ecuación.
Cα-AN (Mm) = ΔV x n x 103
V
Donde ΔV es el volumen en mL de NaOH usados en la titulación; n (mol/L) es la
concentración molar de la solución de NaOH; y V es el volumen de hidrolizado.
El grado de hidrólisis se cálculo de acuerdo a la siguiente ecuación.
GH (%) = α-Amino Nitrógeno (AN) x 100
Nitrógeno total (NT)

42
 Reacción de Biuret: Esta prueba es positiva para sustancias que contengan dentro de
la molécula varios grupos amida muy cercanos dando coloración usualmente
violeta-purpura. Cuando se adiciona una pequeña cantidad de sulfato de cobre (II)
en medio alcalino. La coloración se debe a la formación de un complejo de
coordinación entre el Cu 2+
y los grupos amida de las uniones peptídicas. A medida
que progresa la hidrólisis de una proteína, el color producido en la prueba de Biuret
se decolora gradualmente a rosa y después desaparece ya que los péptidos más
pequeños y los aminoácidos no dan coloración.
Se tomó 1 mL de cada hidrolizado previamente neutralizado y diluido (1/25) para evitar
interferencias de color, se le adicionó 2 mL de hidróxido de sodio al 20 % y 0.5 mL de
solución de sulfato de cobre al 1 %, se usó como prueba positiva la Albumina de suero
Bovino.
 Reacción de Ninhidrina: la ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) un agente
oxidante, reacciona con los α-aminoácidos a un pH entre 4 y 8 para dar un
compuesto de color azul-purpura. Esta reacción se efectúa también con aminas
primarias y amoníaco pero sin desprendimiento de CO2.
Los aminoácidos prolina e hidroxiprolina, también reaccionan con la ninhidrina
pero en este caso se obtiene un color amarillo.
Se tomó 1 mL de cada hidrolizado diluido (1/25) a un pH entre 4 y 8, se le adicionó 1 mL
de reactivo de Ninhidrina, se llevó a ebullición en baño María, se usó Glicina como prueba
positiva.
 Reacción Xantoprotéica: el acido nítrico concentrado reacciona con algunas
proteínas que contengan en su estructura aminoácidos con anillos aromáticos,
dando un color amarillo que se oscurece hasta anaranjado cuando se añade un
álcali. Esta reacción es positiva para las proteínas que contienen fenilalanina,
tirosina o triptófano.

43
Se tomó 1 mL de cada hidrolizado diluido (1/25) y previamente neutralizado, se le adicionó
1 mL de ácido nítrico concentrado y se calentó al baño María hasta cambio de coloración.
Posteriormente se alcalinizó la mezcla adicionando gota a gota hidróxido de sodio al 25 %.
Se uso como prueba positiva tirosina.
 Reacción de aminoácidos azufrados: Los aminoácidos que contengan azufre, como
es el caso de la cisteína y la metionina, reaccionan con el acetato de plomo en
medio básico formando un precipitado negruzco de sulfuro de plomo.
Se tomó 1 mL de cada hidrolizado diluido (1/25) y previamente neutralizado, se
adicionaron 2 mL de hidróxido de sodio al 20 %, se calentó en baño María y por último se
adicionaron 10 gotas de solución de acetato de plomo al 5 %. Se usó cisteína como prueba
positiva.
Espectrometría de masas
Se realizó un análisis de espectrometría de masas a cada hidrolizado, con el fin de tener un
indicio de la presencia de aminoácidos libres, lo cual daría indicios de que tan eficiente es
cada acido para hidrolizar la proteína.
Separación de aminoácidos por cromatografía de capa fina
Posterior a confirmar la presencia de aminoácidos en las hidrólisis realizadas con los
diferentes tipos de ácidos, se realizo una separación de los aminoácidos a través de
cromatografía de capa fina.
Fase estacionaria: Silica gel
Fase móvil: se evaluaron las siguientes mezclas
3:2:1 2-Butanol: Ácido acético glacial: Agua
3:1 2-Butanol: Hidróxido de amonio
Revelador: Ninhidrina al 0.2 %

44
Se preparó una mezcla estándar de aminoácidos a 100 ppm y soluciones de los aminoácidos
individúales a una 200 ppm los cuales son los patrones y se siembran en la silica gel con los
hidrolizados, se lleva a la cámara se deja hasta el frente de solvente, se aplica el revelador y
por último se seca para observar el color que indica la presencia o ausencia de los
aminoácidos.
8.5 Estudios de fitotoxicidad de los hidrolizados
La evaluación de la fitotoxicidad de cada hidrolizado se realizó a través del índice de
germinación (IG) y longitud de radícula de semillas seleccionadas de Raphanus sativus.
La prueba de fitotóxicidad consistió en adicionar 5 mL de cada sistema a evaluar sobre
discos de impregnación de papel de 8 cm de diámetro en cajas de petri, las cuales contenían
20 semillas de Raphanus sativus. Se evaluaron diferentes concentraciones (100 – 75 – 50 –
25 - 12.5 - 6.25 - 3.2 - 1.6 - 0.8 - 0.4 - 0.2 – 0.1) % y 5 mL de agua como control. Se
dejaron en la oscuridad por 48 horas y se procedió a contar el número de semillas de rábano
germinadas. A cada semilla que germinó, se le midió la longitud de la radícula y el peso
total de las radículas este procedimiento se realizó de acuerdo a los protocolos utilizados en
el laboratorio Grupo interdisciplinario de Estudios Moleculares (GIEM).
El índice de germinación fue determinado dividiendo el número de semillas germinadas
sobre el total de semillas por cien.
Se usaron semillas con las siguientes especificaciones:
Lote # 461179-38
% Germinación 90
Pureza 99 %
Análisis 03/2013

45
8.6 Cuantificación del contenido de aminoácidos libres
La determinación de aminoácidos a través de un análisis espectrofotométrico de sus sales
de cobre, se basó en la formación de compuestos solubles de cobre, por medio de la
reacción del aminoácido y un exceso de cobre presente en forma de fosfato de cobre.
Algunos aminoácidos forman sales de cobre escasamente solubles a estas condiciones (Por
ejemplo, Cisteína, Metionina, Triptófano, Leucina y Fenilalanina) por lo tanto el método
requiere la mezcla de cantidades conocidas de otros aminoácido adecuados (Alanina o
Glicina), a través de la cual se forman sales mixtas de cobre solubles que pueden ser
cuantificadas [43].
La glicina fue elegida como estándar debido a su relativa alta solubilidad, su fácil
purificación, su bajo costo y porque da una intensidad de color cerca a un color intermedio
entre los otros aminoácidos.
Preparación de soluciones
 Solución de cloruro de cobre, se disolvieron 2.8 g de CuCl2 • 2H2O en agua
destilada y se llevó a 100 mL en balón volumétrico.
 Solución de fosfato trisódico dodecahidratado, se disolvieron 6.85 g de Na3PO4 •
12H2O en agua destilada y se llevó a 100 mL en balón volumétrico.
 Solución de tetraborato de sodio, se disolvieron 5.0375 g de Na2B4O7 en agua
destilada y se llevó a 500 mL en balón volumétrico, antes de aforar se verificó que
el pH estuviera entra 9.1 – 9.2. La solución debe de ser filtrada antes del uso.
 Para la preparación de la solución de fosfato de cobre, se tomaron 40 mL de la
solución de fosfato trisódico y se le adicionaron 20 mL de la solución de cloruro de
cobre en agitación constante. La suspensión fue centrifugada por 5 min a 6000 rpm,
el precipitado fue lavado dos veces por resuspención en solución de tetraborato de
sodio, seguido por centrifugación. Por último el precipitado fue suspendido en 100
mL de solución de tetraborato de sodio y se adicionaron 6 g de NaCl.

46
Procedimiento
Blanco para curva de calibración: se tomaron 5 mL de solución de tetraborato de sodio
que contenía 6 g de NaCl en 100 mL, se le adicionaron 5 mL de agua destilada, se
tomaron 9.5 mL y se disolvieron 200 mg de Glicina.
Curva de calibración: se preparó una solución madre de Glicina a 3000 ppm y a partir
de ella se prepararon soluciones diluidas de las siguientes concentraciones 375 – 750 –
1125 – 1500 – 1875– 2250 – 2625 ppm. A 10 mL de cada solución estándar fueron
adicionados 10 mL de suspensión de fosfato de cobre en balón de 50 mL, se llevo a
volumen final con agua destilada. La suspensión fue agitada ocasionalmente durante 5
min y centrifugada 5 min a 6000 rpm. Se tomaron 9.5 mL de sobrenadante y se le
adicionaron 200 mg de glicina.
Para la selección de la longitud de onda se realizó un barrido con una solución estándar
de glicina a 3000 ppm, adicionado con 200 mg entre 450 – 700 nm [44].
El cálculo de la concentración de los aminoácidos es igual a la concentración en un
complejo de cobre por dos, ya que la formula empírica de las sales de cobre que forman
los aminoácidos es CuA2, donde A= 1 molécula de aminoácido.
Nota: se debió de tener cuidadoso control con el pH de los hidrolizados, el cual debía
de estar en 7 a la hora de realizar los análisis.
8.7 Formulación de fertilizante foliar líquido
Basados en los requerimientos mínimos exigidos por la ICA, a la norma técnica
Colombiana (NTC 5167) y de acuerdo a las formulaciones que se encuentran en el
mercado, se propone el formulado de la Tabla 4.

47
Tabla 4. Formulación de fertilizante
Componente Concentración (g/L)
Aminoácidos libres 50
Nitrógeno total (N) 150
Magnesio (Mg) 2.5
Cinc (Zn) 1.6
Hierro (Fe) 1.0
Manganeso (Mn) 0.55
pH en solución al 10 % 5.5-6.5
Fósforo (P2O5) 50
Potasio (K2O) 100
En la elección de los micronutrientes para la formulación del fertilizante foliar líquido se
tuvo en la cuenta su función específica en el crecimiento de la planta, en la producción
alimentaria y el hecho de que un nutriente no puede ser sustituido por otro. Como por
ejemplo los micronutrientes como el cinc, hierro y manganeso son necesarios en pequeñas
cantidades, pero imprescindibles para la vida de la planta. Forman parte de la clorofila e
influyen en la actividad de las enzimas, lo que hace a las plantas crecer más sanas y
resistentes frente a las plagas y enfermedades.
Posterior a la formulación del fertilizante foliar a base de aminoácidos producto de la
hidrólisis ácida de la membrana de la cáscara de huevo se realizó una cuantificación del
contenido de nitrógeno total por el método Kjeldahl según la norma NTC 370, el carbono
orgánico oxidable total se determinó a través de una técnica titulométrica según la norma
NTC 5167, el fósforo total expresado como P2O5 se determinó a través de una técnica
espectrofotométrica según la NTC 234, el pH (10%) se determinó a través de una técnica
potenciométrica según la NTC 5167, el calcio total expresado como CaO se determinó a
través de Electroforesis capilar, el magnesio total expresado como MgO se determinó por
Electroforesis capilar, el potasio total expresado como K2O se determinó por electroforesis

48
capilar, el hierro total y el manganeso total se determinaron por absorción atómica, según la
norma SM 3111B. Todos los análisis se realizaron según la metodología del Grupo
Interdisciplinario de Estudios Moleculares (GIEM).
8.8 Evaluación de la eficiencia del fertilizante formulado en un cultivo modelo
Se sembró en materas plásticas (59 cm de largo x 13 cm de alto x 12 cm de ancho) (Figura
7), con una capacidad de 4 kg; con tierra de vivero abonada suplementado con gallinaza
compostada en el punto de siembra. Se sembraron 3 semillas de frijol en cada tres puntos
por matera. A cada matera se le asignó una concentración de hidrolizado 0.1 %, 0.2 % y 0.4
%. Estos resultados como se mencionó en el numeral 8.5 se compararon con dos testigos, el
primero es un fertilizante foliar comercial con aminoácidos libres en su formulado (Tabla
5) y en el segundo sin fertilización.
Figura 6. Foto de matera plástica y sus dimensiones
La fase de experimentación se llevo a cabo en un lugar cubierto por un plástico trasparente
en el cual puede penetrar la luz, más no la lluvia por tanto el riego fue según las
condiciones climáticas (Figura 7).

49
Figura 7. Condiciones de la fase experimental
Especificaciones del frijol usado en el análisis de eficacia
Variedad: frijol cargamanto macho
Pureza 98 %
Germinación mínima 80 %
Lote cc 05-10
Análisis 10/16
Tabla 5. Composición del fertilizante comercial A-MICSUR
COMPOSICIÓN A-MICSUR
Aminoácidos libres 102.40 g/L Cobre (Cu) 0.36 g/L
Carbono orgánico oxidable 187.00 g/L Hierro (Fe) 0.66 g/L
Nitrógeno total (N) 140.80 g/L Manganeso (Mn) 0.48 g/L
Nitrógeno orgánico (N) 140.80 g/L Molibdeno (Mo) 0.06 g/L
Fósforo asimilable (P2O5) 39.60 g/L Zinc (Zn) 0.65 g/L
Potasio soluble en agua (K2O) 84.40 g/L pH en disolución al 10% 7.23
Boro (B) 0.1 g/L Densidad a 20 °C 1.28 g/cc

50
La aplicación del fertilizante se hizo por aspersión con buena cobertura de la planta en tres
etapas, la primera en prefloración, la segunda se hace después de un mes de la floración y la
tercera aplicación, dos meses después de la floración.
Se aplicaron 30 mL de fertilizante foliar formulado a base del hidrolizado de la membrana
de la cáscara de huevo y del fertilizante foliar comercial a base de aminoácidos por
aspersión y en las horas de la mañana.
El fertilizante foliar comercial se diluyó según las especificaciones del fabricante de 1 L
/hectárea, para la dilución se tomaron 0.05 mL del fertilizante y se diluyeron hasta 1 L
con agua potable.
La eficacia del fertilizante se determinó a través de la biomasa de todas las partes de la
planta de frijol, se pesaron las raíces, tallos, hojas, vainas y frutos.

51
9. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
9.1 Proceso de separación
Para la optimización del proceso de separación de la membrana de la cáscara de huevo, se
evaluaron el proceso mecánico, químico y la mezcla de ambos, encontrándose mejores
resultados para la mezcla de ambos métodos. El método químico a través del tratamiento
ácido ayudó a eliminar los remanentes de cáscara de huevo presentes en la membrana por
medio de la disolución del carbonato de calcio, mientras que el método mecánico
comparado con el químico es más eficiente y a demás tiene la ventaja de no disolver el
carbonato de calcio, el cual es el componente principal de la cáscara de huevo. Por lo tanto
al usar el método mecánico se pueden aprovechar tanto la membrana como la cáscara de
huevo para diferentes aplicaciones.
A través de la implementación de las dos metodologías de separación de la membrana de la
cáscara de huevo se obtuvo una eficiencia del 95.5 %
9.2 Caracterización de la membrana
En la Tabla 6, se puede observar el análisis proximal de la membrana de la cáscara de
huevo. La cual incluye la cuantificación del contenido de proteína presente en la membrana
de la cáscara de huevo de 63.4 %, al comparar este valor con la literatura se encuentra que
es de 69.2 % [9], mostrando que aunque los valores no son iguales para ambos casos se
observa un alto contenido de proteína, haciendo de esta un buen candidato para diversas
aplicaciones, entre ellas la obtención de los aminoácidos libres a partir de hidrólisis
química.
En cuanto al contenido de humedad y capacidad de retención de agua, estos valores son
considerados en el momento de la hidrólisis en el cual se debe de hacer la relación
membrana / volumen de ácido.
El contenido de cenizas de un 10.3 % en la membrana esta mas bajo con el reportado en la
literatura, en el cual se encontró un 27.2 %.

52
Tabla 6. Caracterización de la membrana
Caracterización Experimentales (%)
Proteína (N * 6,25) 63.4
Humedad 10.6
Cenizas 10.3
Grasas 0.5
Capacidad de
retención de agua
458
9.3 Hidrólisis de proteína
La selección de cada uno de los ácidos se realizó considerando que podría ser útil el aporte
de alguno de sus elementos en la formulación del fertilizante, como el aporte de nitrógeno
proveniente del ácido nítrico, el aporte de fósforo proveniente de ácido fosfórico y el aporte
de azufre proveniente del ácido sulfúrico. Como referencia para estas hidrólisis se uso el
ácido clorhídrico ya que según la literatura es el acido mas empleado.
El hidrolizado se neutraliza con una base fuerte (hidróxido de sodio concentrado) con el fin
de realizar los ensayos respectivos.
9.4 Grado de hidrolisis
El hidrolizado ácido de la proteína presente en la membrana de cáscara huevo alcanzó un
grado de hidrólisis (GH) de 98.8 % con el ácido clorhídrico y 80.6 % con el ácido sulfúrico,
lo cual confirmaría aun más el hecho de que estos ácidos son los más apropiados para la
hidrólisis ácida y que los parámetros seleccionados para dicha hidrólisis fueron los
adecuados.

53
En la determinación del grado de hidrólisis se determinó el contenido de nitrógeno total
para el hidrolizado con HCl de 1.545 % y para el hidrolizado con H2SO4 de 2.463 %.
A demás se determino de una forma cualitativa el grado de hidrolisis de la proteína a través
de reacciones características para la identificación de aminoácidos y proteínas como se
puede observar en la Tabla 7.
Tabla 7. Reconocimiento de aminoácidos y proteínas.
Ácido Biuret Ninhidrina Xantoprotéica Azufrados
HCl Azul cielo Azul-purpura Anaranjado Negro
H3PO4 Violeta claro Azul-purpura Anaranjado Negro
H2SO4 Azul cielo Azul-purpura Anaranjado Negro
HNO3 Azul cielo Azul-purpura Anaranjado Negro
La prueba de Biuret es negativa para la hidrólisis con ácido fosfórico, lo cual indica que la
hidrólisis no fue completa. Para los demás ácidos es una prueba positiva confirmando que
hubo una hidrólisis total.
La prueba de ninhidrina fue positiva para todas las hidrólisis, lo cual indica la presencia de
α-aminoácidos.
Reacción Xantoprotéica fue positiva para todas las hidrólisis, indicando la presencia de
aminoácidos aromáticos como: fenilalanina, tirosina o triptófano.
Reacción de aminoácidos azufrados fue positiva para todas las hidrólisis, indicando la
presencia de aminoácidos que contengan azufre, como es el caso de la cisteína y
metionina.

54
Espectros de masas
Figura 8. Espectro de masas del hidrolizado con HCl
Figura 9. Espectro de masas de hidrolizado con H2SO4
Figura 10. Espectro de masas del hidrolizado con H3PO4
Figura 11. Espectro de masas hidrolizado con HNO3

55
Como se puede observar en las figuras de la 9 hasta la 12 los espectros de masas confirman
la presencia de picos con pesos moleculares menores a una proteína para todas las hidrólisis
evaluadas, por lo tanto se puede inferir la presencia de péptidos de bajo peso molecular.
Aunque este análisis no es concluyente a la hora de elegir a partir de que ácido se obtuvo la
mejor hidrólisis y la identificación de los aminoácidos libres, da un indicio de la capacidad
que tiene cada ácido para hidrolizar la proteína.
Figura 12. Placa Cromatográfica de todos los hidrolizados comparado con cada estándar de
aminoácido y una mezcla de la misma a 100 ppm.
De las diferentes fases móviles evaluadas, se obtuvo una mejor separación con la mezcla
3:1:1 2-Butanol: Ácido acético glacial: Agua.
Se puede observar en las placas Cromatográficas que los hidrolizados con HCl y H2SO4
tienen un comportamiento muy similar al de la muestra patrón (mezcla de aminoácidos a
100 ppm), (Figura 13) caso opuesto con los hidrolizados realizados con H3PO4 y HNO3
donde no fue posible observar ningún punto que indique la presencia de aminoácidos. De

56
estos resultados se puede concluir que los mejores hidrolizados son obtenidos usando HCl y
H2SO4, los resultados observados con los ácidos H3PO4 y HNO3 sugieren una mala
hidrólisis, lo cual verifica la prueba positiva de Biuret para H3PO4 o que ambos ácidos no
son lo suficientemente eficientes para hidrolizar la proteína.
Como se puede observar en la figura 14, al disminuir la concentración del ácido clorhídrico
y del ácido sulfúrico, cualitativamente no se pudieron observar diferencias significativas en
los hidrolizados de las concentraciones evaluadas, esto es debido a que los hidrolizados
para la concentraciones al 1.5 y 3 M, fueron concentrados a través de la liofilización.
Al no observar diferencias cualitativas se realizó una cuantificación de la proteína presente
en los hidrolizados por el método cuantitativo de Biuret en el cual la intensidad del color es
directamente proporcional a la cantidad de proteínas y se uso como estándar para la
construcción de la curva de calibración albumina de suero bovino. Por lo tanto se pudo
concluir que al disminuir la concentración de los ácidos, disminuyo el grado de hidrólisis
de la proteína.
Figura 13. Placa Cromatográfica de todos los hidrolizados a las diferentes concentraciones
comparado con una mezcla estándares de aminoácidos a 200 ppm

57
9.5 Pruebas de fitotoxicidad
Como se puede observar en la figura 15 y 16, no hubo germinación para los hidrolizados
de HCl y H2SO4 a las siguientes concentraciones 100 - 75 - 50 - 25 %, comparado con el
control el cual tuvo un porcentaje de germinación del 100 %. Por lo tanto se puede concluir
que a estas concentraciones ambos hidrolizados son fitotoxicos.
Se procedió a preparar nuevas diluciones de ambos hidrolizados a las siguientes
concentraciones 25 – 12.5 – 6.25 – 3. 2 %.
Figura 14. Germinación para hidrolizado con HCl 6 M (100 – 75 – 50 – 25 %)
Figura 15. Germinación para hidrolizado con H2SO4 6 M (100 – 75 – 50 – 25 %)

58
Como se puede observar en las Figura 17, para el hidrolizado con HCl 6 M solo se
comienza a obtener germinación a una concentración del 12.5 % para las demás
concentraciones mayores a esta se observa que el hidrolizado sigue siendo fitotóxico.
El índice de germinación para las diferentes concentraciones fue el siguiente: 15 % para la
concentración de 12.5 %, 70 % para la concentración de 6.25 % y 90 % para la
concentración de 3.2 %. Los resultados son comparados con el blanco el cual tiene un IG de
100 %.
Figura 16. Germinación para hidrolizado con HCl 6 M (25 – 12.5 – 6.25 – 3.2 %)
Como se puede observar en la Figura 18, para el hidrolizado con H2SO4 6 M comenzó la
germinación para la concentraciones menores a de 6.25 %, para las concentraciones
superiores sigue presentándose fitotóxicidad del hidrolizado.
El índice de germinación para las diferentes concentraciones fue el siguiente: 75 % para la
concentración de 6.25 % y 80 % para la concentración de 3.2 %. Los resultados son
cercanos al blanco el cual tiene un índice de germinación de 100 %.

59
Figura 17. Germinación para hidrolizado con H2SO4 6 M (25 – 12.5 – 6.25 – 3.2 %)
Para el hidrolizado con HCl 6 M se procede a realizar diluciones de 12.5 – 6.25 – 3.2 – 1.6
– 0.8 % y para el hidrolizado con H2SO4 6 M se realizaron diluciones de 6.25 – 3.2 – 1.6 –
0.8 – 0.4 %. Estas diluciones se realizaron con el fin de encontrar a que concentración se
obtienen resultados similares al blanco, lo cual implicaría que a esa concentración no hay
efecto fitotóxico causado por los hidrolizados.
Como se puede observar en la Figura 19, a medida que se disminuyó la concentración del
hidrolizado, hubo una mayor germinación de las semillas de rábano.
El índice de germinación para las diferentes concentraciones del hidrolizado con HCl 6 M
fue el siguiente: 32 % para la concentración de 6.25 %, 80 % para la concentración de 3.2
%, 100 % para una concentración de 1.6 % y 100 % para una concentración de 0.8%. Los
resultados son comparados con el blanco el cual tiene un índice de germinación de 95 %.
Dado que se obtuvo un índice de germinación muy similar al control para varias
concentraciones se procedió a analizar la longitud de la radícula.

60
Figura 18. Germinación para hidrolizado con HCl 6 M (12.5 – 6.25 – 3.2 - 1.6 – 0.8 %)
Como se puede observar en la Figura 20, se puede ver un comportamiento similar del
hidrolizado con H2SO4, en el cual a medida que se disminuyó la concentración del
hidrolizado, hubo una mayor germinación de las semillas de rábano.
El índice de germinación para las diferentes concentraciones del hidrolizado con H2SO4 6M
fue el siguiente: 85 % para la concentración de 6.25 %, 95 % para la concentración de 3.2
%, 95 % para una concentración de 1.6 %, 95 % para una concentración de 0.8 % y 100 %
para una concentración de 0.4 %. Los resultados son comparados con el blanco el cual tiene
un índice de germinación de 95 %. Dado que se obtuvo un índice de germinación muy
similar al blanco para varias concentraciones se procedió a medir la longitud de la radícula.

61
Figura 19. Germinación para hidrolizado con H2SO4 6 M (6.25 – 3.2 – 1.6 – 0.8 – 0.4 %)
En la medición de la longitud de las radículas se puedo observar aun un efecto fitotóxico de
los hidrolizados a estas concentraciones comparado con el blanco (Figura 21), por lo tanto
se debe evaluar una concentración menor de ambos hidrolizados.
Figura 20. Efecto de los hidrolizados a diferentes concentraciones sobre R. sativus
Del análisis estadístico realizado, se puede concluir que para la única concentración en la
que no se observó una diferencia estadísticamente significativa, comparada con el blanco a
un nivel de confianza de 95 %, fue para el hidrolizado con H2SO4 al 0.8 %. Para todas las

62
demás concentraciones se observaron diferencias estadísticamente significativas a un valor
p < 0.05.
Por lo anterior se procedió a evaluar los hidrolizados a las siguientes concentraciones 1.6 –
0.8 – 0.4 – 0.2 %, donde se encontró un índice de germinación de 95 % para el blanco, para
el hidrolizado con H2SO4 a la diferentes concentraciones (Figura 22) se encontró un índice
de germinación de 85 % para la concentración al 0.2 %, 90 % para la concentración al 0.4
%, 75 % para la concentración al 0.8 % y 100 % para la concentración al 1.6 %.
Figura 21. Germinación para hidrolizado con H2SO4 6 M (1.6 – 0.8 – 0.4 – 0.2 %)
Para el hidrolizado con HCl se obtuvieron los siguientes índices de germinación (Figura
23), 100 % para la concentración al 0.2 %, 90 % para la concentración al 0.4 %, 95 % para
la concentración al 0.8 % y 95 % para la concentración al 1.6 %.

63
Figura 22. Germinación para hidrolizado con HCl 6 M (1.6 – 0.8 – 0.4 – 0.2 %)
Al comparar los índices de germinación se puede observar que son similares al blanco, a
excepción del hidrolizado con H2SO4 a 0.4 % el cual tuvo un índice de germinación más
bajo. Por lo tanto se procedió a medir la longitud de la radícula para todas las
concentraciones de los hidrolizados y compararlas con el blanco (Figura 24).
Figura 23. Efecto de los hidrolizados a diferentes concentraciones sobre R. sativus.
Al realizar el analisis estadistico de las medias de la longitud de la radículas de los
hidrolizados al 0.2 % de concentración con la media del blanco a un nivel de confianza del
95%, se determinó que no existe una diferencia estadisticamente significativa entre las
medias para el hidrolizado con HCl a un valor p = 0.083. Mientras que para el hidrolizado

64
con H2SO4 se encontró que si hay diferencias estadisticamente significativas entre las
medias con un valor p= 0.039.
Para las concentraciones iguales y mayores al 0.4 % de ambos hidrolizados se encontró que
si habian diferencias estadisticamente significativas entre las medias a un nivel de
confianza del 95 %, con un valor p< 0.05.
Por lo tanto se realizarón diluciones por triplicado de ambos hidrolizados a 0.4 – 0.2 – 0.1
%, para observar si a esta concentración no hay ningun efecto fitotóxico por parte de ambos
hidrolizados.
Para el hidrolizado con H2SO4 se encontró un índice de germinación de 90 % para la
concentración de 0.4 %, 100 % para una concentración de 0.2 % y un 95 % para una
concentración de 0.1 %.
Para el hidrolizado con HCl se encontró un índice de germinación de 95 % para la
concentración de 0.4 %, 90 % para una concentración de 0.2 % y un 95 % para una
concentración de 0.1 %, ambos hidrolizados se compararon con el blanco con un índice de
germinación de 95 %.
Al medir la longitud de la radícula de ambos hidrolizados como se observa en la figura 25,
se pueden apreciar mejor las diferencias y compararlas con el blanco.
Figura 24. Efecto de los hidrolizados a diferentes concentraciones sobre R. sativus.
Al realizar el analisis estadistico de las medias de la longitud de la radículas de los
hidrolizados al 0.1 % de concentración con la media del blanco a un nivel de confianza del
95 %, se determinó que no existe una diferencia estadisticamente significativa entre las

65
medias para el hidrolizado con H2SO4 con un valor p = 0.1621. Para el hidrolizado con HCl
se encontró que tampoco hay diferencias estadisticamente significativas entre las medias
con un valor p= 0.1612.
Para las concentraciones al 0.2 % de ambos hidrolizados se encontró que no habian
diferencias significativas a un nivel de confianza de un 95 %, para el el hidrolizado con
H2SO4 se encontro un valor p= 0.2595 y para el hidrolizado con HCl se encontro un valor
p= 0.1706.
Para las concentraciones al 0.4 % de ambos hidrolizados se encontró que no habian
diferencias significativas a un nivel de confianza de un 95 %, para el el hidrolizado con
H2SO4 se encontro un valor p= 0.9591 y para el hidrolizado con HCl se encontro un valor
p= 0.07545.
Con estos resultados podemos concluir que para las concentraciones menores a 0.4 % no
hay efecto fitotóxico de ambos hidrolizados en el modelo Raphanus sativus.
Cuantificación de aminoácidos
Se determinó que el máximo de absorción del complejo de cobre de glicina, adicionado con
glicina fue de 630 nm.
La cuantificación de los aminoácidos libres presentes en los hidrolizados de la proteína de
la membrana de la cáscara de huevo fue determinada por el análisis espectrofotométrico
con sus sales de cobre, en el cual se encontró una correlación lineal entre la absorbancia y
la concentración de aminoácidos, esta correlación se representa a través de la ecuación Y =
a + b*X donde y es la absorbancia y x es la concentración en M.

66
Plot of Fitted Model
Absorbancia = -0.00130925 + 0.000059395*Concentración
0 1 2 3 4
(X 1000)
Concentración
0
0.03
0.06
0.09
0.12
0.15
0.18
Absorbancia
Figura 25. Curva de calibración para la cuantificación de aminoácidos
El coeficiente de correlación igual a 0.999441, indica una relación relativamente fuerte
entre las variables.
De la figura 26, se puede observar la curva de calibración para la cuantificación de los
aminoácidos libres totales a partir del complejo de cobre-glicina, a través de esta curva se
pudo interpolar la concentración de los aminoácidos libres presentes en los diferentes
hidrolizados.
El complejo de cobre-aminoácidos presenta un color azul y a través de la intensidad del
color fue posible estimar la concentración. En la tabla 8, se puede observar el contenido de
aminoácidos libres de los hidrolizados realizados con HCl 6 M y H2SO4 6 M, a parir de esta
información se pudo conocer la concentración final a la cual los hidrolizados no se
presentan un efecto fitotóxico en los modelos biológicos evaluados y la concentración final
en el fertilizante foliar.
Tabla 8. Contenido de aminoácidos libres en hidrolizados
Hidrolizados 6 M
% equivalente de
glicina
HCl 18.7
H2SO4 22.4

67
A demás se pudo corroborar que los hidrolizados de la proteína realizados con HCl y
H2SO4 6 M, tienen una alta eficiencia, comparado con el ácido nítrico y fosfórico.
9.6 Formulación del fertilizante foliar líquido
En la formulación del fertilizante foliar se emplearon sales con alta solubilidad, bajo costo
y accesibilidad. En la Tabla 9 se pueden observar las sales usadas y la composición del
elemento y su solubilidad.
Tabla 9. Fuente de componentes para la formulación del fertilizante foliar
Componente Fuente
Aporte
(%)
Solubilidad
a 20 °C
Referencia
Nitrógeno (N) CO(NH2)2 46 1.080 g/L [45]
Magnesio (Mg) MgSO4 9.8 252 g/L [46]
Cinc (Zn) ZnSO4 • 7H2O 22 960 g/L [47]
Hierro (Fe) FeSO4 • 7H2O 20 400 g/L [48]
Manganeso
(Mn)
MnSO4 • H2O 30 393 g/L [49]
Fósforo (P) (NH4)2HPO4 46 588 g/L [50]
Potasio (K) KCl 60 330 g/L [51]
En la Tabla 10. Se puede observar la caracterización fisicoquímica de los fertilizantes
foliares, formulados a base de aminoácidos libres producto de la hidrólisis ácida (HCl y
H2SO4) de la membrana de cáscara de huevo.

68
Tabla 10. Caracterización fisicoquímica de los fertilizantes foliares formulados
Parámetro Expresado como
HCl
(ppm)
H2SO4
(ppm)
Referencia
(ppm)
Nitrógeno N 12620 13800 150000
Aminoácidos
libres
A.A Glicina 52800 51100 50000
Magnesio MgO 106.08 51.24 2500
Cinc Zn 26.4 25.0 1600
Hierro Fe 73.31 206.48 1000
Manganeso Mn 1.47 4.34 550
Fósforo P2O5 19600 18700 50000
Potasio K2O 84039.2 54654.6 100000
Calcio CaO 265.87 457.43 -
Sodio Na 140.05 267.46 -
Carbono orgánico
oxidable total
No aplica 28800 24100 -
pH (10%) No aplica 6.6 6.8 5.5 - 6.5
Al realizar la comparación de los valores de referencia o esperados en la formulación final
de los fertilizantes foliares a base de aminoácidos libres, obtenidos a partir de la hidrólisis
ácida (HCl –H2SO4) de la proteína presente en la membrana de la cáscara de huevo, se
puede observar que el valor de la concentración de los micronutrientes y macronutrientes se
alejan significativamente del valor de concentración esperado. Pero los resultados cumplen
con el mínimo valor de concentración la norma establecida por el ICA para fertilizantes
foliares por lo tanto, ambos formulados pueden ser usados como fertilizantes foliares.

69
Evaluación de la eficiencia del fertilizante formulado en un cultivo modelo
La evaluación de la eficiencia de los fertilizantes foliares obtenidos por medio del
hidrolizado proteínico de la membrana de la cáscara de huevo, se realizó a través de la
comparación de la biomasa total de cada tratamiento frente al (fertilizante foliar comercial a
base de aminoácidos (A-MICSUR) (Figura 26), la biomasa total incluye raíz, tallo, hojas,
vainas y frutos.
MICSUR).
A partir de la comparación de la biomasa total de los tratamientos frente al fertilizante
foliar comercial se puede observar que el mejor resultado para el hidrolizado con ácido
clorhídrico es al 0.1 % y para el hidrolizado con el ácido sulfúrico es al 0.4 % donde se
pueden observar diferencias significativamente altas con respecto al control, por tanto se
puede interpretar que los formulados a partir de los hidrolizados de la proteína tienen
mayores beneficios en la producción de biomasa.
Con el fin de comparar el efecto en la producción de frutos, se evaluó la biomasa de los
frutos de los dos tratamientos frente al control positivo como se puede observar en la

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figuras 27. En la figuras 28 y 29 se observan las anovas de los mejores resultados con cada
uno de los tratamientos al comparar con el blanco.
MICSUR).
Figura 28. Biomasa de los frutos para el tratamiento con HCl comparado con el control
positivo (A-MICSUR).

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Figura 29. Biomasa de los frutos para el tratamiento con H2SO4 comparado con el control
positivo (A-MICSUR).
En la figura 27 se puede observar que la mayor cantidad de biomasa de los frutos para el
tratamiento con HCl fue al 0.1%, mientas que con el H2SO4 fue al 0.2%, lo cual está de
acuerdo con la obtención de la biomasa total. Se puede observar en las figuras 28 y 29 a
través de las anovas de cada uno de los tratamientos en los que se obtuvo la mayor
producción de biomasa comparada con el control positivo unas diferencias altamente
significativas, esto se ve reflejado en el valor p de cada tratamiento. Para el tratamiento con
HCl 0.1 % asumiendo varianzas iguales se tiene un valor t = 4.7 y p = 0.0033 y para el
tratamiento con H2SO4 0.2 % asumiendo varianzas iguales se tiene un valor t = 7.1 y p =
0.00039.
Se puede inferir a través del análisis estadístico que los fertilizantes foliares obtenidos a
partir del hidrolizado de la membrana de la cáscara de huevo es más eficaz que el
fertilizante foliar comercial. Lo cual podría ser atribuido a los aminoácidos que hacen parte
de la proteína presente en la membrana de la cáscara, donde se destaca el colágeno con una
secuencia basada en glicina-prolina-hidroxiprolina, los cuales se ha encontrado que tienen
una alta influencia en desarrollo de las plantas.

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10. CONCLUSIONES
 A través de la implementación de la combinación de dos técnicas de separación,
tanto física como química se obtuvo la mejor eficiencia de separación para la
 La hidrólisis de la membrana de la cáscara de huevo fue más efectiva con el ácido
clorhídrico y con el ácido sulfúrico, comparado con el ácido nítrico y el ácido
nítrico. Lo cual está de acuerdo con la literatura para el ácido clorhídrico, que
señala este ácido como el convencional y más comúnmente empleado para la
hidrólisis ácida.
 Las pruebas cualitativas para la identificación del grado de hidrólisis, mostraron ser
útiles en la selección de las mejores condiciones de hidrólisis.
 Se obtuvo una alta concentración de los aminoácidos libres expresados como % de
equivalente de glicina, obtenidos a partir de la hidrólisis ácida (HCl y H2SO4) de la
membrana de la cáscara de huevo y el valor esperado para la formulación final de
los fertilizantes foliares.
 A través de las pruebas de fitotóxicidad de los hidrolizados sobre R. sativus, se
logró encontrar a que concentración no había efecto fitotóxico sobre este modelo
biológico.
 Se formularon dos fertilizantes foliares a base de aminoácidos libres con
concentraciones por debajo de lo esperadas, pero con los valores de concentración
para los macronutrientes mayores a los mínimos valores establecidos por el ICA.
Por lo tanto ambos formulados podrían ser usados como fertilizantes foliares.
 La prueba de eficacia de los formulados de los fertilizantes foliares a base de
aminoácidos libres, en P. vulgaris mostró a través de la comparación de la biomasa
total comparada con el control positivo, que los mejores tratamientos fueron
obtenidos con HCl 0.1 % y H2SO4 0.2 %. Los cuales tienen diferencias
significativas comparadas con el control.

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 La producción de frutos es estadísticamente diferente del control comparado con
los tratamientos HCl 0.1 % y H2SO4 0.2 %. Teniendo estos, un efecto estimulante
mayor en la producción de frutos. lo cual se vio reflejado en las anovas de cada una
de las comparaciones.
 La hidrólisis de materiales proteicos de desecho, es una gran estrategia de darles un
valor agregado y aprovechar los recursos disponibles para obtener aminoácidos
libres.

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11. IMPACTO AMBIENTAL
Este proyecto presenta una de las mejores formas de valorizar un residuo avícola, dado que
no solo indica el manejo de la cáscara evitando cualquier posible riesgo de bioseguridad, si
no que nos propone la transformación y aprovechamiento de estos de tal forma que se
conviertan en materia prima para otros procesos, reducción de costos de recolección,
reducción del volumen de los residuos sólidos, se alarga la vida útil de los sistemas de
relleno sanitario, mejora las condiciones medioambientales y de salubridad de las
productoras y sus alrededores.
Además el aprovechamiento de este residuo en la formulación de un fertilizante, disminuye
los efectos adversos que pueden causar a largo plazo los fertilizantes de síntesis química.

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