Metodos Detección de Proteinas.pptx
Descargar como PPTX, PDF0 recomendaciones329 vistas
Este documento describe varios métodos para el análisis de proteínas en biología molecular, incluyendo la estructura y funciones de las proteínas y anticuerpos. Explica técnicas como ELISA, Western blot e inmunohistoquímica que permiten detectar y cuantificar proteínas específicas. Finalmente, resume las utilidades del análisis de proteínas para la investigación biomédica.
Metodos Detección de Proteinas.pptx
- 1. MÉTODOS PARA ANÁLISIS DE PROTEÍNAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR
- 2. PROTEÍNAS Son macromoléculas compuestas por una o más cadenas polipeptídicas plegadas en una forma tridimensional característica. Cadenas polipeptídicas: son cadenas lineales de aminoácidos (de longitud y secuencias variables) enlazados por enlaces peptídicos.
- 3. ESTRUCTURA La conformación tridimensional de una proteína está determinada por la secuencia de aminoácidos en su estructura primaria y las interacciones no covalentes intramoleculares. La función de una proteína a menudo se deriva de su estructura tridimensional.
- 4. • Determinada por la secuencia de aminoácidos en la cadena proteica (número y orden de los aa que la forman). Estructura primaria • Plegamiento de la cadena polipeptídica por la formación de puentes de hidrógeno (Ejemplos: hélices alfa y hojas beta). Estructura secundaria • Arreglo tridimensional de los residuos de aminoácidos. Estructura terciaria • Unión de enlaces débiles (no covalentes) de varias cadenas polipeptídicas con estructura terciaria para formar un complejo proteico Estructura cuaternaria
- 5. FUNCIONES • Proteínas estructurales. • Proteínas andamio. • Proteínas catalíticas (enzimas). • Proteínas de transporte de membrana. • Proteínas regulatorias. • Proteínas de señalización. NOTA: Una proteína puede cumplir mas de un tipo de función.
- 6. ¿QUÉ ES UN ANTICUERPO? Los anticuerpos (también denominados con inmunoglobulinas ) son proteínas que forman parte del sistema inmune y circulan por la sangre. Se producen cuando reconocen sustancias extrañas para el organismo.
- 7. ESTRUCTURA DE UN ANTICUERPO La estructura de un anticuerpo consiste en dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, y en su extremo existe una región hipervariable. La región hipervariable es la que cambia de un anticuerpo a otro, y permite tener una gran diversidad de anticuerpos que podrán responder a la enorme variedad de antígenos.
- 8. ANTÍGENO Cualquier sustancia extraña que al entrar en contacto con el organismos produce una respuesta inmunitaria contra ella. Incluyen: • Toxinas • Sustancias químicas • Bacterias • Virus • Otras
- 9. EPÍTOPO (EPITOPE) Los antígenos presentan una estructura tridimensional y a su vez una región específica que es reconocida por los anticuerpos para su unión a este. También se le denomina determinante antigénico.
- 10. INTERACCIÓN EPÍTOPO- ANTICUERPO El reconocimiento del antígeno por el anticuerpo tiene lugar en un locus específico constituido por los extremos de la cadena ligera y pesada, en la que encaja el antígeno y que permite se ponga de manifiesto toda una serie de fuerzas que mantendrán unidos antígeno y anticuerpo.
- 11. Existe una variedad de anticuerpos para cada posible antígeno, ya que un mismo antígeno puede presentar diferentes epítopos.
- 14. ELISA El ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima (ELISA del ingles Enzyme- Linked ImmunoSorbent Assay) es un método utilizado para detectar cuantitativamente un antígeno en una muestra. Se pueden analizar sustancias específicas de interés en lisados celulares, muestras de sangre, alimentos y más.
- 15. La prueba se hace usando una superficie sólida a la que los anticuerpos u antigenos se adhieren. Se emplean anticuerpos ligados a enzimas a fin de detectar y medir la cantidad de una sustancia en una solución (como el suero). En la etapa final, se produce una reacción enzimática que causa un cambio de color que puede leerse mediante el uso de una máquina especial.
- 16. ANTICUERPOS CONJUGADOS Un anticuerpo conjugado es un anticuerpo monoclonal o policlonal unido a un marcaje y utilizado para detección en una amplia gama de técnicas de análisis. La utilidad específica de un anticuerpo secundario depende de sus sondas conjugadas Los anticuerpos pueden estar conjugados a un fluoróforo (por ejemplo FITC) o bien a una enzima cromogénica (como por ejemplo la peroxidasa de rábano; horse-radish peroxidase HRP).
- 17. ELISA Directo El antígeno se une al fondo del pocillo de la microplaca y, a continuación, se añade un anticuerpo específico del antígeno, conjugado a su vez a una enzima u otra molécula que permita su detección. ELISA Indirecto El antígeno se une al fondo del pocillo de la microplaca y posteriormente se añade un anticuerpo específico del antígeno. A continuación se une al primer anticuerpo un anticuerpo secundario conjugado con una enzima u otra molécula de detección.
- 18. ELISA Competitivo Se une al fondo del pocillo de la microplaca un antígeno de referencia. Se añade a los pocillos la muestra más el anticuerpo y si existe un antígeno presente en la muestra, compite con el antígeno de referencia por la unión al anticuerpo El material no unido se elimina con los lavados. Cuanto más antígeno hay en la muestra, menos anticuerpo termina unido al fondo de los pocillos a través del antígeno de referencia y, por tanto, menos señal.
- 19. ELISA Tipo Sándwich Se usan dos anticuerpos específicos de dos epítopos diferentes presentes en el antígeno diana. El anticuerpo de captura se une al fondo del pocillo de la microplaca uniéndose a uno de los epítopos del antígeno. El anticuerpo de detección se une a un epítopo diferente del antígeno y está conjugado a una enzima que permite su detección. (Si el anticuerpo de detección no está conjugado, entonces se necesita un anticuerpo de detección secundario conjugado con una enzima).
- 21. WESTERN BLOT (INMINOBLOT) Esta técnica es empleada para detectar una proteína específica en una muestra. El método implica el uso de electroforesis en gel para separar las proteínas de la muestra. Las proteínas separadas se transfieren del gel a la superficie de una membrana. La membrana se expone a un anticuerpo específico contra la proteína en estudio. La unión del anticuerpo se detecta usando un marcador radiactivo o químico.
- 22. 1.- Lisis: Las células o los tejidos se tratan con un tampón de lisis y seguidamente se degradan mecánicamente para liberar las proteínas 2.-Cuantificación: Determinar la concentración de proteínas. 3.- Condiciones reductoras y desnaturalizantes las muestras son normalmente tratadas con agentes que rompen las estructuras tridimensionales de las proteínas (dímeros, estructuras terciarias)
- 23. 4.- Electroforesis: Método que permite separar las proteínas bajo un campo eléctrico de acuerdo a su movilidad electroforética. Las proteínas se separan en función de su talla, o peso molecular. Las proteínas de menor tamaño quedan menos retenidas en la matriz del gel y por tanto migran mas rápidamente.
- 24. 5.- Transferencia: Las proteínas cargadas negativamente migran hacia el polo positivo bajo el efecto de un campo eléctrico. Se intercala una membrana entre el gel y el electrodo positivo y las proteínas se adhieren a la membrana siguiendo la misma disposición que en el gel. Las membranas pueden ser de nitrocelulosa o polifluoruro de vinilideno (PVDF).
- 25. 6.- Inmundetección: El uso de anticuerpos específicos soluciona el problema detectando únicamente la proteína de interés
- 28. Densitometría En Western Blot, se utiliza para cuantificar la cantidad de proteína que se encuentra en una determinada banda.
- 30. INMUNOHISTOQUÍMICA Método de laboratorio para el que se usan anticuerpos a fin de determinar si hay ciertos antígenos (marcadores) en una muestra de tejido. Por lo general, los anticuerpos van unidos a una enzima o un tinte fluorescente. Cuando los anticuerpos se unen al antígeno en la muestra de tejido, se activa la enzima o el tinte y se observa el antígeno al microscopio.
- 31. El procedimiento parte de secciones de tejido previamente fijado. Inmediatamente después se incuban en una solución de bloqueo que satura los posibles sitios de unión inespecífica. Tras cada paso de unión de anticuerpos o del complejo avidina-biotina-peroxidasa se procede a lavar los cortes en una solución tamponada de fosfato (), en la que también van disueltos los anticuerpos. La reacción de la peroxidasa convierte unos sustratos, la diaminobencidina y el peróxido de hidrógeno, en un producto insoluble y coloreado visible con el microscopio óptico.
- 34. INMUNOFLUORESCENCIA Se basa en las propiedades de los fluorocromos. No es una inmunohistoquímica puesto que no se produce ninguna reacción química. Los fluorocromos son moléculas que emiten luz visible cuando se les ilumina con una determinada longitud de onda.
- 36. Aunque la inmunofluorescencia se puede usar para detectar a una sola molécula tisular, pero también para una múltiple inmunodetección (detectar dos o más moléculas presentes en una misma célula o matriz extracelular de forma simultánea).Esto es posible porque existe una gran variedad de fluorocromos que son capaces de emitir luz visible tras ser excitados con diferentes longitudes de onda. Tomando fotografías tras cada excitación y superponiendo dichas imágenes podemos averiguar si las moléculas se expresan, por ejemplo, en la misma célula
- 39. UTILIDADES DEL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS • Entendimiento de los mecanismos moleculares de procesos biológicos en organismos sanos o en el durante el desarrollo de un padecimiento. • Diagnóstico. • Búsqueda e identificación de marcadores moleculares. • Diseño e implementación de nuevas terapias. • Desarrollo de tecnologías.