Reporte de práctica 6. halos de inhibición (desinfectantes)
- 1. Centro de Bachillerato Tecnológico Industrial y de Servicios Noº128 Práctica 6. Halos de inhibición (desinfectantes). Sub módulo 3: Ejecuta técnicas de identificación de microorganismos con base en las normas. Equipo 3. Integrantes: Cabral Brandon, González Lesly, Hernández Nayelli, Hernández Alan, Jiménez Fabiola, Lagunas Itzel, Lira Vanesa, Mata Lizbet. Facilitadora: Ing. Acosta Jessica Fecha: Inició 5 de Noviembre del 2014, 12 de Noviembre del 2014. Introducción Las bacterias presentan una gran adaptabilidad a los ambientes en los que se desarrollan y algunas pue- den sobrevivir bajo ciertas condiciones inusuales, pero a pesar de esto, existen compuestos que pue- den ocasionar la relativa muerte de estos microorga- nismos. Estos agentes actúan penetrando la mem- brana externa de las bacterias y destruyéndola. Para medir la eficacia de estos agentes antibacterio- lógicos, se emplea la técnica de los halos de inhibi- ción, la cual ayuda a comparar diversos tipos de de- sinfectantes y antisépticos para identificar al agente más efectivo sobre las bacterias. Los halos de inhibición son áreas circulares que se forman alrededor de las muestras de desinfectantes colocadas en un medio de cultivo, en estas áreas, se inhibe el crecimiento de algunas especies de bacte- rias. Resumen En esta práctica, se aplicó la técnica de halos de in- hibición para determinar la eficacia de algunos de- sinfectantes y limpiadores comunes. Primero, se prepararon una serie de placas de Petri con medio nutritivo y se tomaron muestras con hiso- pos, de distintos objetos: trapeador, manos, mesa, lavabo, baño, cocina y trapo. Luego, se inocularon las muestras en las placas de Petri y en cada cuadrante de la caja se colocó un cuadrado de 5 cm2 empapado de desinfectante. Se colocaron 4 cuadrados con diversos desinfectantes en cada placa. Luego, las placas fueron colocadas en la incubadora por 24 horas. Después de este lapso, se observó el crecimiento de algunas bacterias. Pero no se apre- ciaron los halos de inhibición. Se realizó el análisis morfológico de las colonias y la tinción de Gram para analizar la morfología de las bacterias. Abstract In this practice, the technique of inhibition halos was applied to determine the effectiveness of some com- mon disinfectants and cleaners. First, a serie of Petri dishes was prepared with nutri- tious medium and was taken samples with swabs of different objects: mop, hands, table, sink, bathroom, kitchen and cloth. Then, the samples were inoculated on the Petri dis- hes and in each quadrant was placed a square of 5 cm2 of filter paper, wet with disinfectant. 4 squares with different disinfectants were placed in each dish. Then, the dishes were placed in the incubator for 24 hours. After this period, the growth of some bacteria was observed. But the inhibition halos were not ap- preciated. Morphological analysis of colonies and Gram staining was performed to analyze the morpho- logy of the bacteria. Materiales y métodos Preparación del agar y vaciado Materiales Matraz Erlenmeyer Agitador Guante de asbesto
- 2. Mechero de Bunsen Manguera de látex Espátula Balanza granataria Vidrio de reloj 7 placas de Petri Papel periódico Reactivos Agar Dextrosa papa Agar Nutritivo Agar Saboraud Agua Procedimiento Para cada agar: 1-Preparar la cantidad necesaria de solución de agar y agua para 42 cajas de Petri, tomando en cuenta el margen de error. Hacerlo en un matraz Erlenmeyer. 2-Tomar el matraz con el guante de asbesto y po- nerlo a calentar en el mechero, agitándolo suave- mente para diluir perfectamente el agar. Realizar esto hasta que se haya diluido correctamente y la solución presente un tono cristalino. 3-Envolver las placas de Petri con papel periódico y tapar el matraz con el agar con una cubierta de papel periódico. 4-Esterilizar en olla de presión las placas y los ma- traces con los agares, por 15 minutos, a 15 libras de presión. 5-Una vez esterilizados, desenvolver los instrumen- tos y prepararlos para el vaciado. 6-Colocar tres mecheros de Busen en forma de trián- gulo y vaciar 20 ml de agar en cada placa de Petri (hacerlo dentro de la figura). 7-Etiquetar las placas y dejarlas solidificar. Inoculación y halos de inhibición Materiales 7 placas de Petri (con medio nutritivo solidificado) Hisopos para inocular 3 mecheros de Bunsen 3 mangueras de látex Reactivos Limpiadores: Axion Pinol Ajax Cloro Muestras de: Trapeador Manos Mesa Lavabo Baño Cocina Trapo Procedimiento 1-Tomar cada una de las 7 muestras con un hisopo (procurando darle vueltas para poder tomar mejor la muestra). 2-Inocular cada una de las muestras en cada una de las 7 placas. Emplear el método de estriado de cre- cimiento y realizarlo dentro de un triángulo de me- cheros de Bunsen. 3-Una vez inoculadas, recortar cuadrados de 0.5 cm2 de papel filtro y empaparlos con cuatro limpiadores o desinfectantes diferentes. 4-Colocar cuatro cuadros de papel filtro, cada uno con un desinfectante diferente en cada placa de Petri (colocar cada cuadro en cada cuadrante de la placa). 5-Una vez realizado lo anterior, etiquetar las placas de Petri correctamente y colocarlas en la incubadora a 35°C aproximadamente por 24 horas. 6-Una vez pasado el lapso, sacar las placas y reali- zar un análisis de la morfología de las colonias; la
- 3. tinción de Gram a los cultivos y el análisis de la mor- fología de las bacterias; y medir los halos de inhibi- ción que se formaron alrededor de cada cuadro de papel filtro. 7-Anotar todos los resultados. Resultados En la práctica se obtuvieron los siguientes resulta- dos: Se inocularon las muestras de la siguiente forma: Medio Número Muestra ino- culada Nutritivo 1 Trapeador 2 Manos 3 Mesa 4 Lavabo 5 Baño 6 Cocina 7 Trapo Morfología de colonias La mayoría de las cultivos no presentaron creci- miento de colonias, mientras que en las que se for- maron colonias, solo se presentaron unas cuantas. Medio Color Forma Su- perfi- cie Borde Co- lo- nias Nutritivo 1 Blanco Circu- lar Plana Re- don- deado 1 Nutritivo 3 Blanco Punti- forme Plana Re- don- deado 6 Nutritivo 6 Amari- llo Circu- lar Plana Re- don- deado 2 Nutritivo 6 Blanco Punti- forme Plana Re- don- deado 4 Morfología de bacterias Medio Bacteria Color Tipo Nutritivo 1 Bacilos Morado Gram positivo Nutritivo 3 Bacilos Morado Gram positivo Nutritivo 6 (co- lonia amarilla) Cocos Morado Gram positivo Nutritivo 6 (co- lonia blanca) Bacilos Morado Gram positivo Los cultivos no crecieron adecuadamente, por lo que no se pudieron analizar los halos de inhibición. Conclusión Cabral Brandon: Aplicando esto podemos saber cuántas bacterias tienen los objetos y probar si el producto de limpieza sirve para ayudar a su limpieza González Lesly: En conclusión los halos de inhibi- ción son las zonas que se forman alrededor de un disco para saber qué calidad tiene un antibiótico, en este caso se utilizó para saber cuán bueno son los detergentes que utilizamos en la vida diaria, debido al mal empleo de la práctica y no seguir las instruc- ciones al pie de la letra la práctica no presentó los halos de inhibición creciendo diferentes bacterias en donde no se debería de haber crecido, sin tener la oportunidad de haber medido el diámetro que se pre- senta en los halos. Hernández Nayelli: Como conclusión determina- mos que este se tiene que realizar en un cultivo puro y que es empleado para determinar la sensibilidad (Para realizar pruebas de sensibilidad e identifica- ción se debe partir de un cultivo primario en medio sólido y se debe procesar una colonia aisladas de cada tipo de microorganismo que pueda tener rol pa- tógeno) de un agente microbiano, la limpieza como siempre muy importante ya que se está trabajando con hongos, el tener control acerca de este e inhibir.
- 4. Hernández Alan: Los antibiogramas permiten deter- minar la eficacia de los antibióticos para inhibir el cre- cimiento de algunas bacterias, por lo cual son muy empleados en medicina. Una de las técnicas de los antibiogramas consiste en colocar círculos de papel empapados con antibióti- cos, luego son colocados en un medio de cultivo y se espera a que crezcan las colonias para observar los halos que se forman. El diámetro del Halo determinará la eficacia del anti- biótico sobre las bacterias presentes en el medio analizado y permitirá establecer comparaciones con los halos de otros antibióticos. En conclusión, las técnicas que involucran halos de inhibición son muy importantes, ya que permiten me- dir la eficacia de los desinfectantes y antibióticos, lo cual puede ayudar en la creación de medicinas más potentes y que ayuden a combatir eficazmente a las bacterias patógenas que entran al organismo. Jiménez Fabiola: Se tiene como conclusión que los halos de inhibición es un antibiograma en el que no se produce crecimiento bacteriano en una placa de agar inoculada con el germen. Gracias a esta prác- tica se observó y se consideró la eficacia de algunos desinfectantes ante diferentes muestras, en los cua- les en tales casos algunas de las bacterias hasta se formaron por encima de los halos de inhibición dando a observar y deducir que su eficacia para dar algún tipo de limpieza o desinfección ante ciertas bacterias no es muy eficiente y dando a deducir cua- les lo son y cuales no y así poder tomar en cuenta que tipo de desinfectantes podrías usar para la lim- pieza en tu hogar o hasta en otras partes. Lagunas Itzel: Los halos de inhibición son una prueba importante para comprobar la efectividad de desinfectantes o antibióticos, el que presenta un ma- yor diámetro es el que se considera más eficaz, te- niendo en cuenta que los bordes no siempre son uni- formes. Deben medirse con mucha precisión. Los desinfectantes que fueron analizados si presen- taron un funcionamiento adecuado mientras las bac- terias se encontraban en su fase de latencia. Lira Vanessa: Conforme se van realizando las prac- ticas son cada vez nos vamos percatando más de lo importante que es observar cada tipo de crecimiento que se obtiene ya que no siempre será el mismo y pues de igual manera podemos extender nuestro co- nocimiento a todo lo que vamos aprendiendo cada día en las practicas por ejemplo en esta práctica res- pectivamente al hacer tareas como la de los halos de inhibición principalmente estudiar lo que es el tema y posteriormente aplicarlo en una práctica para así poder realizar mejor las cosas y no equivocarnos de- masiado . Ya que de esa forma pues sabremos iden- tificar con mayor facilidad lo que estamos trabajando debido a todos los procedimientos y métodos que hemos estado utilizando en el laboratorio y en si cada práctica tiene algo nuevo que mostrarnos y so- bre esta se aprendió como es que crecen bacterias al rededor del halo de inhibición y por qué crecen así. Como también hacer con facilidad la tinción y reco- nocer el tipo de bacteria que se observa al microsco- pio. Mata Lucero: Al hablar de halos de inhibición esta- mos hablando de descubrimiento, ya que nos ayu- dan a identificar cual de en este caso desinfectantes de los que utilizamos es el más seguro e inhibe las bacterias en un mayor rango. Nos son de mucha uti- lidad principalmente a nosotros como laboratoristas químicos, ya que regularmente nos exponemos a co- sas muy contaminadas y al momento de la desinfec- ción podremos usar el desinfectante adecuado. También nos ayuda a saber cuál es el de menor in- hibición y por lo tanto el más inseguro. Meléndez Araceli: El estudio de la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos se realiza principalmente por técnicas de dilución o de difusión. Se entiende por halo de inhibición bacteriana a la zona alrededor de un disco de antibiótico en un anti- biograma en el que no se produce crecimiento bac- teriano en una placa de agar inoculada con el ger- men. Es una medida de la potencia del antibiótico frente al germen
- 5. Discusión Al momento de realizar esta práctica, algunos de los métodos o de las instrucciones indicadas fueron he- chas mal, ya que a las 24 horas no se presentó nin- gún crecimiento de bacterias, ni la presencia de los halos de inhibición, pensamos en la teoría de que eran demasiado buenos los desinfectantes utiliza- dos, rechazando este teoría ya que los demás equi- pos si presentaron cambio y los halos de inhibición, a las 48 horas no se volvieron a ver cambios noto- rios, por lo cual la práctica no llego a su objetivo. Bibliografía Malibrán C., (2008). MANUAL DE PROCEDIMIEN- TOS Para la determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos en bacterias aisladas de humanos. Noviembre 14, 2014, de INEI. Recuperado de: http://www.cdc.gov/ncidod/dbmd/gss/publica- tions/documents/Argentina-LevelI/Manual_procedi- mientos.pdf Cercanado E. & Saavedra J., (2009). El antibio- grama. Noviembre 19, 2014, de AEP. Recuperado de: http://www.apcontinuada.com/es/el-antibi oi- grama-interpretacion-del-antibiograma/ar- ticulo/80000504/ Anexos Antibiogramas y los halos de inhibición El estudio de la sensibilidad de los microor- ganismos a los antimicrobianos se realiza principalmente por técnicas de dilución o de difusión. Las técnicas de dilución proporcionan resul- tados cuantitativos (concentración mínima inhibitoria, CMI) y las de difusión cualitativos (sensible, intermedio, resistente). Ambos métodos son comparables ya que hay una correlación directa entre el diámetro del halo de inhibición con un disco y la CMI. Las técnicas bioquímicas y genéticas permi- ten detectar el mecanismo o el gen de resis- tencia en minutos u horas. La realización de un antibiograma se basa en el patrón de resistencia de cada bacteria. Así, los antibióticos a los que esa bacteria es intrínsecamente resistente o cuya sensibili- dad puede inferirse por otros, no suelen in- formarse en el antibiograma. Los patrones de antibiograma poco frecuen- tes o imposibles requieren confirmación, ya que no responden a mecanismos de resis- tencia conocidos. Técnicas de estudio de sensibilidad a los anti- microbianos El estudio de la sensibilidad in vitro de las bacterias a los antimicrobianos se realiza mediante métodos fenotípicos (técnicas de dilución y de difusión), bio- químicos y genéticos. Los métodos fenotípicos (antibiograma) son los más utilizados. Consisten en enfrentar un inóculo bacteriano estandarizado a una única o a diferen- tes concentraciones de antibiótico. La interpreta- ción de los resultados obtenidos permite clasificar a los microorganismos en categorías clínicas: sen- sibles, intermedios o resistentes. Hay que tener en cuenta que no siempre un valor de CMI más bajo indica mayor actividad de este antimicrobiano, ya que las CMI que definen la sensibilidad o resisten- cia son diferentes para cada especie bacteriana y cada antimicrobiano. Si un microorganismo es sen- sible indica que con las dosis habituales se espera una evolución favorable de la infección, siempre que se alcancen valores adecuados en el lugar de la infección, lo que en ocasiones no es posible (p. ej., en el sistema nervioso central). Por el contrario, si el microorganismo es intermedio o resistente, es probable que la evolución sea desfavorable. La in- terpretación de la sensibilidad predice mejor el fra- caso (cuando es resistente) que el éxito de un tra- tamiento. Entre los métodos fenotípicos, las técnicas de dilu- ción determinan la CMI utilizando un medio líquido (dilución en caldo) o un medio sólido (dilución en agar) para disolver las diferentes concentraciones del antimicrobiano. El medio estandarizado para la realización del antibiograma es el medio Mueller- Hinton, al que se le añade sangre u otros suple- mentos para bacterias que no crecen en él. La CMI es la dilución más baja de antimicrobiano en la que
- 6. no se observa crecimiento bacteriano. La dilución en caldo suele realizarse en micrométodo (micro- dilución), en paneles multipocillos, y es el sistema mayoritariamente adoptado por los sistemas auto- máticos comerciales para determinar la sensibili- dad a los antimicrobianos. En estos sistemas, la lectura de los valores de CMI y la interpretación de resultados se realizan de forma automática. Las técnicas de difusión emplean discos de papel impregnados con una solución estandarizada de antibiótico que se disponen sobre la superficie de un medio sólido previamente inoculado en su su- perficie con una suspensión bacteriana. Tras un período de incubación de 18 h, el diámetro del halo formado está en relación con el grado de sensibili- dad del microorganismo. La carga del disco está ajustada para que los halos de inhibición permitan diferenciar los microorganismos sensibles de los resistentes y pueda establecerse una correlación con los valores de CMI: halos pequeños se relacio- nan con valores altos de CMI (resistentes) y halos grandes con CMI bajas (sensibles) (fig. 1A). Otra técnica de difusión es el E-test, que además per- mite la determinación directa del valor de la CMI (fig. 1B). Utiliza tiras de plástico impregnadas con un antibiótico en concentraciones decrecientes. Al contacto de la tira con el agar, el antibiótico difunde e impide el crecimiento del microorganismo. Des- pués de la incubación se observa una zona de in- hibición en forma de elipse: el valor de la CMI es el punto de intersección de la elipse con la tira y está indicado en la escala impresa sobre la superficie de la tira. Esta técnica puede utilizarse directa- mente sobre muestras clínicas para obtener resul- tados preliminares en menos de 24 h, que siempre deben confirmarse mediante pruebas de sensibili- dad estandarizadas con bacterias en cultivo puro.