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Espectrofotometría UV-Vis
-Tránsitos entre estados electrónicos que afectan a electrones en las capas mas externas,
generalmente los implicados en establecer enlaces covalentes.
-La radiación usada incluye la luz “natural” visible, de ahí el término “foto”.
-Se pretende correlacionar la absorción espectrofotométrica con la estructura de la molécula
objeto de estudio para su identificación y su cuantificación.
-Vuelta al modelo ondulatorio de la radiación electromagnética: La luz “natural” no es ni
monocromática ni está polarizada … complicaciones. Perdida de la dependencia con la
orientación…. Uso de monocromadores para seleccionar la λ. Otras complicaciones
derivadas de la naturaleza de las muestras biológicas (disoluciones con disolventes,
recipientes, etc. que también absorben y deben seleccionarse con las mejores propiedades
posibles para que no interfieran)
Bibliografía específica adicional recomendada:
"An introduction to Spectroscopy for Biochemists",
S.B. Brown, Academic Press.

Posibilidades de interacción: complejidad.
-Luz (radiación) “dispersada”: reflexión, refracción, dispersión en sentido estricto (scattering)
de varios tipos, con distinta dirección de propagación y con la misma o distinta (Raman)
frecuencia. Uso de disoluciones “transparentes” en lo posible.
-Luz “absorbida” y posteriormente disipada en forma de calor (aumenta la temperatura) o de
luz emitida (fluorescencia o fosforescencia). También puede haber reacciones fotoquímicas
deseables (retinales en visión) o indeseables (reacciones de fotólisis de la muestra, con
disociación y rotura de enlaces). Precaución con las radiaciones más energéticas …

Intensidad de la radiación:
-La intensidad de la radiación se define como la cantidad de energía que atraviesa por
unidad de tiempo una unidad de superficie colocada perpendicularmente al eje de
propagación de la radiación.
-Relación entre las intensidades de la luz incidente y saliente, asumiendo que solo se da
un fenómeno de absorción
A(λ) = ε (λ) c l
Ley de Lambert-Beer
I = I0 exp(-k.l), es decir log10(I0/I) = k.l, donde
k es el coeficiente de absorción y l el espesor
de la muestra.
En disolución, el coeficiente de absorción (k)
es proporcional a la concentración:
k = ε . C, es decir log10(I0/I) = ε . C. l

Espectrofotometría UV-Vis log10(I0/I) = Aλ = ε (λ) c l
Valores límite de la absorbancia:
-Para I0 = I (no hay absorción); log10(I0/I) = 0, es decir A = 0
-Para I < < < I0 (mucha absorción); log10(I0/I) tiende a infinito.
Significado físico de ε (λ). Dado que A(λ) = ε (λ) c l; para c = 1 M ( y l = 1 cm), A(λ) = ε (λ)
- ε (λ) debería ser una constante, independiente de la concentración.
-Calculo gráfico a partir de la pendiente de una representación de A(λ) versus c.
-Unidades M-1cm-1
-Otros ε posibles, dependiendo de como se exprese la concentración.
Otras medidas de la absorción:
-Transmitancia (T): T = I/I0
-cuando I = 0, T = 0 (absorción total, no hay transmisión)
-cuando I = I0, T = 1 (no hay absorción, se transmite todo)
-generalmente se expresa en porcentajes % T = 100 . I/I0
-Densidad óptica (OD): es simplemente la Absorbancia para l = 1.

Componentes de un espectrofotómetro

Componentes de un espectrofotómetro:
Breve comentario a cubetas, registros, etc.

Componentes de un espectrofotómetro
-Posibilidades de medida: a una λ determinada o todo el espectro:
-Respuesta de los componentes.

Incumplimiento de la Ley de Beer-Lambert: 1) Coeficiente de extinción
dependiente de la concentración

Incumplimiento de la Ley de Beer-Lambert: 2) Soluciones no-transparentes (scattering)
Tipos de scattering:
-Raman (cambia λ; espectroscopia
Raman)
-Tyndall (diametro≥λ/4)
-Rayleigh (diametro ≤λ/4; Abs.
aparente = B + C/λn, donde n suele
ser igual a 4)
Nota: No hay especies absorbentes,
solo scattering.

Incumplimiento de la Ley de Beer-Lambert: 2) Soluciones no-transparentes (scattering)
Correcciones
Caso habitual Caso mixto

Recordatorio OA: características
principales e hibridación
-Capa electrónica o nivel principal:
n = 1, 2, 3, …
-Numero cuántico secundario o del momento
angular (forma del orbital: s, p, d, etc.)
l = 0, 1, … n-1
-Número cuántico magnético (orientación)
m = -l, …0, …+l
-Número cuántico de spin (giro del electrón)
+1/2, -1/2
-Principio de Exclusión de Pauli

Regla de Hund

Recordatorio hibridación de OA

Tipos de transiciones implicadas

Espectrofotometría
UV-Vis
Características de
algunos OM enlazantes y
antienlazantes

Orbitales y electrones disponibles para las transiciones:
-OM enlazantes (σ de enlaces simples y π de enlaces dobles): baja energía (estabilidad),
ocupados por un par de electrones apareados, característicos del estado fundamental.
-OM antienlazantes (σ*, π*): alta energía (inestabilidad), no están ocupados por electrones,
característicos del estado excitado.
-Orbitales no-enlazantes (n). Determinado elementos (oxigeno, nitrógeno, azufre, etc.) tienen
además pares de electrones sin compartir en estos orbitales que también pueden transitar a
estados excitados.
Orden de energías: σ < π < n < π* < σ*; influencia en la ΔE de la transición.
La energía concreta depende de los tipos de OA hibridados, por ejemplo: σ1s < σ2s < σ2p
Transiciones posibles. En principio de cualquiera de los orbitales “llenos” de electrones (σ, π y n)
a los “vacíos” (σ*, π*), pero hay transiciones prohibidas: por distinta simetría de los orbitales
implicados (radial a especular, por ejemplo) o por cambio en el spín del electrón (multiplicidad).
“Prohibido” quiere en realidad decir muy poco probable.
La fortaleza del enlace covalente depende del número (y solapamiento) de OM enlazantes versus
no-enlazantes

Dobles o triples enlaces: Enlace C-C estabilizado por OM enlazantes σ y π: tránsitos con
un menor riesgo de fotólisis

OMs en sistemas conjugados

Las proteínas como cromóforos biológicos:
-El esqueleto polipeptídico
1)OMs π y n.
2)Transición dominante π→π* a 195 nm.
3)Falta de selectividad y dificultades
instrumentales

Las proteínas como cromóforos biológicos:
-Cadenas laterales que absorben en el UV
lejano: sin interés.
- Cadenas laterales que absorben en el UV
próximo (aminoácidos aromáticos):
“Selectividad” y “efecto del medio”.

Aplicaciones obvias de la absorción a 280 nm de los residuos aromáticos de una proteína

Mas aplicaciones: Determinación del número de Trp y Tyr en una proteína;
soluciones simples a un problema analítico complejo.
a) A la λmax del Tyr- (290 nm) hay una pequeña contribución del Trp. Se hace una medida a
pH ácido y otra a pH suficientemente básico. La ΔA290 solo se debe a las Tyr presentes,
dado que la contribución del Trp es constante
ΔA290 = ε (Tyr-)290 . C . l
b) Hay un punto isosbéstico Trp/Tyr- a 294,4 nm, luego
A pH básico; A294,4 = A(Trp) 294,4 + A(Tyr-) 294,4 = ε 294,4 . a; donde a es la suma de las
concentraciones de Trp y Tyr-.
A pH neutro; A280 = A(Trp) 280 + A(Tyr) 280 = ε (Trp) 280 . b + ε (Tyr) 280 . (a-b);
donde b es la concentración de Trp.
Suelen utilizarse valores de ε de aminoácidos libres; preferible usar proteínas desnaturalizadas
con urea, cloruro de guanidinio, etc.

Efectos del disolvente y accesibilidad

Espectroscopia de diferencia

Cinética rápida: instrumentos de “flujo
detenido” (stopped-flow”); también
instrumentos de salto de presión o de
temperatura (“P-jump” and “T-jump”)
Tiempo (ms)

Espectrofotometría UV-Vis Acidos nucleicos

Acidos nucleicos

Otros cromóforos biológicos:
Especificidad y sensibilidad.

Detección de intermediarios en el mecanismo de actuación de transaminasas
dependientes de PLP

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