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- 1. Ubicuidad de los microorganismos y su entorno natural.
- 2. • Las bacterias son minúsculas nanomáquinas biológicas perfectamente organizadas en red, con códigos genéticos reducidos, especializadas pero programadas para funcionar en grupo a fin de poder sobrevivir a cualquier adversidad. • "El mundo está dividido fundamentalmente en bacterias y el resto". ¿HAY ALGO QUE OCURRA EN ESTE PLANETA QUE NO TENGA RELACIÓN CON ESTOS PEQUEÑOS ORGANISMOS?
- 3. Los microorganismos son seres vivos cuya característica principal es la ubicuidad, debido a que se encuentran en los más variados ambientes donde realizan un trabajo interesante con el cual contribuyen a la perpetuación de la vida: • el ciclo del nitrógeno • la descomposición de alimentos en el intestino, ayudando de esta forma al metabolismo • ocasionando diferentes enfermedades en el hombre, en animales y en plantas.
- 4. • Las bacterias poblaron la Tierra mucho antes de que ningún otro grupo de seres vivos la habitaran; se han encontrado restos fósiles de bacterias en rocas de hace 3.800 millones de años. • Esas primeras bacterias habitaron un mundo inhóspito: carente de oxígeno para respirar, con temperaturas extremadamente elevadas y niveles altos de radiación ultravioleta procedente del Sol.
- 5. • Hace 3.500 millones de años, las células bacterianas se dividieron una y otra vez y exhalaron todo el oxígeno necesario para la vida. • Transformaron aquella atmósfera caliente, irrespirable e inhóspita que era en aquel momento nuestro planeta, en un lugar habitable. • Alteraron toda la superficie de la Tierra hasta convertirla en un fértil planeta. • Durante este proceso tuvieron que adaptarse al frío y al calor, al medio acuático y a la densidad terrestre para poder sobrevivir.
- 6. • Nuestras propias células proceden de la simbiosis de bacterias y cuando hace 700 millones de años aparecieron los primeros organismos pluricelulares, las bacterias ya habían establecido su reino 2.800 millones de años antes. • Son las dueñas del planeta y cuando el hombre haya desaparecido, ellas seguirán estando aquí.
- 7. • Desde el punto de vista evolutivo, el hombre es un recién llegado. Como especie se encuentra en una fase juvenil.
- 8. • Las bacterias son organismos extraordinarios en términos de adaptación • Cualquier lugar que sea adecuado para el crecimiento de organismos superiores, también lo es para el crecimiento microbiano. • Cualquier lugar donde exista vida, incluye vida bacteriana.
- 9. Gracias a las bacterias la materia viva se recicla, se transforma y se acopla de tal manera que los residuos de unos sirven de alimento a otros. Es la cadena de la vida en una lucha por la supervivencia. Gracias a sus tareas de "reciclaje", cuando las plantas y los animales mueren, los nutrientes se descomponen y se liberan para servir de alimento a otras especies.
- 10. Los microorganismos se encuentran en los más diversos ambientes y materiales cumpliendo funciones beneficiosas o perjudiciales. Existen evidencias de la presencia de microbios en hábitats tan extremos como la profundidad de los océanos, los polos del globo terráqueo, los vientos hidrotermales, etcétera.
- 11. Los microrganismos pueden encontarse tanto en ambientes familiares como en lugares poco comunes, como aquellos tan extremos que se consideran inadecuados para formas de vida superiores.
- 12. Los microorganismos están presentes en todos las superficies exteriores de los utensilios, en el aire, en el agua, en los alimentos y en las cavidades internas del cuerpo que tienen conexión con el exterior (tracto respiratorio y tracto digestivo). En condiciones normales, los órganos y cavidades internas carecen de microorganismos son estériles (estéril significa libre de microorganismos): músculos, la sangre y el sistema nervioso.
- 13. • Nosotros somos algo así como una comunidad de bacterias ambulantes. Juntos estamos embarcados en esta aventura que es la vida. • Se cree que el número total de genes microbianos en nuestro cuerpo, excede al de genes humanos en una proporción de mil a uno. Aunque debido a su tamaño, sólo un 10% de nuestro peso corresponde a estos microorganismos. Con ellos intercambiamos constantemente sustancias moleculares relacionadas con el crecimiento, desarrollo y reproducción.
- 16. • Los microorganismos que habitan en nuestro interior son también parte del cuerpo humano. “Ellos” realizan funciones que nosotros no hemos necesitado desarrollar. Son imprescindibles para la supervivencia, y cada vez encontramos más indicios del papel fundamental que ejercen en nuestra salud y enfermedad.
- 17. • “Human Microbiome Project”, invierte 115 millones de dólares para secuenciar hasta 1000 genomas microbianos presentes en diferentes partes del cuerpo humano. • El objetivo es determinar cómo cambia la microbiota de un individuo a otro, como evoluciona durante el día, a lo largo de nuestra vida, qué correlación existe con alteraciones en nuestra salud, y muchas otras preguntas que llegarán al contemplar nuestro organismo como un conglomerado de genes microbianos y de homo sapiens. • Somos comunidades andantes de bacterias, y muchos consideran que el mapa del genoma humano no estará completo hasta que incluyamos a todos nuestros huéspedes sin los que no podríamos sobrevivir.
- 18. ¿Cómo han conseguido sobrevivir a tanta adversidad? • La habilidad de los procariotas (organismos sin núcleo verdadero, como las bacterias) para colonizar nichos que nos están vedados a organismos superiores se debe, en gran medida, a su flexibilidad metabólica a nivel de procesos respiratorios.
- 19. ¿Cómo? • Trabajando en equipo, intercambiando información, tejiendo una red altamente resistente y estable frente a perturbaciones externas. • Compartiendo código genético y, por tanto, ayudando a reprogramar continuamente a sus compañeras según las exigencias del entorno. • Desarrollando una cultura constructiva, transformadora, basada en el reciclaje. • Evolucionando a través de la creatividad, de la innovación que les llega desde cualquier punto de la red de comunicación que tienen creada desde hace millones de años y que abarca hasta el último rincón de este planeta. • Trabajando como bloque para autoabastecerse, buscando siempre las condiciones óptimas para el equilibrio de la comunidad. • Cada uno de sus miembros actúa de forma responsable, aportando "su especialidad" en beneficio del conjunto.
- 20. • Esta forma de vida les ha permitido colonizar cada vez más hábitats, aumentar la diversidad de la especie y por supuesto sobrevivir, desarrollar una mayor resistencia a las alteraciones del entorno.
- 22. Hábitat: Lugar donde vive una población microbiana en un determinado ambiente. A cada organismo se Ie puede asignar por lo menos un hábitat en el que se encuentra normalmente, donde se desarrolla y multiplica, y del que puede aislarse con la máxima probabilidad.
- 23. Nicho ecológico. • No hace referencia a una localidad espacial, sino a una función de la especie o población en la comunidad. • EI nicho ecológico caracteriza la profesión de la especie. Cada especie o población desempeña una función determinada que depende de los requerimientos nutricionales y fisiológicos, de las características genéticas, de las capacidades bioquímicas, y de las particularidades estructurales, así como de la tolerancia que presente frente a las condiciones ambientales. • De la suma de estas características depende el que una especie desempeño o no, la función en un ecosistema. • La teoría ecológica indica que para cada organismo existe al menos un nicho, el principal, que es aquel en el que crece mejor.
- 24. • Los microorganismos, al ser pequeños, su hábitat también lo es. • Bacteria 3um, 2mm significan 2 Km. • Se habla de microambiente.
- 26. Los microorganismos no se encuentran aislados, sino que su número suele ser muy elevado por unidad de volumen o por unidad de superficie. Por consiguiente, allí donde se encuentran son muy abundantes.
- 27. • En los ecosistemas naturales es normal la deficiencia en nutrientes. • En la naturaleza libre, en los suelos y las aguas, es normal que los microorganismos estén sometidos a una deficiencia extrema en nutrientes. • En los ecosistemas acuáticos la concentración de un nutriente es frecuentemente inferior a 10 ug/litro. • Por ello, para la mayoría de los microorganismos la situación "normal" es de hambre o pobreza.
- 28. • Crecimientos extremadamente Ientos o períodos alternativos de crecimiento rápido con períodos de reposo son la norma en las condiciones de vida en la naturaleza. • En muchos lugares el tiempo de generación puede suponer entre 100 y 200 días. Incluso Escherichia coli tiene que conformarse en el recto humano con tiempos de duplicación de 20 h.
- 29. La disminución de la velocidad de crecimiento refleja: 1. Que la disponibilidad de nutrientes puede ser baja. 2. Que la distribución de dichos nutrientes a lo largo del hábitat microbiano no es uniforme. 3. Que los m.o. no encuentran en el cultivo axénico, en medios naturales y por lo tanto están sometidos a efectos competitivos de otros m.o.
- 30. Aunque no podemos ver a los microorganismos a simple vista, cuando los cultivamos en un medio adecuado, sí podemos ver manifestaciones de su crecimiento
- 31. Tradicionalmente en microbiología se aísla una bacteria, se hace crecer en un medio de cultivo, y se investigan sus características. Esto representa una limitación, ya que muchas veces no es posible reproducir los microambientes exactos del interior del hospedador, ni permite estudiar las interacciones entre el conjunto de bacterias de una forma global. Sólo sabemos cultivar alrededor de 5,000 especies, lo que representa 1% o menos de la población total. En cambio, la metagenómica contempla a todos los genomas que conviven en un ambiente determinado como un único metagenoma, y lo estudia directamente en su entorno natural.
- 32. • En el estudio de los microorganismos no se toma en general en consideración que las capacidades potenciales de los organismos se exploran tan sólo en una dirección • Esto es, bajo el punto de vista de las condiciones óptimas de crecimiento y de las elevadas tasas de crecimiento.
- 33. En la práctica… • Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las células que se multiplican no cambian de localización. • Tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisión binaria una colonia macroscópica compuesta por decenas de millones de células similares a la original. • Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecerá como cultivo puro de un solo tipo de bacteria.
- 34. • Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfológicamente que es imposible diferenciarlas sólo con el uso del microscopio • En este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian sus características bioquímicas sembrándolas en medios de cultivo especiales.
- 35. • Algunos medios contienen un producto que inhibe el crecimiento de la mayoría de las especies bacterianas, pero no la de un tipo que deseamos averiguar si está presente. • Otras veces el medio de cultivo contiene determinados azúcares especiales que sólo pueden utilizar algunas bacterias. • En algunos medios se añaden indicadores de pH que cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se generan catabolitos ácidos. Si las bacterias son capaces de producir fermentación, generan gases que pueden ser apreciados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado.
- 36. Con otros medios de cultivo se identifica si las bacterias producen determinadas enzimas que digieren los nutrientes: • algunas bacterias con enzimas hemolíticas (capaces de romper los glóbulos rojos) producen hemólisis y cambios apreciables macroscópicamente en las placas de agar-sangre.
- 37. Sembrar o inocular • Es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. • Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento. • La siembra puede realizarse en medio líquido, sólido o semisólido, utilizando punta, asa, hisopo o pipeta estéril.
- 38. Cultivo puro Es aquel que contiene una sola clase de microorganismo. En la práctica los cultivos puros son útiles por diferentes razones: • mantienen los organismos viables • permiten hacer subcultivos para someterlos a diferentes análisis e intercambiarlos con otros laboratorios. Para obtenerlo es necesario recurrir a las técnicas de aislamiento.
- 39. AISLAMIENTO • Aislar es separar un microorganismo a partir de una población que los contiene de varios tipos. • En hábitat naturales raramente encontramos a los microorganismos en cultivo puro (un solo tipo de microorganismo), por lo tanto es necesario hacer algún procedimiento de aislamiento para separar los distintos tipos de microorganismos presentes para luego así poder identificarlos. • El aislamiento se puede lograr directamente a partir de una muestra cuando el o los microorganismos están en una proporción adecuada.
- 40. Para aislar se utiliza alguno de los siguientes procedimientos: a) aislamiento por estrías. b) aislamiento por dilución
- 41. • Se trata de un método rápido y simple de agotamiento progresivo y continuo del inóculo sobre un medio sólido contenido en una caja de Petri. • El objetivo final es obtener un número reducido de bacterias distribuidas individualmente sobre la superficie de la placa. • Al incubar ésta, cada una de las bacterias originará una colonia. • Normalmente, una colonia aislada es un cultivo puro. AISLAMIENTO EN PLACA POR ESTRÍAS
- 42. • Lo que se pretende es formar un gradiente de concentración bacteriana sobre la superficie de la caja de agar, de tal suerte, que en alguna zona de la misma, las células estén lo suficientemente separadas una de otras como para formar colonias aisladas.
- 43. • Existen distintas técnicas, el objeto es obtener colonias aisladas. • La caja debe colocarse en posición invertida sobre la mesa de trabajo. • Tomar la parte que contiene el medio de cultivo, levantarla hasta la altura de la flama del mechero. • En este posición casi vertical, se realizarán las sucesivas series de estrías. • Cargar el asa con la muestra y hacer estrías paralelas en la cuarta parte de la superficie de la placa (con un balanceo sucesivo y rápido); se quema el asa, se enfría, se gira la placa 90º y se vuelve a estriar tocando 3 o 4 veces el área sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de caja. • No hacer mucha presión sobre el agar para no razgarlo. • Por último, sin quemar el asa, se estría el resto de la superficie sin sembrar.
- 44. • VACIADO EN CAJAS DE PETRI • 1- Primeramente se desinfecta el área de trabajo con fenol al 5% o alcohol y posteriormente se enciende el mechero • 2.- Retirar los medios de Cultivo que ya están preparados y esterilizados del refrigerador. Sin destaparlos, llevarlos a calentamiento en Baño María hasta que los medios sólidos se fundan y que tomen una temperatura de 45·C. • 3.- No destapar las cajas de petri, sino hasta el momento que vayan a ser utilizadas. Es conveniente colocarse un cubre bocas la persona que va a realizar el vaciado y evitar hablar en todo momento para no contaminar el medio de cultivo. • 4.- Es conveniente mantener el mechero encendido y trabajar cerca del área estéril al momento del vaciado en las cajas de petri. Levantar la tapadera de la caja petri con la mano izquierda , sin soltarla y sin retirarla demasiado de la base de la misma caja mientras que con la mano derecha tomar el matraz que contiene el medio de cultivo y realizar el vaciado de aproximadamente 15 ml. A 20 ml de Agar por caja procurando que no se forman burbujas, se procede a tapar la caja inmediatamente • 5.- Si se forman burbujas, tomar el mechero, flamear el medio de cultivo sobre la superficie de la caja de petri y de manera rápida. Se procede a tapar la caja. • 6.- Esperar a que el medio solidifique, Se rotulan los medios de cultivo, anotando la fecha y con iniciales el tipo de medio de cultivo. Si las placas no se van a utilizar el mismo día se sujetan con cinta y se colocan en el refrigerador de manera invertida para evitar que el vapor condensado caiga sobre el medio de cultivo y lo pueda contaminar • 7.- Cuando se vayan a utilizar los medios de cultivo preparados, será necesario secar las placas invertidas en estufa a 37 °C. Antes de realizar el sembrado de microorganismos.
- 45. Primero: toma de la muestra
- 48. El aislamiento de microorganismos mediante diluciones es un método tanto cualitativo como cuantitativo. • Es cualitativo porque permite diferenciar las diferentes morfologías coloniales • Es cuantitativo porque permite conocer el número de microorganismos que hay en una suspensión. MÉTODO DE LAS DILUCIONES SUCESIVAS
- 49. • Las diluciones se realizan en tubos que contienen una disolución mineral isotónica (solución Ringer 1/4) que mantiene la viabilidad de las células pero no permite la división celular. • De los tubos de las diluciones se siembra un volumen conocido, 0.01 ó 0.1 ml (10 ó 100 μl), sobre una caja de Petri.
- 50. Consiste en realizar diluciones sucesivas de la muestra en condiciones de esterilidad con objeto de sembrar después cantidades conocidas de las mismas en una serie de las cajas de petri. Al diluir la muestra se consigue tener muy pocas células, que tras inocularse en un medio de cultivo, generen colonias aisladas. Considerando que alguna de las diluciones será tal que al distribuir una parte de ella en la placa, originará colonias separadas. Contando el número de colonias, el volumen sembrado en la placa y la dilución correspondiente, se puede calcular el número de unidades formadoras de colonias presentes en la muestra inicial. Suele ser necesario diluir la muestra usando suero fisiológico o algún otro diluyente. MÉTODO DE LAS DILUCIONES SUCESIVAS
- 51. • A partir de la muestra hacer una serie de 4 diluciones decimales en condiciones de esterilidad. • Extender 25 μl de las diluciones 10-2 , 10-4 , 10-6 y 10-8 en una placa e incubar toda la noche. • Conociendo el número de colonias (UFC), la cantidad sembrada y la dilución correspondiente, • esta técnica permite evaluar el número de microorganismos viables en la muestra original. Debe haber entre 30 y 300 colonias. Si hay menos, no es significativo (puede tratarse de una contaminación) y, si hay más, no están aisladas. Metodología
- 53. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS • Para aislar microorganismos anaerobios estrictos -que son rápidamente destruidos por exposición al oxígeno-, pueden prepararse placas en la forma usual, y luego de sembradas, incubadas en recipientes cerrados en atmósfera sin oxígeno. • También se puede sembrar diluciones en tubos con agar fundido y termostatizado que luego se tapan con una capa de vaselina- parafina, para evitar el acceso de aire. • Con anaerobios más sensibles al oxígeno, se trabaja en cámaras anaeróbicas, o también usando la técnica del "roll-tube", que es un tubo en el que el agar se deposita en las paredes al hacerlo girar mientras se enfría; se trabaja gaseando el tubo continuamente con gas libre de oxígeno mientras el tubo está destapado.
- 54. AISLAMIENTO DE HONGOS MEDIANTE EL METODO EXTENSIÓN EN PLACA
- 55. La ubicuidad de los microorganismos es algo que debemos tener en mente para tomar las precauciones pertinentes e impedir que éstos vayan a interferir en el trabajo que estemos realizando
- 58. Tres Giros