Optimizacion de la produccion de una proteasa alcalina
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La producción máxima de la proteasa activa en frío de Stenotrophomonas malthophilia MTCC 7528 ocurre a las 120 horas de incubación a 20°C y pH 9, produciendo 62.2 unidades/ml de enzima. Esta proteasa purificada muestra un pH y temperatura óptimos de actividad que permiten su aplicación potencial en la industria de detergentes para lavar a bajas temperaturas.
Optimizacion de la produccion de una proteasa alcalina
- 1. Optimización de la producción de una proteasa alcalina extracelular activa en frio de la Stenotrophonoma malthophilia MTCC 7528 y su aplicación en la industria del detergente. Vázquez Sánchez Jorge
- 2. INDICE • Resumen • Introducción. • Enzima proteasa. • Microorganismo y sus Enzimas. • Aplicación • Materiales y métodos • Producción de la proteasa y ensayo enzimático. • Optimización de las condiciones de fermentación. • Efecto del tiempo de incubación. • Extracción y purificación de la proteasa. • Caracterización bioquímica de la proteasa purificada • Efecto del pH y la temperatura • SDS-PAGE y Zimograma . • Compatibilidad Enzimática • Resultados y discusión. • Conclusiones
- 3. Resumen • Los Biodetergentes son mas utilizados, que los detergentes sintéticos convencionales en vista de que sus propiedades de limpieza son mejores , además que favorecen un menor gasto energético y tienen menos residuos contaminantes. • los biodetergentes derivados de organismos mesófilos/termofilos y también los detergentes sintéticos a base de peróxido requieren una alta temperatura para una optima actividad. Por lo tanto, las enzimas activas en frio son muy útiles, ya que funcionan a menores temperaturas y no requieren un alto aporte energético.
- 5. Enzima Proteasa • Proteasas :son enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces peptídicos de las proteínas. Grupo 3: Hidrolasas Catalizan reacciones de hidrólisis y también su reverso. Son las más comunes en el dominio de la tecnología enzimática: A-B + H2O A-OH + H-B
- 6. Microorganismo y sus Enzimas • Microorganismos adaptados al frio • Enzimas activas en frio
- 7. La aplicación Reducción de temperatura y reducción de los tiempos de procesamiento
- 8. Materiales y métodos • Las especies microbianas y el cultivo • La bacteria Stenotrophomonas maltophilia
- 9. Producción de la proteasa y ensayo enzimático El sobrenadante se utilizo para el ensayo
- 10. Optimización en las condiciones de fermentación
- 11. Efecto del tiempo de incubación e incubación con agitación en el crecimiento y producción de la proteasa (15±2°C).
- 12. Extracción y purificación de la proteasa
- 13. Columna DEAE pH de un buffer
- 14. Purificación y caracterización de la proteasa
- 15. Cromatografía de intercambio iónico de DEAE-celulosa de sulfato de amonio Precipitada y dializada se aplicó a una columna (3x12 cm) equilibrada en acetato de sodio tampón (0,02 M, pH 5). La elución se realizó con gradiente de NaCl 0,1 a 1 M. El material removido de la columna (fracción de 0,6 M) se concentró para su posterior aplicación
- 16. Caracterización bioquímica de la proteasa purificada • Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad de proteasa y la estabilidad • Buffers • Fosfato de citrato(pH5-6) • Fosfato de sodio(pH 7) • Tris-HCl (pH 8) • Glicina-NaOH (pH 9-11)
- 17. Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad de la proteasa y estabilidad 84% DE LA ACTIVIDAD TOTAL DE LA ENZIMA Actividad máxima Relativamente estable Proteasa pedobacter cryoconitis Stenotrophonoma malthophilia Temperatura optima y 100% de la actividad de la enzima
- 18. SDS-PAGE y ZIMOGRAMA Materiales y reactivos para Protocolo Zimograma
- 19. Resultados y discusión • Optimización de la producción de enzimas y efectos del tiempo de incubación. • • Se observo el patrón de crecimiento y producción de enzimas de 168 Hrs en los medios de producción de la proteasa 15 +(-) 2 0C(pH 7) • Producción de proteasa Máxima (49 U/ml) a 120 Hrs de incubación
- 20. Efecto de la temperatura de incubación y el pH de los medios de cultivo Los Resultados indicaron • Producción con alta cantidad de enzima 15 a 250 C Fines industriales. • Máxima producción de enzima 62.2 u/ml pH 9 a 120 hrs incubación 200 C
- 21. Efecto de la temperatura y pH en la producción de la proteasa Alta cantidad de enzima Producción máxima de enzima
- 22. Efecto de la agitación y diferentes sustratos • Producción de enzimas por agitación 18.2 a 45.7 u/ml • Uso de sustrato • Producción máxima con caseína (52.4 u/ml) Leche descremada (46.6 u/ml) BSA (37.6 u/ml) Albumina de huevo (26.3 u/ml)
- 23. Efectos de iones metálicos • Cu 2+ (126.8%). Producción de enzimas reforzada • Cr 2+ (134.6%). • Co 2+ (43.5%)….(- producción) • Hg2+, Cd 2+ , Zn 2+ no tiene efecto significativo
- 24. Estabilidad de la proteasa con detergente y lavado análisis de rendimiento a baja temperatura
- 25. Conclusiones • Producción máxima de la proteasa a las 120 hrs de incubación 49(U/ml) • Producción máxima de la proteasa a 200C 56.2 U/ml • Máxima producción de enzima 62.2 u/ml pH 9 a 120 hrs incubación 200 C
- 26. Cont. • Mejor Sustrato para la enzima adaptada al frio Leche descremada (46.6 u/ml) • Iones metálicos Cu 2+ (126.8%). Cr 2+ (134.6%).
- 27. Bibliografía • Production optimization of an extracellular cold-active alkaline protease from Stenotrophomonas maltophiliaMTCC 7528 and its application in detergent industry (Mohammed Kuddus1* and Pramod W. Ramteke). • P. Secades and J. A. Guijarro
Notas del editor
- #4: 1. El propósito de este estudio fue el de optimización, producción y purificación de la proteasa alcalina activa en frio a partir de la bacteria psicro-tolerante Stenotrophonoma malthophilia y su aplicación como aditivo para detergentes que se puedan utilizar para el lavado con agua fria o en frio.
- #9: 1. Agar: de leche descremada; leche en polvo 100 g/l, peptona 5 g/l y se almaceno a 4 grados centigrados
- #10: Medio g/l (Caja de petri):glucosa, 10; peptona, 5; extracto de levadura, 5; KH2PO4, 1 y MgSO4.7H2O, 0.2. Autoclave: se ajusto el pH a 7 mediante la adición de una solución de carbonato de Sodio esterilizado (20 % p/v). Medio( Caja de petri) : fue inoculado con (1% v/v) 24 hrs después del primer cultivo. Incubador agitador: 15±2°C a 100 rpm por 48 hrs. Centrifuga: centrifugado a 4°C (10000×g, 15 min) Ensayo: Secades y Guijarro Concentración de la enzima: Método de Lowry
- #11: Tiempo de incubación: desde 24 hr a 168 hr Efecto de varios inductores: BSA, Caseina, leche descremada, albumina de huevo de .5 a 1 % en los medios de cultivo Condiciones de cultivo: en incubador agitador: 4-45 º C, pH (5-10) se optimizaron las condiciones de incubación estática y movimiento (120 rpm) Evaluación de los Impacto de los metales: Los metales pesados utilizados fueron co 2+ , Hg 2 + , Cd 2 + , Cu 2 + , Zn 2 + y Cr 2 + a la concentración final de 50, 10, 25, 100, 50 y 150 g / ml, respectivamente
- #12: 1. Los resultados indicaron que la producción de proteasa aumento gradualmente y fue máxima a las 120 horas de incubación. 49(U/ml)
- #13: El caldo de fermentación, se incubaron a condiciones optimizadas. se centrifugó a 4 º C (10.000 x g, 15 min) y la proteasa extracelular en el sobrenadante del cultivo celular libre se obtuvo por el sulfato de amonio Precipitación. El precipitado de proteína fue disuelto en tampón de acetato de sodio 0,05 M (pH 5). se dializó frente al mismo tampón durante 24 h con 6-8 cambios. La fracción con máxima actividad de enzima se aplicó a la columna de DEAE-Celulosa (3 × 12 cm, genei Bangalore, India), equilibrada previamente con 0,02 M tampón de acetato de sodio (pH 5), y se eluyó con gradiente lineal de diez De NaCl (0,1-1 M, 5 ml de cada uno) en el mismo tampón
- #14: 1. La fracción con alta actividad de proteasa se concentró por liofilización