Métodos de laboratorio para estudio de resistencia a antibioticos
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Este documento describe varios métodos de laboratorio para estudiar la resistencia a antibióticos, incluyendo métodos in vitro como la difusión en disco, dilución en caldo y métodos moleculares. También discute las directrices del CLSI y otros organismos para las pruebas de sensibilidad y la importancia de los resultados de laboratorio para la práctica clínica. Finalmente, resume varios métodos automatizados comunes y su capacidad para proporcionar información epidemiológica sobre resistencia a antibióticos.
Métodos de laboratorio para estudio de resistencia a antibioticos
- 1. Universidad Nacional Autónoma de Honduras Facultad de Ciencias Escuela de Microbiología Seminario análisis clínico (MB-215) Tema del seminario: “Métodos de laboratorio para estudio de resistencia a antibióticos” Alumno: Joel Saamir García Tegucigalpa MDC, 13 de Febrero del 2014
- 2. Las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos, una estrategia para frenar la expansión de la resistencia bacteriana.
- 3. Desde el año de 1995, la Organización Panamericana de la Salud (OPS) inició un programa que permite realizar la vigilancia de los agentes bacterianos y su correspondiente prueba de susceptibilidad a los antibioticos (PSA) PSA y vigilancia epidemiológica Según la OMS los métodos para el estudio de la resistencia microbiana se puede clasificar en tres tipos: 1) In vitro: P ejem: Difusión en disco, dilución en caldo, etc 2) In vivo: P ejem: Vigilancia de la resistencia a los medicamentos antipalúdicos. 3) Moleculares: En base a la genómica/proteómica y se han utilizado para detectar resistencia genotípica en bacterias. *No hay un método estandarizado que se use de manera internacional y que sea único.
- 4. Métodos de laboratorio para estudiar resistencia a antibióticos
- 5. Estudio laboratorial de la resistencia a antibióticos Algunas infecciones se trataban exitosamente en base en la experiencia clínica pasada de los clínicos (terapia empírica), esto cada vez se vuelve más difícil y poco práctico. Resistencia a muchos antibióticos Variedad de antibióticos disponibles Clínicos más pendientes de los datos de las pruebas de sensibilidad que se practican in vitro, esto pone en relieve la importancia del laboratorio de diagnóstico en la práctica clínica. La prueba de sensibilidad antimicrobiana es una de las tantas armas con las que contamos en el laboratorio para ayudar a los profesionales en medicina controlar los procesos infecciosos que se desarrolla en los pacientes.
- 6. Estudio laboratorial de la resistencia a antibióticos ¿Qué principios debe cumplir una metodología para poder ser utilizada como un ensayo de sensibilidad? Facilidad de realización Flexibilidad Coste Reproducibilidad Fiabilidad Exactitud Adaptación a los sistemas automatizados o semiautomatizados ¿Qué directrices o estándares regulan las pruebas de sensibilidad a los antibióticos y su interpretación? Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI/NCCLS, EE. UU.) Sociedad Británica de Quimioterapia Antimicrobiana (BSAC, Reino Unido) Comité de Antibiogramas de la Sociedad Francesa de Microbiología (CASFM, Francia) Instituto Alemán de Normativas (DIN, Alemania), entre otros.
- 7. Estudio laboratorial de la resistencia a antibióticos ¿Cuáles son los métodos disponibles para probar la sensibilidad a los antibióticos? Métodos de difusión Difusión en disco E-Test Métodos de dilución Macro dilución en caldo Micro dilución en caldo Dilución en medio sólido con agar Otros métodos Métodos moleculares Métodos automatizados
- 8. Estudio laboratorial de la resistencia a antibióticos Método de difusión en disco Difusión de un antibiótico a una determinada concentración a partir de discos, que se depositan en un medio de cultivo sólido que ha sido sembrado con el aislamiento del inóculo seleccionado en cultivo aséptico. Zona de inhibición del crecimiento es proporcional a la sensibilidad de la bacteria frente al antibiótico presente en el disco. Difusión de un antibiótico en un medio de cultivo inoculado crea un gradiente de la sustancia antibiótica. Diámetro zona de inhibición corresponde a la MIC.
- 9. Estudio laboratorial de la resistencia a antibióticos Método de difusión en disco > zona de inhibición, < es la concentración del antibiótico que se requiere para inhibir el crecimiento de la bacteria. Considerar el tamaño de la zona de inhibición. Sus principales ventajas son: Facilidad para modificar los discos con los antimicrobianos de prueba cuando así se requiera. Bajo coste. Se puede utilizar como una prueba de detección frente a gran número de aislamientos.
- 10. Estudio laboratorial de la resistencia a antibióticos Métodos microbiológicos para la detección de BLEE Método de sinergia de doble disco. (Recomendado por la NCCLS en 1998). Discos de CTX (30 μ g), CAZ (30 μ g) y AMC (20/10 μ g) en una placa de agar Müeller-Hinton. Las placas se incuban 18- 24 h a 37 C en atmósfera aeróbica. Ensanchamiento en la zona de inhibición comprendida entre los discos de CTX o CAZ y AMC. Positivo para BLEE
- 11. Estudio laboratorial de la resistencia a antibióticos Método de tiras Épsilon (E test) Combina la simplicidad y flexibilidad de las pruebas de disco-difusión con la capacidad para cuantificar la CIM de las técnicas de dilución. Tira de plástico no poroso con un gradiente predefinido. CMI será el valor obtenido en el punto de intersección de la elipse de inhibición con la tira. Técnica fácil de realizar, reproducible y de rápida interpretación.
- 12. Estudio laboratorial de la resistencia a antibióticos Macro dilución en caldo Cada agente bacteriano se prueba en un rango de concentraciones que suele expresarse en ug de fármaco activo/mL de caldo (ug/mL). La concentración de prueba para un fármaco puede variar según la bacteria y las resistencias asociadas que se intenta detectar con la prueba. 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25 ug/ml (Rangos típicos de concentraciones). CMI = Menor concentración de antibiótico que inhibe por completo el crecimiento bacteriano observable. Ventajas: Aportan resultados de CMI y CMB
- 13. Estudio laboratorial de la resistencia a antibióticos Micro dilución en caldo Técnica de dilución en medio líquido, pero realizada en placas de poliestireno, con micropocillos en lugar de tubos. Los pocillos de cada columna tienen concentraciones crecientes de un antibiótico. Generalmente alrededor de 200 ul de medio por pocillo (Inóculo). Se determinar la CIM, como en la macro dilución. Hay paneles comercializados de ayuda para la interpretación de los resultados.
- 14. Estudio laboratorial de la resistencia a antibióticos Dilución en medio sólido con agar Concentraciones variadas de antibióticos, en un medio solidificado con agar, utilizando generalmente diluciones seriadas dobles. Los resultados derivados de estos ensayos se consideran como los más fiables para la determinación del valor MIC Las ventajas son: Capacidad de ensayar simultáneamente varias bacterias CIM para N. gonorrhoeae. Ensayo estandarizado para bacterias difíciles de cultivar.
- 15. Estudio laboratorial de la resistencia a antibióticos Métodos moleculares Detección de los genes de resistencia a los antibióticos Predecir los fenotipos de resistencia a los antibióticos por la vía de la identificación y la caracterización de los genes conocidos que codifican los mecanismos de resistencia específicos. PCR en tiempo real, piro secuenciación de ADN, espectrometría de masas (MALDI-TOF), micro arreglos de ADN y Bioinformática, son ejemplos de las nuevas herramientas desarrolladas.
- 16. Estudio laboratorial de la resistencia a antibióticos Métodos moleculares Estos métodos se desarrollan mediante diferentes estrategias: A) Hibridación ADN-ADN con sonda de ADN marcada con fluo-rescencia. B) Amplificación por PCR de un gen específico. C) Polimorfismos de fragmentos largos de restricción (RFLP) D) Secuenciación nucleotídica del ADN. La meta es el diseño de nuevos y mejores fármacos dirigidos a blancos previos y otros que inhiban de manera específica el crecimiento bacteriano. Datos epidemiológicos para la detección rápida de genes en bacterias multirresistentes.
- 17. Estudio laboratorial de la resistencia a antibióticos Métodos automatizados Información correcta depende de la metodología de trabajo. Brindan información cuantitativa o semi cuantitativa (concentraciones indicadoras) dependiendo de la configuración antibiótica del dispositivo y organismo (por ejemplo CIM: < de 0.5 ug/ml). Incluyen los puntos de corte de acuerdo a las normas del CLSI o EUCAST. En algunos casos, se incorporan los datos de las cepas salvajes (“wild type”), necesarios para los puntos de corte epidemiológicos. Los mas utilizados son:
- 18. Estudio laboratorial de la resistencia a antibióticos Métodos automatizados MicroScan (Siemens). Vitek II (BioMerieux).
- 19. Estudio laboratorial de la resistencia a antibióticos Métodos automatizados Phoenix (Becton Dickinson Diagnostic System). Estos equipos Manejan información demográfica de los pacientes y permiten realizar informes epidemiológicos de gran riqueza.
- 20. Estudio laboratorial de la resistencia a antibióticos Métodos automatizados Estos informes permiten: A) Control de las infecciones intrahospitalarias. B) Detección de brotes C) Mecanismos de resistencias inusuales D) Agentes patógenos emergentes y unirlos a la vigilancia de la resistencia a los antibióticos. Todos los fabricantes utilizan metodologías diferentes para el mismo fin. Brindan información de la identificación bacteriana en tiempos cercanos a las 4 horas y de PSA (Prueba de Sensibilidad a antibióticos) entre 6 a 16 horas.